DE102020109447A1 - Synthetisches mhc-klasse-ii-protein - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein synthetisches MHC-Klasse-II-Protein. Die Erfindung stellt mittels Disulfidbindungen konformationell stabilisierte MHC-Klasse-II-Proteinen bereit.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein synthetisches MHC-Klasse-II-Protein, Multimere davon und ein Kit.
  • Der Haupthistokompatibilitätskomplex („major histocompatibility complex“, MHC) umfasst eine Gruppe von Genen, die MHC-Proteine bzw. MHC-Proteinkomplexe kodieren, die eine wichtige Rolle im Immunsystems von Wirbeltieren spielen. Unter anderem kodiert der Haupthistokompatibilitätskomplex MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Proteine, die von der Zelle aufbereitete Antigene auf der Zelloberfläche präsentieren, damit diese von T-Lymphozyten erkannt werden können.
  • Um ein besseres Verständnis der Interaktion zwischen T-Zell-Rezeptoren und Antigen-präsentierenden Zellen zu erhalten und damit die Entwicklung verbesserter therapeutischer und diagnostischer Mittel zu ermöglichen, ist es erforderlich, möglichst detaillierte Kenntnisse zu MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Molekülen und deren Rolle bei der Antigen-Präsentation zu gewinnen. Dazu ist es wünschenswert, MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Molküle verfügbar zu haben, die auch außerhalb ihrer natürlichen Umgebung, d.h. außerhalb der Zellmembran, gehandhabt werden können, beispielsweise zum Einsatz in der Zellfärbung, Zellreinigung, Zellstimulation und in Protein-Arrays. Dazu ist es vorteilhaft, konformationell stabile peptidfreie MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II-Proteine verfügbar zu haben.
  • MHC-Klasse-II-Moleküle ähneln MHC-Klasse-I-Molekülen. Es handelt sich um Proteine von sogenannten Antigen-präsentierenden Zellen (beispielsweise dendritischen Zellen, Makrophagen und B-Zellen), die im Zellinneren an endozytierte Peptidfragmente binden und diese an der Zelloberfläche T-Zell-Rezeptoren von CD4-positiven T-Zellen (T-Helferzellen) präsentieren. MHC-Klasse-II-Moleküle liegen in einer großen Zahl von Allotypen vor. Sie bestehen aus zwei Ketten, einer Alpha-Kette (α-Kette) und einer Beta-Kette (ß-Kette), die jeweils Transmembranproteine sind.
  • Rekombinante MHC-Klasse-II-Proteine mit einer Alpha-Kette, einer Beta-Kette und einem an die Peptidbindungsstelle gebundenen Peptid werden beispielsweise eingesetzt, um T-Zellen spezifisch zu markieren. Das kann beispielsweise dazu dienen, T-Zellen zu detektieren (z.B. mittels Durchflusszytometrie), zu aktivieren (über den betreffenden T-Zell-Rezeptor) oder aufzureinigen (z.B. mittels Durchflusszytometrie oder Magnetsortierung). Um die Bindung zu verbessern, nutzt man häufig den „Aviditäts“-Effekt, d.h. die stärkere Bindung von aus mehreren MHC-Klasse-II-Proteine zusammengesetzten Multimeren (z.B. Dimeren, Trimeren, Tetrameren, Pentameren etc.). Die Herstellung von Monomeren, aus denen mit verschiedenen Verfahren Multimere hergestellt werden können, erfolgt in der Regel mittels Expression in Bakterienzellen, Hefezellen, Insektenzellen oder Säugetierzellen.
  • Ein Problem bei bisherigen MHC-Klasse-II-Proteinen, sei es in monomerer oder multimerer Form, besteht beispielsweise darin, dass die beiden Ketten, aus denen ein MHC-Klasse-II-Protein besteht, in dem rekombinanten Komplex oft nicht zusammenbleiben, insbesondere dann nicht, wenn das MHC-Klasse-II-Protein nicht mit einem Peptid beladen ist. Darüber hinaus falten sich MHC-Klasse-II-Proteine häufig nicht oder nicht korrekt in Abwesenheit eines für die Beladung geeigneten Peptids, oder verbleiben in Abwesenheit des Peptids nicht in einem korrekt gefalteten Zustand. Die Herstellung von unbeladenen MHC-Klasse-II-Molekülen ist daher mit großen Schwierigkeiten verbunden und gelingt bislang nicht oder nur unzufriedenstellend. Die Herstellung eines mit einem bestimmten Peptid beladenen MHC-Klasse-II-Moleküls muss daher in jedem Fall von vorne beginnen, weil konformationell stabile unbeladene MHC-Klasse-II-Moleküle nicht in vorgefertigter Form vorliegen.
  • In der WO 2011/101681 A2 sind rekombinante MHC-Klasse-II-Moleküle beschrieben, die mindestens einen Teil des extrazellulären Bereichs einer Alpha-Kette und einer Beta-Kette umfassen, die eine funktionsfähige Peptidbindungsdomäne bilden, wobei die Bereiche der Alpha- und Beta-Kette zur Stabilisierung des MHC-Klasse-II-Heterodimers mittels einer Disulphidbindung zwischen Cysteinresten in der Alpha2- und Beta2-Domäne verbunden sind, die in Alpha2- und Beta2-Domänen nativer MHC-Klasse-II-Moleküle nicht vorhanden sind.
