CN107849139B - 与人crth2特异性结合的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性地识别、结合人CRTH2的抗人CRTH2抗体、该抗体片段、编码该抗体的氨基酸序列的DNA、包含该DNA的载体、生产该抗体的杂交瘤和抗体生产细胞、该抗体的制造方法、包含该抗体或抗体片段的组合物、使用该抗体或抗体片段的过敏性疾病、自身免疫疾病、伴有嗜酸性粒细胞增多或功能亢进的疾病、伴有Th2细胞的增多或功能亢进的疾病等的治疗方法和诊断方法、以及包含该抗体或抗体片段的药物和诊断剂。

Description

与人CRTH2特异性结合的抗体
技术领域
本发明涉及特异性地识别、结合人CRTH2的抗人CRTH2抗体、该抗体片段、编码该抗体的氨基酸序列的DNA、包含该DNA的载体、生产该抗体的杂交瘤和抗体生产细胞、该抗体的制造方法、包含该抗体或抗体片段的组合物、使用该抗体或抗体片段的过敏性疾病、自身免疫疾病、伴有嗜酸性粒细胞增多或功能亢进的疾病、伴有Th2细胞的增多或功能亢进的疾病等的治疗方法和诊断方法、以及包含该抗体或抗体片段的药物和诊断剂。
背景技术
人CRTH2(Chemoattractant receptor-homologous molecule on Th2cells，Th2细胞趋化因子受体同源分子)是也以GPR44、CD294、DP2等别名为人所知的7次跨膜G蛋白偶联型受体(G protein-coupled receptor，以下记作GPCR)，已知其为针对前列腺素D2(以下记作PGD2)的受体之一(非专利文献1)。CRTH2在1996年作为人Th2特异性的蛋白质被克隆出来，将其称为B19而进行了公开(专利文献1)。
已知CRTH2与作为配体的PGD2和以13,14-二氢-15-酮前列腺素D2(以下记作DKPGD2)为代表的PGD2代谢物结合，在细胞内进行Gαi蛋白介导的信号转导，其结果，参与CRTH2表达细胞的迁移和活化(非专利文献1)。
人CRTH2在Th2细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和II型固有淋巴细胞(Type2innate lymphoid cells，以下记作ILC2)等中确认到表达(非专利文献1、2)。已经报道了CRTH2是特异性地表达于Th2细胞因子产生细胞的表面标志物(非专利文献3)。
另外，ILC2是在2011年于人体内鉴定出的与过敏应答相关的新细胞群体，作为规定该细胞的特异性的表面标志物，可以列举CRTH2(非专利文献2)。另外，有CRTH2表达于非典型单核细胞(nonclassical monocyte)、Th2/Th17细胞的报道(非专利文献4、5)。
已知在以哮喘为代表的过敏疾病中CRTH2表达细胞助长病情。已经报道了，在哮喘患者的支气管肺泡灌洗液中的细胞中，与正常人相比，高频率地确认到CRTH2阳性T细胞(非专利文献6)，并且报道了，在特应性皮炎中CRTH2阳性T细胞与严重度相关地增加(非专利文献7)。
嗜酸性粒细胞含有具有细胞毒性的颗粒蛋白质，该蛋白质的沉积可见于慢性支气管哮喘患者的呼吸道组织或特应性皮炎患者的病变部位等，因此认为，嗜酸性粒细胞在慢性支气管哮喘或特应性皮炎等过敏性疾病的病态形成中发挥着重要的作用(非专利文献8、9)。
嗜碱性粒细胞在细胞内存积组胺、白三烯等炎性分子，通过表达于细胞表面的Fcε受体、Fcγ受体的交联，释放出该分子，由此与过敏反应的诱发相关(非专利文献10)。
ILC2是存在于呼吸道粘膜、皮肤等局部的细胞，具有应答伴随组织损伤产生的白介素(以下记作IL)-25、IL-33等细胞因子而产生大量的Th2细胞因子的特性，认为其参与过敏疾病的病态形成(非专利文献11)。
作为针对CRTH2的单克隆抗体，有301108(R&D公司)在市售。另外已知有BM16(专利文献2)。这些抗体为啮齿类抗体，不是作为药品而进行开发的。
此外，已表明，与克隆19A2相关的基因重组嵌合抗体和人源化抗体通过效应子活性进行CRTH2表达细胞的除去；与克隆8B1相关的人源化抗体、与克隆3C12和31A5相关的小鼠抗体对CRTH2具有拮抗活性。
另外，已表明，与克隆19A2相关的抗体对人肥大细胞也具有反应性(专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3144805号公报
专利文献2：国际公开第97/46677号
专利文献3：国际公开第2014/144865号
非专利文献
非专利文献1：The Journal of Experimental Medicine,2001.193(2):p.255-261.
非专利文献2：Nature Immunology,2011.12(11):p.1055-1062.
非专利文献3：European Journal of Immunology,2000.30(10):p.2972-2979.
非专利文献4：Blood,2011.118(5):e16-31.
非专利文献5：Journal of Allergy and Clinical Immunology,2014.134(5):p.1175-1186.e7.
非专利文献6：Clinical&Experimental Immunology,2010.161(1):p.34-40.
非专利文献7：Journal of Investigative Dermatology,2002.119(3):p.609-616.
非专利文献8：Advances in Immunology,1986.39:p.177-253.
非专利文献9：Immunology Today,1992.13(12):p.501-507.
非专利文献10：Journal of Allergy and Clinical Immunology,2013.132(4):p.789-801.
非专利文献11：Journal of Allergy and Clinical Immunology,2014.134(3):p.671-678.
发明内容
发明所要解决的问题
迄今为止已经建立了多种人CRTH2抗体，但期望建立具有对各种人免疫细胞的反应性、对人CRTH2的特异性的结合活性、或者对人CRTH2配体依赖性活性的影响等所期望的活性的抗人CRTH2抗体。
本发明的目的在于提供通过识别、结合人CRTH2的特征性表位而具有所期望的活性的抗人CRTH2抗体、该抗体片段、编码该抗体的氨基酸序列的DNA、包含该DNA的载体、生产该抗体的杂交瘤和抗体生产细胞、该抗体的制造方法、包含该抗体或抗体片段的组合物、使用该抗体或抗体片段的过敏性疾病、自身免疫疾病、伴有嗜酸性粒细胞增多或功能亢进的疾病、伴有Th2细胞的增多或功能亢进的疾病等的治疗方法和诊断方法、以及包含该抗体或抗体片段的药物和诊断剂。
用于解决问题的方法
本发明涉及以下的(1)～(26)。
(1)一种抗体或该抗体片段，其识别、结合序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一者。
(2)如(1)所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为识别、结合选自由序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第12位的脯氨酸、第13位的异亮氨酸、第14位的亮氨酸、第15位的谷氨酸、第177位的天冬氨酸、第178位的甘氨酸、第179位的精氨酸、第180位的异亮氨酸、第181位的蛋氨酸、第182位的半胱氨酸、第183位的酪氨酸、第184位的酪氨酸、第185位的天冬酰胺、第186位的缬氨酸、第187位的亮氨酸、第188位的亮氨酸、第189位的亮氨酸、第195位的精氨酸、第196位的天冬氨酸、第197位的丙氨酸和第198位的苏氨酸组成的组中的至少一个氨基酸残基的抗体。
(3)如(1)或(2)所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为识别选自由以下的(a)～(g)组成的组中的至少一种情况的氨基酸残基的抗体。
(a)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第12位的脯氨酸、第14位的亮氨酸和第15位的谷氨酸、
(b)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第177位的天冬氨酸、第178位的甘氨酸和第179位的精氨酸、
(c)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第180位的异亮氨酸和第181位的蛋氨酸、
(d)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第183位的酪氨酸、第184位的酪氨酸和第185位的天冬酰胺、
(e)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第187位的亮氨酸、第188位的亮氨酸和第189位的亮氨酸、
(f)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第195位的精氨酸、以及
(g)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第196位的天冬氨酸和第198位的苏氨酸。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为选自由以下的(a)～(d)组成的组中的任意一种抗体。
(a)抗体重链可变区(以下简记为VH)的互补决定区(以下简记为CDR)1～3分别包含序列号20～22所表示的氨基酸序列、且抗体轻链可变区(以下简记为VL)的CDR1～3分别包含序列号23～25所表示的氨基酸序列的抗体；
(b)含有包含序列号49所表示的氨基酸序列或在序列号49所表示的氨基酸序列中导入有选自将第18位的亮氨酸置换为蛋氨酸、将第77位的天冬酰胺置换为丝氨酸、将第93位的缬氨酸置换为苏氨酸以及将第117位的苏氨酸置换为缬氨酸的改变中的至少一种改变的氨基酸序列的VH、以及包含序列号33所表示的氨基酸序列或在序列号33所表示的氨基酸序列中导入有选自将第2位的异亮氨酸置换为缬氨酸、将第4位的蛋氨酸置换为亮氨酸、将第15位的脯氨酸置换为亮氨酸以及将第85位的丙氨酸置换为脯氨酸的改变中的至少一种改变的氨基酸序列的VL的抗体；
(c)含有包含序列号49、51、53、55、57和59所表示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列的VH、以及包含序列号33、35、37、39、41、43、45和47所表示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列的VL的抗体；以及
(d)含有包含序列号17所表示的氨基酸序列的VH和包含序列号19所表示的氨基酸序列的VL的抗体。
(5)如(1)～(4)中任一项所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为具有选自由下述(a)～(h)组成的组中的至少一个特征的抗体。
(a)在人CRTH2的配体存在下对人CRTH2的反应性不降低；
(b)不具有中和活性；
(c)具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性；
(d)不与肥大细胞和Th1细胞中的至少一者反应；
(e)与选自嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、Th2细胞和II型固有淋巴细胞(ILC2)中的至少一种细胞反应；
(f)不具有激动活性；
(g)不增强基于人CRTH2的配体的信号；以及
(h)对活化状态或非活化状态的人CRTH2的反应性没有变化。
(6)如(1)～(5)中任一项所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为包含人Fc段的抗体。
(7)如(1)～(6)中任一项所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为单克隆抗体。
(8)如(1)～(7)中任一项所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为基因重组抗体。
(9)如(8)所述的基因重组抗体或该抗体片段，其中，基因重组抗体为选自人型嵌合抗体、人型CDR移植抗体和人抗体中的任意一种基因重组抗体。
(10)如(1)～(9)中任一项所述的抗体或该片段，其中，抗体为与猴CRTH2结合的抗体。
(11)如(1)～(10)中任一项所述的该抗体片段，其中，抗体片段为选自Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、双链抗体(diabody)、dsFv和包含CDR的肽中的任意一种抗体片段。
(12)一种杂交瘤，其产生(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段。
(13)一种DNA，其编码(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段。
(14)一种重组体载体，其含有(13)所述的DNA。
(15)一种转化株，通过将(14)所述的重组体载体导入宿主细胞中而得到。
(16)(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段的制造方法，其特征在于，将(12)所述的杂交瘤或(15)所述的转化株在培养基中进行培养，使(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段在培养物中生产蓄积，从该培养物中收集抗体或该抗体片段。
(17)一种人CRTH2相关疾病的治疗剂，其含有(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段作为有效成分。
(18)一种人CRTH2相关疾病的诊断剂，其含有(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段作为有效成分。
(19)如(17)或(18)所述的剂，其中，CRTH2相关疾病为过敏性疾病、自身免疫疾病、伴有嗜酸性粒细胞增多和功能亢进中的至少一者的疾病、伴有Th2细胞的增多和功能亢进中的至少一者的疾病、或者伴有II型固有淋巴细胞(ILC2)的增多和功能亢进中的至少一者的疾病。
(20)一种人CRTH2相关疾病的治疗方法，其包括给药有效量的(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段。
(21)一种人CRTH2相关疾病的诊断方法，其包括给药有效量的(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段。
(22)如(20)或(21)所述的方法，其中，人CRTH2相关疾病为过敏性疾病、自身免疫疾病、伴有嗜酸性粒细胞增多和功能亢进中的至少一者的疾病、伴有Th2细胞的增多和功能亢进中的至少一者的疾病、或者伴有ILC2的增多和功能亢进中的至少一者的疾病。
(23)如(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段，其用于人CRTH2相关疾病的治疗和诊断中的至少一者。
(24)如(23)所述的抗体或该抗体片段，其中，人CRTH2相关疾病为过敏性疾病、自身免疫疾病、伴有嗜酸性粒细胞增多和功能亢进中的至少一者的疾病、伴有Th2细胞的增多和功能亢进中的至少一者的疾病、或者伴有ILC2的增多和功能亢进中的至少一者的疾病。
(25)(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段在制造人CRTH2相关疾病的治疗剂和诊断剂中的至少一者中的应用。
(26)如(25)所述的应用，其中，人CRTH2相关疾病为过敏性疾病、自身免疫疾病、伴有嗜酸性粒细胞增多和功能亢进中的至少一者的疾病、伴有Th2细胞的增多和功能亢进中的至少一者的疾病、或者伴有ILC2的增多和功能亢进中的至少一者的疾病。
发明效果
根据本发明，提供识别、结合序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一者的抗体或该抗体片段等。
本发明的抗体与嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、Th2细胞、ILC2等表达CRTH2的细胞特异性地反应，即使在高浓度的配体存在下也显示出与CRTH2表达细胞的高反应性，并且不具有激动活性、中和活性和基于人CRTH2配体的信号增强活性。因此，本发明的抗体或该抗体片段能够发挥以表达CRTH2的嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、Th2细胞、ILC2等表达CRTH2的细胞为靶标的治疗效果。
附图说明
图1示出不包含信号序列的Lym2抗体轻链可变区和各人源化Lym2抗体轻链可变区(LV0、LV1、LV2a、LV2b、LV2c、LV3a、LV3b和LV4)的氨基酸序列。各序列中的被框包围的区域表示CDR序列。
图2示出不包含信号序列的Lym2抗体重链可变区和各人源化Lym2抗体重链可变区(HV0、HV1、HV2a、HV2b、HV3和HV4)的氨基酸序列。各序列中的被框包围的区域表示CDR序列。
图3(A)～(C)示出利用流式细胞术分析大鼠/人嵌合型Lym2抗体(以下有时记作chLym2)和人源化Lym2抗体对人嗜酸性粒细胞和人嗜碱性粒细胞的细胞毒活性的结果。图3(A)～(C)中，左侧的图示出对人嗜酸性粒细胞的细胞毒活性，右侧的图示出对人嗜碱性粒细胞的细胞毒活性。各图中，纵轴表示每2000个对照微珠的各细胞的个数，横轴表示抗体浓度。图3(A)○表示chLym2、●表示人源化Lym2抗体LV0HV0、△表示同种型对照抗体。图3(B)○表示chLym2、■表示人源化Lym2抗体LV0HV1、△表示同种型对照抗体。图3(C)○表示chLym2、▲表示人源化Lym2抗体LV0HV2a、△表示同种型对照抗体。
图4(A)示出人源化Lym2抗体LV0HV1对各人CRTH2氨基酸置换体表达细胞的反应性，图4(B)示出chLym2对各人CRTH2氨基酸置换体表达细胞的反应性。各图中，纵轴表示：关于以Azami-Green标签的荧光强度对各抗人CRTH2单克隆抗体的荧光强度进行了校正后的相对荧光强度，将对于野生型人CRTH2表达细胞的反应性的值设为100％时，对于各氨基酸置换体表达细胞的反应性的值(％)。横轴中，WT表示野生型人CRTH2，除此以外表示氨基酸置换体的种类。*是指与野生型CRTH2的相对荧光强度相比观察到90％以上的相对荧光强度的降低。以下，图5～图7也是同样。
图5(A)示出hu19A2v52对各CRTH2氨基酸置换体的反应性，图5(B)示出hu8B1v1对各CRTH2氨基酸置换体的反应性。
图6(A)示出ch3C12对各CRTH2氨基酸置换体的反应性，图6(B)示出ch31A5对各CRTH2氨基酸置换体的反应性。
图7示出BM16对各CRTH2氨基酸置换体的反应性。
图8示出利用流式细胞术分析抗人CRTH2单克隆抗体对人嗜酸性粒细胞的反应性的结果。●表示Lym2抗体、○表示BM16、▲表示301108，纵轴表示荧光强度，横轴表示各抗人CRTH2单克隆抗体的抗体浓度。
图9示出利用流式细胞术分析chLym2对人嗜碱性粒细胞的反应性的结果。涂满的部分表示同种型对照抗体的反应性，由实线包围的部分表示chLym2的反应性，纵轴表示细胞数，横轴表示荧光强度。
图10示出利用流式细胞术分析人源化Lym2抗体LV0HV1对人CD4阳性T细胞的反应性的结果。利用Forward scatter(前向散射，以下记作FSC)-Side scatter(侧向散射，以下记作SSC)展开对淋巴细胞进行分级分离，对于进一步以CD3阳性且CD4阳性细胞进行了分级分离的细胞群，将利用人源化Lym2抗体LV0HV1进行荧光染色的荧光强度和利用CD4抗体进行荧光染色的荧光强度分别示于纵轴和横轴。
图11(A)和图11(B)示出利用流式细胞术分析抗人CRTH2单克隆抗体对人嗜酸性粒细胞和人嗜碱性粒细胞的细胞毒活性的结果。上部表示对人嗜酸性粒细胞的细胞毒活性，下部表示对人嗜碱性粒细胞的细胞毒活性。各图中，纵轴表示每1000个对照微珠的各细胞的个数，横轴表示抗体浓度。○表示人源化Lym2抗体LV0HV1、□表示hu19A2v52、▲表示hu8B1v1、△表示ch3C12、◆表示ch31A5、×表示同种型对照抗体。
图12(A)和图12(B)示出分析抗人CRTH2单克隆抗体的人Th2和Th1细胞因子减少活性的结果。图12(A)中将添加了各抗体时的Th2细胞因子IL-5或IL-13的浓度示于纵轴。另外，图12(B)中将添加了各抗体时的Th1细胞因子IFN-γ的浓度示于纵轴。
图13(A)～图13(C)示出使用人CRTH2表达293EBNA细胞，利用流式细胞术分析在作为CRTH2配体的DKPGD2存在下的抗人CRTH2单克隆抗体的反应性变化的结果。将图例中所示的抗人CRTH2单克隆抗体的浓度为0.3μg/mL、1μg/mL和3μg/mL时的结果分别示于图13(A)、图13(B)和图13(C)。各图中，纵轴表示将不存在DKPGD2的情况下的荧光强度设为100％时的荧光强度的比例。
图14示出利用流式细胞术分析抗人CRTH2单克隆抗体对通过IgE和交联抗体处理进行了刺激的人分化诱导肥大细胞的反应性的结果。各图中，示出了在图的上部所示的抗体的反应性，纵轴表示细胞数，横轴表示荧光强度。涂满的部分表示同种型对照抗体的反应性，由实线包围的部分表示抗人CRTH2单克隆抗体的反应性。
图15示出利用流式细胞术分析抗人CRTH2单克隆抗体对人分化诱导Th1细胞的反应性的结果。各图中，示出了在图的上部所示的抗体的反应性，纵轴表示细胞数，横轴表示荧光强度。涂满的部分表示同种型对照抗体的反应性，由实线包围的部分表示抗人CRTH2单克隆抗体的反应性。
图16示出以人嗜酸性粒细胞的形态变化为指标的Lym2抗体的拮抗活性评价的结果。将在图的下部所示的各抗体的存在下或非存在下进行图例所示浓度的DKPGD2处理时，在流式细胞仪分析中的高FSC区检测出的嗜酸性粒细胞的比例(％)示于纵轴。
图17示出以人嗜酸性粒细胞的形态变化为指标的Lym2抗体的激动活性评价的结果。将进行图例所示浓度的Lym2抗体处理时在高FSC区检测出的嗜酸性粒细胞的比例(％)示于纵轴。
图18(A)～图18(C)均示出以人嗜酸性粒细胞的形态变化为指标的抗人CRTH2单克隆抗体的激动活性、拮抗活性和基于配体的活化增强活性的评价结果。图18(A)示出关于人源化抗体或嵌合抗体的结果，图18(B)示出关于大鼠抗体的结果，图18(C)示出关于小鼠抗体的结果。各图中，纵轴表示在DKPGD2的存在或非存在下进行图例所示的各抗人CRTH2单克隆抗体或同种型抗体处理时在流式细胞仪分析中的高FSC区检测出的嗜酸性粒细胞的比例(％)。
图19示出利用ELISA法分析对CRTH2表达细胞的膜级分的GTPγS或GDP处理所带来的CRTH2的构象的变化对CRTH2单克隆抗体的反应性造成的影响的结果。纵轴表示将未进行GTPγS和GDP处理时的吸光度设为1时的倍数变化(Fold change)。横轴表示GTPγS和GDP处理的有无以及评价抗体(hu19A2v52和人源化Lym2抗体LV0HV1)。
图20示出利用流式细胞术分析Azami-Green融合人CRTH2表达CHO/DG44细胞和食蟹猴CRTH2表达CHO/DG44细胞中的Azami-Green的表达的结果。纵轴表示细胞数，横轴表示Azami-Green的荧光强度。涂满的部分表示作为亲代细胞的CHO/DG44细胞中的荧光强度，由实线包围的部分表示Azami-Green融合人CRTH2表达CHO/DG44细胞中的荧光强度，由虚线包围的部分表示Azami-Green融合食蟹猴CRTH2表达CHO/DG44细胞中的荧光强度。
图21示出利用流式细胞术分析人源化Lym2抗体LV0HV1和同种型抗体对Azami-Green融合人CRTH2表达CHO/DG44细胞和食蟹猴CRTH2表达CHO/DG44细胞的反应性的结果。○表示LV0HV1对Azami-Green融合人CRTH2表达CHO/DG44细胞的反应性，●表示LV0HV1对Azami-Green融合食蟹猴CRTH2表达CHO/DG44细胞的反应性，△表示同种型抗体对Azami-Green融合人CRTH2表达CHO/DG44细胞的反应性，▲表示同种型抗体对Azami-Green融合食蟹猴CRTH2表达CHO/DG44细胞的反应性，纵轴表示荧光强度，横轴表示各抗体的抗体浓度。
具体实施方式
作为本发明中的人CRTH2，可以列举包含序列号2或GenBank登记号BAA74518所表示的氨基酸序列的多肽。包含在序列号2或GenBank登记号BAA74518所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加一个以上的氨基酸而得到的氨基酸序列且具有人CRTH2的功能的多肽、以及包含与序列号2或GenBank登记号BAA74518所表示的氨基酸序列具有60％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选98％以上的同源性的氨基酸序列且具有人CRTH2的功能的多肽也包含在本发明中的人CRTH2中。
具有在序列号2或GenBank登记号BAA74518所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加一个以上的氨基酸而得到的氨基酸序列的多肽可以通过使用定点诱变法[Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编)，约翰威利父子出版社(1987-1997)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；Nucleic AcidsResearch,13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等，在例如编码具有序列号2所表示的氨基酸序列的多肽的DNA中导入定点突变而得到。缺失、置换或添加的氨基酸的数量没有特别限定，优选为一个～几十个、例如1～20个，更优选为一个～几个、例如1～5个氨基酸。
作为编码人CRTH2的基因，可以列举GenBank登记号AB008535或序列号1所表示的碱基序列。含有包含在GenBank登记号AB008535或序列号1所表示的碱基序列中缺失、置换或添加一个以上的碱基而得到的碱基序列且编码具有人CRTH2的功能的蛋白质的DNA的基因；含有包含与GenBank登记号AB008535或序列号1所表示的碱基序列具有至少60％以上的同源性的碱基序列、优选具有80％以上的同源性的碱基序列、进一步优选具有95％以上的同源性的碱基序列且编码具有人CRTH2的功能的多肽的DNA的基因；以及含有包含在严格的条件下与具有序列号1所表示的碱基序列的DNA杂交的DNA且编码具有人CRTH2的功能的多肽的DNA的基因等也包含在本发明的编码CRTH2的基因中。
作为在严格的条件下杂交的DNA，是指通过使用具有序列号1所表示的碱基序列的DNA作为探针的菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern印记杂交法或DNA微阵列法等得到的能够杂交的DNA。
具体而言，可以列举能够通过如下方法进行鉴定的DNA：使用固定有来源于杂交的菌落或噬菌斑的DNA、或者具有该序列的PCR产物或寡聚DNA的滤膜或载玻片，在0.7～1.0mol/L的氯化钠存在下在65℃下进行杂交[Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，约翰威利父子出版社(1987-1997)；DNA Cloning 1：Core Techniques，A Practical Approach(DNA克隆I：核心技术实用方法)，第二版，牛津大学出版社(1995)]后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成由150mmol/L氯化钠、15mmol/L柠檬酸钠构成)，在65℃的条件下对滤膜或载玻片进行清洗。
作为能够杂交的DNA，可以列举与GenBank登记号AB008535或序列号1所表示的碱基序列具有至少60％以上的同源性的DNA、优选具有80％以上的同源性的DNA、进一步优选具有95％以上的同源性的DNA。
编码真核生物的蛋白质的基因的碱基序列常常可以确认到基因的多态性。在本发明中使用的基因内由于这种多态性使碱基序列产生小规模突变而得到的基因也包含在本发明的编码人CRTH2的基因中。
除了特别说明的情况以外，本发明中的同源性的数值可以是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序算出的数值，对于碱基序列，可以列举使用BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中默认的参数算出的数值等，对于氨基酸序列，可以列举使用BLAST2[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997)、Genome Res.,7,649(1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中默认的参数算出的数值等。
