CN107149673A - 神经营养因子cdnf在制备缺血性脑血管疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及神经营养因子保守性多巴胺能神经营养因子(cerebral dopamine neurotrophic factor，CDNF)在制备缺血性脑血管疾病药物中的应用。发明人首次发现CDNF具有减少皮层缺血面积，改善恢复动物运动能力的功能，进而发现CDNF对神经元和神经胶质细胞的保护作用不是通过内质网应激通路调控的。可以将CDNF设计为靶向药物来预防治疗缺血性脑卒中，对缺血性脑卒中临床预防治疗有着潜在的巨大应用价值，并且为进一步研究CDNF的生物学功能奠定了基础。

Description

神经营养因子CDNF在制备缺血性脑血管疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及神经营养因子保守性多巴胺能神经营养因子(cerebral dopamineneurotrophic factor，CDNF)在制备缺血性脑血管疾病药物中的应用，特别涉及一种新型神经营养因子CDNF在制备防治局灶性脑缺血药物中的应用，属于缺血性脑卒中药物技术领域。

背景技术

神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)是机体产生的能够促进神经细胞存活、生长、分化的一类多肽或蛋白质因子，它不仅在发育过程中调节神经元的存活，而且能阻止成熟神经元损伤后的死亡，促进神经元的修复、轴突再生、调节突触可塑性和神经递质传递等神经系统保护功能。现在已知的神经营养因子包括：神经生长因子(nerve growthfactor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)、神经营养素(neurotrophin-4，NT-4)、胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)等。不同的神经营养因子作用于不同特异类型的神经元亚群。由于神经营养因子对神经元的营养作用，它们不仅是神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默氏病、侧索硬化，而且是神经外伤如脊髓损伤的潜在治疗因子。

如中国专利文献CN1394962A(申请号01120212.2)涉及利用工程菌甲醇酵母(Pichia pastoris)生产制备人脑源性神经营养因子BDNF，以及在制备治疗维持和促进外周神经嵴和基板来源的多种感觉神经元的发育、生长和分化，神经中枢基底前脑、胆碱能神经元、GABA能神经元、中脑黑质多巴胺能神经元和一些如早老性痴呆、帕金森病、外周神经损伤等神经性疾病药物中的应用。

最近，科研人员又发现了一种新的神经营养因子CDNF。其蛋白典型的特征是含有8个半胱氨酸残基，其间隔排列从脊椎动物到无脊椎动物是保守的。作为分泌蛋白，人来源的CDNF中包含有一个潜在的N-连接糖基化位点，在瞬时过表达细胞中分泌的CDNF有糖基化和非糖基化2种形式，而小鼠来源的CDNF没有潜在的N-连接或O-连接糖基化位点。

在真核细胞中，内质网负责蛋白质合成、修饰和分泌。当细胞受到某些因素的刺激后，一些蛋白无法进行糖基化修饰，不能折叠或错误折叠并滞留在内质网内，从而引起内质网应激(ERS)。内质网应激会激活细胞内信号转导通路即未折叠蛋白反应(UPR)，UPR能增加蛋白折叠能力和折叠错误蛋白的降解，从而来减少内质网应激。适度的内质网应激反应对细胞具有保护作用，但持续或较强的内质网应激则可激活凋亡通路而诱发细胞凋亡。内质网应激的中期效应主要是内质网应激蛋白的表达上调，这些蛋白具有促进ER未折叠与错误折叠蛋白恢复正常构象、维持内质网和胞质内钙平衡、对抗氧化应激的作用，有助于减轻内质网应激。

脑卒中可以引起内质网应激。脑卒中是临床最常见的疾病之一，具有发病率、致残率和病死率高的特点，严重威胁着人类的健康，其中缺血性脑卒中占全部卒中的70％～80％。由于脑卒中与帕金森病、阿尔茨海默氏病、侧索硬化等疾病的致病机理不同，且目前临床上无有效的方法对此治疗痊愈，神经功能的重建恢复仍是缺血性脑卒中治疗的难题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种神经营养因子CDNF在制备缺血性脑血管疾病药物中的应用，具体涉及CDNF的生物学功能研究及对脑损伤的神经保护作用，可用于制备缺血性脑血管疾病治疗药物。

