CN115536752A - 抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及抗原受体及其用途。本发明一般性地包括通过靶向在细胞表面表达抗原的细胞来治疗疾病。特别地，本发明涉及重组抗原受体及其用途。经改造以表达这样的抗原受体的T细胞可用于治疗以表达被所述抗原受体结合的一种或更多种抗原为特征的疾病。

Description

抗原受体及其用途
本申请是申请号为201680058729.1的发明名称为“抗原受体及其用途”的中国专利申请的分案申请，原申请是2016年10月05日提交的PCT国际申请PCT/EP2016/073792于2018年04月08日进入中国国家阶段的申请。
技术领域
本发明涉及重组抗原受体及其用途。经改造以表达此类抗原受体的T细胞可用于治疗以表达被所述抗原受体结合的一种或更多种抗原为特征的疾病。
背景技术
T细胞在人和动物中的细胞介导的免疫中发挥着关键作用。特定抗原的识别和结合由在T细胞表面上表达的T细胞受体(TCR)介导。T细胞的TCR能够与同主要组织相容性复合物(MHC)分子结合并呈递在靶细胞表面上的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联，从而导致增殖和分化为成熟效应T细胞。
TCR是复杂信号传导机器的一部分，其包含TCRα链和β链的异二聚体复合物，这是共受体CD4或CD8和CD3信号转导模块(图1)。TCRα/β异二聚体负责抗原识别并通过细胞膜与CD3合作传递活化信号，而CD3链本身将输入信号转移至细胞内的衔接蛋白(adaptorprotein)。因此，TCRα/β链的转移提供了将T细胞重定向至任何感兴趣的抗原的机会。
基于过继性细胞转移(Adoptive cell transfer，ACT)的免疫疗法可以广泛地定义为用先前致敏的T细胞进行的被动免疫的形式，所述先前致敏的T细胞在从低前体频率离体扩增至临床相关细胞数目后转移至非免疫接受者或自体宿主。已经用于ACT实验的细胞类型包括淋巴因子活化的杀伤(lymphokine-activated killer，LAK)细胞(Mule,J.J.等(1984)Science 225,1487-1489；Rosenberg,S.A.等(1985)N.Engl.J.Med.313,1485-1492)，肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)(Rosenberg,S.A.等(1994)J.Natl.Cancer Inst.86,1159-1166)，造血干细胞移植(hematopoietic stem celltransplantation,HSCT)后的供体淋巴细胞，以及肿瘤特异性T细胞系或克隆(Dudley,M.E.等(2001)J.Immunother.24,363-373；Yee,C.等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99,16168-16173)。已经表明过继性T细胞转移对人病毒感染如CMV具有治疗活性。对于黑素瘤的过继性免疫疗法，Rosenberg及其同事建立了一种ACT方法，其依赖输注体外扩增的分离自切除肿瘤的自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)并结合非清髓性淋巴消耗化学治疗和高剂量IL2。临床研究导致患有转移性黑素瘤的经治疗患者约50％的客观响应率(Dudley,M.E.等(2005)J.Clin.Oncol.23:2346-2357)。
一种替代方法是在短期离体培养期间重编程为表达具有确定特异性之肿瘤反应性免疫受体的自体T细胞的过继转移，然后再输注入患者体内(Kershaw M.H.等(2013)Nature Reviews Cancer 13(8):525-41)。这种策略使ACT适用于多种常见的恶性肿瘤，即使患者中缺乏肿瘤反应性T细胞。由于T细胞的抗原特异性完全依赖于TCRα链和β链的异源二聚体复合物，所以将克隆的TCR基因转移至T细胞中提供了将其重定向至任何感兴趣的抗原的潜力。因此，TCR基因疗法提供了以自体淋巴细胞作为治疗选择开发抗原特异性免疫疗法的有吸引力的策略。TCR基因转移的主要优点是在数天内产生治疗量的抗原特异性T细胞，以及引入患者内源TCR库中不存在的特异性的可能性。数个研究小组证明，TCR基因转移是重定向原代T细胞的抗原特异性的有吸引力的策略(Morgan,R.A.等(2003)J.Immunol.171,3287-3295；Cooper,L.J.等(2000)J.Virol.74,8207-8212；Fujio,K.等(2000)J.Immunol.165,528-532；Kessels,H.W.等(2001)Nat.Immunol.2,957-961；Dembic,Z.等(1986)Nature 320,232-238)。TCR基因治疗在人中的可行性最初由Rosenberg及其团队在治疗恶性黑素瘤的临床试验中证明。用黑素瘤/黑素细胞抗原特异性TCR以逆转录病毒转导的自体淋巴细胞的过继转移导致达30％的经治疗黑素瘤患者中的癌症消退(Morgan,R.A.等(2006)Science 314,126-129；Johnson,L.A.等(2009)Blood 114,535-546)。与此同时，TCR基因疗法的临床测试也延伸到靶向许多不同肿瘤抗原的黑素瘤之外的癌症(Park,T.S.等(2011)Trends Biotechnol.29,550-557)。