  • Es besteht nach wie vor Bedarf an konformationell stabilisierten MHC-Klasse-II-Proteinen, insbesondere an peptidfreien für eine künftige Peptidbeladung geeigneten MHC-Klasse-II-Proteinen.
  • Zur Lösung der Aufgabe stellt die Erfindung ein synthetisches MHC-Klasse-II-Protein bereit, umfassend zumindest einen extrazellulären Abschnitt einer Alpha-Kette und einen extrazellulären Abschnitt einer Beta-Kette, die gemeinsam eine funktionsfähige Peptidbindungsdomäne bilden, wobei das synthetische MHC-Klasse-II-Protein gegenüber einem Wildtyp-MHC-Klasse-II-Protein mindestens eine zusätzliche oder in ihrer Position abweichende Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinresten aufweist, und wobei die mindestens eine zusätzliche oder abweichende Disulfidbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Disulfidbindungen zwischen i) einem Cysteinrest der Alpha-Kette und einem weiteren Cysteinrest der Alpha-Kette, oder ii) einem Cysteinrest der Beta-Kette und einem weiteren Cysteinrest der Beta-Kette, oder iii) einem Cysteinrest der Alpha-Kette und einem Cysteinrest der Beta-Kette, wobei die mindestens eine zusätzliche oder abweichende Disulfidbindung ausgebildet ist zwischen
    • - Rest 8 der Alpha-Kette und Rest 14 der Beta-Kette,
    • - Rest 12 der Alpha-Kette und Rest 10 der Beta-Kette,
    • - Rest 47 der Alpha-Kette und Rest 89 der Beta-Kette,
    • - Rest 51 der Alpha-Kette und Rest 89 der Beta-Kette,
    • - Rest 52 der Alpha-Kette und Rest 85 der Beta-Kette,
    • - Rest 70 der Alpha-Kette und Rest 9 der Beta-Kette,
    • - Rest 73 der Alpha-Kette und Rest 32 der Beta-Kette,
    • - Rest 76 der Alpha-Kette und Rest 53 der Beta-Kette, oder
    • - Rest 82 der Alpha-Kette und Rest 31 der Beta-Kette,

    und wobei die Positionen der Reste gemäß der einheitlichen IMGT-Nummerierung angegeben sind.
  • Der Begriff „synthetisches MHC-Klasse-II-Protein“ bezieht sich auf ein MHC-Klasse-II-Protein, dass so, in der Natur nicht vorkommt. Ein synthetisches MHC-Klasse-II-Protein unterscheidet sich von einem natürlich vorkommenden MHC-Klasse-II-Protein in seiner Primärstruktur, Sekundärstruktur, Tertiärstruktur oder Quartärstruktur. Die Begriffe „synthetisch“ und „rekombinant“ werden hier synonym verwendet.
  • Der Ausdruck, wonach das MHC-Klasse-II-Protein gegenüber einem Wildtyp-MHC-Klasse-II-Protein eine „in ihrer Position abweichende Disulfidbindung“ (kurz „abweichende Disulfidbindung“) aufweist, bedeutet, dass das MHC-Klasse-II-Protein verglichen mit einem beliebigen natürlichen MHC-Klasse-II-Protein, vorzugsweise verglichen mit einem entsprechenden Wildtyp-MHC-Klasse-II-Protein, eine Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinresten in dem Protein aufweist, die in einem (entsprechenden) natürlich vorkommenden MHC-Klasse-II-Protein nicht vorkommt. Das kann bedeuten, dass einer der an einer Disulfidbrücke beteiligten Cysteinreste an einer gegebenüber dem Wildtyp abweichenden Position vorliegt, beide Cysteinreste an Positionen vorliegen, an denen im Wildtyp-Protein kein Cysteinrest vorhanden ist oder im Wildtyp-Protein zwischen dort vorhandenen Cysteinresten keine Disulfidbrücke gebildet ist. Unter einer „zusätzlichen Disulfidbindung“ ist eine Disulfidbindung in dem synthetischen MHC-Klasse-II-Protein zu verstehen, die zusätzlich zu einer beim Wildtyp natürlicherweise vorkommenden Disulfidbindung vorhanden ist.
  • Unter einer „Disulfidbindung“ oder „Disulfidbrückenbindung“ ist eine kovalente Bindung zwischen den Schwefelatomen zweier Cysteinreste zu verstehen.
  • Der Begriff „entsprechendes natürlich vorkommendes MHC-Klasse-II-Protein“ bezieht sich auf ein natürlich vorkommendes MHC-Klasse-II-Protein, das strukturell die größte Ähnlichkeit zu einem gegebenen synthetischen MHC-Klasse-II-Protein aufweist. Die strukturelle Ähnlichkeit kann vom Fachmann leicht mittels Sequenzvergleich (Sequenz-Alignment), beispielsweise mittels bekannter Computerprogramme wie BLAST, festgestellt werden.