作为默认的参数，G(起始空位罚分，Cost to open gap)在碱基序列的情况下为5、在氨基酸序列的情况下为11；-E(空位延伸罚分，Cost to extend gap)在碱基序列的情况下为2、在氨基酸序列的情况下为1；-q(核苷酸错配罚分，Penalty for nucleotidemismatch)为-3；-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)为1；-e(期望值，expect value)为10；-W(字长大小，wordsize)在碱基序列的情况下为11个残基、在氨基酸序列的情况下为3个残基；-y[非空位延伸下降的阈值，Dropoff(X)for blast extensionsin bits]在blastn的情况下为20、在blastn以外的程序中为7；-X(空位比对的下降阈值，Xdropoff value for gapped alignment in bits)为15；-Z(最终空位比对的下降值，finalX dropoff value for gapped alignment in bits)在blastn的情况下为50、在blastn以外的程序中为25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
包含序列号2或GenBank登记号BAA74518所示的氨基酸序列的部分序列的多肽可以通过本领域技术人员公知的方法来制作。例如，可以通过使编码序列号2所表示的氨基酸序列的DNA的一部分缺失并对导入有包含上述DNA的表达载体的转化体进行培养来制作。另外，可以基于利用上述方法制作的多肽或DNA，利用与上述同样的方法，得到具有在序列号2或GenBank登记号BAA74518所示的氨基酸序列的部分序列中缺失、置换或添加一个以上的氨基酸而得到的氨基酸序列的多肽。此外，包含序列号2或GenBank登记号BAA74518所示的氨基酸序列的部分序列的多肽、或者具有在序列号2或GenBank登记号BAA74518所示的氨基酸序列的部分序列中缺失、置换或添加一个以上的氨基酸而得到的氨基酸序列的多肽也可以通过芴甲氧羰基(Fmoc)法、叔丁氧羰基(tBoc)法等化学合成法来制造。
作为人CRTH2的功能，可以列举通过与其配体例如PGD2的结合，进行人CRTH2依赖性的细胞内信号转导，诱导表达人CRTH2的细胞的迁移、来自该细胞的细胞因子产生亢进、或者伴有细胞径、细胞表面积等的变化的细胞形态变化等。
作为人CRTH2的细胞外区域，可以列举包含序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第1～33位的氨基酸残基的N末端区域、包含第95～111位的氨基酸残基的环1区域、包含第169～206位的氨基酸残基的环2区域和包含第264～285位的氨基酸残基的环3区域[JImmunol,1999.162(3):p.1278-86.]。作为N末端区域、环1区域、环2区域和环3区域，具体而言，可以列举分别包含序列号2所表示的氨基酸序列中的第1～33位、第95～111位、第169～206位和第264～285位的氨基酸残基的多肽部分。
作为本发明中的抗体，可以是单克隆抗体、多克隆抗体等中的任意一种抗体，优选列举单克隆抗体。作为本发明的抗体，具体而言，可以列举由杂交瘤产生的抗体或利用基因重组技术产生的基因重组抗体。另外，作为基因重组抗体，可以列举例如利用基因重组技术制作的小鼠抗体、大鼠抗体、人型嵌合抗体、人源化抗体和人抗体等。
单克隆抗体是指单一克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体，其识别唯一的表位(也称为抗原决定簇)，构成单克隆抗体的氨基酸序列(一级结构)是相同的。
作为本发明中的单克隆抗体，可以列举由杂交瘤生产的抗体、或者由利用包含抗体基因的表达载体进行了转化的转化体生产的抗体等利用基因重组技术制作的基因重组抗体。
多克隆抗体是指含有两种以上的单克隆抗体的抗体群，可以利用构成该抗体群的多种抗体识别多个表位。
作为本发明中的表位，可以列举单克隆抗体所识别、结合的单一的氨基酸序列和由氨基酸序列构成的立体结构、以及通过翻译后修饰进行了修饰的氨基酸序列和由该氨基酸序列构成的立体结构等。
作为通过翻译后修饰进行了修饰的氨基酸序列，可以列举结合有糖链键合于具有OH取代基的苏氨酸和丝氨酸上的O键合型糖链、糖链键合于具有NH2取代基的谷氨酰胺和天冬酰胺上的N键合型糖链、以及硫酸分子键合于具有OH取代基的苏氨酸上的硫酸基等的氨基酸序列。
本发明的抗体所识别的人CRTH2的表位可以通过使用使人CRTH2的一部分结构域缺失而得到的缺陷体、使人CRTH2的一部分氨基酸残基置换为其他氨基酸残基而得到的突变体、置换为来自于其他蛋白质的结构域而得到的突变体以及人CRTH2的部分肽片段等进行抗体的结合实验来确定。另外，本发明的抗体所结合的人CRTH2的表位可以通过向利用蛋白分解酶进行了消化的人CRTH2中添加本发明的抗体并使用已知的质谱分析法进行表位定位(epitope mapping)来确定。
作为本发明的抗体所识别的人CRTH2的表位中含有的氨基酸残基，可以列举例如通过该氨基酸残基的置换而使本发明的抗体的反应性消失的氨基酸残基。
本发明中的抗体的反应性例如可以通过使用流式细胞术等测定抗体对表达野生型人CRTH2受体或氨基酸置换体的细胞的结合量(根据野生型和置换体的表达量进行校正)来求出。另外，抗体的结合量可以通过使用固相夹心法等的放射免疫分析、针对人CRTH2的使用酶联免疫测定法(ELISA)等的公知的免疫学检测法、或者使用Biacore系统(GEHealthcare公司)等的表面等离子共振等的方法进行确认。
另外，也可以将公知的免疫学检测法[Monoclonal Antibodies-Principles andPractice，第三版，学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)；单克隆抗体实验手册，讲谈社Scientific(1987)]等组合来进行确认。
本发明中的抗体的反应性消失是指，与抗体对表达野生型人CRTH2的细胞的反应性相比，抗体对表达氨基酸置换体的细胞的反应性降低70％以上、优选降低80％以上，更优选降低90％以上，进一步优选降低95％以上。
作为本发明的抗体所结合的表位，可以列举包含序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一个氨基酸残基的表位。
另外，作为本发明的抗体所结合的表位，具体而言，可以列举下述的(a)～(c)的表位。
(a)包含序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸的表位、
(b)包含序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第194位的天冬氨酸的表位、
(c)包含序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸的表位。
另外，作为本发明的抗体所结合的表位，可以列举包含序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一个氨基酸残基且包含选自由序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第12位的脯氨酸、第14位的亮氨酸、第15位的谷氨酸、第177位的天冬氨酸、第178位的甘氨酸、第179位的精氨酸、第180位的异亮氨酸、第181位的蛋氨酸、第183位的酪氨酸、第184位的酪氨酸、第185位的天冬酰胺、第187位的亮氨酸、第188位的亮氨酸、第189位的亮氨酸、第195位的精氨酸、第196位的天冬氨酸和第198位的苏氨酸组成的组中的至少一个氨基酸残基的表位。
另外，作为本发明的抗体所结合的表位，可以列举包含序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一个氨基酸残基且包含下述的(a)～(g)中的至少任意一种的表位。
(a)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第12位的脯氨酸、第14位的亮氨酸和第15位的谷氨酸、
(b)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第177位的天冬氨酸、第178位的甘氨酸和第179位的精氨酸、
(c)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第180位的异亮氨酸和第181位的蛋氨酸、
(d)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第183位的酪氨酸、第184位的酪氨酸和第185位的天冬酰胺、
(e)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第187位的亮氨酸、第188位的亮氨酸和第189位的亮氨酸、
(f)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第195位的精氨酸、以及
(g)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第196位的天冬氨酸和第198位的苏氨酸。
另外，作为本发明的抗体所结合的表位中含有的其他氨基酸残基，只要是在本发明的抗体与CRTH2结合时存在于序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列中且实质上进行识别和结合的氨基酸残基，则可以为任何氨基酸残基，具体而言，可以列举在立体结构上与选自由序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第12位的脯氨酸、第14位的亮氨酸、第15位的谷氨酸、第177位的天冬氨酸、第178位的甘氨酸、第179位的精氨酸、第180位的异亮氨酸、第181位的蛋氨酸、第183位的酪氨酸、第184位的酪氨酸、第185位的天冬酰胺、第187位的亮氨酸、第188位的亮氨酸、第189位的亮氨酸、第192位的甘氨酸、第194位的天冬氨酸、第195位的精氨酸、第196位的天冬氨酸和第198位的苏氨酸组成的组中的氨基酸残基邻近地存在的氨基酸残基、以及在一级序列上与选自选自由序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第12位的脯氨酸、第14位的亮氨酸、第15位的谷氨酸、第177位的天冬氨酸、第178位的甘氨酸、第179位的精氨酸、第180位的异亮氨酸、第181位的蛋氨酸、第183位的酪氨酸、第184位的酪氨酸、第185位的天冬酰胺、第187位的亮氨酸、第188位的亮氨酸、第189位的亮氨酸、第192位的甘氨酸、第194位的天冬氨酸、第195位的精氨酸、第196位的天冬氨酸和第198位的苏氨酸组成的组中的氨基酸的氨基酸残基邻近的氨基酸残基等。
抗体分子也称为免疫球蛋白(以下记作Ig)，人抗体根据分子结构的差异分类为IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM的同种型。也将氨基酸序列的同源性比较高的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4统称为IgG。
抗体分子由称为重链(Heavy chain，以下记作H链)和轻链(Light chain，以下记作L链)的多肽构成。另外，H链自N末端侧起由H链可变区(也记作VH)、H链恒定区(也记作CH)各区域构成，L链自N末端侧起由L链可变区(也记作VL)、L链恒定区(也记作CL)各区域构成。
CH按各亚类分别已知有α、δ、ε、γ和μ链。进一步，CH自N末端侧起由CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域、CH3结构域各结构域构成。结构域是指构成抗体分子的各多肽的功能性结构单元。另外，将CH2结构域和CH3结构域合并称为Fc段或简称为Fc。CL已知有Cλ链和Cκ链。
作为本发明的抗体中的CH，只要属于Ig则可以为任何CH，但优选IgG类的CH，进一步可以使用属于IgG类的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等亚类中的任意一种。
作为本发明的抗体中的CL的氨基酸序列，可以为人抗体的氨基酸序列或非人动物抗体的氨基酸序列中的任意一种，但优选人抗体的氨基酸序列的Cκ或Cλ。
本发明的抗体是识别、结合序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一个氨基酸残基的抗体。
作为本发明的抗体，具体而言，可以列举选自下述的(a)～(c)中的抗体。
(a)识别并结合序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸的抗体、
(b)识别并结合序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第194位的天冬氨酸的抗体、
(c)识别并结合序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸这两者的抗体。
另外，作为本发明的抗体，可以列举识别序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一个氨基酸残基、且识别、结合选自由序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第12位的脯氨酸、第14位的亮氨酸、第15位的谷氨酸、第177位的天冬氨酸、第178位的甘氨酸、第179位的精氨酸、第180位的异亮氨酸、第181位的蛋氨酸、第183位的酪氨酸、第184位的酪氨酸、第185位的天冬酰胺、第187位的亮氨酸、第188位的亮氨酸、第189位的亮氨酸、第195位的精氨酸、第196位的天冬氨酸和第198位的苏氨酸组成的组中的至少一个氨基酸残基的抗体。
另外，作为本发明的抗体，可以列举识别序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一个氨基酸残基、且识别并结合下述的(a)～(g)中的至少任意一种的抗体。
(a)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第12位的脯氨酸、第14位的亮氨酸和第15位的谷氨酸、
(b)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第177位的天冬氨酸、第178位的甘氨酸和第179位的精氨酸、
(c)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第180位的异亮氨酸和第181位的蛋氨酸、
(d)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第183位的酪氨酸、第184位的酪氨酸和第185位的天冬酰胺、
(e)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第187位的亮氨酸、第188位的亮氨酸和第189位的亮氨酸、
(f)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第195位的精氨酸、以及
(g)序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第196位的天冬氨酸和第198位的苏氨酸。
另外，作为本发明的抗体，具体而言，可以列举选自下述(a)～(d)中的抗体。
(a)VH的互补决定区(complementary determining region，CDR；以下简记为CDR)1～3的氨基酸序列分别包含序列号20、21和22所表示的氨基酸序列、且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号23、24和25所表示的氨基酸序列的抗体；
(b)与上述(a)所述的抗体竞争性地与人CRTH2结合的抗体；
(c)与包含上述(a)所述的抗体所结合的表位的表位结合的抗体；以及
(d)与和上述(a)所述的抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体。
本发明的上述(b)的抗体表示阻碍上述(a)的抗体与人CRTH2的结合的抗人CRTH2抗体。另外，本发明的上述(c)的抗体表示在将上述(a)所述的抗体作为第一抗体并且将第一抗体所结合的表位作为第1表位的情况下，与包含该第1表位的表位结合的抗体。
另外，作为本发明的抗体，具体而言，可以列举选自下述(a)～(c)中的抗体。
(a)含有包含序列号49所表示的氨基酸序列或者在序列号49所表示的氨基酸序列中导入有选自将第18位的亮氨酸置换为蛋氨酸、将第77位的天冬酰胺置换为丝氨酸、将第93位的缬氨酸置换为苏氨酸以及将第117位的苏氨酸置换为缬氨酸的改变中的至少一种改变的氨基酸序列的VH、以及包含序列号33所表示的氨基酸序列或者在序列号33所表示的氨基酸序列中导入有选自将第2位的异亮氨酸置换为缬氨酸、将第4位的蛋氨酸置换为亮氨酸、将第15位的脯氨酸置换为亮氨酸以及将第85位的丙氨酸置换为脯氨酸的改变中的至少一种改变的氨基酸序列的VL的抗体；
(b)含有包含序列号49、51、53、55、57和59所表示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列的VH以及包含序列号33、35、37、39、41、43、45和47所表示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列的VL的抗体；以及
(c)含有包含序列号17所表示的氨基酸序列的VH以及包含序列号19所表示的氨基酸序列的VL的抗体。
作为上述(b)的抗体，优选列举选自以下(1)～(3)中的抗体。
(1)含有包含序列号49所表示的氨基酸序列的VH、以及包含序列号33、35、37、39、41、43、45和47所表示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列的VL的抗体；
(2)含有包含序列号59所表示的氨基酸序列的VH、以及包含序列号33、35、37、39、41、43、45和47所表示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列的VL的抗体；以及
(3)含有包含序列号51、53、55和57所表示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列的VH、以及包含序列号33所表示的氨基酸序列的VL的抗体。
作为上述(b)的抗体，特别是优选列举含有包含序列号51所表示的氨基酸序列的VH以及包含序列号33所表示的氨基酸序列的VL的抗体。
作为本发明的抗体，可以列举对于将人CRTH2的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一者置换为丙氨酸而得到的氨基酸置换体的反应性消失的抗体。
另外，本发明的抗体包含在人CRTH2的配体存在下对人CRTH2的反应性不降低的抗体。与在人CRTH2的配体存在下对人CRTH2的反应性降低的抗体相比，在人CRTH2的配体存在下对人CRTH2的反应性不降低的抗体即使在炎症局部那样以高浓度存在人CRTH2的配体的条件下，也能够显示出高反应性。因此，能够以不依赖人CRTH2配体的方式与人CRTH2特异性地结合，能够发挥出药效。
本发明中，在人CRTH2的配体存在下抗体的反应性降低是表示，与不存在人CRTH2的配体的情况下抗体对人CRTH2表达细胞的反应性相比，人CRTH2的配体存在下的该反应性降低至少5％以上。更严格来说，表示降低10％以上。
作为人CRTH2的配体，只要与人CRTH2特异性地结合则可以包含任意的配体，优选列举PGD2或DKPGD2。更优选列举DKPGD2。
本发明中，对活化状态或非活化状态的人CRTH2的反应性没有变化是指，在存在或不存在二磷酸鸟苷(GDP)或GDP类似物或者三磷酸鸟苷(GTP)或GTP类似物的情况下，抗体对人CRTH2的反应性没有变化。
作为GDP类似物，可以列举例如5’-O-(β-硫代)二磷酸鸟苷(GDPβS)。作为GTP类似物，可以列举例如5’-O-(γ-硫代)三磷酸鸟苷(GTPγS)。
本发明的抗体包含不具有中和活性的抗体、不具有激动活性的抗体、不增强基于人CRTH2的配体的信号的抗体、或者对活化状态或非活化状态的人CRTH2的反应性没有变化的抗体。
本发明中，抗体的中和活性是指抗体所具有的抑制人CRTH2的生物活性的活性。例如是指抑制人CRTH2与其配体的结合的活性、抑制基于人CRTH2的信号转导的活性等拮抗活性。
本发明中，激动活性是指模仿人CRTH2的配体的生物学活性的活性，是指诱导CRTH2的活化和伴随活化的各种反应的活性。作为本发明中的激动活性，具体而言，可以列举细胞迁移活性、细胞的形态变化诱导活性等。
本发明中，基于人CRTH2的配体的信号是指人CRTH2的配体与人CRTH2结合使人CRTH2活化所伴随的信号。
基于人CRTH2的配体的信号和激动活性可以通过分析人CRTH2的活化所伴随的各种反应来进行评价。例如，可以通过分析人CRTH2表达细胞的形态变化来进行评价。
作为人CRTH2表达细胞，只要表达人CRTH2则可以为任何细胞，可以列举例如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、Th2细胞、II型固有淋巴细胞(ILC2)、非典型单核细胞、Th2/Th17细胞等。
本发明中，抗体不增强基于人CRTH2的配体的信号是指，与人CRTH2的配体单独作用于人CRTH2时相比，在使人CRTH2的配体和抗体共同作用于人CRTH2时，不增强人CRTH2的活化和伴随该活化的各种反应。
本发明的抗体包含对人CRTH2表达细胞显示出细胞毒活性的抗体。作为本发明中的细胞毒活性，可以列举补体依赖性细胞毒活性(以下记作CDC活性)或者抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性(以下记作ADCC活性)等。
作为本发明中的CDC活性，可以列举如下反应：与细胞表面上的人CRTH2结合的抗体分子藉由Fc部分与补体系统的C1q结合，其结果，C1至C9各补体成分活化，最终C5至C9在细胞膜上形成被称为膜攻击复合物的孔形成聚合物，引起细胞溶解[ImmunolToday.1999Dec；20(12):576-82.]。
作为本发明中的ADCC活性，可以列举与细胞表面上的人CRTH2结合的抗体分子藉由Fc部分使表达Fc受体的例如自然杀伤细胞(以下记作NK细胞)等活化，由此，通过穿孔素、颗粒酶等细胞毒性分子的释放、吞噬作用的亢进等而产生的细胞毒反应[ChemicalImmunology,65,88(1997)；Immunol Today,20,576(1999)]。
本发明的抗体包含对肥大细胞不具有细胞毒性的抗体。这样的抗体具有不必担心由于肥大细胞的损伤所引起的炎性介质的游离而导致的副作用的优点。
本发明的抗体包含在抗体的Fc段上结合有N-糖苷结合糖链且在该N-糖苷结合糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺上未结合有岩藻糖的抗体。作为在抗体的Fc段上结合有N-糖苷结合糖链且在该N-糖苷结合糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺上未结合有岩藻糖的抗体，可以列举例如使用α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)制作的抗体。在抗体的Fc段上结合有N-糖苷结合糖链且在该N-糖苷结合糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺上未结合有岩藻糖的本发明的抗体具有高的ADCC活性。
本发明的抗体包含按照与Fc受体的结合活性提高的方式对抗体的Fc段的氨基酸残基进行了改变的抗体。作为按照与Fc受体的结合活性提高的方式对抗体的Fc段的氨基酸残基进行了改变的抗体，可以列举例如利用美国专利第7317091号说明书记载的方法制作的抗体分子。
本发明的抗体包含改变包含抗体可变区的多肽的表面电荷或在初级内体内的pH下的抗原结合活性而延长了血中半衰期的抗体。
作为改变包含抗体分子的可变区的多肽的表面电荷或在初级内体内的pH下的抗原结合活性而延长了血中半衰期的抗体，可以列举例如利用日本特开2013-165716号公报、日本特开2012-021004号公报记载的方法制作的抗体。
本发明的抗体包含人型嵌合抗体(以下也仅记作嵌合抗体)、人型CDR移植抗体(以下也仅记作人源化抗体)和人抗体等基因重组抗体。
嵌合抗体是指由人以外的动物(非人动物)的抗体的VH和VL与人抗体的CH和CL构成的抗体。作为非人动物，只要能够制作杂交瘤，可以使用小鼠、大鼠、仓鼠、兔等任何动物。
本发明的嵌合抗体可以通过下述方法来制造：获取编码与人CRTH2特异性地反应的人以外的动物的抗体的VH和VL的cDNA，分别插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中而构建嵌合抗体表达载体，导入动物细胞中进行表达。
人源化抗体是指将人以外的动物的抗体的VH和VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的适当位置而得到的抗体。
本发明的人源化抗体可以通过下述方法来制造：构建编码将与人CRTH2特异性地反应的人以外的动物的抗体的VH和VL的CDR移植到任意的人抗体的VH和VL的框架(以下记作FR)中而得到的可变区(以下也记作V区)的cDNA，分别插入到具有编码CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中而构建人源化抗体表达载体，将该表达载体导入动物细胞中进行表达。
作为人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列，只要是来源于人抗体的氨基酸序列则可以为任何氨基酸序列。例如，可以列举Protein Data Bank等数据库中登录的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列、或人抗体的VH和VL的FR的各亚群的共同氨基酸序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,1991)等。
在这些氨基酸序列中缺失、添加、置换或插入一个以上的氨基酸、且与人CRTH2特异性地结合、并且例如在细胞毒活性等生物活性方面具有同等功能的抗体或该抗体片段也包含在本发明的抗体中。
本发明的抗体包含与猴CRTH2结合的抗体。作为猴CRTH2，可以列举例如狨CRTH2、食蟹猴CRTH2和恒河猴CRTH2。优选列举食蟹猴CRTH2。
作为本发明的抗体，Fc与抗体片段结合而成的Fc融合蛋白、Fc与天然存在的配体或受体结合而成的Fc融合蛋白(也称为免疫粘附素)、使多个Fc段融合而成的Fc融合蛋白等也包含在本发明中。另外，为了使抗体稳定化或者为了控制血中半衰期而进行了氨基酸残基置换的包含氨基酸残基改变的改变Fc段等也可以用作本发明的抗体。
本发明中，抗体片段是指包含识别、结合序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一者的抗原结合结构域、且具有抗原结合活性的片段。作为本发明的抗体片段，可以列举Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(以下记作scFv)、双链抗体、dsFv和包含多个CDR的肽等。
Fab是将IgG用作为蛋白质分解酶的木瓜蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第224位的氨基酸残基处被切断)H链的N末端侧约一半与L链整体以二硫键结合而成的、分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的Fab可以通过将本发明的与人CRTH2特异性地结合的抗体用作为蛋白质分解酶的木瓜蛋白酶进行处理而得到。或者，可以通过将编码该抗体的Fab的DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中、将该载体导入原核生物或真核生物中进行表达来制造。
F(ab’)2是将IgG用作为蛋白质分解酶的胃蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第234位的氨基酸残基处被切断)比Fab藉由铰链区的二硫键结合而成的片段稍大的、分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的F(ab’)2可以通过将本发明的与人CRTH2特异性地结合的抗体用作为蛋白质分解酶的胃蛋白酶进行处理而得到。或者，可以使下述的Fab’进行硫醚键合或二硫键合来制作。
Fab’是将上述F(ab’)2的铰链区的二硫键切断而得到的、分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的Fab’可以通过将本发明的与人CRTH2特异性地结合的F(ab’)2组合物与还原剂二硫苏糖醇进行处理而得到。或者，可以通过将编码该抗体的Fab’片段的DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中、将该载体导入原核生物或真核生物中进行表达而制造。