使用基因工程方法将具有确定特异性的抗原靶向受体插入T细胞中已极大延伸了ACT的潜在能力。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是一类由与胞外抗原结合结构域(最常见的是来自单克隆抗体的单链可变片段(scFv))融合的细胞内T细胞信号传导结构域构成的抗原靶向受体。CAR直接识别细胞表面抗原，不依赖于MHC介导的呈递，从而允许使用对所有患者中的任何给定抗原具有特异性的单一受体构建体。最初的CAR将抗原识别结构域与T细胞受体(TCR)复合物的CD3ζ活化链融合(图2)。随后的CAR迭代包括与CD3ζ串联的次级共刺激信号，包括来自CD28或多种TNF受体家族分子(如4-1BB(CD137)和OX40(CD134))的胞内结构域。此外，第三代受体除了CD3ζ之外还包含两种共刺激信号，最通常是来自CD28和4-1BB。第二代和第三代CAR显著改善了体外和体内抗肿瘤效力(Zhao等(2009)J.Immunol.,(183)5563-5574)，在一些情况下在晚期癌症患者中诱导完全缓解(Porter等(2011)N.Engl.J.Med.,(365)725-733)。
经典CAR由与跨膜信号传导结构域(例如CD3ζ)融合的抗原特异性单链抗体(scFv)片段组成。在引入到T细胞中后，其表达为膜结合蛋白并在与其同源抗原结合后诱导免疫应答(Eshhar等(1993)PNAS,(90)720-724)。诱导的抗原特异性免疫应答导致细胞毒性CD8+ T细胞的活化，这继而导致根除表达特异性抗原的细胞，例如表达特异性抗原的肿瘤细胞或病毒感染细胞。然而，这些经典CAR构建体不能通过其内源CD3复合物来活化/刺激T细胞，而这对于T细胞活化通常是必需的。由于抗原结合结构域与CD3ζ融合，所以通过生物化学“短路(short circuit)”诱导T细胞活化(Aggen等(2012)Gene Therapy,(19)365-374)。T细胞的这种通过该生物化学短路的非生理性活化对于以这种方式进行治疗的患者具有风险，因为T细胞的过度活化可能导致不希望的副作用。例如，已经在体外观察到由CAR表达引起的重组T细胞的长期基础活化(“滋养信号传导(tonic signaling)”)，其导致抑制分子(例如LAG-3，TIM-3和PD-1)在重组CAR表达T细胞表面上的积累增加，这继而导致T细胞的过早耗尽，随后对于体内针对肿瘤细胞的应答产生强烈负面影响(Long等(2015)Nat.Med.,(21)581-590)。这种不良反应与通过该抗体的框架残基的scFv片段的不规则聚类有关。另外，虽然这种类型的经典CAR构建体已经成功地针对不同的瘤形成(例如白血病)进行了测试(Porter等(2011)N.Engl.J.Med.,(365)725-733)，但由于正常组织中的靶抗原(靶肿瘤抗原)的基础表达，其也导致致命的自身免疫病(脱靶反应(on-target/off-tumor-reaction)；Morgan等(2010)Mol Ther.,(18)843-51)。
其中通过更加生理性的机制发生T细胞活化的一种替代方法是提供与来自T细胞受体(TCR)的Cβ恒定结构域融合的类似单链-TCR(scTv)片段以及其与来自TCR的Cα恒定结构域的共表达(Voss等(2010)Blood,(115)5154-5163)，后者募集必需的内源CD3ζ同二聚体(Call等(2002)Cell,(111)967-79)。然而，为了使这些构建体充当免疫系统活化剂，需要来自TCR的恒定结构域来源于小鼠TCR或鼠源化(Cohen等(2006)Cancer Res.,(66)8878-86)以实现scTCR和Cα之间的链配对。这些构建体发挥功能必须具有异基因序列的事实提高了在施用时免疫系统与其反应的风险，并降低或破坏了其治疗效果。
因此，需要提供替代的重组抗原受体，其中例如受体在抗原结合时足以能够通过内源CD3复合物以正常生理方式活化表达它的T细胞，并且任选地，至少在抗原受体的信号传递结构域中不需要存在任何非人来源的氨基酸序列，其可诱导针对重组抗原受体本身的不希望的免疫应答。
发明描述
发明内容
本发明涉及具有至少两个抗原结合位点的重组抗原受体。所述抗原受体包含两条肽链。在一个方面，除免疫受体信号传递结构域外，所述肽链各自包含至少两个结构域，其中一条肽链上的两个结构域中的每一个与另一条肽链上的一个结构域形成抗原结合位点。在另一个方面，除免疫受体信号传递结构域外，一条肽链具有至少四个结构域，其中四个结构域中的两个与相同肽链上的两个剩余结构域形成两个抗原结合位点。
在一个方面，本发明涉及抗原受体，该受体包含第一肽链和第二肽链，其中第一肽链包含至少第一结构域和第二结构域以及免疫受体信号传递结构域；第二肽链包含至少第一结构域和第二结构域以及免疫受体信号传递结构域；其中来自第一肽链的第一结构域与来自第二肽链的一个结构域一起形成第一抗原结合位点，并且其中来自第一肽链的第二结构域与来自第二肽链的另一个结构域一起形成第二抗原结合位点。在该方面的抗原受体中，形成各个抗原结合位点的结构域优选位于不同的肽链上。因此，抗原结合位点通过结构域的分子间相互作用形成。
在一个实施方案中，第一结构域和/或第二结构域各自包含免疫球蛋白链的可变区或T细胞受体链的可变区或所述可变区的一部分。