  • Unter einem „MHC-Molekül“ oder „MHC-Protein“ wird ein Protein des Haupthistokompatibilitätskomplexes verstanden, d.h. ein Protein, das vom Haupthistokompatibilitätskomplex kodiert wird. MHC-Moleküle werden in verschiedene Klassen, z.B. Klasse I und Klasse II, unterteilt. Unter dem Begriff „MHC-Klasse-I-Protein“ „MHC-Klasse-I-Molekül“, „Klasse-I-Molekül“, „MHC-I-Molekül“, MHC-Klasse-I-Protein”, „Klasse-I-Protein“ oder „MHC-I-Protein“ wird ein Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I-Protein, unter dem Begriff „MHC-Klasse-II-Protein“ „MHC-Klasse-II-Molekül“, „Klasse-II-Molekül“, „MHC-II-Molekül“, MHC-Klasse-II-Protein”, „Klasse-II-Protein“ oder „MHC-II-Protein“ ein Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-II-Protein verstanden. MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Proteine sind vom Haupthistokompatibilitätskomplex (engl. „Major Histocompatibility Complex“, MHC) kodierte Transmembranproteine und an der zellulären Immunantwort beteiligt. MHC-Klasse-I-Proteine binden Peptide aus dem Zellinneren, wie beispielsweise aus dem Cytosol oder dem Lumen der endocytischen Organellen und präsentieren diese an der Zelloberfläche den zytotoxischen T-Zellen (Antigenpräsentation). Von MHC-Klasse-II-Proteinen präsentierte Antigene veranlassen die Bindung von CD-4-positiven T-Helferzellen. Ein MHC-I-Molekül besteht in der Regel aus einer schweren Alpha-Kette (α-Kette) auch kurz „hc“, Molekulargewicht ca. 44 kDa, etwa 350 Aminosäuren) mit drei extrazellulären Domänen (α1, α2 und α3) und einer Transmembrandomäne sowie einer nicht kovalent daran gebundenen leichten Beta-Kette (β-Kette, auch „β2-Mikroglobulin“ oder kurz „β2m“, ca. 12 kDa, 99 Aminosäuren). Menschliche MHC-Klasse-I-Proteine werden auch als HLA-Proteine (HLA = human leukocyte antigen) bezeichnet. Der Begriff umfasst sowohl klassische MHC-Klasse-I-Proteine wie HLA-A, HLA-B und HLA-C als auch nicht-klassische MHC-Klasse-I-Proteine wie HLA-E, HLA-F und HLA-G. MHC-Klasse-II-Proteine bestehen in der Regel aus zwei nahezu gleich großen Ketten, einer Alpha-Kette (α-Kette, ca. 33 kDa) und einer Beta-Kette (β-Kette, ca. 30 kDa) mit jeweils einer extrazellulären Domäne, einem Transmembransegment und einer relativ kurzen cytosolischen Komponente. Die extrazelluläre Domäne umfasst zwei Domänen (α1, α2 bzw. β1, β2), wobei die Peptidbindungstelle (Peptidbindungsdomäne) von Teilen der membranfernen bzw. distalen α1- und der β1-Kette gebildet wird. MHC-Klasse-II-Moleküle werden beim Menschen von drei Isotypen kodiert: HLA-DP, HLA-DQ und HLA-DR (zur Bedeutung von „HLA“ s.o.). Die HLA-DP-Ketten werden von Genen kodiert, die als HLA-DPA (für die Alpha-Kette) oder HLA-DPB (für die Beta-Kette) bezeichnet werden. Die Ketten für HLA-DQ und -DR werden auf die gleiche Weise kodiert. Sämtliche MHC-Klasse-II-Gene sind stark polymorph. Jeder gegebene Allotyp eines MHC-Klasse-II-Moleküls kann Tausende verschiedener Peptide binden. Der Begriff „MHC-Molekül“ oder „MHC-Protein“ umfasst zudem auch peptidbindende Fragmente aller dieser Proteine, insbesondere die extrazelluläre Domäne oder Abschnitte davon. Unter einem „Abschnitt“ oder „Fragment“ werden hier insbesondere zusammenhängende Teilsequenzen von mindestens 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 80, 90 oder mindestens 100 Aminosäuren verstanden. Der Begriff umfasst auch MHC-Proteine nicht-menschlicher Wirbeltierspezies, beispielsweise von Maus (Mus musculus), Ratte (Rattus norvegicus), Rind (Bos taurus), Pferd (Equus equus) oder Grüner Meerkatze (Macaca mulatta). Die MHC-Klasse-I-Proteine der Maus werden beispielsweise als H-2-Proteine bezeichnet, die von den Genloci H-2D, H-2K und H-2L kodiert werden. Ein bestimmter Allotyp eines Maus-MHC-Klasse-I-Proteins ist beispielsweise H-2Kb oder H-2Ld. Unterklassen von MHC-Klasse-II-Proteinen der Maus sind beispielsweise H-2A, H-2E und H-2P-Proteine.
  • Der Begriff „funktionsfähige Peptidbindungsdomäne“ in Bezug auf ein synthetisches MHC-Protein bezeichnet eine Peptidbindungsdomäne, die in der Lage ist, ein Peptid zu binden, das auch von einem natürlichen MHC-Protein gebunden wird.
  • Unter einem „peptidfreien MHC-Molekül“ oder „leeren MHC-Molekül“ wird ein unbeladenes MHC-Molekül verstanden, d.h. ein MHC-Molekül, an das kein Peptid (Antigen) gebunden ist.