scFv是使用由4个Gly和1个Ser残基构成的连接子(G4S)以任意个数连接而成的连接肽等适当的肽连接子(P)将一条VH与一条VL连接而得到的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，是具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的scFv可以通过下述方法来制造：获取编码本发明的与人CRTH2特异性地结合的抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入原核生物或真核生物中进行表达。
双链抗体是scFv形成二聚体而得到的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。二价抗原结合活性可以相同，也可以使一者为不同的抗原结合活性。
本发明的双链抗体可以通过下述方法来制造：获取编码本发明的与人CRTH2特异性地结合的抗体的VH和VL的cDNA，按照P的氨基酸序列的长度为8个残基以下的方式构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入原核生物或真核生物中进行表达。
dsFv是指将VH和VL中的各一个氨基酸残基置换为半胱氨酸残基、使所得的多肽藉由该半胱氨酸残基间的二硫键进行结合而成的片段。置换为半胱氨酸残基的氨基酸残基可以按照Reiter等所示的方法(Protein Engineering,7,697-704,1994)基于抗体的立体结构预测进行选择。
本发明的dsFv可以通过下述方法来制造：获取编码本发明的与人CRTH2特异性地结合的抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入原核生物或真核生物中进行表达。
包含CDR的肽含有VH或VL的CDR中的至少1个区域以上而构成。包含多个CDR的肽可以直接或藉由适当的肽连接子进行结合。
本发明的包含CDR的肽可以通过下述方法来制造：构建编码本发明的与人CRTH2特异性地结合的抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入原核生物或真核生物中进行表达。
另外，包含CDR的肽也可以利用Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。
在构成上述的抗体或该抗体片段的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加一个以上的氨基酸、且具有与上述的抗体或该抗体片段同样的活性的单克隆抗体或该抗体片段也包含在本发明的抗体或该抗体片段中。缺失、置换、插入或添加的氨基酸的数量为一个以上，其数量没有特别限定，为利用Molecular Cloning(分子克隆)、第2版；CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编)；Nucleic AcidsResearch,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；Nucleic Acids Research,13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等中记载的定点诱变法等公知技术能够缺失、置换或添加的程度的数量，例如为一个～数十个、优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个。
在本发明的人CRTH2或抗体的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了一个以上的氨基酸残基是指，在同一序列中的任意的一个或多个氨基酸序列中存在一个或多个氨基酸残基的缺失、置换、插入或添加，也可以同时发生缺失、置换、插入或添加，置换、插入或添加的氨基酸残基无论是天然型还是非天然型都可以。
作为天然型氨基酸残基，可以列举例如L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。
以下，示出能够相互置换的氨基酸残基的优选例。同一组中所含的氨基酸残基能够相互置换。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸
E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸
F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组：苯丙氨酸、酪氨酸
作为本发明的转化体，是将编码与人CRTH2特异性地结合的抗体分子的DNA导入宿主细胞中而得到的转化体，只要是生产本发明的抗体的转化体，则包含任何转化体。作为具体例，可以列举将编码与人CRTH2特异性地结合的抗体分子的DNA导入以下的(a)～(i)等的宿主细胞中而得到的转化体作为优选例。
(a)来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞；
(b)大鼠骨髓瘤细胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞；
(c)小鼠骨髓瘤细胞株NS0细胞；
(d)小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0-Ag14细胞；
(e)来源于叙利亚仓鼠肾脏组织的BHK细胞；
(f)产生抗体的杂交瘤细胞；
(g)人白血病细胞株那马瓦(Namalwa)细胞；
(h)胚胎干细胞；
(i)受精卵细胞。
另外，作为生产在抗体的Fc段上结合有N-糖苷结合糖链且在该N-糖苷结合糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺上未结合有岩藻糖的抗体的本发明的转化体，可以列举将编码与人CRTH2特异性地结合的抗体分子的DNA导入利用国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号中记载的方法制作的糖转移酶降低或缺陷的宿主细胞中而得到的转化体作为优选例。
作为本发明的抗体或该抗体片段的制造法，只要是对生产本发明的抗体或该抗体片段的转化体进行培养的制造方法，则可以包含任何抗体制造方法，作为优选例，可以列举下述的抗体或该抗体片段的制造方法：对生产本发明的抗体或该抗体片段的转化体进行培养，使抗体或该抗体片段在培养物中生成并蓄积，收集该抗体或该抗体片段，进行纯化。
利用上述制造法制造的抗体或该抗体片段也可作为本发明的抗体或该抗体片段被列举。
作为本发明的组合物，只要是包含本发明的抗体或该抗体片段的组合物，则可以为任何组合物，可以为包含与抗体结合的糖链单一的抗体分子的组合物、或包含具有多种糖链结构的抗体分子的组合物。另外，也可以为包含适当的添加剂、缓冲液等的组合物。作为本发明的组合物，优选列举含有本发明的抗体或该抗体片段作为有效成分的药物、诊断剂等。
作为本发明的药物或诊断剂，只要是含有本发明的抗体或该抗体片段作为有效成分的药物或诊断剂，则可以含有任何药物或诊断剂。作为优选例，可以列举与人CRTH2表达细胞相关的疾病的药物或诊断剂。
作为本发明的治疗方法，只要是给药有效量的本发明的抗体或该抗体片段的治疗方法，则可以包含任何治疗方法，优选列举与人CRTH2表达细胞相关的疾病的治疗方法。
作为本发明的抗体或该抗体片段的应用，只要是本发明的抗体或该抗体片段在制造与人CRTH2表达细胞相关的疾病的治疗剂中的应用，则可以包含任何抗体或该抗体片段的应用。另外，本发明的抗体或该抗体片段可以用于人CRTH2表达细胞相关的障碍或疾病的治疗和预防中的至少一者。
作为人CRTH2表达细胞相关的障碍或疾病，没有限定，可以列举例如过敏性疾病、自身免疫疾病、伴有嗜酸性粒细胞增多和功能亢进中的至少一者的疾病、伴有Th2细胞的增多和功能亢进中的至少一者的疾病、以及伴有ILC2的增多和功能亢进中的至少一者的疾病等。
更具体而言，可以列举例如包括过敏性或非过敏性鼻炎或鼻窦炎、慢性鼻窦炎或鼻炎、鼻息肉、伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎、嗜酸性粒细胞性鼻窦炎、急性鼻窦炎、哮喘、儿童哮喘、过敏性支气管炎、肺泡炎、农民肺(Farmer’s disease)、高反应性呼吸道、由感染(例如细菌、病毒、蠕虫、真菌、原生动物或其他病原引起的过敏性结膜炎、支气管炎或肺炎)、支气管扩张症、成人呼吸窘迫综合征、支气管和肺水肿、由各种起因(例如毒气、蒸气的误吸、吸入)引起的支气管炎、肺炎或间质性肺炎、由心衰、X射线、放射线、化疗引起的支气管炎、肺炎或间质性肺炎、与胶原病例如红斑狼疮、系统性硬皮病相关的支气管炎、肺炎或间质性肺炎、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、各种起因的间质性肺疾病或间质性肺炎(例如石棉肺、矽肺、Boeck病或结节病、肉芽肿病、囊性纤维化或粘液粘稠病或α1-抗胰蛋白酶缺乏症)、嗜酸性粒细胞性蜂窝组织炎(例如韦尔斯氏综合征)、嗜酸性粒细胞性肺炎(例如吕弗勒氏综合征、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎)、嗜酸性粒细胞性筋膜炎(例如舒尔曼氏综合征)、嗜酸性粒细胞性食管炎、嗜酸性粒细胞增多综合征、迟发型过敏症、非过敏性哮喘、运动引起的支气管收缩；慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性支气管炎、慢性支气管炎、肺气肿；过敏性休克或过敏性反应、药物过敏(例如对青霉素、头孢菌素)、因摄取受污染色氨酸而引起的嗜酸性粒细胞增多性肌痛综合征、昆虫叮咬过敏；自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、银屑病关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、重症肌无力症、免疫性血小板减少症(成人ITP、新生儿血小板减少症、儿童ITP)、免疫性溶血性贫血(自身免疫型和药物诱发型)、埃文斯综合征(血小板和红细胞免疫性血细胞减少症)、新生儿Rh病、古德帕斯丘氏综合征(抗GBM疾病)、乳糜泻(Celiac)、自身免疫性心肌病、青少年型糖尿病；肾小球肾炎、自身免疫性甲状腺炎、贝切特病；移植物排斥(例如在移植中)例如同种异体移植物排斥或移植物抗宿主病；炎性肠病例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；脊椎关节病；硬皮病；银屑病(包括T细胞介导的银屑病)和炎性皮肤病例如皮炎、湿疹、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、荨麻疹(例如慢性突发性、慢性自发性、物理性荨麻疹)、大疱性类天疱疮；血管炎(例如坏死性、皮肤性、肉芽肿性和过敏性血管炎、嗜酸性粒细胞性多发血管炎性肉芽肿病)；结节性红斑；嗜酸性粒细胞性肌炎、嗜酸性粒细胞性筋膜炎、伴有皮肤或器官的白细胞浸润的癌症在内的炎症性或过敏性疾病和状态。
作为人CRTH2表达细胞相关的障碍或疾病，优选列举哮喘、儿童哮喘、慢性阻塞性肺疾病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、以及急性或慢性鼻窦炎。
含有本发明的抗体或该抗体片段或它们的衍生物的药物可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段或它们的衍生物，但通常以与药理学上可接受的一种以上的载体一起混合、利用制剂学技术领域中公知的方法制造而成的药物制剂的形式提供。
作为给药途径，可以列举例如经口给药或口腔内、呼吸道内、直肠内、皮下、肌肉内、静脉内或腹腔内等非经口给药。作为给药形态，可以列举例如喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或贴片剂等。
作为适合于经口给药的制剂，可以列举例如乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等。
本发明的抗体包含利用化学或基因工程方法在本发明的抗体或其抗体片段上结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质、核酸等而得到的抗体的衍生物。
在将抗体的衍生物作为治疗方法、预防方法、治疗药或治疗药使用的情况下，作为结合在本发明的抗体或其抗体片段上的药剂，可以列举化疗剂、抗体药物、免疫激活剂、高分子药剂等。作为蛋白质，可以列举细胞因子、增殖因子、毒素蛋白等。作为核酸，可以列举Decoy核酸、反义核酸、siRNA、miRNA等。
在将抗体的衍生物作为检测方法、定量方法、检测用试剂或定量用试剂使用的情况下，作为结合在本发明的抗体或其抗体片段上的药剂，可以列举通常的免疫学检测或测定法中使用的标记物。
本发明中的抗体的衍生物可以通过利用化学方法[抗体工程入门、地人书馆(1994)中记载的方法等]在本发明的抗体或其抗体片段的H链或L链的N末端侧或C末端侧、抗体或其抗体片段中的适当的取代基或侧链上、以及抗体或该抗体片段中的糖链等上结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质等而制造。
另外，本发明中的抗体的衍生物可以通过利用基因工程的方法将编码本发明的抗体或抗体片段的DNA与编码想要结合的蛋白质的DNA连接，插入到表达载体中，将该表达载体导入适当的宿主细胞中进行表达来制造。
作为放射性同位素，可以列举例如131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。可以利用氯胺T法等使放射性同位素直接结合在抗体上。另外，也可以在抗体上结合对放射性同位素进行螯合的物质。作为螯合剂，可以列举例如1-异硫氰酸苄酯基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作为低分子药剂，可以列举例如吖啶酯或洛酚碱等发光物质、或者异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基罗丹明异硫氰酸盐(RITC)等荧光物质等。
作为使低分子药剂与抗体结合的方法，可以列举例如通过戊二醛使药剂与该抗体的氨基间结合的方法、或者通过水溶性碳二亚胺使药剂的氨基与该抗体的羧基结合的方法等。
作为高分子药剂，可以列举例如聚乙二醇(以下记作PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚环氧乙烷、苯乙烯马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物或羟丙基甲基丙烯酰胺等。
免疫学检测或测定方法是指使用实施了标记的抗原或抗体对抗体量或抗原量进行检测或测定的方法。作为免疫学检测或测定方法，可以列举放射性物质标记免疫抗体法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法(luminescentimmunoassay)、蛋白免疫印迹法或物理化学方法等。
通过使用本发明的抗体或该抗体片段，按照上述方法对表达人CRTH2的细胞进行检测或测定，能够对人CRTH2相关的疾病进行诊断。
本发明中，作为进行人CRTH2的检测或测定的对象的生物体试样，只要是组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿、粪便、组织液、肺泡灌洗液或培养液等可能包含分泌到细胞外的人CRTH2或其一部分的肽片段者或表达人CRTH2的细胞的试样，则没有特别限定。
含有本发明的抗体或其抗体片段或它们的衍生物的诊断剂可以根据目标诊断法含有用于进行抗原抗体反应的试剂、该反应的检测用试剂。作为用于进行抗原抗体反应的试剂，可以列举缓冲剂、盐等。作为检测用试剂，可以列举识别该抗体或其抗体片段或它们的衍生物的进行了标记的二次抗体、或与标记对应的底物等在通常的免疫学的检测或测定法中使用的试剂。
以下，具体地对本发明的抗体的制造方法、疾病的治疗方法和疾病的诊断方法进行说明。
1.抗体的制造方法
(1)抗原的制备
作为抗原的人CRTH2或表达人CRTH2的细胞可以通过将包含编码全长或部分长度的人CRTH2的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等中而得到。
另外，也可以通过从大量表达人CRTH2的各种人培养细胞、人组织等中纯化人CRTH2而得到。另外，也可以直接使用该培养细胞或该组织等作为抗原。此外，也可以利用Fmoc法或tBoc法等化学合成法制备具有CRTH2的部分序列的合成肽，将其用作抗原。
在人CRTH2或具有人CRTH2的部分序列的合成肽上，可以在C末端或N末端附加有FLAG或His等公知的标签。
本发明中使用的人CRTH2可以通过使用Molecular Cloning、A LaboratoryManual(分子克隆实验指南)、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)或Current Protocolsin molecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编)、约翰威利父子出版社(1987-1997)等中记载的方法等，利用例如以下的方法，使编码该人CRTH2的DNA在宿主细胞中进行表达来制造。
首先，将包含编码人CRTH2的部分的全长cDNA插入到适当的表达载体的启动子的下游，由此制作重组载体。代替上述全长cDNA，也可以使用基于全长cDNA而制备的、包含编码多肽的部分的适当长度的DNA片段。接着，将所得到的该重组载体导入适合于该表达载体的宿主细胞中，由此能够得到生产多肽的转化体。
作为表达载体，只要是能够在所使用的宿主细胞中自主复制或能够整合到染色体中、并且在能够对编码多肽的DNA进行转录的位置含有适当的启动子的表达载体，均可以使用。
作为宿主细胞，只要是大肠杆菌等属于埃希氏菌属等的微生物、酵母、昆虫细胞或动物细胞等能够表达目的基因的宿主细胞，均可以使用。
在使用大肠杆菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，重组载体优选为能够在原核生物中自主复制、并且包含启动子、核糖体结合序列、包含编码人CRTH2的部分的DNA和转录终止序列的载体。
另外，该重组载体中未必需要具有转录终止序列，但优选紧挨在结构基因下配置转录终止序列。此外，该重组载体可以含有控制启动子的基因。
作为该重组载体，优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺序列(也称为SD序列)与起始密码子之间调节为适当的距离(例如
Figure GDA0001547836100000401
Figure GDA0001547836100000402
个碱基)的质粒。
另外，作为编码该人CRTH2的DNA的碱基序列，可以对碱基进行置换以形成最适于在宿主内表达的密码子，由此能够提高作为目标的人CRTH2的生产率。
作为表达载体，只要能够在所使用的宿主细胞中发挥功能，均可以使用，可以列举例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上为罗氏诊断公司制造)、pKK233-2(法玛西亚公司制造)、pSE280(Invitrogen公司制造)、pGEMEX-1(普洛麦格公司制造)、pQE-8(Qiagen公司制造)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry、48、669(1984)]、pLSA1[Agric Biol.Chem.、53、277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制造)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP6798)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(美国专利第4686191号说明书、美国专利第4939094号说明书、美国专利第5160735号说明书)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(法玛西亚公司制造)、pET系统(Novagen公司制造)或pME18SFL3等。
作为启动子，只要能够在所使用的宿主细胞中发挥功能，则可以为任何启动子。可以列举例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子或T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，还可以列举例如将两个Ptrp串联而成的串联启动子、tac启动子、lacT7启动子或letI启动子等进行了人工设计改变的启动子等。
作为宿主细胞，可以列举例如大肠杆菌XL-1Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49或大肠杆菌DH5α等。
作为将重组载体导入到宿主细胞中的方法，只要是将DNA导入到所使用的宿主细胞中的方法，则可以使用任何方法，可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)；Gene,17,107(1982)；Molecular&GeneralGenetics,168,111(1979)]。
在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，只要是能够在动物细胞中发挥功能的表达载体，则均可以使用，可以列举例如pcDNA I、pcDM8(Funakoshi公司制造)、pAGE107[日本特开平03-22979号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本特开平02-227075号公报)、pcDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNA I/Amp(Invitrogen公司制造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司制造)、pREP4(Invitrogen公司制造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、N5KG1val(美国专利第6001358号说明书)、INPEP4(Biogen-IDEC公司制造)和转座子载体(国际公开第2010/143698号)等。
作为启动子，只要是能够在动物细胞中发挥功能的启动子，均可以使用，可以列举例如巨细胞病毒(CMV)的即刻早期(IE)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子或莫洛尼小鼠白血病病毒的启动子或增强子。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。
作为宿主细胞，可以列举例如人白血病细胞那马瓦(Namalwa)细胞、猴细胞COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞[Journal of Experimental Medicine,108,945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)；Genetics,55,513(1968)；Chromosoma,41,129(1973)；Methods in Cell Science,18,115(1996)；Radiation Research,148,260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)；Cell,6,121(1975)；Molecular Cell Genetics,Appendix I、II(pp.883-900)]、CHO/DG44、CHO-K1(ATCC编号：CCL-61)、DUkXB11(ATCC编号：CCL-9096)、Pro-5(ATCC编号：CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat#11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK或HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)等。
作为将重组载体导入到宿主细胞中的方法，只要是将DNA导入到动物细胞中的方法，均可以使用。可以列举例如电穿孔法[Cytotechnology、3、133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平02-227075号公报)或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
将如上得到的来源于包含整合有编码人CRTH2的DNA的重组载体的微生物或动物细胞等的转化体在培养基中进行培养，使该人CRTH2在培养物中生成并蓄积，从该培养物中进行收集，由此能够制造人CRTH2。将该转化体在培养基中进行培养的方法可以按照宿主培养中使用的通常的方法来进行。
在来源于真核生物的细胞中进行表达的情况下，能够得到附加有糖或糖链的人CRTH2。
在对利用使用了诱导性启动子的重组载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要向培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用了lac启动子的重组载体进行了转化的微生物进行培养的情况下，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，在对利用使用了trp启动子的重组载体进行了转化的微生物进行培养的情况下，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
作为对以动物细胞为宿主而得到的转化体进行培养的培养基，可以列举例如通常使用的RPMI1640培养基[The Journal of the American Medical Association、199、519(1967)]、伊格尔(Eagle)的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、杜氏改良MEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]、伊思考夫(Iscove)改良的杜氏培养基(IMDM)、或者在这些培养基中添加胎牛血清(FBS)等而得到的培养基等。培养通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在下等条件下进行
Figure GDA0001547836100000431
天。另外，培养中可以根据需要向培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
作为编码人CRTH2的基因的表达方法，除了直接表达以外，还可以使用分泌生产或融合蛋白表达等方法[Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]。
作为人CRTH2的生产方法，有在宿主细胞内进行生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法、或在宿主细胞外膜上进行生产的方法，可以通过改变所使用的宿主细胞或所生产的人CRTH2的结构来选择适当的方法。
在人CRTH2在宿主细胞内或宿主细胞外膜上进行生产的情况下，通过使用鲍尔森等人的方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、罗等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)；Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本特开平05-336963号公报或国际公开第94/23021号等中记载的方法，能够使人CRTH2主动地分泌至宿主细胞外。
另外，也可以利用使用了二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统(日本特开平02-227075号公报)来提高人CRTH2的生产量。
所得到的人CRTH2例如可以如下进行分离、纯化。在人CRTH2在细胞内以溶解状态进行表达的情况下，在培养结束后通过离心分离回收细胞，悬浮于水性缓冲液中后，利用超声波破碎机、法式压滤壶、MANTON-GAULIN匀浆器或卧式砂磨机等将细胞破碎，得到无细胞提取液。