在一个实施方案中，形成第一抗原结合位点的结构域之一包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且形成第一抗原结合位点的另一个结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。在一个实施方案中，形成第二抗原结合位点的结构域之一包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且形成第二抗原结合位点的另一个结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
在一个实施方案中，来自第一肽链的第一结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且来自第二肽链的与来自第一肽链的第一结构域形成抗原结合位点的结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。在一个实施方案中，来自第一肽链的第二结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且来自第二肽链的与来自第一肽链的第二结构域形成抗原结合位点的结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
在一个实施方案中，来自第一肽链的第一结构域和第二结构域各自包含免疫球蛋白的重链可变区或其一部分；并且来自第二肽链的第一结构域和第二结构域各自包含免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
在一个实施方案中，来自第一肽链的N末端结构域与来自第二肽链的N末端结构域一起形成抗原结合位点；并且来自第一肽链的C末端结构域与来自第二肽链的C末端结构域一起形成抗原结合位点。
在一个实施方案中，来自第一肽链的N末端结构域与来自第二肽链的C末端结构域一起形成抗原结合位点；并且来自第一肽链的C末端结构域与来自第二肽链的N末端结构域一起形成抗原结合位点。
在一个方面，本发明涉及抗原受体，所述受体包含第一肽链和第二肽链，其中第一肽链包含至少四个结构域和免疫受体信号传递结构域；第二肽链包含免疫受体信号传递结构域；其中来自第一肽链的两个结构域形成第一抗原结合位点，并且其中来自第一肽链的另外两个结构域形成第二抗原结合位点。在该方面的抗原受体中，形成各个抗原结合位点的结构域优选位于相同肽链上。因此，抗原结合位点通过结构域的分子内相互作用形成。
在一个实施方案中，四个结构域各自包含免疫球蛋白链的可变区或T细胞受体链的可变区或所述可变区的一部分。
在一个实施方案中，形成第一抗原结合位点的结构域之一包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且形成第一抗原结合位点的另一个结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。在一个实施方案中，形成第二抗原结合位点的结构域之一包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且形成第二抗原结合位点的另一个结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
在一个实施方案中，四个结构域的两个N末端结构域一起形成抗原结合位点；并且四个结构域的两个C末端结构域一起形成抗原结合位点。
在一个实施方案中，四个结构域的两个N末端结构域中的一个包含免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且四个结构域的两个N末端结构域中的另一个包含免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分；并且四个结构域的两个C末端结构域中的一个包含免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且四个结构域的两个C末端结构域中的另一个包含免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
在本发明的抗原受体的一个实施方案中，免疫受体信号传递结构域包含T细胞受体链的恒定区或不变区或者免疫细胞Fc受体链的恒定区或不变区或者所述恒定区或不变区的一部分。在本发明的抗原受体的一个实施方案中，(i)第一肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分，并且第二肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其一部分，或者(ii)第一肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其一部分，并且第二肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分。
在本发明的抗原受体的一个实施方案中，免疫受体信号传递结构域为人来源。
在一个实施方案中，本发明的抗原受体包含连接抗原受体的结构域的接头。在一个实施方案中，本发明的抗原受体包含在形成抗原结合位点的结构域之间和/或在形成抗原结合位点的结构域与免疫受体信号传递结构域之间的一个或更多个接头。接头可以是任意长度的随意的(arbitrary)氨基酸序列，只要其不干扰抗原受体的功能，例如抗原受体与抗原结合或与内源CD3复合物缔合的能力，或不干扰抗原受体在抗原结合后诱导免疫应答的能力。