  • Unter einem peptidbeladenen MHC-Moleküle wird hier ein Komplex aus Peptid und MHC-Molekül verstanden. Ein Komplex aus Peptid und MHC-Protein, d.h. ein MHC-Protein, beispielsweise MHC-Klasse-I-Protein, mit daran gebundenem Peptid, wird hier auch als „Peptid/MHC-Protein-Komplex“ oder „MHC-Protein/Peptid-Komplex“ bezeichnet. Ein Komplex aus Peptid und MHC-Klasse-I-Protein wird auch als „Klasse-I-Peptid-Komplex“ oder „Peptid/MHC-I“ bezeichnet. Als Abkürzung für einen solchen Komplex wird auch „pMHC-1“ verwendet. Ein Komplex aus Peptid und MHC-Klasse-II-Protein wird auch als „Klasse-II-Peptid-Komplex“ oder „Peptid/NII-IC-11“ bezeichnet. Als Abkürzung für einen solchen Komplex wird auch „pMHC-II“ verwendet. Die Begriffe „antigenpräsentierendes MHC-Klasse-I-Protein“ oder „antigenpräsentierendes MHC-Klasse-II-Protein“ werden synonym zu dem jeweiligen Komplex verwendet. „Antigenpräsentierend“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass das MHC-Klasse-I-Protein oder das MHC-Klasse-II-Protein ein Peptid (Antigen) gebunden aufweist.
  • Unter einem „konformationell stabilen“ MHC-Molekül, beispielsweise MHC-Klasse-II-Molekül, wird ein MHC-Molekül, z.B. MHC-Klasse-II-Protein, verstanden, das unter natürlichen Bedingungen in einer Zelle oder unter üblichen Versuchsbedingungen eine Konformation aufweist bzw. beibehält, die es dem MHC-Molekül ermöglicht, seine natürliche Funktion wahrzunehmen. Insbesondere bedeutet der Ausdruck, dass das MHC-Molekül so gefaltet ist oder bleibt und die das MHC-Molekül zusammensetzenden Molekülketten so miteinander in Wechselwirkung treten, dass das MHC-Molekül seine natürliche Funktion, insbesondere die Funktion der Peptidbindung und vorzugsweise auch der Peptidpräsentation, erfüllen kann.
  • Unter einer „einheitlichen IMGT-Nummerierung“ („IMGT unique numbering“) wird ein standardisiertes Nummerierungssystem des so genannten „ImMunoGeneTics information system (IMGT)“ für Immunglobuline, T-Zellrezeptorenn, MHC-Proteine und verwandte Immunsystem-Proteine des Menschen und anderer Wirbeltiere verstanden (s. http://imgt.cines.fr; Lefranc, M.-P., „IMGT, the international ImMunoGeneTics information system®“ Nucl. Acids Res., 33, D593-D597 (2005), doi:10.1093/nar/gki065; Lefranc M.-P., Duprat E., Kaas Q., Tranne M., Thiriot A. and Lefranc G. IMGT unique numbering for MHC groove G-DOMAIN and MHC superfamily (MhcSF) G-LIKE-DOMAIN. Dev. Comp. Immunol., 2005, 29, 917-938, doi:10.1016/j.dci.2005.03.003).
  • Typische Sequenzen für Alpha- und Beta-Ketten der humanen MHC-Klasse-II-Isotypen HLA-DR, HLA-DQ und HLA-DP sind unter den Sequenznummern 1 bis 6 angegeben. Eine typische Alpha-Kette für HLA-DR (HLA-DRA*01:01, s. auch UniProtKB P01903) ist in SEQ ID NO: 1 angegeben, eine typische Beta-Kette für HLA-DR (HLA-DRB1*01:01, s. auch UniProtKB P04229) in SEQ ID NO: 2. Eine typische Alpha-Kette für HLA-DQ (HLA-DQA1*03:01, s. auch UniProtKB Q5Y7C3) ist in SEQ ID NO: 3 angegeben, eine typische Beta-Kette für HLA-DQ (HLA-DQB1*02:01, s. auch UniProtKB Q5Y7D3) in SEQ ID NO: 4. Eine typische Alpha-Kette für HLA-DP (HLA-DPA1*01:03, s. auch UniProtKB P20036) ist in SEQ ID NO: 5 angegeben, eine typische Beta-Kette für HLA-DP (HLA-DPB1*04:01, s. auch UniProtKB P04440) in SEQ ID NO: 6.
  • Die erfindungsgemäßen MHC-Klasse-II-Proteine weisen mindestens eine Disulfidbindung auf, die in natürlichen MHC-Klasse-II-Proteinen nicht vorkommt. Das erfindungsgemäßen MHC-Klasse-II-Protein weist daher mindestens eine Disulfidbindung zwischen Cysteinresten des erfindungsgemäßen MHC-Klasse-II-Proteins auf, die in einem entsprechenden natürlichen (Wildtyp-)MHC-Klasse-II-Protein nicht vorkommen. Das erfindungsgemäße MHC-Klasse-II-Protein kann dazu Cysteinreste an Positionen aufweisen, an denen in dem Wildtyp-Protein kein Cysteinrest steht. Es kann also beispielsweise eine Nicht-Cystein-Aminosäure durch Cystein ersetzt sein oder ein Cysteinrest, der Teil einer Disulfidbrücke ist, zusätzlich in der Kette vorhanden sein. Es kann auch eine Disulfidbrücke zwischen Cysteinresten vorhanden sein, die natürlicherweise vorhanden sind, zwischen denen jedoch im Wildtyp keine Disulfidbindung ausgebildet ist. Die mindestens eine Disulfidbindung ist erfindungsgemäß gebildet a) kettenintern („intrachain“) zwischen verschiedenen Cysteinresten innerhalb der Alpha-Kette (z.B. zwischen Rest 8 und Rest 139, Rest 13 und Rest 66, Rest 13 und Rest 67, Rest 20 und Rest 63, Rest 22 und Rest 59, Rest 34 und Rest 56 oder Rest 34 und Rest 56 der Alpha-Kette), b) kettenintern zwischen verschiedenen Cysteinresten innerhalb der Beta-Kette (z.B. zwischen Rest 38 und Rest 54, Rest 38 und Rest 58, Rest 42 und Rest 75, Rest 47 und Rest 58 oder Rest 49 und Rest 58 der Beta-Kette) oder c) kettenüberbrückend („interchain“) zwischen einem Cysteinrest der Alpha-Kette und einem Cysteinrest der Beta-Kette, wobei die mindestens eine kettenüberbrückende Disulfidbindung zwischen Rest 8 der Alpha-Kette und Rest 14 der Beta-Kette, Rest 12 der Alpha-Kette und Rest 10 der Beta-Kette, Rest 47 der Alpha-Kette und Rest 89 der Beta-Kette, Rest 51 der Alpha-Kette und Rest 89 der Beta-Kette, Rest 52 der Alpha-Kette und Rest 85 der Beta-Kette, Rest 70 der Alpha-Kette und Rest 9 der Beta-Kette, Rest 73 der Alpha-Kette und Rest 32 der Beta-Kette, Rest 76 der Alpha-Kette und Rest 53 der Beta-Kette, oder Rest 82 der Alpha-Kette und Rest 31 der Beta-Kette gebildet ist.