从将上述无细胞提取液离心分离而得到的上清中，利用通常的蛋白质分离纯化法，即，单独使用或者组合使用溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化学公司制造)等树脂的阴离子交换色谱法、使用S-琼脂糖FF(法玛西亚公司制造)等树脂的阳离子交换色谱法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和色谱法、色谱聚焦法或等电点电泳等电泳法等方法，能够得到纯化蛋白质。
在人CRTH2在细胞内形成不溶体而进行表达的情况下，与上述同样地回收细胞后将其破碎，进行离心分离，由此作为沉淀级分回收该人CRTH2的不溶体。将回收的该人CRTH2的不溶体用蛋白变性剂进行可溶化。对该可溶化液进行稀释或透析，由此使该人CRTH2恢复至正常的立体结构后，利用与上述同样的分离纯化法能够得到多肽的纯化蛋白质。
在人CRTH2或其糖修饰体等衍生物被分泌至细胞外的情况下，可以在培养上清中回收该人CRTH2或其糖修饰体等衍生物。与上述同样地使用离心分离等方法对该培养上清进行处理，由此获取可溶性级分，使用与上述同样的分离纯化法，能够从该可溶性级分中得到纯化蛋白质。
另外，本发明中使用的人CRTH2也可以利用Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。另外，也可以利用Advanced ChemTech公司、珀金埃尔默公司、法玛西亚公司、ProteinTechnology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、Perceptive公司或岛津制作所公司等的肽合成仪进行化学合成。
(2)动物的免疫和融合用抗体产生细胞的制备
对
Figure GDA0001547836100000451
周龄的小鼠、大鼠或仓鼠等动物进行(1)中得到的抗原的免疫，采集该动物的脾脏、淋巴结、外周血中的抗体产生细胞。另外，在免疫原性低、在上述动物中未观察到抗体效价的充分升高的情况下，也可以使用人CRTH2基因敲除小鼠作为被免疫动物。
免疫通过将抗原与例如弗氏完全佐剂、或者氢氧化铝凝胶与百日咳菌疫苗等适当的佐剂一起给药于动物的皮下、尾根部、静脉内或腹腔内来进行。在抗原为部分肽的情况下，制作与BSA(牛血清白蛋白)或钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)等载体蛋白的结合体，将其用作免疫原。
抗原的给药在第一次给药后每隔
Figure GDA0001547836100000461
周进行
Figure GDA0001547836100000462
次。在各给药后第
Figure GDA0001547836100000463
天从眼底静脉丛或尾静脉采血，使用酶免疫测定法[Antibodies-A Laboratory Manual(抗体实验室手册)，冷泉港实验室(1988)]等测定其血清的抗体效价。将其血清对免疫所用的抗原显示出充分的抗体效价的动物作为融合用抗体产生细胞的供给源。
在抗原的最终给药后第
Figure GDA0001547836100000464
天，从免疫后的动物体内摘除脾脏等包含抗体产生细胞的组织，采集抗体产生细胞。在使用脾脏细胞的情况下，将脾脏细切、打散后离心分离，进而除去红细胞，从而获得融合用抗体产生细胞。
(3)骨髄瘤细胞的制备
作为骨髄瘤细胞，使用由小鼠得到的细胞株，例如8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(来源于BALB/c)骨髄瘤细胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology andImmunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]或P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。
该骨髄瘤细胞在正常培养基[添加有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、FBS和8-氮杂鸟嘌呤的RPMI1640培养基]中传代，在细胞融合的3～4天前，传代于正常培养基中，在融合当天确保2×107个以上的细胞数。
(4)细胞融合和单克隆抗体产生杂交瘤的制备
将(2)中得到的融合用抗体产生细胞和(3)中得到的骨髄瘤细胞用最低必需培养基(MEM)培养基或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、氯化钠7.65g、蒸馏水1升、pH7.2)充分清洗，按照细胞数为融合用抗体产生细胞:骨髄瘤细胞＝5～10:1的方式混合，离心分离后，除去上清。
将沉淀的细胞团块充分打散后，在37℃下一边搅拌一边加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培养基和二甲亚砜的混合液。进一步，每
Figure GDA0001547836100000471
分钟添加MEM培养基1～2mL，添加数次后，加入MEM培养基使总量为50mL。离心分离后，除去上清。
将沉淀的细胞团块轻轻打散后，将细胞轻柔地悬浮于HAT培养基[添加有次黄嘌呤、胸腺嘧啶和氨基蝶呤的正常培养基]中。将该悬浮液在37℃、5％CO2温箱中培养7～14天。
培养后，抽取一部分培养上清，利用后述的对人CRTH2表达细胞的反应性分析等杂交瘤选择方法，筛选出与含有人CRTH2的抗原反应而不与不含人CRTH2的抗原反应的细胞群。接着，利用有限稀释法反复进行两次克隆[第一次使用HT培养基(从HAT培养基中去除氨基喋呤后的培养基)，第二次使用正常培养基]，筛选出稳定确认到强抗体效价的细胞作为单克隆抗体产生杂交瘤。
(5)纯化单克隆抗体的制备
对姥鲛烷处理[腹腔内给药2,6,10,14-四甲基十五碳烷(姥鲛烷)0.5mL，饲养2周]后的8～10周龄的小鼠或裸鼠腹腔内注射(4)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤。在10～21天杂交瘤形成癌性腹水。从该小鼠采集腹水，离心分离除去固体成分后，用40～50％硫酸铵进行盐析，利用辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM级分，制成纯化单克隆抗体。
另外，将(4)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤在添加有10％FBS的RPMI1640培养基等中进行培养后，通过离心分离除去上清，悬浮于Hybridoma-SFM培养基中，培养3～7天。对所得到的细胞悬浮液进行离心分离，利用蛋白A柱或蛋白G柱从所得到的上清中进行纯化，收集IgG级分，也能够纯化单克隆抗体。需要说明的是，也可以在Hybridoma-SFM培养基中添加5％的DAIGO GF21。
抗体亚类的确定使用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法来进行。蛋白量的定量可以利用劳里法或由280nm处的吸光度算出。
(6)单克隆抗体的筛选
单克隆抗体的筛选如下所示，通过利用流式细胞术分析对于表达人CRTH2的细胞的反应性来进行。
作为表达人CRTH2的细胞，可以列举例如将(1)中得到的包含编码人CRTH2的cDNA的表达载体导入动物细胞等中而得到的基因导入细胞、人的嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、Th2、ILC2、非典型单核细胞和Th2/Th17细胞等。
将细胞分注到96孔板等板中后，分注血清、杂交瘤的培养上清或纯化单克隆抗体等受试物质作为第一抗体，使其进行反应。将反应后的细胞用含有1～10％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(以下记作BSA-PBS)等充分清洗后，分注用荧光试剂等进行了标记的抗免疫球蛋白抗体作为第二抗体，使其进行反应。用BSA-PBS等充分清洗后，使用流式细胞仪对标记化抗体的荧光量进行测定，由此筛选出与表达细胞特异性地反应的单克隆抗体。
另外，与本发明的单克隆抗体竞争性地与人CRTH2结合的单克隆抗体可以通过将受试抗体添加至上述的使用流式细胞术的结合反应检测系统中使其进行反应而获得。
即，通过筛选在添加了受试抗体时抑制本发明的单克隆抗体的结合的抗体，能够获取在与人CRTH2的氨基酸序列或其立体结构的结合中与本发明中获取的单克隆抗体竞争的单克隆抗体。
此外，结合在和与本发明的人CRTH2的氨基酸序列或其立体结构结合的单克隆抗体所识别的表位相同的表位上的抗体可以通过如下方法获取：对利用上述使用流式细胞术的结合反应检测系统获取的抗体的表位进行鉴定，制作所鉴定的表位的部分合成肽或模拟表位的立体结构的合成肽等，进行免疫。
2.基因重组抗体的制作
作为基因重组抗体的制作例，以下示出人型嵌合抗体和人源化抗体的制作方法。
(1)基因重组抗体表达用载体的构建
基因重组抗体表达用载体是整合有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体，可以通过将编码人抗体的CH和CL的DNA分别克隆到动物细胞用表达载体中来构建。
人抗体的C区可以使用任何人抗体的CH和CL。例如使用人抗体的γ1亚类的CH和κ类的CL等。编码人抗体的CH和CL的DNA使用cDNA，但也可以使用由外显子和内含子构成的染色体DNA。
动物细胞用表达载体只要能够整合编码人抗体的C区的基因并进行表达，则可以使用任何表达载体。例如使用pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]等。
动物细胞用表达载体中启动子和增强子使用SV40的初期启动子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]或免疫球蛋白H链的启动子[Cell,41,479(1985)]和增强子[Cell,33,717(1983)]等。
从基因重组抗体表达载体的构建的容易度、向动物细胞中导入的容易度、抗体H链和L链在动物细胞内的表达量的平衡达到均衡等观点出发，基因重组抗体表达用载体使用抗体H链和L链存在于同一载体上的类型(串联型)的基因重组抗体表达用载体[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]，但也可以使用抗体H链和L链存在于分开的载体上的分离型载体。串联型的基因重组抗体表达用载体使用pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]等。
(2)编码来源于人以外的动物的抗体的V区的cDNA的获取和氨基酸序列的分析
编码非人抗体的VH和VL的cDNA的获取和氨基酸序列的分析可以如下进行。
由产生非人抗体的杂交瘤细胞提取mRNA，合成cDNA。将所合成的cDNA克隆到噬菌体或质粒等载体中，制作cDNA文库。
使用编码小鼠抗体的C区部分或V区部分的DNA作为探针，从上述文库中分别分离出具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。分别确定重组噬菌体或重组质粒上的作为目标的小鼠抗体的VH或VL的全部碱基序列，由碱基序列分别推定VH或VL的全部氨基酸序列。
制作产生非人抗体的杂交瘤细胞的人以外的动物使用小鼠、大鼠、仓鼠或兔等，但只要能够制作杂交瘤细胞，任何动物均可以使用。
由杂交瘤制备总RNA时，使用异硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]或RNA easy试剂盒(Qiagen公司制造)等试剂盒等。
由总RNA制备mRNA时，使用固定有寡聚(dT)的纤维素柱法[Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]或Oligo-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒(宝生物公司制造)等试剂盒等。另外，也可以使用Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen公司制造)或QuickPrep mRNA纯化试剂盒(法玛西亚公司制造)等试剂盒由杂交瘤细胞制备mRNA。
cDNA的合成和cDNA文库的制作使用公知的方法[Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols inmolecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编)，附录1，约翰威利父子出版社(1987-1997)]；用于cDNA合成和质粒克隆的Superscript质粒系统(Invitrogen公司制造)或ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene公司制造)等试剂盒等。
制作cDNA文库时，作为整合以由杂交瘤细胞提取的mRNA为模板而合成的cDNA的载体，只要是可整合该cDNA的载体，则任何载体均可以使用。
例如使用ZAP ExPress[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司制造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A Practical Approach(DNA克隆实用方法)，I，49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司制造)、λEx Cell、pT7T3-18U(法玛西亚公司制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
作为导入利用噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要能够导入、表达和维持该cDNA文库，则可以使用任何大肠杆菌。例如使用XL-1Blue MRF[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]或JM105[Gene,38,275(1985)]等。
从cDNA文库中选择编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆时，使用利用了同位素或荧光标记的探针的集落杂交法或菌斑杂交法[Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]等。
另外，也可以通过制备引物，以由mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，进行聚合酶链式反应法[以下记作PCR法；Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in molecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编)，附录1，约翰威利父子出版社(1987-1997)]来制备编码VH或VL的cDNA。
将所选择的cDNA用适当的限制酶等切割后，克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，利用通常使用的碱基序列分析方法等确定该cDNA的碱基序列。作为碱基序列分析方法，例如在进行双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等反应后，使用ABI PRISM3700(PE生物系统公司制造)或A.L.F.DNA测序仪(法玛西亚公司制造)等碱基序列自动分析装置等。
根据所确定的碱基序列分别推定VH和VL的全部氨基酸序列，与已知抗体的VH和VL的全部氨基酸序[A.L.F.DNA,US Dept.Health and Human Services(1991)]进行比较，由此分别确认所获取的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列。
关于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列，通过与已知抗体的VH和VL的全部氨基酸序列[A.L.F.DNA,US Dept.Health and Human Services(1991)]进行比较，能够推定分泌信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进而能够知晓它们所属的亚类。另外，对于VH和VL的各CDR的氨基酸序列，也可以通过与已知抗体的VH和VL的氨基酸序列[A.L.F.DNA,US Dept.Health and Human Services(1991)]进行比较来找出。
另外，使用所得到的VH和VL的完整氨基酸序列，对例如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意的数据库进行BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等的同源性检索，能够确认VH和VL的完整氨基酸序列是否为新序列。
(3)人型嵌合抗体表达载体的构建
将分别编码非人抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，由此能够构建人型嵌合抗体表达载体。
为了将编码非人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与人抗体的CH或CL的5’末端侧连接，制作以如下方式设计的VH和VL的cDNA：连接部分的碱基序列编码适当的氨基酸且成为适当的限制酶识别序列。
将所制作的VH和VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的人源化抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达，从而构建人型嵌合抗体表达载体。
另外，也可以使用在两端具有适当的限制酶的识别序列的合成DNA，利用PCR法对编码非人抗体VH或VL的cDNA分别进行扩增，将它们克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体中。
(4)编码人源化抗体的V区的cDNA的构建
编码人源化抗体的VH或VL的cDNA可以如下构建。
分别选择出移植非人抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列。所选择的FR的氨基酸序列只要是来源于人抗体的FR的氨基酸序列，则可以使用任何氨基酸序列。
例如使用蛋白数据库(Protein Data Bank)等数据库中登记的人抗体的FR的氨基酸序列、或人抗体的FR的各亚类的共有氨基酸序列[A.L.F.DNA,US Dept.Health andHuman Services(1991)]等。为了抑制抗体的结合活性的降低，选择与原抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽量高的同源性(至少60％以上)的FR的氨基酸序列。
接着，向所选择的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列中分别移植原抗体的CDR的氨基酸序列，分别设计出人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列。考虑在抗体基因的碱基序列中出现的密码子的使用频率[A.L.F.DNA,US Dept.Health and Human Services(1991)]而将所设计的氨基酸序列转换成DNA序列，分别设计出编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。
基于设计好的DNA序列，合成多条由约100个碱基的长度构成的合成DNA，使用这些合成DNA进行PCR反应。这种情况下，从PCR反应中的反应效率和能够合成的DNA的长度的观点出发，优选对于H链、L链分别设计各6条合成DNA。另外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制酶的识别序列，能够容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆到(1)中得到的人源化抗体表达用载体中。
PCR反应后，将扩增产物分别克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，通过与(2)中记载的方法同样的方法确定碱基序列，从而获取具有编码所期望的人源化抗体的H链全长或L链全长的氨基酸序列的DNA序列的质粒。
或者，也可以使用基于设计好的DNA序列以各一条长链DNA的形式合成VH全长和VL全长而得到的DNA来代替上述PCR扩增产物。进一步，通过在合成长链DNA的两端导入适当的限制酶的识别序列，能够容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆到(1)中得到的人源化抗体表达用载体中。
(5)人源化抗体的V区的氨基酸序列的改变
对于人源化抗体而言，仅将非人抗体的VH和VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的FR中时，其抗原结合活性与原来的非人抗体相比降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。在人源化抗体中，通过鉴定出人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接与抗原的结合相关的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基、以及维持抗体的立体结构而间接与抗原的结合相关的氨基酸残基，并将这些氨基酸残基置换为原来的非人抗体的氨基酸残基，能够使降低的抗原结合活性升高。
为了鉴定出与抗原结合活性相关的FR的氨基酸残基，可以通过使用X射线晶体分析[J.Mol.Biol.、112、535(1977)]或计算机建模[Protein Engineering,7,1501(1994)]等进行抗体的立体结构的构建和分析。另外，通过针对各个抗体制作多种改变体并反复研究与各自的抗原结合活性的相关性来进行各种尝试，能够获取具有所需要的抗原结合活性的人源化抗体。
人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基可以通过使用改变用合成DNA进行(4)中记载的PCR反应来进行置换。对于PCR反应后的扩增产物，通过(2)中记载的方法来确定碱基序列，从而确认已实施了目标改变。
(6)人源化抗体表达载体的构建
将所构建的编码基因重组抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，能够构建人源化抗体表达载体。
例如，通过向(4)和(5)中得到的构建人源化抗体的VH或VL时使用的合成DNA中位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制酶的识别序列，并分别克隆到(1)中得到的人源化抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达。
(7)基因重组抗体的瞬时性表达
使用(3)和(6)中得到的基因重组抗体表达载体或者对它们进行改变而得到的表达载体，进行基因重组抗体的瞬时性表达，能够高效地对所制作的多种基因重组抗体的抗原结合活性进行评价。
导入表达载体的宿主细胞只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞，则可以使用任何细胞，例如使用COS-7细胞(ATCC编号：CRL1651)[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC出版社,283(1991)]。
向COS-7细胞中导入表达载体时，使用DEAE-右旋糖酐法[Methods in NucleicAcids Res.，CRC出版社(1991)]或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
导入表达载体后，使用酶免疫抗体法[Monoclonal Antibodies-Principles andpractice，第三版，学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)；单克隆抗体实验手册，讲谈社Scientific(1987)]等测定培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性。
(8)稳定表达基因重组抗体的转化株的获取和基因重组抗体的制备
通过将(3)和(6)中得到的基因重组抗体表达载体导入适当的宿主细胞中，能够得到稳定表达基因重组抗体的转化株。
表达载体向宿主细胞中的导入使用电穿孔法[日本特开平02-257891号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]等。
导入基因重组抗体表达载体的宿主细胞只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞，则可以使用任何细胞。例如使用CHO-K1(ATCC编号：CCL-61)、DUkXB11(ATCC编号：CCL-9096)、Pro-5(ATCC编号：CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies，目录号11619)、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(ATCC编号：CRL1581)、小鼠P3-X63-Ag8653细胞(ATCC编号：CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(Dihydroforate Reductase，以下记作DHFR)缺陷的CHO细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、获得了凝集素抗性的Lec13[Somatic Celland Molecular Genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC编号：CRL1662)等。
导入表达载体后，将稳定表达基因重组抗体的转化株在含有G418硫酸盐等药剂的动物细胞培养用培养基中进行培养，由此进行选择(日本特开平02-257891号公报)。
动物细胞培养用培养基使用RPMI1640培养基(Invitrogen公司制造)、GIT培养基(日本制药公司制造)、EX-CELL301培养基(JRH公司制造)、IMDM培养基(Invitrogen公司制造)、Hybridoma-SFM培养基(Invitrogen公司制造)、或者在这些培养基中添加有FBS等各种添加物的培养基等。
通过将所得到的转化株在培养基中进行培养，使基因重组抗体在培养上清中表达并蓄积。培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性可以利用ELISA法等进行测定。另外，可以利用DHFR扩增系统(日本特开平02-257891号公报)等使转化株所产生的基因重组抗体的表达量升高。
基因重组抗体使用蛋白A柱从转化株的培养上清中进行纯化[MonoclonalAntibodies-Principles and practice(单克隆抗体原理与实践)，第三版，学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual(抗体实验室手册)，冷泉港实验室(1988)]。另外，也可以将凝胶过滤、离子交换色谱和超滤等蛋白质的纯化中使用的方法组合。
纯化后的基因重组抗体的H链、L链或整个抗体分子的分子量可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法[Nature,227,680(1970)]或蛋白免疫印迹法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice(单克隆抗体原理与实践)，第三版，学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual(抗体实验室手册)，冷泉港实验室(1988)]等进行测定。
3.纯化单克隆抗体或该抗体片段的活性评价
纯化后的本发明的单克隆抗体或该抗体片段的活性评价可以如下进行。
对人CRTH2表达细胞株的结合活性可以利用例如上述1.(6)记载的使用流式细胞术的结合反应检测系统等荧光抗体法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]进行测定。
对人CRTH2阳性培养细胞株的CDC活性或ADCC活性利用公知的测定方法[CancerImmunol.Immunother.,36,373(1993)；Current protocols in Immunology,Chapter7.Immunologic studies in humans,Editor,John E,Coligan et al.,约翰威利父子出版社公司(1993)]进行测定。
4.控制抗体的效应子活性的方法