本发明技术方案如下：

一种神经营养因子CDNF在制备缺血性脑血管疾病药物中的应用。

根据本发明优选的，所述缺血性脑血管疾病为脑卒中。

根据本发明优选的，所述的药物剂型为注射剂。

有益效果

1、本申请发明人通过研究发现，虽然CDNF是分泌蛋白，但CDNF的有C末段序列RTDL和KTEL与典型的内质网滞留信号KDEL序列非常相似，发明人通过在大脑中动脉闭塞造成的局灶性脑缺血再灌注模型中研究了CDNF的神经保护作用及其在内质网应激中的作用，阐明了CDNF在缺血性脑卒中的神经保护作用不是通过内质网应激通路调控的及在脑缺血模型中CDNF具有显著的神经保护作用；

2、本申请公开了CDNF不同与其他营养因子如中脑胶质源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)的作用机制，为缺血性脑卒中临床预防治疗提供了新的靶向药物，证明了CDNF在缺血性脑卒中临床预防治疗中潜在的巨大应用，并且为进一步研究新型神经营养因子CDNF的生物学功能奠定了基础。

附图说明

图1A、制作大脑动脉闭塞模型及脑内皮层显微注射CDNF的动物实验操作流程图；

图1B、大脑动脉闭塞模型的脑内皮层注射CDNF和PBS的皮层缺血范围柱状图；

图1C、大脑动脉闭塞模型的脑内皮层注射CDNF和PBS的脑切片缺血范围的曲线图；

图1D、大脑动脉闭塞模型的脑内皮层注射CDNF和PBS后TCC染色的脑切片照片；

图中，切片从左向右按顺序排列代表脑从前向后的方向，刻度：10mm；

图2A、脑内皮层注射CDNF和PBS后，二者Bederson评分的柱状图；

图2B、脑内皮层注射CDNF和PBS后，缺血皮层caspase-3阳性细胞数目的柱状图；

图3A、CDNF和NGF处理的神经元细胞进行氧糖剥夺实验的细胞存活率柱状图；

图3B、CDNF和NGF处理的传代3-4次的星形神经胶质细胞进行氧糖剥夺实验的细胞存活率柱状图；

图4A、脑缺血再灌注24小时后免疫组织化学双重染色结果照片；其中：标尺45μm；

图4B、脑缺血再灌注24小时后免疫组织化学双重染色结果照片；其中：标尺45μm；

图5、Western Blot显示不同脑缺血再灌注时间的皮层缺血区域CDNF的表达变化结果；

图6A、内质网应激化学诱导剂衣霉素处理体外培养的神经元后双重荧光免疫细胞化学染色结果；

图6B、内质网应激化学诱导剂衣霉素处理体外培养的神经元后Western Blot检测结果，Tuni是衣霉素的缩写。

具体实施方式

下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

本发明在大鼠局灶性脑缺血再灌注模型中通过脑内皮层显微注射的方法，研究了CDNF对缺血性脑卒中及体外氧糖剥夺模型中的神经保护作用，同时，还在脑缺血模型及体外的内质网应激诱导模型中研究了CDNF的表达水平及其在内质网应激中的作用。从而促成了本发明。

实施例1:脑内皮层显微注射CDNF预处理对局灶性脑缺血再灌注的神经保护作用

1、脑内显微注射及建立线栓法大鼠局灶性脑缺血再灌注模型：动物实验流程如图1A所示。Sprague-Dawley大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)腹腔注射10％的水合氯醛后，将鼠脑固定于脑立体定位仪上，切开颅顶部皮肤，暴露颅骨，以颅骨面人字缝尖为体表标志，用微量加样器抽取PBS及6μg CDNF按照文献方法(J Cereb Blood FlowMetab,1999,19(12):1329-1335)注入左侧大脑皮层，20分钟后制作MCAO模型。

取体重300±5g的SD大鼠，腹腔注射10％的水合氯醛(0.3～0.4ml/100g体重)后，仰卧固定于手术台上，沿颈部正中切口，钝性分离皮下组织，分离接扎左侧颈总动脉(CCA)，并沿CCA向上分离颈内动脉(ICA)与颈外动脉(ECA)的分叉处，结扎ECA近端。在颈总动脉交叉处剪一小口，将直径为0.25mm栓线从小口插入ICA约18.5±0.5mm，遇有轻微阻力，表明栓线穿过大脑中动脉起始端至近端，将大脑中动脉起始端阻塞，接扎颈内动脉备线。缝合切口，置线头于体外，再灌注时将栓线抽至颈内动脉起始部即可。缺血时间是2h，再灌注时间是2、4、6、12、24h，每个时间点8～10只动物。假手术对照组不插线，其余操作和实验组相同。