  • In bevorzugten Ausführungsformen kann die mindestens eine zusätzliche oder abweichende Disulfidbindung bei einer Disulfidbindung zwischen einem Cysteinrest der Alpha-Kette und einem weiteren Cysteinrest der Alpha-Kette ausgebildet sein zwischen
    • - Rest 8 der Alpha-Kette und Rest 139 der Alpha-Kette,
    • - Rest 13 der Alpha-Kette und Rest 66 der Alpha-Kette,
    • - Rest 13 der Alpha-Kette und Rest 67 der Alpha-Kette,
    • - Rest 20 der Alpha-Kette und Rest 63 der Alpha-Kette,
    • - Rest 22 der Alpha-Kette und Rest 59 der Alpha-Kette,
    • - Rest 34 der Alpha-Kette und Rest 56 der Alpha-Kette, oder
    • - Rest 34 der Alpha-Kette und Rest 59 der Alpha-Kette, und bei einer Disulfidbindung zwischen einem Cysteinrest der Beta-Kette und einem weiteren Cysteinrest der Beta-Kette ausgebildet sein zwischen
    • - Rest 38 der Beta-Kette und Rest 54 der Beta-Kette,
    • - Rest 38 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette,
    • - Rest 42 der Beta-Kette und Rest 75 der Beta-Kette,
    • - Rest 47 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette, oder
    • - Rest 49 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette,

    und wobei die Positionen der Reste gemäß der einheitlichen IMGT-Nummerierung angegeben sind.
  • Das erfindungsgemäße MHC-Klasse-II-Protein kann auch zwei, drei, vier, fünf oder mehr der zusätzlichen oder abweichenden Disulfidbindungen aufweisen. Bevorzugt sind die Disulfidbindungen ausgewählt aus der Gruppe von Disulfbindungen, bestehend aus einer Disulfbindungen zwischen
    • - Rest 8 der Alpha-Kette und Rest 14 der Beta-Kette,
    • - Rest 12 der Alpha-Kette und Rest 10 der Beta-Kette,
    • - Rest 47 der Alpha-Kette und Rest 89 der Beta-Kette,
    • - Rest 51 der Alpha-Kette und Rest 89 der Beta-Kette,
    • - Rest 52 der Alpha-Kette und Rest 85 der Beta-Kette,
    • - Rest 70 der Alpha-Kette und Rest 9 der Beta-Kette,
    • - Rest 73 der Alpha-Kette und Rest 32 der Beta-Kette,
    • - Rest 76 der Alpha-Kette und Rest 53 der Beta-Kette,
    • - Rest 82 der Alpha-Kette und Rest 31 der Beta-Kette,
    • - Rest 8 der Alpha-Kette und Rest 139 der Alpha-Kette,
    • - Rest 13 der Alpha-Kette und Rest 66 der Alpha-Kette,
    • - Rest 13 der Alpha-Kette und Rest 67 der Alpha-Kette,
    • - Rest 20 der Alpha-Kette und Rest 63 der Alpha-Kette,
    • - Rest 22 der Alpha-Kette und Rest 59 der Alpha-Kette,
    • - Rest 34 der Alpha-Kette und Rest 56 der Alpha-Kette,
    • - Rest 34 der Alpha-Kette und Rest 59 der Alpha-Kette,
    • - Rest 38 der Beta-Kette und Rest 54 der Beta-Kette,
    • - Rest 38 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette,
    • - Rest 42 der Beta-Kette und Rest 75 der Beta-Kette,
    • - Rest 47 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette, und
    • - Rest 49 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette.
  • Die Nummerierung der Reste erfolgt gemäß der einheitlichen IMGT-Nummerierung.
  • Es ist erfindungsgemäß jede beliebige Kombination von Disulfidbindungen möglich, mit der Maßgabe, dass ein gegebener Cysteinrest in einem bestimmten MHC-Klasse-II-Protein jeweils nur an einer Disulfidbindung beteiligt sein kann. Bei einer Disulfidbindung zwischen einem Cysteinrest 38 der Beta-Kette und einem Cysteinrest 54 der Beta-Kette kann somit keine weitere Disulfidbindung unter Beteiligung des Cysteinrestes 38 (z.B. zwischen Rest 38 und Rest 58 der Beta-Kette) vorhanden sein.