作为控制本发明的单克隆抗体的效应子活性的方法，已知有对结合于抗体的Fc段的第297位的天冬酰胺(Asn)的N键合复合型糖链的还原末端上存在的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上α1,6键合的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量进行控制的方法(国际公开第2005/035586号、国际公开第2002/31140号、国际公开第00/61739号)；或者通过改变抗体的Fc段的氨基酸残基而进行控制的方法等。对本发明的单克隆抗体使用任意一种方法，均能够控制效应子活性。
效应子活性是指藉由抗体的Fc段所引起的抗体依赖性活性，已知有ADCC活性、CDC活性、或者由巨噬细胞或树突细胞等吞噬细胞产生的抗体依赖性吞噬活性(Antibody-dependent phagocytosis，ADP活性)等。
作为效应子活性的测定法，例如，可以将作为靶标的炎性细胞、作为效应子的人外周血单核细胞(PBMC)、以及炎性细胞特异性的抗体混合，温育约4小时后，测定作为细胞损伤指标的游离出来的乳酸脱氢酶(LDH)。或者，可以向人PBMC中混合例如CD20这样的识别血液细胞特异性抗原的抗体，温育后，进行游离LDH的测定或利用流式细胞术测定该细胞数的减少作为效应子活性。
通过控制抗体的Fc的N键合复合型糖链的核心岩藻糖的含量，能够增加或降低抗体的效应子活性。作为降低与抗体的Fc结合的N键合复合型糖链上结合的岩藻糖的含量的方法，可以列举例如使用α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞来表达抗体的方法，能够获取未结合岩藻糖的抗体。未结合岩藻糖的抗体具有高的ADCC活性。
另一方面，作为增加与抗体的Fc结合的N键合复合型糖链上结合的岩藻糖的含量を的方法，可以列举例如使用导入有α1,6-岩藻糖转移酶基因的宿主细胞来表达抗体的方法，能够获取结合有岩藻糖的抗体。结合有岩藻糖的抗体具有比未结合岩藻糖的抗体低的ADCC活性。
另外，可以通过改变抗体的Fc段的氨基酸残基来增加或降低ADCC活性或CDC活性。例如，通过使用美国专利公开第2007/0148165号说明书中记载的Fc段的氨基酸序列，能够增加抗体的CDC活性。
另外，通过进行美国专利第6737056号说明书、美国专利第7297775号说明书或美国专利第7317091号说明书中记载的氨基酸改变，既可以增加也可以降低ADCC活性或CDC活性。
另外，本发明的抗体也包含通过配合上述的抗体恒定区中的氨基酸改变、糖链改变来进行例如日本特开2013-165716号公报、日本特开2012-021004号公报等中记载的氨基酸改变而控制对Fc受体的反应性，由此控制了血中半衰期的抗体。
此外，通过将上述方法组合而用于一种抗体，能够获取控制了抗体的效应子活性、血中半衰期的抗体。
5.本发明的单克隆抗体或使用该抗体片段的疾病的治疗方法
本发明的抗体能够用于人CRTH2相关疾病的治疗。作为给药，可以列举例如经口给药或口腔内、呼吸道内、直肠内、皮下、肌肉内、静脉内或者腹腔内等非经口给药。作为给药形态，可以列举例如喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或贴片剂等。
作为适合于经口给药的制剂，可以列举例如乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等。
乳剂或糖浆剂这样的液体制备物使用水、蔗糖、山梨醇或果糖等糖类、聚乙二醇或聚丙二醇等二醇类、芝麻油、橄榄油或大豆油等油类，对羟基苯甲酸酯类等防腐剂、或者草莓香料或薄荷等香料类等作为添加剂来制造。
胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等赋形剂、淀粉或海藻酸钠等崩解剂、硬脂酸镁或滑石等润滑剂、聚乙烯醇、羟丙基纤维素或明胶等粘结剂、脂肪酸酯等表面活性剂或甘油等增塑剂等作为添加剂来制造。
作为适合非经口给药的制剂，可以列举例如注射剂、栓剂或喷雾剂等。
注射剂使用由盐溶液、葡萄糖溶液或该两者的混合物构成的载体等来制造。
栓剂使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体来制造。
喷雾剂使用不刺激接受者的口腔和呼吸道粘膜并且使本发明的单克隆抗体或该抗体片段以微细粒子的形式分散从而容易吸收的载体等来制造。作为载体，使用例如乳糖或甘油等。另外，也可以以气溶胶或干粉的形式制造。
此外，上述非经口剂中也可以添加在适合经口给药的制剂中作为添加剂所例示的成分。
6.本发明的抗体或使用该抗体片段的疾病的诊断方法
通过使用本发明的抗体或该抗体片段对表达人CRTH2或人CRTH2的细胞进行检测或测定，能够对人CRTH2相关疾病进行诊断。
作为人CRTH2相关疾病之一的过敏疾病的诊断例如可以通过使用流式细胞仪等免疫学方法检测来自于患者的外周血、咳痰、鼻涕或肺泡灌洗液等中存在的炎性细胞上表达的人CRTH2来进行。
免疫学的方法是指使用实施了标记的抗原或抗体对抗体量或抗原量进行检测或测定的方法。例如使用放射性物质标记免疫抗体法、酶联免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、蛋白免疫印迹法或物理化学方法等。
放射性物质标记免疫抗体法例如是使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进一步使实施了放射线标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后利用闪烁计数仪等进行测定。
酶联免疫测定法例如是使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进一步使实施了标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后利用吸光光度计对显色色素进行测定。例如使用夹心ELISA法等。
作为酶联免疫测定法中使用的标记物，可以使用公知[酶免疫测定法、医学书院(1987)]的酶标记。例如使用碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记或生物素标记等。
夹心ELISA法是使抗体结合于固相上后、使其捕获作为检测或测定对象的抗原并使第二抗体与被捕获的抗原反应的方法。该ELISA法中，准备作为与要检测或测定的抗原结合的抗体或抗体片段的、抗原结合位点不同的两种抗体，预先使其中的第一抗体或抗体片段吸附到板(例如96孔板)上，接着将第二抗体或抗体片段预先用FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶或生物素等进行标记。
在吸附有上述抗体的板上使从生物体内分离的细胞或其破碎液、组织或其破碎液、细胞培养上清、血清、胸水、腹水或眼液等进行反应，然后使标记的抗体或抗体片段进行反应，并进行与标记物质对应的检测反应。利用将浓度已知的抗原进行连续稀释而制作的标准曲线，算出受试样品中的抗原浓度。
作为夹心ELISA法中使用的抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任何一种，也可以使用Fab、Fab’或F(ab’)2等抗体片段。作为夹心ELISA法中使用的两种抗体的组合，可以是识别不同表位的单克隆抗体或抗体片段的组合，也可以是多克隆抗体与单克隆抗体或抗体片段的组合。
荧光免疫测定法利用文献[Monoclonal Antibodies-Principles and practice(单克隆抗体原理与实践)，第三版，学术出版社(1996)；单克隆抗体实验手册、讲谈社Scientific(1987)]等中记载的方法进行测定。作为荧光免疫测定法中使用的标记物，可以列举例如公知[荧光抗体法、Soft Science公司(1983)]的荧光标记。可以列举例如异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基罗丹明异硫氰酸盐(RITC)等。
发光免疫测定法利用文献[生物发光与化学发光、临床检查42、广川书店(1998)]等中记载的方法进行测定。作为发光免疫测定法中使用的标记物，可以列举例如公知的发光体标记，可以列举吖啶酯、洛酚碱等。
蛋白免疫印记法通过将抗原或表达抗原的细胞等利用SDS(十二烷基硫酸钠)-PAGE[Antibodies-A Laboratory Manual(抗体实验室手册)，冷泉港实验室(1988)]分级分离后，将该凝胶印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝酸纤维素膜上，使识别抗原的抗体或抗体片段与该膜进行反应，进而使实施了FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶标记或生物素标记等的抗小鼠IgG抗体或结合片段进行反应，然后使该标记可见化来进行测定。以下示出一例。
将表达具有序列号2所表示的氨基酸序列的多肽的细胞或组织溶解，在还原条件下使每个泳道的蛋白量为0.1～30μg，利用SDS-PAGE法进行电泳。将电泳后的蛋白转印到PVDF膜上，在1～10％BSA-PBS中在室温下反应30分钟，进行封闭操作。
在此，使本发明的抗体进行反应，用含有0.05～0.1％的Tween-20的PBS(以下记作Tween-PBS)进行清洗，并使过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG在室温下反应2小时。用Tween-PBS进行清洗，使用ECL蛋白免疫印迹检测试剂(安玛西亚公司制造)等对结合有单克隆抗体的条带进行检测，由此对具有序列号2所表示的氨基酸序列的多肽进行检测。作为利用蛋白免疫印迹法的检测中使用的抗体，使用能够与未保持天然型立体结构的多肽结合的抗体。
关于物理化学方法，例如使作为抗原的人CRTH2与本发明的单克隆抗体或该抗体片段结合，由此形成聚集物，对该聚集物进行检测。此外，作为物理化学方法，还可以列举例如毛细管法、单向免疫扩散法、免疫比浊法或乳胶免疫比浊法[临床检查法提要、金原出版(1998)]等。
乳胶免疫比浊法中，使用以抗体或抗原致敏的粒径约0.1～1μm的聚苯乙烯乳胶等载体，利用对应的抗原或抗体引起抗原抗体反应时，反应液中的散射光增加，透射光减少。以吸光度或积分球浊度的形式检测该变化，由此测定受试样品中的抗原浓度等。
作为使用本发明的抗体或该抗体片段在治疗开始前判断该抗体的治疗有效性的方法，可以列举例如下述方法。
首先，在治疗开始前，从患者体内采集例如外周血、咳痰、肺泡灌洗液、鼻涕等，向其悬浮液中添加本发明的抗体或该抗体片段，一定时间后，测定以炎性细胞的除去、对Th2型细胞因子等生物体功能分子的抑制活性为代表的抗炎性细胞活性。测定的结果，在检测到抗炎性细胞活性的情况下，在治疗开始前判断本发明的抗体或该抗体片段对具有该外周血、咳痰、鼻涕等的患者的治疗有效。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[实施例1]
人CRTH2表达细胞的制成
(1)人CRTH2表达载体的制作
全合成人CRTH2(以下有时也记作CRTH2)的cDNA，用于以下的试验。将人CRTH2的cDNA序列记载于序列号1，将氨基酸序列记载于序列号2。
(i)人CRTH2基因表达pKANTEX93载体的构建
使用限制酶EcoRI和KpnI，将人CRTH2的cDNA与载体pKANTEX93(国际公开第97/10354号)连接，构建人CRTH2基因表达pKANTEX93载体。
(ii)人CRTH2基因表达pAMoh载体的构建
对于pAMoh(国际公开第03/087366号)，也使用限制酶KpnI和HindIII整合人CRTH2基因，构建人CRTH2基因表达pAMoh载体。
(2)人CRTH2表达CHO/DG44细胞的制成
从三菱化学株式会社横滨综合研究所获得DHFR基因缺陷CHO(中国仓鼠卵巢)细胞DG44株(CHO/DG44细胞)，用于人CRTH2表达细胞的制成。培养使用添加有10％透析胎牛血清(dFBS)(GIBCO公司)、HT[次磺嘌呤(H)、胸腺嘧啶核苷(T)]补充剂(GIBCO公司)和50μg/mL庆大霉素(NACALAI TESQUE公司制造)的IMDM(GIBCO公司)(以下简记为IMDM培养基)。
首先，通过限制酶AatII处理将(1)-(i)中制作的人CRTH2基因表达pKANTEX93载体切断，将所得到的直链状DNA进行纯化，溶解于无菌水中。利用电穿孔法将该DNA导入CHO/DG44细胞中，在去除了HT补充剂的IMDM培养基中培养约3天。
然后，利用添加有10％dFBS、0.5mg/mL G418(NACALAI TESQUE公司制造)和50μg/mL庆大霉素(NACALAI TESQUE公司)的IMDM(以下简记为IMDM选择培养基)选择出耐药剂性细胞。将选择出的耐药剂性细胞以达到75个细胞/板的方式接种到96孔板中，进一步在IMDM选择培养基中培养约2周。在显微镜下对每孔进行观察，将形成单个克隆的细胞依次进行扩大培养。
利用0.02％EDTA溶液(NACALAI TESQUE公司)将所得到的耐药剂性细胞剥离，用PBS(phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲生理盐水)清洗后，在含有2％胎牛血清(FBS)、0.05％NaN3和1mM EDTA的PBS(Staining Medium，染色介质；以下简记为SM)中悬浮。接着，以达到2×105细胞/孔的方式接种到96孔板中，以1700rpm进行2分钟的离心分离。
除去上清后，添加利用SM制备的PE标记抗人CRTH2抗体(贝克曼库尔特公司)，在4℃下进行1小时的反应。清洗细胞后，将细胞在SM中悬浮，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACS CantoII)对荧光强度进行分析。选择高表达人CRTH2的克隆，将该细胞作为人CRTH2表达CHO/DG44细胞。
(3)FLAG融合人CRTH2表达载体的制作
(i)FLAG融合人CRTH2基因表达pAMoh载体的构建
使用引物humanCRTH2FLAG-A(序列号3)和humanCRTH2FLAG-B(序列号4)，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，以下记作PCR)由(1)-(ii)中制作的人CRTH2基因表达pAMoh扩增在C末端附加有FLAG标签的人CRTH2(序列号5)，使用限制酶KpnI和HindIII与载体pAMoh(国际公开第03/087366号)连接，构建FLAG融合人CRTH2基因表达pAMoh载体。
(ii)FLAG融合人CRTH2基因表达pKANTEX93载体的构建
使用引物humanCRTH2FLAG-C(序列号6)和humanCRTH2FLAG-D(序列号7)，通过PCR由(3)-(i)中构建的FLAG融合人CRTH2基因表达pAMoh载体扩增在C末端附加有FLAG标签的人CRTH2，使用限制酶EcoRI和KpnI与载体pKANTEX93(国际公开第97/10354号)连接，构建FLAG融合人CRTH2基因表达pKANTEX93载体。
(4)FLAG融合人CRTH2表达3Y1-B细胞的制成
从理研生物资源中心获得大鼠3Y1-B细胞，用于FLAG融合人CRTH2表达细胞的制成。培养使用添加有10％FBS(GIBCO公司)和50μg/mL庆大霉素(NACALAI TESQUE公司)的DMEM(GIBCO公司)(以下简记为DMEM培养基)。
通过限制酶AatII处理将(3)-(ii)中制作的FLAG融合人CRTH2基因表达pKANTEX93载体切断，将所得到的直链状DNA进行纯化，溶解于无菌水中。利用使用Fugene6(普洛麦格公司)的脂质体转染(Lipofection)法将该DNA导入3Y1-B细胞中，在DMEM培养基中培养约3天。然后，在添加有10％FBS、0.8mg/mL G418(NACALAI TESQUE公司)和50μg/mL庆大霉素(NACALAI TESQUE公司)的DMEM(以下记作DMEM选择培养基)中选择耐药剂性细胞。
用0.05％胰蛋白酶溶液(Invitrogen公司)将所得到的耐药剂性细胞剥离，用PBS清洗后，在SM中悬浮。接着，以达到2×105细胞/孔的方式接种到96孔板中，以1700rpm进行2分钟的离心分离。除去上清后，添加用SM制备的PE标记抗人CRTH2抗体(贝克曼库尔特公司)，在4℃下进行1小时的反应。清洗细胞后，将细胞在SM中悬浮，利用流式细胞仪(BDBiosciences公司，FACS Aria)对荧光强度进行分析。对高表达FLAG融合人CRTH2的级分进行单细胞分选，并进行扩大培养，作为FLAG融合人CRTH2表达3Y1-B细胞。
[实施例2]
针对人CRTH2的单克隆抗体的制作
(1)对大鼠的免疫
为了获取针对人CRTH2的单克隆抗体，对初次给药时的周龄为9周龄的雌性WKY/NCrlCrlj大鼠(WKY大鼠)(Charles River公司)进行免疫。
初次给药时，将5×106细胞的FLAG融合人CRTH2表达3Y1-B细胞悬浮在100μL的生理盐水(大塚制药工场公司)中，与Sigma Adjuvant System(注册商标)(Sigma-Aldrich公司制造)100μL合并制备200μL的细胞悬浮液，在WKY大鼠的尾根部以每一处100μL对左右两处进行肌肉内给药。
另外，在初次给药2周后，将5×106细胞的FLAG融合人CRTH2表达3Y1-B细胞悬浮于200μL的生理盐水中，以同样的方法进行给药。
(2)杂交瘤的制作
在进行(1)中的第2次免疫3天后，利用外科方法从WKY大鼠体内摘除髂淋巴结，供于细胞融合。
首先，将摘除的髂淋巴结用载玻片磨碎，使组织打散。将该髂淋巴结组织悬浮于最低必需培养基(MEM)(Invitrogen公司)中，从细胞滤网中通过，由此除去多余的组织。通过以1200rpm进行5分钟离心分离而除去上清后，再次在MEM中悬浮，制成髂淋巴结细胞。
向所得到的髂淋巴结细胞数中混合1/5细胞数的小鼠骨髓瘤细胞株P3-U1(ATCC)。通过离心分离除去上清后，在37℃的温浴中温育，同时缓慢地添加500μL的PEG溶液[分别混合聚乙二醇1000(纯正化学公司)和MEM各1mL，并添加DMSO(二甲亚砜)(Sigma-Aldrich公司)350μL而成]，每隔1分钟向其中添加MEM 1mL，添加5次后进一步添加45mL的MEM。
通过以900rpm进行5分钟离心分离而除去上清后，将细胞在HAT培养基[向500mL的RPMI-1640(和光纯药公司)中添加10mL的HAT(次磺嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T))溶液(GIBCO公司)、0.5mL的55mmol/L 2-巯基乙醇(Invitrogen公司)、50mL的胎牛血清(Moregate Biotech公司)和0.5mL的10mg/mL庆大霉素溶液(NACALAI TESQUE公司)而成]中悬浮，接种到96孔板中进行培养。
(3)杂交瘤筛选
将(2)中接种的杂交瘤培养7天后，收集各孔的培养上清，分析对人CRTH2的反应性。阳性对照细胞和阴性对照细胞分别设定为人CRTH2表达CHO/DG44细胞和CHO/DG44细胞。首先，用0.02％EDTA溶液(NACALAI TESQUE公司)将阳性对照细胞和阴性对照细胞剥离，以每孔分别达到1×105细胞/50μL的方式接种到96孔板中，添加50μL的培养上清，在4℃下进行30分钟的反应。
清洗细胞后，在用SM稀释至300倍的抗大鼠IgG(Fc)-Dylight488(abcam公司)100μL中悬浮，在4℃下进行30分钟的反应。再次清洗细胞后，将细胞在SM中悬浮，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司制造，FACS CantoII)对荧光强度进行分析。
对于观察到与人CRTH2表达CHO/DG44细胞的特异性反应的孔的杂交瘤，使用克隆培养基[在S-Clone克隆培养基CM-B(EIDIA公司)中添加0.5mL的10mg/mL庆大霉素溶液(NACALAI TESQUE公司)、5mL的HT补充剂(Gibco公司)而成]利用有限稀释法进行2次单细胞克隆。最终建立了对于人CRTH2表达CHO/DG44细胞显示出最强的流式细胞术反应性的杂交瘤Lym2克隆(以下记作杂交瘤Lym2)。
(4)杂交瘤Lym2的培养上清中含有的抗体的亚类的鉴定
用PBS(NACALAI TESQUE公司制造)将对杂交瘤Lym2进行3天培养而得到的培养上清稀释至10倍，使用该稀释液150μL，利用大鼠单克隆抗体同种型检测试剂盒(AbD Serotec公司)按照附带的说明书进行亚类的分析。
其结果可知，杂交瘤Lym2的培养上清中含有的大鼠抗人CRTH2单克隆抗体(以下有时也简记为Lym2抗体)为大鼠IgG2b抗体。
(5)Lym2抗体的纯化
将杂交瘤Lym2在向Hybridoma-SFM(Invitrogen公司)中添加5％胎牛血清超低IgG(Invitrogen公司)而成的培养基中培养1周。回收培养上清，供于纯化。
使用Prosep-G(GE Healthcare公司)，从培养上清中纯化Lym2抗体。首先，将培养上清加载到柱上，用PBS对柱进行清洗后，利用pH5.0、3.5和3.0的洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸一水合物-NaOH/pH5.0、3.5和3.0)依次进行洗脱。洗脱的级分迅速用中和缓冲液(2M Tris-HCl/pH8.5)进行中和。
测定各级分的吸光度(280nm)，回收测定值高的连续级分作为抗体级分。用PBS进行透析，将通过0.22μm的过滤器后的物质作为纯化蛋白。将280nm的吸光系数设定为1.4，算出浓度。
[实施例3]
利用流式细胞术进行的Lym2抗体的抗原结合性评价
用0.05％胰蛋白酶溶液(Invitrogen公司)将FLAG融合人CRTH2表达3Y1-B细胞剥离，用PBS清洗后，在SM中悬浮。接着，以每孔达到2×105个细胞的方式接种到96孔板中，以1700rpm进行2分钟的离心分离。除去上清后，添加用SM制备成10μg/mL的Lym2抗体100μL，在4℃下进行1小时的反应。
清洗细胞后，添加用SM稀释至100倍的抗大鼠IgG-FITC(贝克曼库尔特公司)，在4℃下进行1小时的反应。再次清洗细胞后，将细胞在SM中悬浮，利用流式细胞仪(BDBiosciences公司制造，FACS CantoII)对荧光强度进行分析。其结果，确认了Lym2抗体对FLAG融合人CRTH2表达3Y1-B细胞的结合。
[实施例4]
Lym2抗体重链和轻链可变区基因的克隆
使用RNAiso plus(宝生物公司)，按照附带的说明书将用PBS清洗后的杂交瘤Lym2裂解，制备总RNA。所得到的总RNA溶解于DEPC处理的水(Invitrogen公司)中。接着，使用Oligotex-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒(从总RNA中)(宝生物公司)，按照附带的说明书从所得到的总RNA中纯化mRNA。进一步，使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司)，按照附带的说明书由纯化的mRNA制备cDNA。
以所得到的cDNA为模板，使用引物RatIgG2bH-A(序列号8)和RatIgG2bH-B(序列号9)，通过PCR扩增大鼠IgG2b重链基因，使用引物Ratk-A(序列号10)和Ratk-B(序列号11)，通过PCR扩增大鼠轻链(κ链)基因。对所扩增的基因进行亚克隆，分析碱基序列。
其结果，鉴定出包含信号序列的Lym2抗体的VH和VL的碱基序列和氨基酸序列。将VH、VL各自的碱基序列示于序列号12、14，将氨基酸序列示于序列号13、15。另外，根据Kabat等人[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and HumanServices(1991)]的报告，鉴定出不包含信号序列的Lym2抗体的VH和VL的序列。
将除去信号序列后的VH、VL各自的碱基序列示于序列号16、18，将氨基酸序列示于序列号17、19。另外，将Lym2抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于序列号20、21和22，将Lym2抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于序列号23、24和25。
[实施例5]
大鼠/人嵌合型Lym2抗体的制作
(1)大鼠/人嵌合型Lym2抗体表达载体的构建
大鼠/人嵌合型Lym2抗体表达载体通过利用下述方法将Lym2抗体重链和轻链可变区基因分别与人IgG1重链和κ链恒定区基因连接而制作。
首先，全合成序列号26的序列作为VH，全合成序列号27的序列作为VL。从所合成的序列通过PCR使用引物chLym2VH-A(序列号28)和引物chLym2VH-B(序列号29)扩增VH，使用引物chLym2VL-A(序列号30)和引物chLym2VL-B(序列号31)扩增VL。
对基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)进行纯化。使用该片段以及人κ链恒定区表达载体(BglII/BsiWI处理)和人重链(IgG1)恒定区表达载体(Sal1/Nhe1处理)，利用In-Fuision HD克隆试剂盒(Clontech公司)按照附带的说明书进行向载体的亚克隆。
转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(宝生物公司)中，实施质粒提取、序列确认，由此制作大鼠/人嵌合型Lym2抗体(以下记作chLym2)表达载体。
(2)chLym2瞬时性表达细胞株的制备
为了制作chLym2的瞬时性表达株，使用FreeStyle(商标)MAX CHO表达系统(Lifetechnologies公司)，按照附带的说明书利用下述方法将(1)中制作的表达载体导入宿主细胞中。宿主细胞使用FUT8敲除CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)的FreeStyle(商标)CHO表达培养基(Lifetechnologies公司)驯化株。
将(1)中制作的312.5μg的chLym2抗体表达载体(将轻链表达载体与重链表达载体以1:2混合而成)溶解于20mL的Opti-Pro SFM(Invitrogen公司)，另外，将312.5μL的Freestyle MAX试剂(Invitrogen公司制造)溶解于20mL的Opti-Pro SFM中，在室温下放置5分钟。将上述二液混合，在室温下放置15分钟。将该混合溶液全部添加至250mL的宿主细胞培养液(1×106细胞/mL)中，得到chLym2瞬时性表达细胞株。
(3)chLym2的纯化
将(2)中得到的chLym2瞬时性表达细胞株悬浮于添加有8mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen公司)的Free style CHO表达培养基(Invitrogen公司)中，在三角烧瓶中培养5天后，回收培养上清。将回收的培养上清进行离心分离，使用0.22μm过滤器进行过滤，由此制备含有chLym2的培养上清。
使用MabSelect SuRe(GE Healthcare公司)，从所制备的培养上清中纯化chLym2。首先，将培养上清加载到柱上，用PBS将柱清洗后，利用pH5.0、3.5、3.0的洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸一水合物-NaOH/pH5.0、3.5、3.0)依次洗脱。洗脱的级分迅速用中和缓冲液(2MTris-HCl/pH8.5)进行中和。
测定各级分的280nm的吸光度(A280)，回收测定值高的连续级分作为抗体级分。将抗体级分用PBS进行透析，将通过0.22μm的过滤器后的物质作为纯化蛋白。将280nm的吸光系数设定为1.37，算出浓度。
[实施例6]
人源化抗体的制作
(1)人源化Lym2抗体重链和轻链可变区的设计
(i)人源化Lym2抗体的VL和VH的氨基酸序列的设计
如下设计人源化Lym2抗体的VL的氨基酸序列。
首先，如下选择适合于Lym2抗体的VL的CDR1～3的氨基酸序列(序列号23、24、25)的移植的人抗体的VL的FR的氨基酸序列。
关于已知的人抗体重链可变区序列，利用美国国家生物技术信息中心所提供的BLASTP数据库检索与Lym2抗体的VL的FR序列的同源性高的人抗体序列。其结果，GeneBankID:ABA71374.1为同源性最高的人抗体序列，因此选择该抗体的FR。在如上确定的人抗体FR序列的适当位置移植序列号23、24、25所表示的Lym2抗体的VL的CDR1～3的氨基酸序列，由此设计出LV0(序列号33)。
接着，如下设计人源化Lym2抗体的VH的氨基酸序列。如下选择适合于Lym2抗体的VH的CDR1～3的氨基酸序列(序列号20、21、22)的移植的人抗体VH的FR的氨基酸序列。与VL同样地利用BLASTP数据库检索与Lym2的VH的FR序列的同源性高的人抗体序列。
其结果，GeneBank ID:AAY33331.1为同源性最高的人抗体序列，因此选择该抗体的FR。在如上确定的人抗体FR序列的适当位置移植序列号20、21、22所表示的Lym2抗体的VH的CDR1～3的氨基酸序列，由此设计出HV0(序列号49)。