在本发明的抗原受体的一个实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点与相同抗原或不同抗原结合。在本发明的抗原受体的一个实施方案中，第一抗原结合位点和第二抗原结合位点与相同抗原上的不同表位结合。因此，虽然形成第一抗原结合位点的结构域优选来自相同免疫球蛋白，并且形成第二抗原结合位点的结构域优选来自相同免疫球蛋白，但是形成第一抗原结合位点的结构域和形成第二抗原结合位点的结构域来自相同或不同的免疫球蛋白，所述不同的免疫球蛋白与相同或不同抗原结合。
在一个实施方案中，抗原是疾病特异性抗原，优选肿瘤抗原。在一个实施方案中，抗原在细胞表面上表达。
在一个方面，本发明涉及本发明任何抗原受体的肽链。在一个实施方案中，本发明涉及包含第一结构域和第二结构域的肽链，所述第一结构域和第二结构域各自包含免疫球蛋白的重链可变区或其一部分或者各自包含免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分，并且其中所述肽链还包含免疫受体信号传递结构域。在一个实施方案中，本发明涉及肽链，其包含至少4个结构域和免疫受体信号传递结构域，其中来自肽链的两个结构域形成第一抗原结合位点，并且来自肽链的另外两个结构域形成第二抗原结合位点。本发明的肽链的另一些实施方案如本文对本发明的抗原受体所述。
在一个方面，本发明涉及经遗传修饰以表达本发明的抗原受体的细胞，特别是免疫效应细胞，例如T细胞。在一个方面，本发明涉及表达本发明抗原受体的第一肽链、第二肽链或第一肽链和第二肽链两者或者表达本发明肽链的重组细胞，特别是免疫效应细胞，例如T细胞。本发明的细胞或重组细胞的另一些实施方案如本文对本发明的抗原受体或本发明的肽链所述。
在一个方面，本发明涉及用于产生表达本发明抗原受体的细胞的方法，所述方法包括：(a)提供细胞；(b)提供第一遗传构建体，所述第一遗传构建体编码本发明抗原受体的第一肽链；(c)提供第二遗传构建体，所述第二遗传构建体编码本发明抗原受体的第二肽链；(d)将第一遗传构建体和第二遗传构建体引入到细胞中；以及(e)使得构建体在细胞中表达。在一个实施方案中，本发明涉及用于产生表达抗原受体的细胞的方法，所述受体包含第一肽链和第二肽链，所述方法包括：(a)提供细胞；(b)提供第一遗传构建体，所述第一构建体编码包含至少第一结构域和第二结构域以及免疫受体信号传递结构域的第一肽链；(c)提供第二遗传构建体，所述第二构建体编码包含至少第一结构域和第二结构域以及免疫受体信号传递结构域的第二肽链；(d)将第一遗传构建体和第二遗传构建体引入到细胞中；以及(e)使得构建体在细胞中表达；其中来自第一肽链的第一结构域能够与来自第二肽链的一个结构域一起形成第一抗原结合位点，并且其中来自第一肽链的第二结构域能够与来自第二肽链的另一个结构域一起形成第二抗原结合位点。在一个实施方案中，本发明涉及用于产生表达抗原受体的细胞的方法，所述受体包含第一肽链和第二肽链，所述方法包括：(a)提供细胞；(b)提供第一遗传构建体，所述第一遗传构建体编码包含至少四个结构域和免疫受体信号传递结构域的第一肽链；(c)提供第二遗传构建体，所述第二遗传构建体编码包含免疫受体信号传递结构域的第二肽链；(d)将第一遗传构建体和第二遗传构建体引入到细胞中；以及(e)使得构建体在细胞中表达；其中来自第一肽链的两个结构域能够形成第一抗原结合位点，并且其中来自第一肽链的另外两个结构域能够形成第二抗原结合位点。在本发明方法的一个实施方案中，抗原受体的表达在细胞表面处。在本发明方法的一个实施方案中，第一肽链和第二肽链在单个遗传构建体上提供。在本发明方法的一个实施方案中，细胞是人细胞。在本发明方法的一个实施方案中，细胞是免疫效应细胞，例如T细胞。在本发明方法的一个实施方案中，遗传构建体包含DNA和/或RNA。本发明方法的另一些实施方案如本文对本发明的抗原受体所述。
在一个方面，本发明涉及通过本发明用于产生表达抗原受体的细胞的方法产生的重组细胞，特别是免疫效应细胞，例如T细胞。本发明的重组细胞的另一些实施方案如本文对本发明的抗原受体或本发明的用于产生表达抗原受体的细胞的方法所述。
在一个方面，本发明涉及编码本发明抗原受体的第一肽链、第二肽链或第一肽链和第二肽链两者或者编码本发明肽链的核酸，例如DNA或RNA。本发明核酸的另一些实施方案如本文对本发明的抗原受体或本发明的肽链所述。
本发明通常包括通过使用本发明的抗原受体靶向在细胞表面上表达一种或更多种抗原的细胞，例如在细胞表面上表达一种或更多种疾病特异性抗原的病变细胞，特别是在细胞表面上表达一种或更多种肿瘤抗原的癌细胞来治疗疾病。该方法提供了选择性根除在其表面上表达一种或更多种抗原的细胞，从而使对不表达所述抗原的正常细胞的不利影响最小化。在一个实施方案中，施用经遗传修饰以表达本发明的抗原受体的T细胞，所述抗原受体通过与抗原结合来靶向细胞。T细胞能够识别在细胞表面上表达抗原的病变细胞，从而导致根除病变细胞。在一个实施方案中，靶细胞群或靶组织是肿瘤细胞或肿瘤组织。
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗原受体、本发明的重组细胞或本发明的核酸；以及可药用载体。本发明的药物组合物可用作药物，特别是用于治疗以表达被本发明的抗原受体结合的一种或更多种抗原(例如一种或更多种肿瘤抗原)为特征的疾病，例如癌症。
在一个方面，本发明涉及治疗疾病(例如癌症)的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本发明的药物组合物，其中所述疾病以表达被所述抗原受体结合的至少一种抗原(例如肿瘤抗原)为特征。