  • Es ist bevorzugt, wenn Alpha- und Beta-Kette, oder zumindest deren extrazellulärer Abschnitt, demselben Isotyp entstammen. Das erfindungsgemäße MHC-Klasse-II-Protein ist somit bevorzugt ein HLA-DPalpha/HLA-DPbeta-Komplex, ein HLA-DQalpha/HLA-DQbeta-Komplex oder HLA-DRalpha/HLA-DRbeta-Komplex oder ein Komplex aus den jeweiligen extrazellulären Abschnitten der Alpha- und Beta-Ketten von HLA-DP, HLA-DQ oder HLA-DR.
  • Das erfindungsgemäße MHC-Klasse-II-Protein kann a) peptidbeladen oder b) peptidfrei sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße MHC-Klasse-II-Protein peptidfrei. Bei einem peptidbeladenen MHC-Klasse-II-Protein weist das MHC-Klasse-II-Protein ein geeignetes Peptid an seiner Peptidbindungsstelle (Bindungstasche) nicht-kovalent gebunden auf. Es kann sich um ein beliebiges Peptid handeln, dass auch an die Peptidbindungsstelle eines natürlicherweise vorkommenden MHC-Klasse-II-Proteins bindet. Peptide, die an MHC-Klasse-II-Proteine binden, weisen häufig 13 bis 17 Aminosäuren auf, können aber auch kürzer oder länger sein. Ein peptidfreies MHC-Klasse-II-Protein weist eine freie Peptidbindungsstelle (Bindungstasche) auf, d.h. eine Peptidbindungsstelle, an die kein Peptid gebunden ist, aber gebunden werden kann. Ein derartiges „leeres“ MHC-Klasse-II-Protein kann vorteilhaft zu verschiedenen Zwecken genutzt werden, beispielsweise zur Untersuchung des Bindungsverhaltens von T-Zell-Rezeptoren, von Beladungsmechanismen in der Zelle oder zur Herstellung von maßgeschneiderten Peptid-/MHC-Klasse-II-Protein-Komplexen.
  • Das erfindungsgemäße synthetische MHC-Klasse-II-Protein kann eine vollständige Alpha-Kette und/oder eine vollständige Beta-Kette umfassen. „Vollständig“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die jeweilige Kette neben der extrazellulären Domäne auch eine Transmembrandomäne und vorzugsweise auch eine cytoplasmatische Domäne umfasst, zumindest aber eine extrazellulären Domäne und eine Transmembrandomäne. Ein derartiges erfindungsgemäßes synthetisches MHC-Klasse-II-Protein kann beispielsweise zur Verankerung in Zellmembranen, künstlichen Lipiddoppelschichten oder Virenhüllen eingesetzt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen synthetischen MHC-Klasse-II-Proteins umfasst das MHC-Klasse-II-Protein nur einen extrazellulären Abschnitt einer Alpha-Kette und einen extrazellulären Abschnitt einer Beta-Kette. Derartige lösliche MHC-Klasse-II-Proteine können vorteilhaft zu vielen Zwecken eingesetzt werden, beispielsweise als Färbungsreagenz zur Identifikation von antigenspezifischen T-Zellen. Bevorzugt umfasst zumindest eine der Ketten, bevorzugt beide Ketten, eines solchen erfindungsgemäßen synthetischen MHC-Klasse-II-Proteins ein an die Kette fusioniertes Element, beispielsweise einen Affinitäts-Tag, z.B. einen His-Tag (z.B. zur Isolierung mit Hilfe von Nickel-NTA-Agarose), einen Avi-Tag (z.B. zur enzymatischen Biotinylierung, die den Nachweis oder die Isolation des Proteins durch Streptavidin ermöglicht), oder die Fc-Domäne eines Antikörpers (z.B. zum Nachweis oder zur Isolierung mit Hilfe von Protein A).
  • Ein erfindungsgemäßes synthetisches MHC-Klasse-II-Protein kann auf eine dem Fachmann bekannte Weise hergestellt werden, beispielsweise mittels Expression in Bakterienzellen, z.B. E.-coli-Zellen, Hefezellen, Insektenzellen oder Säugetierzellen (s. z.B. auch WO 2011/101681 A2 ).
  • Ein erfindungsgemäßes synthetisches MHC-Klasse-II-Protein kann zu verschiedenen Zwecken verwendet werden, beispielsweise
    • - zur Markierung und zum Nachweis von T-Zellen und anderen Zellen, die Rezeptoren tragen, die MHC-Klasse-II-Moleküle erkennen,
    • - zur Aktivierung und Inaktivierung von T-Zellen und anderen Zellen, die Rezeptoren tragen, die MHC-Klasse-II-Moleküle erkennen,
    • - zum Sortieren oder Isolieren von T-Zellen und anderen Zellen, die Rezeptoren tragen, die MHC-Klasse-II-Moleküle erkennen,
    • - zur Messungen der Affinität von rekombinanten T-Zell-Rezeptoren zu MHC-Klasse-II-/Peptid-Komplexen, insbesondere Screening-Verfahren, und
    • - zur Herstellung oder Verwendung in MHC-Klasse-II-Arrays, die zur Untersuchung der Bindung von Zellen, Zellfragmenten, Liposomen, Mizellen oder isolierten rekombinanten T-Zell-Rezeptoren verwendet werden können.