2.TCC染色显示梗死区域：缺血再灌注24h后将实验动物断头取脑，从前向后制备2mm厚的冠状切片，置于含2％2，3，5一三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazoliumchloride，TTC；购自美国Sigma公司)的生理盐水溶液中37℃恒温孵育30min，脑片中皮质梗死区不染色而呈现白色，未受损脑组织呈红色。4％多聚甲醛固定24h拍照。采用数码医学图像分析系统测定每片脑片的面积及梗死面积，并计算每片脑片的体积及梗死体积，PBS对照组皮层缺血体积比率是21.40±4.87％，CDNF预处理组皮层缺血体积比率显著减少至5.02±3.46％(P<0.05图1B，D)。为了进一步精确缺血范围，按从前向后的顺序将每张脑切片的缺血面积进行了测量，结果显示在CDNF组和PBS对照组比较发现CDNF可使每张脑切片中缺血面积cm²下降，特别是在第2张(8.96±7.53vs 31.66±6.89，P<0.05)，第3张(16.62±9.51vs38.70±8.82，P<0.05)及第4张(10.75±6.75vs 30.99±10.73，P<0.05，图1C)切片。这些结果提示CDNF预处理可以显著降低缺血皮层的梗死区域。

3.神经功能缺陷评分：根据Longa和Bederon的5分制评分方法，缺血2h再灌注24h后进行评分。其评分标准是：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展手术对侧前肢；2分，向对侧转圈；3分，向对侧倾斜；4分，不能自发行走，意识丧失。0分和4分的动物弃之不用。PBS对照组Bederson评分是2.2±0.45，而CDNF预处理组Bederson评分是1.33±0.52，与PBS组差异显著(P<0.05，图2A)。结果提示CDNF预处理可以显著降低神经功能缺陷评分，提示CDNF预处理可以恢复神经功能。

4.大脑皮层凋亡细胞检测：制作缺血再灌注模型后，缺血2小时再灌注24h后，将大鼠进行心脏灌流，然后断头取脑，用4％多聚甲醛固定过夜，梯度蔗糖溶液沉降，用冰冻切片包埋剂包埋组织进行系列冰冻切片，取冰冻切片通过免疫荧光组织化学染色方法显示大脑皮层中的caspase-3阳性细胞，caspase-3阳性细胞代表的是凋亡细胞。PBS对照组皮层中caspase-3阳性细胞比率是44.77±1.88％，而CDNF预处理组则显著降低了caspase-3阳性细胞比率为23.84±1.46％(P<0.05，图2B)，这提示CDNF预处理对皮层细胞具有保护作用。

实施例2:CDNF对体外培养的神经元和神经胶质细胞在氧糖剥夺实验中的神经保护作用

1.CCK-8试剂盒检测显示CDNF对体外培养的神经元的神经保护作用：取体外培养7天的神经元进行氧糖剥夺实验，用CCK-8试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)检测细胞存活率，结果显示OGD处理可使神经元细胞存活率降低到64.14±4.09％，而50ng/ml CDNF处理后可以使细胞存活率提高到72.81±4.97％，100ng/ml CDNF处理后可以使细胞存活率提高到80.69±4.21％，100ng/ml NGF处理后可以使细胞存活率提高到73.59±5.49％(图3A)，这些结果显示CDNF和NGF都能提高OGD处理神经元的细胞存活率，这提示CDNF对体外培养的神经元具有神经保护作用。

2.CCK-8试剂盒检测显示CDNF对体外培养的星形神经胶质细胞的神经保护作用：取传代3-4次的星形神经胶质细胞进行氧糖剥夺实验，用CCK-8试剂盒检测细胞存活率，结果显示OGD处理可使神经元细胞存活率降低到35.08±1.88％，而50ng/ml CDNF处理后可以使星形神经胶质细胞存活率提高到42.40±5.91％，100ng/ml CDNF处理后可以使细胞存活率提高到48.88±3.78％，100ng/ml NGF处理后可以使细胞存活率提高到53.60±4.41％(图3B)，这些结果显示CDNF和NGF都能提高OGD处理星形神经胶质细胞的细胞存活率，其中100ng/ml CDNF和100ng/ml NGF组和OGD组比较差异显著(图3B，P<0.05)。这提示CDNF对体外培养的星形神经胶质细胞具有神经保护作用。