在一个方面，本发明涉及治疗患有与至少一种抗原的表达或升高的表达相关的疾病、病症或状况的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用经遗传修饰以表达靶向所述至少一种抗原的本发明抗原受体的T细胞。在一个实施方案中，所述疾病、病症或状况是癌症。在一个实施方案中，所述T细胞可以对对象是自体的、同种异体的或同基因的。
在本发明的一个实施方案中，抗原受体与仅一种抗原结合(例如为单特异性并且识别相同的表位或者为双特异性或多特异性并且识别相同抗原上的不同表位)或与不同的抗原，特别是两种不同的抗原结合。
在本发明所有方面的一个实施方案中，治疗方法还包括从对象获得细胞样品，所述样品包含T细胞或T细胞祖细胞，以及用编码本发明抗原受体的核酸转染所述细胞以提供经遗传修饰以表达抗原受体的T细胞。在本发明所有方面的一个实施方案中，用编码抗原受体的核酸稳定或瞬时转染经遗传修饰以表达抗原受体的T细胞。因此，编码抗原受体的核酸整合或不整合到T细胞的基因组中。在本发明所有方面的一个实施方案中，T细胞和/或细胞样品来自经遗传修饰以表达抗原受体的T细胞所施用的对象。在本发明所有方面的一个实施方案中，T细胞和/或细胞样品来自与经遗传修饰以表达抗原受体的T细胞所施用的哺乳动物不同的哺乳动物。
在本发明所有方面的一个实施方案中，遗传修饰以表达抗原受体的T细胞失活以表达内源性T细胞受体和/或内源性HLA。
在本发明所有方面的一个实施方案中，抗原在病变细胞(例如癌细胞)中表达。在一个实施方案中，抗原在病变细胞(例如癌细胞)的表面上表达。在一个实施方案中，抗原受体结合胞外结构域或抗原胞外结构域中的表位。在一个实施方案中，抗原受体结合存在于活细胞表面上的抗原的天然表位。在本发明所有方面的一个实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在本发明所有方面的一个实施方案中，抗原选自密蛋白(例如密蛋白6和密蛋白18.2)、CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、间皮素、CEA、c-Met、PSMA、GD-2和NY-ESO-1。在本发明所有方面的一个实施方案中，抗原是病原体抗原。病原体可能是真菌、病毒或细菌病原体。在本发明所有方面的一个实施方案中，抗原的表达在细胞表面处。在一个实施方案中，抗原是密蛋白，特别是密蛋白6或密蛋白18.2，并且所述抗原受体与所述密蛋白的第一胞外环结合。在一个实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，所述抗原受体与细胞上存在的抗原的结合导致所述T细胞的免疫效应功能，例如释放细胞因子。在一个实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，所述抗原受体与存在于细胞(例如抗原呈递细胞)上的抗原的结合导致所述T细胞的刺激、引发(priming)和/或扩增。在一个实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，所述抗原受体与存在于病变细胞(例如癌细胞)上的抗原的结合导致病变细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述T细胞优选释放细胞毒性因子，例如穿孔素和颗粒酶。
在本发明所有方面的一个实施方案中，抗原受体形成抗原结合位点的结构域包含在抗原受体的外结构域(exodomain)中。在本发明所有方面的一个实施方案中，本发明的抗原受体包含跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域是跨膜的疏水性α螺旋。
在本发明所有方面的一个实施方案中，本发明的抗原受体包含引导新生蛋白进入内质网的信号肽。在一个实施方案中，信号肽在形成抗原结合位点的结构域之前。
在本发明所有方面的一个实施方案中，本发明的抗原受体优选对其靶向的抗原具有特异性，特别是当其存在于细胞(例如病变细胞或抗原呈递细胞)的表面上时。
在本发明所有方面的一个实施方案中，本发明的抗原受体可以由T细胞表达或存在于T细胞的表面上，所述T细胞优选细胞毒性T细胞。在一个实施方案中，T细胞与本发明的抗原受体靶向的抗原反应。
在另一个方面，本发明提供了用于本文所述方法的本文所述的药剂和组合物。
从下面的详细描述和权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得明显。
发明详述
尽管以下详细描述了本发明，但应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应该理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，然而，应该理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。不应将各种描述的实例和优选实施方案解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数目的公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则认为本申请的描述公开了本申请中的所有描述的要素的任何排列和组合。
优选地，本文使用的术语定义为如以下中描述的："A multilingual glossary ofbiotechnological terms:(IUPAC Recommendations)",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,和H.