上述中所设计的人源化Lym2抗体的VL的氨基酸序列LV0和VH的氨基酸序列HV0是在所选择的人抗体的FR的氨基酸序列中仅移植来自于大鼠单克隆抗体Lym2的CDR的氨基酸序列而得到的序列。但是，一般而言，在制作人源化抗体的情况下，仅将啮齿类来源抗体的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的FR中时，多数情况下结合活性降低。
为了避免这种结合活性的降低，在移植CDR的氨基酸序列的同时，对于在人抗体与啮齿类抗体之间存在差异的FR的氨基酸残基中认为对结合活性造成影响的氨基酸残基进行置换。因此，本实施例中，也如下鉴定并置换了认为对结合活性造成影响的FR的氨基酸残基。
首先，使用计算机建模的方法构建了由上述中所设计的人源化Lym2抗体的VL的氨基酸序列LV0和VH的氨基酸序列HV0构成的抗体可变区(以下记为LV0HV0)的三维结构。
三维结构座标制作和三维结构的表示使用Discovery Studio(Accelrys公司)。另外，也同样地构建了Lym2抗体的可变区的三维结构的计算机模型。进一步，选择出LV0HV0的VL和VH的FR的氨基酸序列中与Lym2抗体不同的氨基酸残基，制作将其改变为Lym2抗体的氨基酸残基的氨基酸序列，同样地构建三维结构模型。将这些所制作的Lym2抗体、LV0HV0和改变体的各可变区的三维结构进行比较，鉴定出预测对抗体的结合活性造成影响的氨基酸残基。
其结果，作为LV0HV0的FR的氨基酸残基中改变抗原结合部位的三维结构、认为对抗体的结合活性造成影响的氨基酸残基，在LV0中选择出序列号33的氨基酸序列的第2位的Ile、第4位的Met、第15位的Pro和第85位的Ala，在HV0中选择出序列号49的氨基酸序列的第18位的Leu、第77位的Asn、第93位的Val和第117位的Thr。
进行将这些选择出的氨基酸残基中至少一个以上的氨基酸序列置换为存在于Lym2抗体的相同部位的氨基酸残基的氨基酸改变，设计出具有各种改变的人源化抗体的VL和VH。具体而言，对于VL，导入将序列号33的氨基酸序列的第2位的Ile置换为Val、将第4位的Met置换为Leu、将第15位的Pro置换为Leu、或者将第85位的Ala置换为Pro的氨基酸改变中的至少一种改变。对于VH，导入将序列号49的氨基酸序列的第18位的Leu置换为Met、将第77位的Asn置换为Ser、将第93位的Val置换为Thr、或者将第117位的Thr置换为Val的氨基酸改变中的至少一种改变。
作为改变了LV0HV0或LV0HV0的FR中存在的至少一个氨基酸残基的人源化Lym2抗体的抗体可变区，分别设计了LV0HV0、LV1HV0、LV2aHV0、LV2bHV0、LV2cHV0、LV3aHV0、LV3bHV0、LV4HV0、LV0HV4、LV1HV4、LV2aHV4、LV2bHV4、LV2cHV4、LV3aHV4、LV3bHV4、LV4HV4、LV0HV1、LV0HV2a、LV0HV2b和LV0HV3。
在下文的记述中，将包含上述可变区的人源化Lym2抗体分别简记为LV0HV0、LV1HV0、LV2aHV0、LV2bHV0、LV2cHV0、LV3aHV0、LV3bHV0、LV4HV0、LV0HV4、LV1HV4、LV2aHV4、LV2bHV4、LV2cHV4、LV3aHV4、LV3bHV4、LV4HV4、LV0HV1、LV0HV2a、LV0HV2b和LV0HV3。
将轻链可变区LV0(序列号33)、LV1(序列号35)、LV2a(序列号37)、LV2b(序列号39)、LV2c(序列号41)、LV3a(序列号43)、LV3b(序列号45)、LV4(序列号47)和重链可变区HV0(序列号49)、HV1(序列号51)、HV2a(序列号53)、HV2b(序列号55)、HV3(序列号57)、HV4(序列号59)的氨基酸序列分别示于图1和图2。
(ii)人源化Lym2抗体的可变区基因的设计
编码人源化抗体的可变区的氨基酸序列的碱基序列使用在动物细胞中高频率地使用的密码子进行设计。使用这些碱基序列，进行以下所示的人源化Lym2抗体表达载体的构建和对应的抗体的表达。
(2)人源化Lym2抗体表达载体的构建
依照实施例5-(1)中记载的方法，构建人源化Lym2抗体表达载体。即，进行分别编码序列号33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59所表示的氨基酸序列的、序列号32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58所表示的碱基序列的DNA的全合成，利用序列号28-31所示的引物通过PCR扩增对应的VL、VH基因片段。对基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)进行纯化。
使用In-Fuision HD克隆试剂盒(Clontech公司)，按照附带的说明书将该VL或VH片段分别亚克隆到人κ链恒定区表达载体(BglII/BsiWI处理)和人重链(IgG1)恒定区表达载体(Sal1/Nhe1处理)中。使用所制作的载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(宝生物公司)，实施质粒提取、序列确认，挑选出插入了正确序列的菌落，为瞬时性表达进行质粒大量制备。
(3)人源化Lym2抗体的瞬时性表达
所制作的人源化Lym2抗体的瞬时性表达如下进行：将实施例5-(2)中记载的在FreeStyle(商标)CHO表达培养基(Lifetechnologies公司制造)中驯化的CHO细胞作为宿主，使用FreeStyle(商标)MAX CHO表达系统(Lifetechnologies公司制造)进行。质粒导入的方法按照附带的说明书进行。轻链表达载体与重链表达载体以1:2的比率混合使用。
培养液量以200mL进行，在37℃、8％CO2、125rpm的设定条件下培养5天。培养后，对细胞悬浮液进行离心分离，从0.2μm过滤器(ThermoScientific公司制造)中通过，回收含有人源化Lym2抗体的培养上清。
(4)人源化Lym2抗体的纯化
利用以下所示的使用MabSelect SuRe(GE Healthcare公司)的亲和纯化对人源化Lym2抗体进行纯化。将树脂用PBS平衡化后，加载(3)中获取的培养上清，用PBS清洗2次。
清洗后，使用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸、50mM NaCl、pH3.4)将抗体洗脱，添加1/10量的中和缓冲液(1M磷酸-NaOH、pH 7.0)进行中和。接着，使用NAP25(GE Healthcare公司)将缓冲液置换为PBS。使用Amicon Ultra-4离心过滤单元(密理博公司)通过超滤进行浓缩，使用Nanodrop8000(Thermo Scientific公司)测定280nm下的吸光度(A280)，进行抗体溶液的浓度测定和制备。
[实施例7]
chLym2和人源化Lym2抗体的抗原结合活性
用0.25％胰蛋白酶-EDTA(NACALAI TESQUE公司)将FLAG融合人CRTH2表达3Y1-B细胞剥离，用PBS清洗后，在SM中悬浮。接着，以使细胞数为每孔1×105个的方式接种到96孔板中，添加终浓度为50000、12500、3125、781、195、49、12和3ng/mL的各chLym2或人源化Lym2抗体，在4℃下进行60分钟的反应。
将细胞用SM清洗后，添加用SM稀释至500倍的山羊F(ab’)2抗人IgG PE(γ链特异性)(Southern Biotech公司)，在4℃下进行60分钟的反应。用SM清洗细胞后，将细胞在50μL的SM中重悬，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACS CantoII)对荧光强度进行测定。
利用FlowJo 7.65(TOMY DIGITAL BIOLOGY公司)对数据进行分析，由各浓度下的几何平均值进行基于Logistic曲线的曲线拟合，使用统计分析语言R(Ver.3.02)算出chLym2和各人源化Lym2抗体的结合的50％有效浓度(EC50)值及其标准误差(SE)值。将结果示于表1。
[表1]
Figure GDA0001547836100000791
其结果，如表1所示，暗示各种人源化抗体具有与嵌合抗体同等的人CRTH2反应性。
[实施例8]
chLym2和人源化Lym2抗体对嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的除去(depletion)活性
将添加肝素钠注射液采集的人外周血在4℃下以1500rpm离心分离30分钟，回收血浆。
向回收血浆后的含有红细胞的沉淀物中添加PBS(NACALAI TESQUE公司)，恢复至原来的血液容量，对1mL悬浮液添加溶血用溶液[将10×RBC裂解缓冲液(e-bioscience公司)用无菌水稀释至10倍而成]10mL并颠倒混合。在室温下放置10分钟后，在常温下以1500rpm进行5分钟的离心分离，除去上清，用PBS清洗2次。
然后，将细胞沉淀物在所回收的血浆中悬浮，以300μL/孔接种到48孔板中，添加终浓度为1000、100、33、11、3.7、1.2、0.4和0.01ng/mL的各chLym2、各人源化Lym2抗体LV0HV0、LV0HV1、LV0HV2a或同种型对照抗体[使用Clin Cancer Res 2005,11(8),3126-3135记载的编码抗2,4-二硝基苯酚(DNP)IgG1抗体的载体，依照实施例5中记载的方法制作的IgG1抗体(以下记作抗DNP IgG1抗体)]，在37℃、5％CO2温箱内进行20小时反应。
反应后，回收各孔的细胞液，添加SM 10mL，以200μL/样品添加流式细胞术用CountBright绝对计数微珠(Molecular Probes公司)作为对照微珠后，在4℃下以2000rpm进行10分钟的离心分离，除去上清。用SM清洗2次，以300μL/样品添加用SM稀释的10000μg/mL人血清IgG(Sigma-Aldrich公司制造)，悬浮后，在4℃进行30分钟反应。
然后，以40μL/孔接种到96孔板中，作为嗜酸性粒细胞的检测，添加5μL/孔的PE抗人Siglec-8抗体(BioLegend公司)，作为嗜碱性粒细胞的检测，添加5μL/孔的PE-Cy7小鼠抗人CD123(BD Biosciences公司)和抗人Fcε受体I alpha(FcεR1)APC(eBioscience公司)，在4℃下进行40分钟反应。
用SM清洗2次后，用含有1％的7-AAD染色溶液(BD Biosciences公司)的SM将细胞悬浮，在4℃放置10分钟后，使用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACS CantoII)对荧光强度进行分析。
人嗜酸性粒细胞作为FSC-SSC展开的粒细胞级分中的7-AAD阴性siglec8-PE阳性级分检测出来。人嗜碱性粒细胞作为FSC-SSC展开的淋巴细胞级分中的7-AAD阴性、CD123-PC-Cy7阳性、FcεRI-APC阳性级分检测出来。细胞除去活性通过分析按一定数量的CountBright的计数值平均的各细胞的计数值来进行评价。
其结果，如图3(A)～图3(C)所示，可知所评价的人源化Lym2抗体LV0HV0、LV0HV1和LV0HV2a均对于嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞显示出与嵌合Lym2抗体chLym2同等的细胞毒活性。
[实施例9]
比较对照用抗人CRTH2抗体的制作
(1)比较对照用抗人CRTH2抗体表达载体的制作
进行编码国际公开第2014/144865号记载的抗人CRTH2单克隆抗体hu19A2v52、hu8B1v1、mu8B1、mu3C12和mu31A5的VH和VL的氨基酸序列(分别由国际公开第2014/144865号中的SEQ ID Nos：57和40、64和52、62和50、63和51、以及65和53表示)的碱基序列的全合成。
依照实施例5-(1)中记载的方法，为了得到各抗体的VH和VL的组合，将上述碱基序列整合到抗体表达载体中，分别制作5种比较对照用人源化或嵌合抗人CRTH2抗体(分别为hu19A2v52、hu8B1v1、ch8B1、ch3C12和ch31A5)表达载体。
(2)比较对照用抗人CRTH2抗体的瞬时性表达细胞的制作和抗体的纯化
依照实施例5-(2)和(3)中记载的方法，使hu19A2v52、hu8B1v1、ch8B1、ch3C12或ch31A5的抗体表达载体在宿主细胞中进行瞬时性表达，从培养上清中进行各抗体的纯化。
[实施例10]
使用人CRTH2氨基酸置换体表达细胞的、抗人CRTH2单克隆抗体的表位分析
(1)人CRTH2氨基酸置换体表达载体的制作
制作将人CRTH2的氨基酸序列中细胞外区域的氨基酸残基部分地置换为其他氨基酸残基的氨基酸置换体的表达载体。具体而言，分别制作表达对序列号2所表示的氨基酸序列进行了S2A；N4A；T6A和L7A；K8A、P9A和L10A；P12A、L14A和E15A；Q16E、R19H和Q21R；H23A、S24A和N25A；T26A、S27A和I28A；D171A、T172A和I173A；S174A、R175A和L176A；D177A、G178A和R179A；I180A和M181A；Y183A、Y184A和N185A；L187A、L188A和L189A；N190A；P191A；G192A；P193A；D194A；R195A；D196A和T198A；N275A、G277A和L278A；P276A；P279A和L281A；P280A；或者V282A、R283A和R284A的置换的氨基酸置换体的载体。需要说明的是，上记氨基酸置换的符号表示[置换前的氨基酸残基的单字母表示][从N末端开始计数的置换的位置][置换后的氨基酸残基的单字母表示]。
作为表达载体，使用phmAG1-MNLinker(MBL公司)，在BamHI和HindIII的限制酶位点插入编码缺失终止密码子的各种氨基酸置换体的基因，由此在细胞内C末端区域附加Azami-Green的标签。
表达上述氨基酸置换体的载体通过如下方法制作：1)全合成编码氨基酸置换体的基因序列并插入载体的方法；或者2)由插入有编码序列号1所示的野生型人CRTH2氨基酸序列的DNA的载体通过进行定点诱变来制作。
(2)人CRTH2氨基酸置换体瞬时性表达细胞的制成
人CRTH2氨基酸置换体的表达细胞株的制备使用CHO-S细胞(LifeTechnologies公司)。细胞的传代使用含有8mM L-谷氨酰胺(Invitrogen公司)的Free style CHO表达培养基(Invitrogen公司)，在37℃、5％CO2条件下进行振荡培养。
将(1)中制作的25μg的人CRTH2氨基酸置换体表达载体溶解于400μL的Opti-ProSFM(Invitrogen公司)中，另外，将25μL的Freestyle MAX试剂(Invitrogen公司)溶解于400μL的Opti-Pro SFM中，在室温下放置5分钟。将上述二液混合，在室温下放置15分钟。将该混合溶液添加至上述CHO-S培养液中，培养24小时，由此得到人CRTH2氨基酸置换体表达细胞株。
(3)使用人CRTH2氨基酸置换体表达细胞的、获取抗体的反应性分析
将(2)中建立的人CRTH2氨基酸置换体表达CHO-S细胞用SM清洗后，以每孔为2×105细胞的方式接种到96孔板中，以1700rpm进行2分钟的离心分离。除去上清后，添加用SM制备成10μg/mL的chLym2、LV0HV1、实施例9中制作的抗人CRTH2抗体hu19A2v52、hu8B1v1、ch3C12或ch31A5、或者市售大鼠抗人CRTH2抗体BM16(santa cruz公司)，在4℃下进行1小时的反应。
清洗细胞后，在添加有chLym2、LV0HV1、hu19A2v52、hu8B1v1、ch3C12或ch31A5的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的山羊抗人IgG alexa647(Molecular Probes公司)，在添加有BM16的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的山羊抗大鼠IgG alexa647(MolecularProbes公司)，在4℃下进行1小时的反应。
反应后，清洗细胞，用SM将细胞悬浮，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACSCantoII)对荧光强度进行分析。关于分析，从全细胞中对Azami-Green的阳性细胞进行设门，分析该群体中的各抗体的反应性。
另外，为了对各突变体间的表达水平进行校正，将基于各抗体的结合的Alexa647的荧光强度除以在C末端区域附加有Azami-Green的荧光强度，算出相对荧光强度，作为各抗体的反应性。并且，对于各抗体，分析将各抗体对野生型人CRTH2表达细胞的荧光强度设为100％时的、对人CRTH2氨基酸置换体表达细胞的相对荧光强度。
其结果，如图4～图7所示，可知人源化Lym2抗体LV0HV1对P12A、L14A和E15A；D177A、G178A和R179A；I180A和M181A；Y183A、Y184A和N185A；L187A、L188A和L189A；G192A；D194A；R195A；或者D196A和T198A的人CRTH2氨基酸置换体表达细胞的反应性消失。
另外可知，嵌合Lym2抗体chLym2还对D171A、T172A和I173A的人CRTH2氨基酸置换体表达细胞的反应性消失。人源化Lym2抗体LV0HV1对包含D171A、T172A和I173A的人CRTH2氨基酸置换体表达细胞的反应性大幅降低，由此暗示，LV1HV0和chLym2均与相同的表位结合。
另一方面，此次比较的其他抗人CRTH2抗体对与本发明的抗人CRTH2抗体不同位点的人CRTH2氨基酸置换体表达细胞的反应性显著降低，由此表明，现有的其他抗人CRTH2抗体识别与本申请发明的抗体不同的表位。
进一步详细确认对各氨基酸置换体表达细胞的反应性的结果，现有的抗人CRTH2抗体对包含G192A或D194A的氨基酸置换体表达细胞的反应性均不降低，只有本申请发明的抗体对该细胞的反应性降低，由此表明，本申请发明的抗人CRTH2抗体与包含人CRTH2的Gly192和Asp194中的至少一个氨基酸残基的表位结合。
[实施例11]
对人嗜酸性粒细胞的反应性评价
对添加肝素钠注射液采集的人外周血添加等量的注射用生理盐水并混合。向50mL容量的离心管中添加Ficoll-Paque PREMIUM1.084(GE Healthcare公司)15mL，层叠用生理盐水稀释的上述人外周血30mL，在室温下以1500rpm进行30分钟离心分离。
离心分离后，利用吸液器除去血浆层、单核细胞层和一半Ficoll层，并且使用无菌的棉棒除去附着在离心管的壁面的血小板。然后，向各管中分注无菌的冰冷却水27mL，进行30秒钟溶血。
然后，添加冰冷却的10×PIPES缓冲液[在500mL的蒸馏水中溶解32.15g的氯化钠(和光纯药公司)、1.85g的氯化钾(NACALAI TESQUE公司)、38g的PIPES(哌嗪-1,4-双(2-乙基磺酸)(NACALAI TESQUE公司)、8.4g的氢氧化钠(NACALAI TESQUE公司)而成]3mL，恢复至等渗，在4℃下以1200rpm进行5分钟离心分离。离心分离结束后，抽吸上清，添加2mL的1×PIPES缓冲液[使用蒸馏水将10×PIPES缓冲液稀释至10倍而得到的溶液]，将细胞沉淀物打散。
再次重复上述溶血操作，使用在autoMACS冲洗溶液(Miltenyi Biotec公司)中添加MACS BSA储存溶液(Miltenyi Biotec公司)而得到的液体(以下简记为MACS缓冲液)将所得到的细胞沉淀物清洗2次。
计数细胞数后，使用人CD16微珠(Miltenyi Biotec公司)，按照附带的说明书利用阴性选择法分离出嗜酸性粒细胞。
将分离出的细胞用SM清洗后，以每孔为1×105细胞的方式接种到96孔板中，以2000rpm进行2分钟的离心分离。除去上清后，添加用SM稀释的终浓度为10、3.3、1.1、0.37和0.12μg/mL各Lym2抗体、市售CRTH2抗体的BM16(santa cruz公司)或301108(R&D公司)，在4℃下进行1小时的反应。
清洗细胞后，向添加有Lym2抗体或BM16的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的CELL LAB小鼠抗大鼠κ(κ轻链特异性)FITC(贝克曼库尔特公司)，向添加有301108的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的CELL LAB山羊抗小鼠IgG(γ链特异性)荧光素(FITC)偶联物(贝克曼库尔特公司)，在4℃下进行1小时的反应。再次清洗细胞后，将细胞用SM悬浮，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACS CantoII)对荧光强度进行分析。
其结果可知，大鼠抗人CRTH2抗体Lym2对人嗜酸性粒细胞显示出比市售的大鼠抗人CRTH2抗体BM16和小鼠抗人CRTH2抗体301108更强的反应性(图8)。
[实施例12]
对人嗜碱性粒细胞的chLym2的反应性
对添加肝素钠注射液采集的人外周血添加等量的注射用生理盐水并混合。向50mL容量的离心管中添加Ficoll-Paque PREMIUM 1.084(GE Healthcare公司)15mL，层叠用生理盐水稀释的人外周血30mL，在室温下以1500rpm进行30分钟离心分离。
离心分离后，用移液器回收单核细胞层，使用MACS缓冲液清洗2次。计数细胞数后，使用人嗜碱性粒细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec公司制造)，按照附带的说明书利用阴性选择法分离出嗜碱性粒细胞。
将分离出的细胞用SM清洗后，以每孔为5×104细胞的方式接种到96孔板中，以2000rpm进行2分钟的离心分离。除去上清后，用100μL的SM将细胞悬浮，以终浓度为10μg/mL的方式添加使用Zenon Alexa Fluor 647人IgG标记试剂盒(Molecular Probes公司制造)按照附带的说明书进行了标记的chLym2或实施例8记载的同种型对照抗体，在4℃下进行1小时的反应。清洗细胞后，将细胞用SM悬浮，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACSCantoII)对荧光强度进行分析。
其结果，确认到chLym2对人嗜碱性粒细胞的反应性(图9)。因此可知，本申请发明的嵌合抗人CRTH2抗体cLym2与嗜碱性粒细胞结合。
[实施例13]
人源化Lym2抗体对人CD4阳性T细胞的反应性
依照实施例12，将代替Ficoll-Paque PREMIUM 1.084使用Ficoll-Paque PREMIUM(GE Healthcare公司)制备的单核细胞层的细胞悬浮液以100μL/孔接种到96孔板中，以终浓度为10μg/mL的方式添加使用免称重型EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(PIERCE公司)按照附带的说明书进行了生物素标记的人源化Lym2抗体LV0HV1，在4℃下进行1小时的反应。
清洗细胞后，添加用SM稀释的终浓度10μg/mL链霉亲和素Alexa Fluor647偶联物(Molecular Probes公司)、和附带的说明书中记载的量的FITC抗人CD3抗体(BioLegend公司制造)和CD4抗体(克隆SK3、PE偶联)(stem cell technology公司)，在4℃下进行1小时的反应。
再次清洗细胞后，将细胞用SM悬浮，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACSCantoII)对荧光强度进行分析。分析中，通过FSC-SSC展开对淋巴细胞进行分级分离，进一步以CD3阳性且CD4阳性细胞进行分级分离，对于所得到的细胞群，将利用人源化Lym2抗体LV0HV1进行荧光染色的荧光强度示于纵轴，将利用CD4抗体进行荧光染色的荧光强度示于横轴，由此算出CD3阳性CD4阳性细胞中的人源化Lym2抗体LV0HV1的反应性级分的比例。其结果，人源化Lym2抗体LV0HV1与CD3阳性CD4阳性的T细胞级分的约2～3％发生了反应(图10)。
[实施例14]
对嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的细胞毒活性
将与实施例8同样地制备的细胞悬浮液以95μL/孔接种到96孔板中，添加1000、10、3、1、0.3、0.1ng/mL各终浓度的受试抗体，在37℃、5％CO2温箱内进行20小时反应。作为受试抗体，使用人源化Lym2抗体LV0HV1、实施例9中制作的抗人CRTH2抗体hu19A2v52、hu8B1v1、ch3C12和ch31A5。作为同种型对照抗体，使用抗DNP IgG1抗体。
向反应后的各孔中以100μL/孔添加SM，以20μL/孔添加CountBright流式细胞术用绝对计数微珠(Molecular Probes公司)作为对照微珠，在4℃下以2000rpm进行2分钟的离心分离，除去上清。用SM清洗2次，以100μL/孔添加用SM稀释的10000μg/mL人血清IgG(Sigma-Aldrich公司)，在4℃进行30分钟反应。之后，通过与实施例8同样的方法进行。
其结果，人源化抗人CRTH2抗体LV0HV1以抗体浓度依赖性的方式将嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞均除去。与人源化抗人CRTH2抗体LV0HV1相比，现有的抗人CRTH2抗体ch3C12的除去细胞的活性弱[图11(A)和图11(B)]。因此暗示，本申请发明的抗人CRTH2抗体能够发挥出以表达CRTH2的嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞为靶标的治疗效果。
[实施例15]
对Th2细胞的细胞毒活性
将与实施例13同样地制备的单核细胞层用添加有1/10体积FBS(Gibco公司)、200mM-L-谷氨酰胺储存溶液(NACALAI TESQUE公司)、10mM MEM非必需氨基酸溶液(Gibco公司)、100mM丙酮酸钠(Gibco公司)、1M HEPES缓冲溶液(Gibco公司)和1/100体积青霉素-链霉素液体(Gibco公司制造)的RPMI1640(和光纯药公司)[以下记作PBMC(peripheral bloodmononuclear cell，外周血单核细胞)培养基]清洗2次，制备1×107细胞/mL细胞悬浮液。
将所制备的细胞悬浮液以100μL/孔接种到96孔板中，以终浓度10μg/mL添加chLym2抗体、人源化抗人CRTH2抗体LV0HV1或实施例8记载的同种型对照抗体，在37℃、5％CO2温箱内进行20小时反应。
将反应后的细胞用PBMC培养基清洗7次，充分除去受试抗体后，悬浮于100μL的PBMC培养基中，接种到以1μg/mL的浓度固相化有抗CD3抗体OKT3(Abcam公司)的板中。然后，以100μL/孔添加制备成2μg/mL的抗CD28抗体(BD Biosciences公司)，在37℃、5％CO2温箱内进行3天反应。
回收反应后的上清，使用人IFN-γFlex Set(BD Biosciences公司)、人IL-5FlexSet(BD Biosciences公司)、人IL-13Flex Set(BD Biosciences公司)，按照附带的说明书进行上清中细胞因子的定量。
其结果，嵌合抗人CRTH2抗体chLym2和人源化抗人CRTH2抗体LV0HV1使作为Th2细胞因子的IL-5和IL-13的产生减少，但另一方面，作为Th1细胞因子的IFN-γ的产生没有变化。即，暗示本发明的抗体选择性地除去了Th2细胞[图12(A)和图12(B)]。因此，暗示本发明的抗人CRTH2抗体能够发挥出以Th2细胞作为靶标的治疗效果。
[实施例16]
配体存在下的反应性评价(293EBNA)
使用Fugene6(普洛麦格公司)将实施例1-(1)-(ii)中制作的人CRTH2基因表达pAMoh载体导入293EBNA细胞(Invitrogen公司)中，在由10％FBS、0.25mg/mL G418(NACALAITESQUE公司)、100μg/mL青霉素、100U/mL链霉素(NACALAI TESQUE公司)和300μg/mL潮霉素B(和光纯药公司)DMEM构成的培养基中选择耐药剂性细胞，建立人CRTH2表达293EBNA细胞。
用0.02％EDTA溶液(NACALAI TESQUE公司)将人CRTH2表达293EBNA细胞剥离，用PBS清洗后，在上述培养基中悬浮。接着，以达到1×105细胞/90μL/孔的方式接种到96孔板中，以终浓度为10μM的方式添加DKPGD2(Cayman chemical公司)。
在37℃、5％CO2温箱内放置15分钟后，添加0.3、1和3μg/mL各终浓度的人源化Lym2抗体LV0HV1、公知的抗人CRTH2抗体hu19A2v52、hu8B1v1、ch3C12、ch31A5、BM16(santa cruz公司)或301108(R&D公司)，在常温下进行30分钟的反应。