实施例3:局灶性脑缺血再灌注对CDNF表达的影响

1.免疫组织化学方法检测CDNF在局灶性脑缺血再灌注模型的大脑皮层中的表达：缺血2小时再灌注24小时后，取冰冻切片做双重免疫荧光组织化学染色，结果显示在缺血侧皮层CDNF阳性细胞增多，而NeuN阳性的神经元数目明显下降(图4A)，GFAP阳性的星形胶质细胞数目也明显增加(图4B)，其中有些细胞是CDNF和NeuN双阳性的，有些细胞是CDNF和GFAP双阳性的。这提示在局灶性脑缺血再灌注皮层CDNF的表达上调，有些NeuN阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞都会分泌CDNF。

2.Western Blot检测CDNF在局灶性脑缺血再灌注模型的大脑皮层中的表达：缺血2小时再灌注0.5，2小时及缺血2小时再灌注4小时后，取大脑皮层缺血边缘区组织提蛋白做Western Blot，结果显示随着再灌注时间及缺血时间的延长，CDNF的表达水平变化不大(图5)。这提示局灶性脑缺血再灌注后，CDNF的表达不像其他内质网应激蛋白是以时间依赖性的方式变化的。

实施例4:体外培养神经元中应用内质网应激诱导剂检测CDNF的表达

1.双重荧光免疫细胞化学染色方法检测CDNF在衣霉素处理神经元中的表达：分别用2.5μg/ml和10μg/ml的衣霉素(内质网应激化学诱导剂)处理培养7天的神经元4小时，染色显示内质网应激标志物CHOP的表达上调，但是CDNF的表达变化不大(图6A)。这结果提示CDNF可能不是内质网应激蛋白。

2.Western Blot检测CDNF在在衣霉素处理神经元中的表达：2.5μg/ml衣霉素分别处理培养7天的神经元1，4小时，通过Western Blot显示内质网应激标志物CHOP的蛋白表达上调，但是CDNF的蛋白表达变化不显著(图6B)。这结果提示CDNF可能不是内质网应激蛋白。

对比例

CDNF和MANF组成了一类新型的进化保守的具有神经营养因子活性的蛋白家族，两种蛋白典型的特征是都含有8个半胱氨酸残基，其间隔排列从脊椎动物到无脊椎动物是保守的。二者在氨基酸组成结构上具有60％的同源性，并且都是分泌蛋白，人来源的CDNF中包含有一个潜在的N-连接糖基化位点，在瞬时过表达细胞中分泌的CDNF有糖基化和非糖基化2种形式，而小鼠来源的CDNF和人、鼠来源的MANF都没有潜在的N-连接或O-连接糖基化位点。尽管是分泌蛋白，研究发现部分地MANF停留在内质网内，MANF和CDNF分别有C末段序列RTDL和KTEL，它们和典型的内质网滞留信号KDEL序列非常相似，这提示MANF和CDNF可能在内质网中具有重要的功能。

目前研究证实MANF是内质网应激蛋白，MANF表达上调会帮助内质网内未折叠或折叠错误的蛋白折叠，从而来降低内质网应激，减少细胞死亡。在脑缺血模型中，MANF的表达增加，其通过内质网应激机制显著地降低缺血梗死面积和减少缺血部位的神经元死亡。而在细胞株中的实验结果显示CDNF的表达在内质网应激条件下没有上调变化，这提示内质网中CDNF的功能是以恒定型方式进行的。目前关于CDNF在内质网中的作用机制还不清楚。

发明人通过在大脑中动脉闭塞造成的局灶性脑缺血再灌注模型中研究了CDNF的神经保护作用及其在内质网应激中的作用，首次阐明了CDNF在缺血性脑卒中的神经保护作用不是通过内质网应激通路调控的及在脑缺血模型中CDNF具有显著的神经保护作用。从而证明，虽然CDNF和MANF结构类似，属于同一类蛋白家族，但是二者在脑缺血模型中实行神经保护的机制完全不相同。

Claims (3)

1.一种神经营养因子CDNF在制备缺血性脑血管疾病药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缺血性脑血管疾病为脑卒中。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物剂型为注射剂。