Figure BDA0003702799390000111
编辑,(1995)Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用在本领域文献中解释的生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法(参见例如Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,J.Sambrook等编.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor 1989)。
在整个说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变化将被理解为暗示包括指出的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题在于包含指出的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。在描述本发明的上下文(特别是在权利要求的上下文)中，未用数量词限定的名词应解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另外指出或者与上下文明显矛盾。本文对数值范围的记载仅为了作为单独指代落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另有指示，否则每个单独的值都包括在说明书中，就如同其在本文单独列举一样。
本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行，除非本文另有指示或者与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明另外要求保护的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践必不可少。
贯穿本说明书的全文引用了多个文献。本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借先前的发明而早于这些公开内容。
术语“免疫应答”是指对抗原的综合身体反应，并且优选是指细胞免疫应答或细胞以及体液免疫应答。免疫应答可以是保护性/预防性/预防和/或治疗性的。
“提供免疫应答”可意味着在提供免疫应答之前没有针对特定靶抗原、靶细胞和/或靶组织的免疫应答，但是也可意味着在提供免疫应答之前具有一定水平的针对特定靶抗原、靶细胞和/或靶组织的免疫应答，并且在提供免疫应答之后，所述免疫应答增强。因此，“提供免疫应答”包括“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”。优选地，在对象中提供免疫应答之后，所述对象被保护免于发生诸如癌症疾病的疾病，或者通过提供免疫应答改善了疾病状况。例如，可以在患有癌症疾病的患者或具有发生癌症疾病的风险的对象中提供针对肿瘤抗原的免疫应答。在这种情况下提供免疫应答可意味着对象的疾病状况改善，对象不发生转移，或者具有发生癌症疾病风险的对象不发生癌症疾病。
“细胞介导的免疫”或“细胞免疫”或类似术语意在包括针对以表达抗原为特征，特别是以用I类或II类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答与被称为T细胞或T淋巴细胞的细胞有关，其作为“辅助细胞”或“杀伤细胞”。辅助T细胞(也称为CD4+ T细胞)通过调节免疫应答发挥核心作用，而杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、细胞溶解性T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀伤病变细胞(例如癌细胞)从而预防生产更多的病变细胞。
术语“抗原”涉及包含针对其产生和/或定向免疫应答之表位的物质。优选地，本发明上下文中的抗原是这样的分子，其任选在加工后诱导免疫反应，所述免疫反应优选地是抗原或表达抗原的细胞特异性的，优选在细胞表面上。术语“抗原”特别包括蛋白质和肽。抗原优选是对应于或来自天然存在的抗原的产物。这样的天然存在的抗原可包括或可来自变应原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他感染原和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本发明，抗原可对应于天然存在的产物，例如病毒蛋白或其一部分。
术语“病原体”涉及致病微生物，并且包括病毒、细菌、真菌、单细胞生物体和寄生虫。致病病毒的实例是人免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒(HSV)、甲型肝炎病毒(HAV)、HBV、HCV、乳头瘤病毒和人T嗜淋巴细胞病毒(HTLV)。单细胞生物体包括疟原虫、锥虫、变形虫等。
在一个优选的实施方案中，抗原是疾病特异性抗原或疾病相关抗原。术语“疾病特异性抗原”或“疾病相关抗原”是指具有病理学意义的所有抗原。在一个特别优选的实施方案中，抗原存在于病变细胞、组织和/或器官中，而其在健康细胞、组织和/或器官中不存在或以减少的量存在，因此可用于例如通过携带靶向抗原的抗原受体的T细胞来靶向病变细胞、组织和/或器官。在一个实施方案中，疾病特异性抗原或疾病相关抗原存在于病变细胞的表面上。