  • Zwei oder mehr erfindungsgemäße synthetische MHC-Klasse-II-Proteine können auch in multimerer Form angeordnet sein. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung daher auch ein Protein-Multimer, umfassend mindestens zwei, drei, vier, fünf oder mehr erfindungsgemäße synthetische MHC-Klasse-II-Proteine. Ein erfindungsgemäßes Multimer umfasst mindestens zwei, vorzugsweise drei, vier, fünf oder mehr erfindungsgemäße MHC-Klasse-II-Proteine, die jeweils mindestens einen extrazellulären Abschnitt einer Alpha-Kette und einen extrazellulären Abschnitt einer Beta-Kette umfassen, die gemeinsam eine funktionsfähige Peptidbindungsdomäne bilden. Es handelt sich vorzugsweise um ein Multimer aus zwei oder mehr identischen erfindungsgemäßen synthetischen MHC-Klasse-II-Proteinen oder einem Multimer aus erfindungsgemäßen synthetischen MHC-Klasse-II-Proteinen mit derselben Bindungsspezifität. Multimere von erfindungsgemäßen synthetischen MHC-Klasse-II-Proteinen sind vorteilhaft unter Nutzung des „Aviditäts-Effektes“ einsetzbar, weil hier multivalente Bindungen, beispielsweise zwischen einem T-Zell-Rezeptor und einem MHC-Klasse-II-Protein-Multimer, zu einer stärkeren Bindung führen.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Kit, beispielsweise zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen MHC-Klasse-II-Proteinen und T-Zell-Rezeptoren, umfassend mindestens ein erfindungsgemäßes synthetisches MHC-Klasse-II-Protein oder mindestens ein erfindungsgemäßes MHC-Klasse-II-Protein-Multimer.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist das erfindungsgemäße synthetische MHC-Klasse-II-Protein oder das erfindungsgemäße MHC-Klasse-II-Protein-Multimer auf einem festen Träger immobilisert, beispielsweise an eine Oberfläche des Trägers adsorbiert oder chemisch gekoppelt. Bevorzugt ist es, wenn mehrere verschiedene erfindungsgemäße synthetische MHC-Klasse-II-Proteine oder erfindungsgemäße MHC-Klasse-II-Protein-Multimere in der Art eines Protein-Arrays auf demselben Träger immobilisiert, vorzugsweise an eine gemeinsame Oberfläche des Trägers adsorbiert oder chemisch gekoppelt sind.
  • Ein erfindungsgemäßes Kit kann, insbesondere in den Ausführungsformen mit immobilisierten MHC-Klasse-II-Proteinen oder MHC-Klasse-II-Protein-Multimeren, vorteilhaft beispielsweise zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen MHC-Klasse-II-Proteinen und T-Zell-Rezeptoren eingesetzt werden, zum Beispiel zur Untersuchung der Affinität zwischen MHC-Klasse-II-Proteinen und T-Zell-Rezeptoren mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR) oder ähnlichen Methoden. Weitere Anwendungsbeispiele für das erfindungsgemäße Kit, bei denen die spezifischen Wechselwirkungen zwischen MHC-Klasse-II-Proteinen und T-Zell-Rezeptoren ausgenutzt werden können, sind die Detektion von antigen-spezifischen T-Zellen, die Aktivierung von T-Zellen oder die Isolation von T-Zellen. Für die Isolation von T-Zellen ist es beispielsweise bevorzugt, wenn der feste Träger eine feste Phase ist, beispielsweise eine Chromatographiematrix.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 2011/101681 A2 [0007, 0030]

Claims (11)

  1. Synthetisches MHC-Klasse-II-Protein, umfassend zumindest einen extrazellulären Abschnitt einer Alpha-Kette und einen extrazellulären Abschnitt einer Beta-Kette, die gemeinsam eine funktionsfähige Peptidbindungsdomäne bilden, wobei das synthetische MHC-Klasse-II-Protein gegenüber einem Wildtyp-MHC-Klasse-II-Protein mindestens eine zusätzliche oder in ihrer Position abweichende Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinresten aufweist, und wobei die mindestens eine zusätzliche oder abweichende Disulfidbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Disulfidbindungen zwischen i) einem Cysteinrest der Alpha-Kette und einem weiteren Cysteinrest der Alpha-Kette, oder ii) einem Cysteinrest der Beta-Kette und einem weiteren Cysteinrest der Beta-Kette, oder iii) einem Cysteinrest der Alpha-Kette und einem Cysteinrest der Beta-Kette, wobei die mindestens eine zusätzliche oder abweichende Disulfidbindung ausgebildet ist zwischen - Rest 8 der Alpha-Kette und Rest 14 der Beta-Kette, - Rest 12 der Alpha-Kette und Rest 10 der Beta-Kette, - Rest 47 der Alpha-Kette und Rest 89 der Beta-Kette, - Rest 51 der Alpha-Kette und Rest 89 der Beta-Kette, - Rest 52 der Alpha-Kette und Rest 85 der Beta-Kette, - Rest 70 der Alpha-Kette und Rest 9 der Beta-Kette, - Rest 73 der Alpha-Kette und Rest 32 der Beta-Kette, - Rest 76 der Alpha-Kette und Rest 53 der Beta-Kette, oder - Rest 82 der Alpha-Kette und Rest 31 der Beta-Kette, und wobei die Positionen der Reste gemäß der einheitlichen IMGT-Nummerierung angegeben sind.