将细胞用SM清洗5次后，向添加有LV0HV1、hu19A2v52、hu8B1v1、ch3C12或ch31A5的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的10μg/mL山羊抗人IgG Alexa647(Molecular Probes公司)，向添加有BM16的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的10μg/mL山羊抗大鼠IgGAlexa647(Molecular Probes公司)，向添加有301108的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的10μg/mL山羊抗小鼠IgG Alexa647(Molecular Probes公司)，在4℃进行40分钟的反应。再次清洗细胞后，将细胞在SM中悬浮，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACSCantoII)对荧光强度进行分析。
其结果，如图13(A)～(C)所示，现有的抗人CRTH2抗体在作为人CRTH2配体的DKPGD2存在下对人CRTH2表达细胞的结合均降低，与此相对，人源化Lym2抗体LV0HV1在所研究的任一抗体浓度下对人CRTH2表达细胞的结合均几乎没有降低。
即，可知本发明的抗体即使在高浓度的配体存在下也具有高反应性。因此，暗示本发明的抗人CRTH2抗体即使在配体存在下也能够以与不存在配体时同等的反应性与人CRTH2表达细胞结合，是能够作用于该人CRTH2表达细胞的有用抗体。
[实施例17]
对分化诱导人肥大细胞的反应性分析
依照Nature Protocols 2006,1(4),2178-2183记载的方法，制备肥大细胞。将分化诱导开始后11周的时间点的肥大细胞用SM清洗，以每孔为5×104细胞的方式接种到96孔板中，添加PE抗人CD203c(E-NPP3)抗体(BioLegend公司制造)、Brilliant Violet 421(商标)抗人CD117(c-kit)抗体(BioLegend公司制造)、抗人FcεIalpha(FcεR1)PE(eBioscience公司制造)，在4℃下进行1小时的反应。清洗细胞后，在SM中悬浮，利用流式细胞仪(BDBiosciences公司制造，FACS CantoII)对荧光强度进行分析。
其结果，可以确认，进行了分化诱导的肥大细胞均表达作为肥大细胞表面标志物的CD203c、CD117、FcεRI。
向分化诱导开始后15周的时间点的肥大细胞培养液中以终浓度10μg/mL添加将抗DNP IgG1抗体的恒定区重组为IgE型的人IgE，在37℃、5％CO2温箱内进行3天反应。
将反应后的肥大细胞用添加有终浓度100μg/mL的青霉素、100U/mL链霉素(NACALAI TESQUE公司)和55μMβ-ME(Gibco公司)的IMDM(Gibco公司)(以下简记为碱性培养基)清洗2次，在4mL的碱性培养基中悬浮，添加终浓度10μg/mL的多克隆兔抗人IgE抗体(Dako公司)，使用MACS mix tube旋转器(Miltenyi Biotec公司)使其旋转，同时在37℃、5％CO2温箱内进行1小时反应。
将反应后的细胞用SM清洗两次，以每孔为5×104个的方式接种到96孔板中，以2000rpm进行2分钟的离心分离。除去上清后，以100μL/孔添加用SM稀释的10000μg/mL人血清IgG(Sigma-Aldrich公司)，在4℃下反应30分钟，以终浓度10μg/mL添加使用免称重型EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(PIERCE公司制造)按照附带的说明书分别进行了生物素标记的人源化抗人CRTH2抗体LV0HV1、抗人CRTH2抗体hu19A2v52、ch8B1、ch3C12或ch31A5、或者未标记的市售的抗人CRTH2抗体BM16(santa cruz公司)或301108(R&D公司)，在4℃下进行1小时的反应。
需要说明的是，作为同种型对照抗体，对于BM16，使用纯化的大鼠IgG2a,κ同种型对照抗体(BioLegend公司制造)；对于301108，使用阴性对照小鼠IgG2a(Dako公司)；对于除此以外的抗体，使用抗DNP IgG1抗体。
清洗细胞后，向添加有生物素标记的LV0HV1、hu19A2v52、ch8B1、ch3C12或ch31A5的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的链霉亲和素、Alexa Fluor 647偶联物(MolecularProbes公司)，向添加有BM16的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的山羊抗大鼠IgGAlexa647(Molecular Probes公司)，向添加有301108的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的山羊抗小鼠IgG Alexa647(Molecular Probes公司)，在4℃下进行40分钟的反应。再次清洗细胞后，将细胞在SM中悬浮，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACS CantoII)对荧光强度进行分析。
其结果，如图14所示，hu19A2v52对肥大细胞显示出反应性，另一方面，对包含LV0HV1的hu19A2v52以外的抗体不显示出反应性。
[实施例18]
对分化诱导Th1的反应性分析
(1)从PBMC分离初始T细胞
将来源于正常人的冷冻PBMC(Allcells公司)用含有50μL无RNase重组DNase I(Roche Diagnostics公司)的20mL PBMC培养基清洗1次，再次悬浮于含有50μL无RNase重组DNase I的20mL PBMC培养基中，在37℃、5％CO2温箱内放置2小时。
然后，用实施例11中记载的MACS缓冲液清洗两次，使用初始人CD4+T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec公司)，按照附带的说明书利用阴性选择法分离出初始CD4阳性T细胞。为了提高初始CD4阳性T细胞的纯度，实施两次上述阴性选择。
(2)从初始CD4阳性T细胞分化诱导Th1细胞
将依照J Immunol,2002.169(5):p.2498-2506记载的方法分离的初始CD4阳性T细胞以1×106细胞/mL悬浮于添加有10％FBS(Gibco公司)和2mM谷氨酸(NACALAI TESQUE公司)的RPMI1640(Gibco公司)(以下简记为培养基)中，作为刺激的步骤，接种到以1μg/mL的浓度固相化有抗CD3抗体OKT3(Abcam公司)的板上，添加终浓度2μg/mL抗CD28抗体(BDBiosciences公司)、100ng/mL重组人IL-12(peprotech公司)、10ng/mL重组人IL-2(peprotech公司)和5μg/mL抗IL-4抗体(BD Biosciences公司)，在37℃、5％CO2温箱内进行4天反应。
然后，回收细胞，通过离心分离除去上清后，以1×106细胞/mL在培养基中悬浮，作为增殖的步骤，添加终浓度100ng/mL重组人IL-12(peprotech公司)、10ng/mL重组人IL-2(peprotech公司制造)和5μg/mL抗IL-4抗体(BD Biosciences公司制造)，在37℃、5％CO2温箱内进行3天反应。
将上述的刺激、增殖的步骤总计重复3次，由此建立分化诱导Th1细胞。
(3)由分化诱导Th1细胞产生细胞因子的分析
向(2)的分化诱导Th1细胞培养液中添加终浓度20ng/mL的12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(Sigma-Aldrich公司)、1μg/mL的来自于链霉菌的离子霉素钙盐(Sigma-Aldrich公司)和10μg/mL的来自于布雷正青霉菌的布雷非德菌素A(Sigma-Aldrich公司)，在37℃、5％CO2温箱内进行6小时反应。然后，以2×105细胞/孔接种到96孔板中，用PBS(NACALAI TESQUE公司)进行清洗。
然后，使用用于405nm激发的LIVE/DEAD可固定水性死细胞染色试剂盒(MolecularProbes公司)，按照附带的说明书对死细胞进行染色，用PBS清洗两次后，除去上清，使用固定缓冲液(BD Biosciences公司)在4℃下进行45分钟反应。
反应后，用PBS清洗1次、用1×Perm/清洗缓冲液(BD Biosciences公司)清洗2次后，添加2.5μL的PE抗人IFN-γ抗体(BioLegend公司)、5μL的APC抗人IL-4抗体(BioLegend公司)、10μL的抗IL-5抗体APC(Miltenyi Biotec公司)和20μL的APC抗人IL-13抗体(BioLegend公司)，在4℃下进行30分钟反应。
然后，用1×Perm/清洗缓冲液清洗2次，将细胞在SM中悬浮，利用流式细胞仪(BDBiosciences公司，FACS CantoII)对荧光强度进行分析。
其结果，可确认分化诱导Th1是IL-4/5/13为阴性、90％为IFNγ阳性的群体，并可以确认其为选择性地产生Th1细胞因子的细胞。
(4)抗人CRTH2抗体对分化诱导Th1细胞的反应性分析
将(2)中建立的分化诱导Th1细胞用SM清洗后，以每孔为5×104细胞的方式接种到96孔板中，以2000rpm进行2分钟的离心分离。除去上清后，添加用SM稀释的10μg/mL大鼠抗人CRTH2抗体Lym2、公知的抗人CRTH2抗体BM16(santa cruz公司)或301108(R&D公司)，在4℃下进行1小时的反应。
作为同种型对照抗体，对于Lym2使用大鼠IgG2b、κ单克隆[RTK4530]-BSA/无叠氮化合物(abcam公司制造)，对于BM16使用纯化的大鼠IgG2a、κ同种型对照抗体(BioLegend公司制造)，对于301108使用阴性对照小鼠IgG2a(Dako公司制造)。
清洗细胞后，向添加有Lym2抗体或BM16的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的10μg/mL CELL LAB小鼠抗大鼠κ(κ轻链特异性)FITC(贝克曼库尔特公司制造)，向添加有301108的孔中以终浓度10μg/mL添加用SM稀释的10μg/mL CELL LAB山羊抗小鼠IgG(γ链特异性)荧光素(FITC)偶联物(贝克曼库尔特公司制造)，在4℃下进行1小时的反应。再次清洗细胞后，将细胞在SM中悬浮，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司制造，FACS CantoII)对荧光强度进行分析。
其结果，如图15所示，大鼠抗人CRTH2抗体Lym2和市售的大鼠抗人CRTH2抗体BM16对分化诱导Th1不显示出反应性。另一方面，市售的小鼠抗人CRTH2抗体301108对分化诱导Th1显示出反应性。
因此可知，本发明的抗人CRTH2抗体虽然与嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和Th2细胞反应，但不与Th1细胞反应。另外可知，301108对于表达CRTH2的细胞以外的细胞也非特异性地显示出反应性。
[实施例19]
以人嗜酸性粒细胞的形态变化为指标的Lym2抗体的拮抗活性评价
利用与实施例11同样的方法，从人外周血进行嗜酸性粒细胞的分离。将分离的人嗜酸性粒细胞在杜氏磷酸缓冲生理盐水(以下记作D-PBS(-))(NACALAI TESQUE公司)中悬浮，在37℃、5％CO2温箱内进行1小时30分钟的反应。然后，使用含有10％FBS的RPMI1640以2×105细胞/孔接种到96孔板中。然后，添加终浓度10μg/mL的同种型对照抗体[CELL LAB大鼠IgG2b同种型对照抗体(贝克曼库尔特公司)]、Lym2抗体或作为阳性对照的终浓度10μM的CRTH2低分子拮抗药OC000459(Cayman chemical公司)，在37℃、5％CO2温箱内进行30分钟反应。
接着，添加0.1、1、10、100和1000nM各终浓度的DKPGD2(Cayman chemical公司)，进一步在37℃、5％CO2温箱内进行60分钟反应。反应后，用冰冷却PBS清洗2次，添加200μL/孔的固定缓冲液(BD Biosciences公司)，充分悬浮后，在4℃下放置30分钟。然后，用SM清洗两次，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACS CantoII)对嗜酸性粒细胞的形态变化进行分析。
嗜酸性粒细胞的形态变化以利用流式细胞仪进行的分析中细胞的大小、细胞的表面积或作为细胞径指标的前向散射光(FSC)散点的增加为指标进行分析，以未进行DKPGD2处理的嗜酸性粒细胞的FSC作为基准，算出在高FSC的设门中检测到的嗜酸性粒细胞的比例(％)。
其结果，如图16所示，人CRTH2配体DKPGD2诱导了浓度依赖性的嗜酸性粒细胞的形态变化，而CRTH2低分子拮抗药OC000459抑制了DKPGD2依赖性的嗜酸性粒细胞的形态变化。与此相对，本发明的抗人CRTH2抗体Lym2和同种型对照抗体均未抑制DKPGD2依赖性的嗜酸性粒细胞的形态变化。即，暗示本发明的抗人CRTH2抗体不具有拮抗活性。
[实施例20]
以人嗜酸性粒细胞的形态变化为指标的Lym2抗体的激动活性评价
在与上述实施例19同样的实验体系中，添加0、0.01、0.1、1和10μg/mL各终浓度的大鼠抗人CRTH2抗体Lym2，进行1小时反应，对嗜酸性粒细胞的形态变化进行分析。
其结果，如图17所示，显示出Lym2抗体即使以抗体浓度0-10μg/mL的范围进行处理也不引起嗜酸性粒细胞的形态变化。即，暗示本发明的抗人CRTH2抗体不具有激动活性。
[实施例21]
以人嗜酸性粒细胞的形态变化为指标的抗人CRTH2抗体的激动活性、拮抗活性、基于配体的信号增强活性的评价
利用与实施例11同样的方法从人外周血进行嗜酸性粒细胞的分离。但是，不进行向血液中添加等量的注射用生理盐水的操作，而直接层叠Ficoll-Paque PREMIUM 1.084(GE Healthcare公司)。将分离出的人嗜酸性粒细胞在D-PBS(-)(NACALAI TESQUE公司)中悬浮，在5％CO2温箱内在37℃下进行1小时30分钟的反应。
然后，使用含有10％FBS的RPMI1640，以0.7×105细胞/孔接种到96孔板中。然后，以终浓度10μg/mL添加同种型对照抗体、人源化Lym2抗体LV0HV1、实施例9中制成的抗人CRTH2抗体hu19A2v52、ch8B1、ch3C12或ch31A5、或者市售的抗人CRTH2抗体BM16(santacruz公司)或301108(R&D公司)，在37℃、5％CO2温箱内进行30分钟反应。
需要说明的是，作为同种型对照抗体，对于BM16使用纯化的大鼠IgG2a、κ同种型对照抗体(BioLegend公司)，对于301108使用阴性对照小鼠IgG2a(Dako公司)，对于其他抗体使用抗DNP IgG1抗体。
接着，添加100nM终浓度的DKPGD2(Cayman chemical公司)或含有10％FBS的RPMI1640，进一步在37℃、5％CO2温箱内进行60分钟反应。反应后，用冰冷却PBS清洗2次，添加100μL/孔的固定缓冲液(BD Biosciences公司)，充分悬浮后，在4℃下放置30分钟。然后，用SM清洗两次，利用与实施例19同样的方法对嗜酸性粒细胞的形态变化进行分析。
其结果，如图18(A)～(C)所示，关于不存在配体的条件下由抗人CRTH2抗体的处理引起的形态变化，尽管在hu19A2v52的情况下多少观察到形态变化的倾向，但不存在引起强形态变化的抗体，暗示所有抗体均不具有激动活性。
另外，关于DKPGD2处理条件下由抗人CRTH2抗体的处理引起的形态变化，通过ch8B1、ch3C12、ch31A5的处理，抑制了由DKPGD2诱发的形态变化，由此暗示这些抗体具有拮抗活性。该结果与现有专利文献(国际公开2014/144865号)中的见解一致。
另一方面，hu19A2v52和BM16使DKPGD2所诱发的形态变化增强。特别是可知hu19A2v52使100nM的DKPGD2所诱发的形态变化增强至约2倍。
如上所述，hu19A2v52和BM16抗体在不存在配体的情况下不诱发形态变化，由此暗示，这些抗体具有增强基于CRTH2配体DKPGD2的信号的活性。
另一方面，LV0HV1和301108与同种型对照抗体同样地在不存在或存在DKPGD2的任何一种条件下对形态变化均未显示出影响，由此暗示其不具有增强基于DKPGD2的信号的活性。
本发明的抗人CRTH2抗体在不会阻断或增强生理信号的方面是优选的。
[实施例22]
CRTH2单克隆抗体对CRTH2活化状态的变迁所伴随的构象变化的反应性评价
(1)辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的制作
使用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo公司)，按照附带资料在人源化Lym2抗体LV0HV1和hu19A2v52上直接标记HRP后，用D-PBS(-)(NACALAI TESQUE公司)稀释至1mg/mL。
(2)人CRTH2表达细胞的膜级分的制备
将实施例1中建立的人CRTH2表达CHO/DG44细胞剥离到0.02％EDTA溶液(NACALAITESQUE公司)中，使用冷却至4℃的D-PBS(-)对细胞进行清洗。使用Minute质膜蛋白分离试剂盒(Invent Biotechnologies)，按照附带资料制备膜级分。
(3)抗人CRTH2抗体对人CRTH2表达细胞的膜级分的反应性的评价
将添加有50mM HEPES(Gibco公司)、5mM MgCl2(NACALAI TESQUE公司)、100mMNaCl(NACALAI TESQUE公司)和1mM EDTA(Invitrogen公司)的50mM Tris-HCl缓冲液pH7.4(NACALAI TESQUE公司)(以下记作ELISA反应液)添加至(2)中制备的膜级分中，制备成1mg/mL，以50μL/管添加至PROTEOSAVE 1.5mL微型管(住友电木公司)中。
接着，以50μL/管进行添加有500μM GTPγS(Roche Diagnostics公司)或500μMGDP(Sigma-Aldrich公司)的ELISA反应液的添加，在30℃下温育1小时。
接着，分别以50μL/管添加用D-PBS(-)稀释至10mg/mL的人血清IgG(Sigma-Aldrich公司)和30％w/v无脂肪酸BSA-PBS(Wako公司)，在30℃下温育30分钟。
接着，利用ELISA反应液将(1)中制作的HRP标记的LV0HV1或hu19A2v52稀释至5μg/mL，以50μL/管进行添加后，在30℃下温育1小时，由此进行抗体对膜级分的反应。以16000g在4℃下离心30分钟后，除去上清。
然后，向原本已添加了GTPγS的管中以1mL/管进行添加有100μM GTPγS的ELISA反应液的添加，向添加有GDP的管中进行添加有100μM GDP的ELISA反应液的添加，再次以16000g在4℃下离心30分钟后，除去上清。将同样的操作重复4次后，以100μL/管添加D-PBS(-)，使膜级分充分悬浮。
将悬浮液以30μL/孔添加至96孔板中，以100μL/孔添加1-StepUltra TMB-ELISA试剂(Thermo scientific公司)。在室温下反应10分钟后，以100μL/孔添加0.5mol/L硫酸(Wako公司)，使反应停止。
利用SPECTRA max 340PC测定480nm下的吸光度，使用Graphpad Prism(ver.6.05)对所得到的结果进行分析。另外，应用Tukey多重比较检验，与显著性差异检验一并实施。
其结果，如图19所示，GDP处理时hu19A2v52对膜级分的反应性与GTPγS处理时相比显著地降低(p<0.0001)。另一方面，LV0HV1的反应性在GTPγS或GDP处理时没有变化(p>0.1)。
已知CRTH2为GPCR，GPCR通常在活化型构象时结合GTP，在非活化型构象时结合GDP。如上述结果所示，本发明的抗人CRTH2抗体无论有无利用GTP类似物GTPγS或GDP进行处理，对CRTH2的反应性均没有变化，由此暗示出不受CRTH2的活化所伴随的构象变化的影响而显示出恒定反应性的可能性。
[实施例23]
Azami-Green融合人和食蟹猴CRTH2表达phmAG1-MNLinker载体的制作
(1)Azami-Green融合人CRTH2表达phmAG1-MNLinker载体的制作
对于实施例1的(1)-(ii)中制作的人CRTH2基因表达pAMoh，使用引物humanCRTH2azami-A(序列号60)和humanCRTH2azami-B(序列号61)通过PCR对目的片段进行扩增，使用限制酶BamHI和HindIII与载体phmAG1-MNLinker(MBL公司)连接，构建Azami-Green融合人CRTH2表达phmAG1-MNLinker载体。
(2)Azami-Green融合食蟹猴CRTH2表达phmAG1-MNLinker载体的制作
对于使用全合成的食蟹猴CRTH2的cDNA(cDNA序列：序列号62、氨基酸序列：序列号63)利用与实施例1的(1)-(ii)同样的方法构建的食蟹猴CRTH2表达pMoh载体，使用引物cynoCRTH2azami-A(序列号64)和cynoCRTH2azami-B(序列号65)，与(1)同样地构建Azami-Green融合食蟹猴CRTH2表达phmAG1-MNLinker载体。
[实施例24]
Azami-Green融合人CRTH2表达CHO/DG44细胞和食蟹猴CRTH2表达CHO/DG44细胞的制成
通过限制酶BsaI处理将实施例23中制作的人和食蟹猴CRTH2基因表达phmAG1-MNLinker载体切断，将所得到的直链状DNA进行纯化，溶解于无菌水中。利用电穿孔法将该DNA导入CHO/DG44细胞中，在IMDM培养基中培养约3天。
然后，在添加有0.5mg/mL G418(NACALAI TESQUE公司)的IMDM选择培养基中选择耐药剂性细胞。用0.25％胰蛋白酶-EDTA(NACALAI TESQUE公司)将选择出的耐药剂性细胞剥离，用PBS清洗后，在IMDM选择培养基中悬浮。然后，使用细胞分选仪SH800(Sony公司)，分别对于在人CRTH2表达细胞和食蟹猴CRTH2表达细胞中显示出相同程度的Azami-Green荧光强度的细胞群体进行设门，以1个细胞/孔进行分选，进行扩大培养，分别建立Azami-Green融合人CRTH2表达CHO/DG44细胞和食蟹猴CRTH2表达CHO/DG44细胞。
对于Azami-Green融合人CRTH2表达CHO/DG44细胞和食蟹猴CRTH2表达CHO/DG44细胞，利用与上述同样的方法进行细胞制备，使用流式细胞仪(BD Biosciences公司，FACSCantoII)进行Azami-Green的表达确认。其结果，如图20所示，确认了各细胞的Azami-Green的表达为同等程度。
[实施例25]
人源化Lym2抗体LV0HV1对人或食蟹猴CRTH2的结合活性评价
用0.02％EDTA溶液(NACALAI TESQUE公司制造)将实施例24中建立的Azami-Green融合人或食蟹猴CRTH2表达CHO/DG44细胞剥离，用PBS清洗后，在SM中悬浮。接着，与使细胞数为每孔2×105个的方式接种到96孔板中，添加30000、7500、1875、469、117、29、7和2ng/mL各终浓度的人源化Lym2抗体LV0HV1或抗DNP IgG1抗体，在4℃下进行40分钟的反应。
将细胞用SM清洗3次后，以每孔100μL添加用SM稀释为10μg/mL浓度的山羊抗人IgGalexa647(Molecular Probes公司制造)，在4℃下进行40分钟的反应。用SM清洗细胞后，将细胞在100μL的SM中再悬浮，利用流式细胞仪(BD Biosciences公司制造，FACS CantoII)对荧光强度进行测定。
利用FlowJo 7.65(TOMY DIGITAL BIOLOGY公司)对数据进行分析。其结果，如图21所示，可知LV0HV1对人CRTH2和猴CRTH2显示出几乎同等的结合性。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供通过识别、结合人CRTH2的特征性表位而具有所期望的活性的抗人CRTH2抗体、该抗体片段、编码该抗体的氨基酸序列的DNA、包含该DNA的载体、生产该抗体的杂交瘤和抗体生产细胞、该抗体的制造方法、包含该抗体或抗体片段的组合物、使用该抗体或抗体片段的过敏性疾病、自身免疫疾病、伴有嗜酸性粒细胞增多或功能亢进的疾病、伴有Th2细胞的增多或功能亢进的疾病等的治疗方法和诊断方法、以及包含该抗体或抗体片段的药物和诊断剂。
使用特定的方式详细地对本发明进行了说明，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以在不脱离本发明的意图和范围的情况下进行各种变更和变形。需要说明的是，本申请基于2015年7月15日提交的日本专利申请(日本特愿2015-141633)，通过引用将其全部内容援引于此。
序列表自由文本
序列号3：人工序列的记载：humanCRTH2FLAG-A的碱基序列
序列号4：人工序列的记载：humanCRTH2FLAG-B的碱基序列
序列号5：人工序列的记载：带FLAG标签的人CRTH2cDNA的碱基序列
序列号6：人工序列的记载：humanCRTH2FLAG-C的碱基序列
序列号7：人工序列的记载：humanCRTH2FLAG-D的碱基序列
序列号8：人工序列的记载：RatIgG2bH-A的碱基序列
序列号9：人工序列的记载：RatIgG2bH-B的碱基序列
序列号10：人工序列的记载：Ratk-A的碱基序列
序列号11：人工序列的记载：Ratk-B的碱基序列
序列号20：人工序列的记载：Lym2抗体VH CDR1的氨基酸序列
序列号21：人工序列的记载：Lym2抗体VH CDR2的氨基酸序列
序列号22：人工序列的记载：Lym2抗体VH CDR3的氨基酸序列
序列号23：人工序列的记载：Lym2抗体VL CDR1的氨基酸序列
序列号24：人工序列的记载：Lym2抗体VL CDR2的氨基酸序列
序列号25：人工序列的记载：Lym2抗体VL CDR3的氨基酸序列
序列号26：人工序列的记载：chLym2表达载体用VH的合成DNA
序列号27：人工序列的记载：chLym2表达载体用VL的合成DNA
序列号28：人工序列的记载：chLym2VH-A的碱基序列
序列号29：人工序列的记载：chLym2VH-B的碱基序列
序列号30：人工序列的记载：chLym2VH-C的碱基序列
序列号31：人工序列的记载：chLym2VH-D的碱基序列
序列号32：人工序列的记载：LV0的碱基序列
序列号33：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号34：人工序列的记载：LV1的碱基序列
序列号35：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号36：人工序列的记载：LV2a的碱基序列
序列号37：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号38：人工序列的记载：LV2b的碱基序列
序列号39：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号40：人工序列的记载：LV2c的碱基序列
序列号41：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号42：人工序列的记载：LV3a的碱基序列
序列号43：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号44：人工序列的记载：LV3b的碱基序列
序列号45：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号46：人工序列的记载：LV4的碱基序列
序列号47：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号48：人工序列的记载：HV0的碱基序列
序列号49：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号50：人工序列的记载：HV1的碱基序列
序列号51：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号52：人工序列的记载：HV2a的碱基序列
序列号53：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号54：人工序列的记载：HV2b的碱基序列
序列号55：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号56：人工序列的记载：HV3的碱基序列
序列号57：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号58：人工序列的记载：HV4的碱基序列
序列号59：人工序列的记载：合成构建体的氨基酸序列
序列号60：人工序列的记载：human CRTH2azami-A的碱基序列
序列号61：人工序列的记载：human CRTH2azami-B的碱基序列
序列号64：人工序列的记载：cyno CRTH2azami-A的碱基序列
序列号65：人工序列的记载：cyno CRTH2azami-B的碱基序列
序列表
<110> 协和发酵麒麟株式会社(Kyowa Hakko Kirin, Co., Ltd.)