在一个优选的实施方案中，抗原是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原，即癌细胞成分，其可来自细胞质、细胞表面和细胞核，特别是作为癌细胞上的表面抗原产生，优选大量产生的那些抗原。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”涉及在正常条件下在有限数量的组织和/或器官中或在特定发育阶段中特异性表达的蛋白质，例如，肿瘤抗原在正常条件下可以在胃组织(优选在胃粘膜)中，在生殖器官(例如在睾丸)中，在滋养层组织(例如在胎盘)中或在种系细胞中特异性表达，并且在一个或更多个肿瘤或癌症组织中表达或异常表达。在本文中，“有限数量”优选表示不超过3，更优选不超过2。本发明上下文中的肿瘤抗原包括例如分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即，在正常条件下在某分化阶段的特定细胞类型中特异性表达的蛋白质；癌症/睾丸抗原，即在正常情况下在睾丸和有时在胎盘中特异性表达的蛋白质；以及种系特异性抗原。在本发明的上下文下，肿瘤抗原优选与癌细胞的细胞表面缔合，并且优选不在正常组织中不表达或仅很少地表达。优选地，肿瘤抗原或肿瘤抗原的异常表达鉴定癌细胞。在本发明的上下文中，对象(例如患有癌症疾病的患者)中由癌细胞表达的肿瘤抗原优选为所述对象中的自身蛋白质。在一些优选实施方案中，本发明上下文中的肿瘤抗原在正常条件下在非必需的组织或器官(即在被免疫系统损伤时不会导致对象死亡的组织或器官)中或者在免疫系统不能接近或仅很难地接近的身体器官或组织中特异性表达。优选地，在正常组织中表达的肿瘤抗原与癌组织中表达的肿瘤抗原之间，肿瘤抗原的氨基酸序列相同。
可用于本发明的肿瘤抗原的实例是p53、ART-4、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abLCAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、密蛋白家族的细胞表面蛋白(例如CLAUDIN-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12)、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A(优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12)、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、p190小BCR-abL、Pm1/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE和WT。特别优选的肿瘤抗原包括CLAUDIN-18.2(CLDN18.2)和CLAUDIN-6(CLDN6)。
本文使用的术语“CLDN”或简单的“C1”是指密蛋白，包括CLDN6和CLDN18.2。优选地，密蛋白是人密蛋白。密蛋白是紧密连接的最重要组分的蛋白质家族，其中其建立了旁细胞屏障，所述屏障控制上皮细胞之间的细胞间间隙中分子的流动。密蛋白是跨膜4次的跨膜蛋白，其中N末端和C末端都位于细胞质中。第一胞外环称为EC1或ECL1，由平均53个氨基酸组成，第二胞外环称为EC2或ECL2，由约24个氨基酸组成。密蛋白家族的细胞表面蛋白在多种来源的肿瘤中表达，并且由于其选择性表达(在毒性相关的正常组织中不表达)和定位于质膜上而特别适合作为与靶向癌症免疫疗法相关的靶结构。
CLDN6和CLDN18.2已被鉴定为在肿瘤组织中差异表达，其中表达CLDN18.2的唯一正常组织是胃(胃粘膜的分化上皮细胞)并且表达CLDN6的唯一正常组织是胎盘。
CLDN18.2在多种来源的癌症如胰腺癌、食道癌、胃癌、支气管癌、乳腺癌和ENT肿瘤中表达。CLDN18.2是用于预防和/或治疗原发性肿瘤的有价值的靶标，例如胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌、以及它们的转移，特别是胃癌转移(例如Krukenberg肿瘤)、腹膜转移和淋巴结转移。靶向至少CLDN18.2的抗原受体可用于治疗此类癌症疾病。
已经发现CLDN6在例如卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、黑素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾细胞癌和膀胱癌中表达。CLDN6是用于预防和/或治疗以下的特别优选的靶标：卵巢癌，特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤；肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌；胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌；皮肤癌，特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌；恶性黑素瘤；头颈癌，特别是恶性多形性腺瘤；肉瘤，特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤；胆管癌；膀胱癌，特别是移行细胞癌和乳头状癌；肾癌，特别是肾细胞癌，包括透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌；结肠癌，小肠癌，包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌；睾丸胚胎癌、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌，睾丸癌，特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌；子宫癌，生殖细胞肿瘤，如畸胎癌或胚胎癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤，以及其转移形式。靶向至少CLDN6的抗原受体可用于治疗这些癌症疾病。