  2. Synthetisches MHC-Klasse-II-Protein nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine zusätzliche oder abweichende Disulfidbindung zwischen einem Cysteinrest der Alpha-Kette und einem weiteren Cysteinrest der Alpha-Kette ausgebildet ist zwischen - Rest 8 der Alpha-Kette und Rest 139 der Alpha-Kette, - Rest 13 der Alpha-Kette und Rest 66 der Alpha-Kette, - Rest 13 der Alpha-Kette und Rest 67 der Alpha-Kette, - Rest 20 der Alpha-Kette und Rest 63 der Alpha-Kette, - Rest 22 der Alpha-Kette und Rest 59 der Alpha-Kette, - Rest 34 der Alpha-Kette und Rest 56 der Alpha-Kette, oder - Rest 34 der Alpha-Kette und Rest 59 der Alpha-Kette, und die mindestens eine zusätzliche oder abweichende Disulfidbindung zwischen einem Cysteinrest der Beta-Kette und einem weiteren Cysteinrest der Beta-Kette ausgebildet ist zwischen - Rest 38 der Beta-Kette und Rest 54 der Beta-Kette, - Rest 38 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette, - Rest 42 der Beta-Kette und Rest 75 der Beta-Kette, - Rest 47 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette, oder - Rest 49 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette, und wobei die Positionen der Reste gemäß der einheitlichen IMGT-Nummerierung angegeben sind.
  3. Synthetisches MHC-Klasse-II-Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein, zwei, drei, vier, fünf oder mehr zusätzliche oder abweichende Disulfidbindungen in dem MHC-Klasse-II-Molekül gebildet sind, ausgewählt aus der Gruppe von Disulfidbindungen bestehend aus einer Disulfidbindung zwischen - Rest 8 der Alpha-Kette und Rest 14 der Beta-Kette, - Rest 12 der Alpha-Kette und Rest 10 der Beta-Kette, - Rest 47 der Alpha-Kette und Rest 89 der Beta-Kette, - Rest 51 der Alpha-Kette und Rest 89 der Beta-Kette, - Rest 52 der Alpha-Kette und Rest 85 der Beta-Kette, - Rest 70 der Alpha-Kette und Rest 9 der Beta-Kette, - Rest 73 der Alpha-Kette und Rest 32 der Beta-Kette, - Rest 76 der Alpha-Kette und Rest 53 der Beta-Kette, - Rest 82 der Alpha-Kette und Rest 31 der Beta-Kette, - Rest 8 der Alpha-Kette und Rest 139 der Alpha-Kette, - Rest 13 der Alpha-Kette und Rest 66 der Alpha-Kette, - Rest 13 der Alpha-Kette und Rest 67 der Alpha-Kette, - Rest 20 der Alpha-Kette und Rest 63 der Alpha-Kette, - Rest 22 der Alpha-Kette und Rest 59 der Alpha-Kette, - Rest 34 der Alpha-Kette und Rest 56 der Alpha-Kette, - Rest 34 der Alpha-Kette und Rest 59 der Alpha-Kette, - Rest 38 der Beta-Kette und Rest 54 der Beta-Kette, - Rest 38 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette, - Rest 42 der Beta-Kette und Rest 75 der Beta-Kette, - Rest 47 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette, und - Rest 49 der Beta-Kette und Rest 58 der Beta-Kette, und wobei die Positionen der Reste gemäß der einheitlichen IMGT-Nummerierung angegeben sind.
  4. Synthetisches MHC-Klasse-II-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das MHC-Klasse-II-Protein a) peptidbeladen oder b) peptidfrei ist, vorzugsweise peptidfrei ist.
  5. Synthetisches MHC-Klasse-II-Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das MHC-Klasse-II-Protein eine vollständige Alpha-Kette und/oder eine vollständige Beta-Kette umfasst.
  6. Synthetisches MHC-Klasse-II-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das MHC-Klasse-II-Protein nur einen extrazellulären Abschnitt einer Alpha-Kette und einen extrazellulären Abschnitt einer Beta-Kette umfasst.
  7. MHC-Klasse-II-Protein-Multimer, umfassend mindestens zwei, drei oder vier synthetische MHC-Klasse-II-Proteine nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
  8. Kit, umfassend mindestens ein synthetisches MHC-Klasse-II-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder mindestens ein MHC-Klasse-II-Protein-Multimer nach Anspruch 7.
  9. Kit nach Anspruch 8, wobei das mindestens eine synthetische MHC-Klasse-II-Protein oder MHC-Klasse-II-Protein-Multimer auf einem festen Träger immobilisiert ist, bevorzugt an eine Oberfläche des Trägers adsorbiert oder chemisch gekoppelt ist.
  10. Kit nach Anspruch 9, wobei mehrere verschiedene erfindungsgemäße synthetische MHC-Klasse-II-Proteine oder erfindungsgemäße MHC-Klasse-II-Protein-Multimere in der Art eines Protein-Arrays auf demselben Träger immobilisiert, vorzugsweise an eine gemeinsame Oberfläche des Trägers adsorbiert oder chemisch gekoppelt sind.
  11. Kit nach einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei der feste Träger eine feste Phase, vorzugsweise eine Chromatographiematrix ist.
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