<120> 与人CRTH2特异性结合的抗体(antibody specifically binding to humanCRTH2)
<130> W520787
<150> JP2015-141633
<151> 2015-7-15
<160> 65
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1188
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1188)
<400> 1
atg tcg gcc aac gcc aca ctg aag cca ctc tgc ccc atc ctg gag cag 48
Met Ser Ala Asn Ala Thr Leu Lys Pro Leu Cys Pro Ile Leu Glu Gln
1 5 10 15
atg agc cgt ctc cag agc cac agc aac acc agc atc cgc tac atc gac 96
Met Ser Arg Leu Gln Ser His Ser Asn Thr Ser Ile Arg Tyr Ile Asp
20 25 30
cac gcg gcc gtg ctg ctg cac ggg ctg gcc tcg ctg ctg ggc ctg gtg 144
His Ala Ala Val Leu Leu His Gly Leu Ala Ser Leu Leu Gly Leu Val
35 40 45
gag aat gga gtc atc ctc ttc gtg gtg ggc tgc cgc atg cgc cag acc 192
Glu Asn Gly Val Ile Leu Phe Val Val Gly Cys Arg Met Arg Gln Thr
50 55 60
gtg gtc acc acc tgg gtg ctg cac ctg gcg ctg tcc gac ctg ttg gcc 240
Val Val Thr Thr Trp Val Leu His Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ala
65 70 75 80
tct gct tcc ctg ccc ttc ttc acc tac ttc ttg gcc gtg ggc cac tcg 288
Ser Ala Ser Leu Pro Phe Phe Thr Tyr Phe Leu Ala Val Gly His Ser
85 90 95
tgg gag ctg ggc acc acc ttc tgc aaa ctg cac tcc tcc atc ttc ttt 336
Trp Glu Leu Gly Thr Thr Phe Cys Lys Leu His Ser Ser Ile Phe Phe
100 105 110
ctc aac atg ttc gcc agc ggc ttc ctg ctc agc gcc atc agc ctg gac 384
Leu Asn Met Phe Ala Ser Gly Phe Leu Leu Ser Ala Ile Ser Leu Asp
115 120 125
cgc tgc ctg cag gtg gtg cgg ccg gtg tgg gcg cag aac cac cgc acc 432
Arg Cys Leu Gln Val Val Arg Pro Val Trp Ala Gln Asn His Arg Thr
130 135 140
gtg gcc gcg gcg cac aaa gtc tgc ctg gtg ctt tgg gca cta gcg gtg 480
Val Ala Ala Ala His Lys Val Cys Leu Val Leu Trp Ala Leu Ala Val
145 150 155 160
ctc aac acg gtg ccc tat ttc gtg ttc cgg gac acc atc tcg cgg ctg 528
Leu Asn Thr Val Pro Tyr Phe Val Phe Arg Asp Thr Ile Ser Arg Leu
165 170 175
gac ggg cgc att atg tgc tac tac aat gtg ctg ctc ctg aac ccg ggg 576
Asp Gly Arg Ile Met Cys Tyr Tyr Asn Val Leu Leu Leu Asn Pro Gly
180 185 190
cct gac cgc gat gcc acg tgc aac tcg cgg cag gtg gcc ctg gcc gtc 624
Pro Asp Arg Asp Ala Thr Cys Asn Ser Arg Gln Val Ala Leu Ala Val
195 200 205
agc aag ttc ctg ctg gcc ttc ctg gtg ccg ctg gcg atc atc gcc tcg 672
Ser Lys Phe Leu Leu Ala Phe Leu Val Pro Leu Ala Ile Ile Ala Ser
210 215 220
agc cac gcg gcc gtg agc ctg cgg ttg cag cac cgc ggc cgc cgg cgg 720
Ser His Ala Ala Val Ser Leu Arg Leu Gln His Arg Gly Arg Arg Arg
225 230 235 240
cca ggc cgc ttc gtg cgc ctg gtg gcg gcc gtc gtg gcc gcc ttc gcg 768
Pro Gly Arg Phe Val Arg Leu Val Ala Ala Val Val Ala Ala Phe Ala
245 250 255
ctc tgc tgg ggg ccc tac cac gtg ttc agc ctg ctg gag gcg cgg gcg 816
Leu Cys Trp Gly Pro Tyr His Val Phe Ser Leu Leu Glu Ala Arg Ala
260 265 270
cac gca aac ccg ggg ctg cgg ccg ctc gtg tgg cgc ggg ctg ccc ttc 864
His Ala Asn Pro Gly Leu Arg Pro Leu Val Trp Arg Gly Leu Pro Phe
275 280 285
gtc acc agc ctg gcc ttc ttc aac agc gtg gcc aac ccg gtg ctc tac 912
Val Thr Ser Leu Ala Phe Phe Asn Ser Val Ala Asn Pro Val Leu Tyr
290 295 300
gtg ctc acc tgc ccc gac atg ctg cgc aag ctg cgg cgc tcg ctg cgc 960
Val Leu Thr Cys Pro Asp Met Leu Arg Lys Leu Arg Arg Ser Leu Arg
305 310 315 320
acg gtg ctg gag agc gtg ctg gtg gac gac agc gag ctg ggt ggc gcg 1008
Thr Val Leu Glu Ser Val Leu Val Asp Asp Ser Glu Leu Gly Gly Ala
325 330 335
gga agc agc cgc cgc cgc cgc acc tcc tcc acc gcc cgc tcg gcc tcc 1056
Gly Ser Ser Arg Arg Arg Arg Thr Ser Ser Thr Ala Arg Ser Ala Ser
340 345 350
cct tta gct ctc tgc agc cgc ccg gag gaa ccg cgg ggc ccc gcg cgt 1104
Pro Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Glu Glu Pro Arg Gly Pro Ala Arg
355 360 365
ctc ctc ggc tgg ctg ctg ggc agc tgc gca gcg tcc ccg cag acg ggc 1152
Leu Leu Gly Trp Leu Leu Gly Ser Cys Ala Ala Ser Pro Gln Thr Gly
370 375 380
ccc ctg aac cgg gcg ctg agc agc acc tcg agt tag 1188
Pro Leu Asn Arg Ala Leu Ser Ser Thr Ser Ser
385 390 395
<210> 2
<211> 395
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ser Ala Asn Ala Thr Leu Lys Pro Leu Cys Pro Ile Leu Glu Gln
1 5 10 15
Met Ser Arg Leu Gln Ser His Ser Asn Thr Ser Ile Arg Tyr Ile Asp
20 25 30
His Ala Ala Val Leu Leu His Gly Leu Ala Ser Leu Leu Gly Leu Val
35 40 45
Glu Asn Gly Val Ile Leu Phe Val Val Gly Cys Arg Met Arg Gln Thr
50 55 60
Val Val Thr Thr Trp Val Leu His Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ala
65 70 75 80
Ser Ala Ser Leu Pro Phe Phe Thr Tyr Phe Leu Ala Val Gly His Ser
85 90 95
Trp Glu Leu Gly Thr Thr Phe Cys Lys Leu His Ser Ser Ile Phe Phe
100 105 110
Leu Asn Met Phe Ala Ser Gly Phe Leu Leu Ser Ala Ile Ser Leu Asp
115 120 125
Arg Cys Leu Gln Val Val Arg Pro Val Trp Ala Gln Asn His Arg Thr
130 135 140
Val Ala Ala Ala His Lys Val Cys Leu Val Leu Trp Ala Leu Ala Val
145 150 155 160
Leu Asn Thr Val Pro Tyr Phe Val Phe Arg Asp Thr Ile Ser Arg Leu
165 170 175
Asp Gly Arg Ile Met Cys Tyr Tyr Asn Val Leu Leu Leu Asn Pro Gly
180 185 190
Pro Asp Arg Asp Ala Thr Cys Asn Ser Arg Gln Val Ala Leu Ala Val
195 200 205
Ser Lys Phe Leu Leu Ala Phe Leu Val Pro Leu Ala Ile Ile Ala Ser
210 215 220
Ser His Ala Ala Val Ser Leu Arg Leu Gln His Arg Gly Arg Arg Arg
225 230 235 240
Pro Gly Arg Phe Val Arg Leu Val Ala Ala Val Val Ala Ala Phe Ala
245 250 255
Leu Cys Trp Gly Pro Tyr His Val Phe Ser Leu Leu Glu Ala Arg Ala
260 265 270
His Ala Asn Pro Gly Leu Arg Pro Leu Val Trp Arg Gly Leu Pro Phe
275 280 285
Val Thr Ser Leu Ala Phe Phe Asn Ser Val Ala Asn Pro Val Leu Tyr
290 295 300
Val Leu Thr Cys Pro Asp Met Leu Arg Lys Leu Arg Arg Ser Leu Arg
305 310 315 320
Thr Val Leu Glu Ser Val Leu Val Asp Asp Ser Glu Leu Gly Gly Ala
325 330 335
Gly Ser Ser Arg Arg Arg Arg Thr Ser Ser Thr Ala Arg Ser Ala Ser
340 345 350
Pro Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Glu Glu Pro Arg Gly Pro Ala Arg
355 360 365
Leu Leu Gly Trp Leu Leu Gly Ser Cys Ala Ala Ser Pro Gln Thr Gly
370 375 380
Pro Leu Asn Arg Ala Leu Ser Ser Thr Ser Ser
385 390 395
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: human CRTH2 FLAG-A
<400> 3
cataagcttg ccaccatgtc ggccaac 27
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: human CRTH2 FLAG-B
<400> 4
catggtaccc tacttatcgt cgtcatcctt gtaatcactc gaggtgctgc tcagcgcccg 60
gttcag 66
<210> 5
<211> 1212
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: FLAG tagged human CRTH2
cDNA
<400> 5
atgtcggcca acgccacact gaagccactc tgccccatcc tggagcagat gagccgtctc 60
cagagccaca gcaacaccag catccgctac atcgaccacg cggccgtgct gctgcacggg 120
ctggcctcgc tgctgggcct ggtggagaat ggagtcatcc tcttcgtggt gggctgccgc 180
atgcgccaga ccgtggtcac cacctgggtg ctgcacctgg cgctgtccga cctgttggcc 240
tctgcttccc tgcccttctt cacctacttc ttggccgtgg gccactcgtg ggagctgggc 300
accaccttct gcaaactgca ctcctccatc ttctttctca acatgttcgc cagcggcttc 360
ctgctcagcg ccatcagcct ggaccgctgc ctgcaggtgg tgcggccggt gtgggcgcag 420
aaccaccgca ccgtggccgc ggcgcacaaa gtctgcctgg tgctttgggc actagcggtg 480
ctcaacacgg tgccctattt cgtgttccgg gacaccatct cgcggctgga cgggcgcatt 540
atgtgctact acaatgtgct gctcctgaac ccggggcctg accgcgatgc cacgtgcaac 600
tcgcggcagg tggccctggc cgtcagcaag ttcctgctgg ccttcctggt gccgctggcg 660
atcatcgcct cgagccacgc ggccgtgagc ctgcggttgc agcaccgcgg ccgccggcgg 720
ccaggccgct tcgtgcgcct ggtggcggcc gtcgtggccg ccttcgcgct ctgctggggg 780
ccctaccacg tgttcagcct gctggaggcg cgggcgcacg caaacccggg gctgcggccg 840
ctcgtgtggc gcgggctgcc cttcgtcacc agcctggcct tcttcaacag cgtggccaac 900
ccggtgctct acgtgctcac ctgccccgac atgctgcgca agctgcggcg ctcgctgcgc 960
acggtgctgg agagcgtgct ggtggacgac agcgagctgg gtggcgcggg aagcagccgc 1020
cgccgccgca cctcctccac cgcccgctcg gcctcccctt tagctctctg cagccgcccg 1080
gaggaaccgc ggggccccgc gcgtctcctc ggctggctgc tgggcagctg cgcagcgtcc 1140
ccgcagacgg gccccctgaa ccgggcgctg agcagcacct cgagtgatta caaggatgac 1200
gacgataagt ag 1212
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: human CRTH2 FLAG-C
<400> 6
catgaattcg ccaccatgtc ggccaac 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: human CRTH2 FLAG-D
<400> 7
catggtaccc tacttatcgt cgtcatc 27
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: RatIgG2bH-A
<400> 8
cgctggacag ggctccagag ttcc 24
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: RatIgG2bH-B
<400> 9
gggcatgtag ggcatttgtg tccaatgc 28
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: Ratk-A
<400> 10
gactgaggca cctccagttg ctaactgttc c 31
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: Ratk-B
<400> 11
cctgttgaag ctcttgacga cgggtgagg 29
<210> 12
<211> 426
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(426)
<400> 12
atg gac atc agg ctc agc ttg gct ttc ctt gtc ctt ttc ata aaa ggt 48
Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly
1 5 10 15
gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag 96
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
cct gga agg tcc atg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act ttc 144
Pro Gly Arg Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
agt aac tat tac atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca aag aag ggt ctg 192
Ser Asn Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu
50 55 60
gag tgg gtc gca acc att agt tat gat ggt agt agc act tac tat cga 240
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg
65 70 75 80
gac tcc gtg aag ggc cga ttc act atc tcc aga gat aat gca aaa agc 288
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser
85 90 95
acc cta tac ctg caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act 336
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
tat tac tgt gca aga cat cgg ggt tat tac tac agt ggg gcg ggg tac 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ala Gly Tyr
115 120 125
ttt gat tac tgg ggc caa gga gtc atg gtc aca gtc tcc tca 426
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 13
<211> 142
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 13
Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ala Gly Tyr
115 120 125
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 14
<211> 393
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(393)
<400> 14
atg aaa gtg cct ggt agg ctg ctg gtg ctg ttg ttt tgg att cca gct 48
Met Lys Val Pro Gly Arg Leu Leu Val Leu Leu Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
tcc agg agt gat gtt gtg ttg aca caa act cca gtt tcc ctg tct gtc 96
Ser Arg Ser Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val
20 25 30
aca ctt gga gat caa gct tct ata tct tgc agg tct agt cag agc ctg 144
Thr Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
gaa tat agt gat gga tac act tat ttg gaa tgg tac cta cag aag cca 192
Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
ggc cag tct cca cag gtc ctc atc tat gga gtt tcc aac cga ttt tct 240
Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
ggg gtc cca gac agg ttc att ggc agt ggg tca ggg aca gat ttc acc 288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc aag atc agc aga gta gag cct gag gac ttg gga gtt tat tac tgc 336
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
ttc caa gct aca cat gat cct ctc acg ttc ggc tca ggg acg aag ttg 384
Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
gaa ata aaa 393
Glu Ile Lys
130
<210> 15
<211> 131
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 15
Met Lys Val Pro Gly Arg Leu Leu Val Leu Leu Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Arg Ser Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val
20 25 30
Thr Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 16
<211> 369
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(369)
<400> 16
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga agg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
tcc atg aaa ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc act ttc agt aac tat 96
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
tac atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca aag aag ggt ctg gag tgg gtc 144
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt tat gat ggt agt agc act tac tat cga gac tcc gtg 192
Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc act atc tcc aga gat aat gca aaa agc acc cta tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga cat cgg ggt tat tac tac agt ggg gcg ggg tac ttt gat tac 336
Ala Arg His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
tgg ggc caa gga gtc atg gtc aca gtc tcc tca 369
Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 123
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 336
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 18
gat gtt gtg ttg aca caa act cca gtt tcc ctg tct gtc aca ctt gga 48
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
gat caa gct tct ata tct tgc agg tct agt cag agc ctg gaa tat agt 96
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser
20 25 30
gat gga tac act tat ttg gaa tgg tac cta cag aag cca ggc cag tct 144
Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca cag gtc ctc atc tat gga gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc att ggc agt ggg tca ggg aca gat ttc acc ctc aag atc 240
Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
agc aga gta gag cct gag gac ttg gga gtt tat tac tgc ttc caa gct 288
Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
85 90 95
aca cat gat cct ctc acg ttc ggc tca ggg acg aag ttg gaa ata aaa 336
Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 19
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
85 90 95
Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: Lym2 VH CDR1 amino acid
<400> 20
Asn Tyr Tyr Met Ala
1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: Lym2 VH CDR2 amino acid
<400> 21
Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: Lym2 VH CDR3 amino acid
<400> 22
His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: Lym2 VL CDR1 amino acid
<400> 23
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: Lym2 VL CDR2 amino acid
<400> 24
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: Lym2 VL CDR3 amino acid
<400> 25
Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 26
<211> 437
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: synthetic DNA of chLym2
VH for vector
<400> 26
gacccctcac catgaatctg gggctgtcgc tgatcttcct ggcgctgatc ctgaagggcg 60
tgcagtgcga agtgcagctt gtcgaatccg gcggcgggct tgttcagccc gggcgctcga 120
tgaagctgtc gtgcgccgcg tccggcttca cgttctcgaa ctactacatg gcgtgggtgc 180
gccaggcgcc gaagaagggg ctggagtggg tcgcgacgat ctcgtacgac ggctcgtcga 240
cgtactatcg cgattccgtg aaggggcgct tcacgatctc gcgcgacaac gcgaagtcga 300
cgctgtatct gcagatggat tcgctgcgct ccgaggatac cgcgacgtac tactgcgcgc 360
gccatcgcgg ctactactac tccggcgccg gctacttcga ctactggggg cagggcgtga 420
tggtgaccgt gtcgtcc 437
<210> 27
<211> 404
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: synthetic DNA of chLym2
VL for vector
<400> 27
gcctcttcac catgaagctg cccgttcgcc tgcttgtgct gatgttctgg atccccgcgt 60
cgtcgtccga cgtcgtgctg acgcagacgc ccgtgtcgct gtccgtgacg ctgggcgatc 120
aggcgtcgat ctcgtgtcgc tcgtcgcagt cgctggagta ctccgacggc tacacgtatc 180
tggagtggta tctgcagaag cccgggcagt cgccgcaggt gctgatctac ggcgtgtcga 240
atcgcttctc cggcgttccc gatcgcttca tcggctccgg ctccgggacc gacttcacgc 300
tgaagatctc gcgcgtcgaa cccgaggatc tgggcgtgta ctactgcttc caggcgacgc 360
acgatccgct gacgttcggc tccgggacga agctggagat caag 404
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: chLym2 VH-A
<400> 28
atcacagatc gtcgacgacc cctcaccatg aatctg 36
<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: chLym2 VH-B
<400> 29
ggcccttggt gctagcggac gacacggtca ccatc 35
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: chLym2 VH-C
<400> 30
acgccatcac agatctgcct cttcaccatg aagctg 36
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: chLym2 VH-D
<400> 31
gtgcagccac cgtacgcttg atctccagct tcgtc 35
<210> 32
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: LV0 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 32
gac atc gtg atg acg cag acg ccg ctg tcg ctg ccc gtt acg ccc ggc 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
gaa tcc gcg tcg atc tcg tgt cgc tcg tcg cag tcg ctg gag tac tcc 96
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser
20 25 30
gac ggc tac acg tat ctg gag tgg tat ctg cag aag ccc ggg cag tcg 144
Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
ccg cag gtg ctg atc tac ggc gtg tcg aat cgc ttc tcc ggc gtt ccc 192
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
gat cgc ttc tcc ggc tcc ggc tcc ggg acc gac ttc acg ctg aag atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
tcg cgc gtc gag gcc gag gac gtc ggc gtg tac tac tgc ttc cag gcg 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
85 90 95
acg cac gat ccg ctg acg ttc ggg cag ggg acg aag ctg gag atc aag 336
Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
85 90 95
Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 34
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: LV1 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 34
gac atc gtg atg acg cag acg ccg ctg tcg ctg ccc gtg acg ctg ggc 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
gag tcc gcg tcg atc tcg tgt cgc tcg tcg cag tcg ctg gag tac tcc 96
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser
20 25 30
gac ggc tac acg tat ctg gag tgg tat ctg cag aag ccc ggg cag tcg 144
Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
ccg cag gtg ctg atc tac ggc gtg tcg aat cgc ttc tcc ggc gtt ccc 192
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
gat cgc ttc tcc ggc tcc ggc tcc ggg acc gac ttc acg ctg aag atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
tcg cgc gtc gag gcc gag gac gtc ggc gtg tac tac tgc ttc cag gcg 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
85 90 95
acg cac gat ccg ctg acg ttc ggg cag ggg acg aag ctg gag atc aag 336
Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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gcg cgc cat cgc ggc tac tac tac tcc ggc gcc ggc tac ttc gac tac 336
Ala Arg His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
tgg ggg cag ggc gtg atg gtg acc gtg tcg tcc 369
Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> Artificial
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<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> Artificial
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gaa gtg cag ctt gtc gaa tcc ggc ggc ggc gtc gtt cag ccc ggg cgc 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
tcg atg cgc ctg tcg tgc gcc gcg tcc ggc ttc acg ttc tcg aac tac 96
Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
tac atg gcg tgg gtg cgc cag gcg ccc ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcg acg atc tcg tac gac ggc tcg tcg acg tac tat cgc gat tcc gtg 192
Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
aag ggg cgc ttc acg atc tcg cgc gac aac gcg aag aac tcg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
ctg cag atg aac tcg ctg cgc gcc gag gat acc gcg acg tac tac tgc 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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gcg cgc cat cgc ggc tac tac tac tcc ggc gcc ggc tac ttc gac tac 336
Ala Arg His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
tgg ggg cag ggc gtg atg gtg acc gtg tcg tcc 369
Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
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Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcg acg atc tcg tac gac ggc tcg tcg acg tac tat cgc gat tcc gtg 192
Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
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aag ggg cgc ttc acg atc tcg cgc gac aac gcg aag tcg tcg ctg tat 240
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ctg cag atg aac tcg ctg cgc gcc gag gat acc gcg acg tac tac tgc 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<212> DNA
<213> Macaca fascicularis
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cggagccaca gcaacaccag catccgctac atcgaccacg cgaccgtgct gctgcacggg 120
ctggcctcgc tgctgggcct ggtggagaac ggagtcatcc tcttcgtggt gggctgccgc 180
atgcgccaga ccgtggtcac cacctgggtg ctacacctgg cactgtctga cctgttggcc 240
tctgcttccc tgcccttctt cacctacttc ttggccgtgg gccactcgtg ggagctgggc 300
accaccttct gcaaactgca ttcctccatc ttctttctca acatgtttgc cagcggcttc 360
ctgctcagcg ccatcagcct ggaccgctgc ctgcaggtgg tgtggccggt gtgggcgcag 420
aaccaccgca ccgtggccgc agcgcacaaa gtctgcctgg tgctctgggc actagcagtg 480
ctcaacacgg tgccctattt cgtgttccgg gacaccatct cacggctgga tgggcgcatc 540
atgtgctact acaacgtgct gctcctgaac ccggggcctg accgtgacgc cacgtgcaac 600
tcgcgccagg cggccctggc agtcagcaag ttcctgctgg ccttcctggt gccgctggcg 660
atcatcgcct cgagccatgc ggccgtgagc ctgcgactgc agcaccgcgg acgccggcgg 720
cccggccgct ttgtgcgcct ggtggcggcc gtcgtggcgg ccttcgcact ctgctggggg 780
ccctaccacg tgttcagcct gctggaggcg cgggcgcacg ccaaccccgg gttgcggccg 840
cttgtgtggc gcgggctgcc cttcgtcacc agcctggcct tcttcaacag cgtggccaac 900
ccggtgctct acgtgctcac ctgccccgac atgctgcgca agctgcggcg ctcgctgcgc 960
acggtgctgg agagcgtgct ggtggacgac agcgagctgg gtggcgcggg aagcagccgc 1020
cgccgccgcc gcaccccctc cacggcccgc tcggcctcct ccttagctct cagcagccgc 1080
cccgaggaac ggcggggccc cgcgcgcctc ttcggctggc tgctgggcgg ctgcgcagcg 1140
tccccgcaga ggggccccct gaaccgggcg ctgagcagca cctcgagtta g 1191
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<211> 396
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 63
Met Ser Ala Asn Ala Thr Leu Lys Pro Leu Cys Pro Ile Leu Glu Glu
1 5 10 15
Met Ser His Leu Arg Ser His Ser Asn Thr Ser Ile Arg Tyr Ile Asp
20 25 30
His Ala Thr Val Leu Leu His Gly Leu Ala Ser Leu Leu Gly Leu Val
35 40 45
Glu Asn Gly Val Ile Leu Phe Val Val Gly Cys Arg Met Arg Gln Thr
50 55 60
Val Val Thr Thr Trp Val Leu His Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ala
65 70 75 80
Ser Ala Ser Leu Pro Phe Phe Thr Tyr Phe Leu Ala Val Gly His Ser
85 90 95
Trp Glu Leu Gly Thr Thr Phe Cys Lys Leu His Ser Ser Ile Phe Phe
100 105 110
Leu Asn Met Phe Ala Ser Gly Phe Leu Leu Ser Ala Ile Ser Leu Asp
115 120 125
Arg Cys Leu Gln Val Val Trp Pro Val Trp Ala Gln Asn His Arg Thr
130 135 140
Val Ala Ala Ala His Lys Val Cys Leu Val Leu Trp Ala Leu Ala Val
145 150 155 160
Leu Asn Thr Val Pro Tyr Phe Val Phe Arg Asp Thr Ile Ser Arg Leu
165 170 175
Asp Gly Arg Ile Met Cys Tyr Tyr Asn Val Leu Leu Leu Asn Pro Gly
180 185 190
Pro Asp Arg Asp Ala Thr Cys Asn Ser Arg Gln Ala Ala Leu Ala Val
195 200 205
Ser Lys Phe Leu Leu Ala Phe Leu Val Pro Leu Ala Ile Ile Ala Ser
210 215 220
Ser His Ala Ala Val Ser Leu Arg Leu Gln His Arg Gly Arg Arg Arg
225 230 235 240
Pro Gly Arg Phe Val Arg Leu Val Ala Ala Val Val Ala Ala Phe Ala
245 250 255
Leu Cys Trp Gly Pro Tyr His Val Phe Ser Leu Leu Glu Ala Arg Ala
260 265 270
His Ala Asn Pro Gly Leu Arg Pro Leu Val Trp Arg Gly Leu Pro Phe
275 280 285
Val Thr Ser Leu Ala Phe Phe Asn Ser Val Ala Asn Pro Val Leu Tyr
290 295 300
Val Leu Thr Cys Pro Asp Met Leu Arg Lys Leu Arg Arg Ser Leu Arg
305 310 315 320
Thr Val Leu Glu Ser Val Leu Val Asp Asp Ser Glu Leu Gly Gly Ala
325 330 335
Gly Ser Ser Arg Arg Arg Arg Arg Thr Pro Ser Thr Ala Arg Ser Ala
340 345 350
Ser Ser Leu Ala Leu Ser Ser Arg Pro Glu Glu Arg Arg Gly Pro Ala
355 360 365
Arg Leu Phe Gly Trp Leu Leu Gly Gly Cys Ala Ala Ser Pro Gln Arg
370 375 380
Gly Pro Leu Asn Arg Ala Leu Ser Ser Thr Ser Ser
385 390 395
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cataagctta ctcgaggtgc tgctcagc 28

Claims (14)

1.一种抗体或该抗体片段，其识别、结合序列号2所表示的人CRTH2的氨基酸序列的第192位的甘氨酸和第194位的天冬氨酸中的至少一者，
所述抗体为抗体重链可变区VH的互补决定区CDR1～3分别由序列号20～22所表示的氨基酸序列构成、且抗体轻链可变区VL的CDR1～3分别由序列号23～25所表示的氨基酸序列构成的抗体，
所述抗体片段为具有抗原结合活性的抗体片段。
2.如权利要求1所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为含有包含序列号49所表示的氨基酸序列或在序列号49所表示的氨基酸序列中导入有选自将第18位的亮氨酸置换为蛋氨酸、将第77位的天冬酰胺置换为丝氨酸、将第93位的缬氨酸置换为苏氨酸以及将第117位的苏氨酸置换为缬氨酸的改变中的至少一种改变的氨基酸序列的VH、以及包含序列号33所表示的氨基酸序列或在序列号33所表示的氨基酸序列中导入有选自将第2位的异亮氨酸置换为缬氨酸、将第4位的蛋氨酸置换为亮氨酸、将第15位的脯氨酸置换为亮氨酸以及将第85位的丙氨酸置换为脯氨酸的改变中的至少一种改变的氨基酸序列的VL的抗体。
3.如权利要求2所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为含有包含序列号49、51、53、55、57和59所表示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列的VH、以及包含序列号33、35、37、39、41、43、45和47所表示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列的VL的抗体。
4.如权利要求1所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为含有包含序列号17所表示的氨基酸序列的VH和包含序列号19所表示的氨基酸序列的VL的抗体。
5.如权利要求1所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为具有选自由下述(a)～(h)组成的组中的至少一个特征的抗体，
(a)在人CRTH2的配体存在下对人CRTH2的反应性不降低；
(b)不具有中和活性；
(c)具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性即ADCC活性；
(d)不与肥大细胞和Th1细胞中的至少一者反应；
(e)与选自嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、Th2细胞和II型固有淋巴细胞(ILC2)中的至少一种细胞反应；
(f)不具有激动活性；
(g)不增强基于人CRTH2的配体的信号；以及
(h)对活化状态或非活化状态的人CRTH2的反应性没有变化。
6.如权利要求1所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为包含人Fc段的抗体。
7.如权利要求1所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为单克隆抗体。
8.如权利要求1所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为基因重组抗体。
9.如权利要求8所述的基因重组抗体或该抗体片段，其中，基因重组抗体为选自人型嵌合抗体和人型CDR移植抗体中的任意一种基因重组抗体。
10.如权利要求1所述的该抗体片段，其中，抗体片段为选自Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、双链抗体和dsFv中的任意一种抗体片段。
11.一种DNA，其编码权利要求1～10中任一项所述的抗体或该抗体片段。
12.一种重组体载体，其含有权利要求11所述的DNA。
13.一种转化株，通过将权利要求12所述的重组体载体导入宿主细胞中而得到。
14.权利要求1～10中任一项所述的抗体或该抗体片段的制造方法，其特征在于，将权利要求13所述的转化株在培养基中进行培养，使权利要求1～10中任一项所述的抗体或该抗体片段在培养物中生产蓄积，从该培养物中收集抗体或该抗体片段。
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