在本发明实施方案的上下文中，抗原优选存在于细胞表面上，优选抗原呈递细胞或病变细胞的表面上。根据本发明，抗原如果与抗原受体结合，其优选能够任选地在适当的共刺激信号存在下诱导携带与抗原结合的抗原受体的T细胞的刺激、引发和/或扩增。病变细胞表面上的抗原的识别可导致针对抗原(或表达抗原的细胞)的免疫反应。
根据本发明的多个方面，目的优选是提供针对表达抗原的病变细胞(例如表达抗原如肿瘤抗原，特别是CLDN6或CLDN18.2的癌细胞)的免疫应答，以及治疗涉及表达抗原(如肿瘤抗原)的细胞的疾病(如癌症疾病)。优选地，本发明涉及施用抗原受体改造的免疫效应细胞，例如靶向表达抗原的病变细胞的T细胞。在表面上表达抗原的细胞可以被携带靶向该抗原之抗原受体的免疫效应细胞靶向。
“细胞表面”根据其在本领域中的通常含义使用，因此包括可接近而被蛋白质和其他分子结合的细胞外部。如果抗原位于细胞的表面处并且可接近而被添加至细胞的抗原结合分子(如抗原受体或抗原特异性抗体)结合，则抗原在所述细胞表面上表达。在一个实施方案中，在细胞表面上表达的抗原是具有被抗原受体识别的胞外部分的完整膜蛋白。如果抗原受体位于细胞的表面处并且可接近而被例如向细胞特异性添加的抗原受体的抗原结合，则抗原受体在所述细胞表面上表达。在一个实施方案中，在细胞表面上表达的抗原受体是具有识别抗原的胞外部分的完整膜蛋白。
在本发明的上下文中，术语“胞外部分”或“外结构域”是指朝向细胞的胞外空间并且优选地被位于细胞外部的结合分子(例如抗体)从所述细胞的外部接近的分子(例如，蛋白质)的部分。优选地，该术语是指一个或更多个胞外环或结构域或其片段。
术语“一部分”或“部分”在本文中可互换使用，并且是指结构(例如氨基酸序列)的连续或不连续的元件。术语“片段”是指诸如氨基酸序列的结构的连续元件。结构的一部分、部分或片段优选地包含所述结构的一个或更多个功能特性，例如，抗原性、免疫性和/或结合性。蛋白质序列的一部分或部分优选包含蛋白质序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续和/或非连续氨基酸。蛋白质序列的片段优选包含蛋白质序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
根据本发明，如果表达水平低于检测限和/或如果表达水平太低而不允许被添加至细胞的抗原特异性抗体结合，则细胞中(基本上)不表达抗原。根据本发明，如果表达水平高于检测限和/或如果表达水平足够高以允许添加至细胞的抗原特异性抗体结合，则细胞中表达抗原。优选地，细胞中表达的抗原表达或暴露于(即存在于)所述细胞的表面上，因此可被添加至细胞的抗原特异性分子(如抗体或抗原受体)结合。
“靶细胞”是指为免疫应答(例如细胞免疫应答)的靶标的细胞。靶细胞包括任何不需要的细胞，例如癌细胞。在一些优选实施方案中，靶细胞是表达优选存在于细胞表面上的靶抗原，特别是疾病特异性抗原的细胞。
术语“表位”是指分子如抗原中的抗原决定簇，即分子中被免疫系统识别(即结合)，例如被抗体或抗原受体识别的部分或片段。例如，表位是抗原上被免疫系统识别的离散的三维位点。表位通常由分子(例如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者的结合失去，但与后者的结合未失去。优选地，表位能够引起针对抗原或表达抗原的细胞的免疫应答。优选地，该术语涉及抗原的免疫原性部分。蛋白质(例如肿瘤抗原)的表位优选包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且长度优选为5至100，优选5至50，更优选8至30，最优选10至25个氨基酸，例如表位的长度可以优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
“抗原加工”是指将抗原降解成所述抗原的片段的加工产物(例如，将蛋白质降解成肽)以及使这些片段中的一种或更多种(例如通过结合)与MHC分子缔合，以用于被细胞呈递，优选被抗原呈递细胞呈递至特定T细胞。
抗原呈递细胞(APC)是在其表面上的主要组织相容性复合物(MHC)的情况下展示抗原的细胞。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这种复合物。抗原呈递细胞加工抗原并将其呈递至T细胞。根据本发明，术语“抗原呈递细胞”包括专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。
专职抗原呈递细胞非常有效地通过吞噬作用或通过受体介导的胞吞作用使抗原内化，然后在其膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段。T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物并与其相互作用。然后由抗原呈递细胞产生额外的共刺激信号，导致T细胞的活化。共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的限定特征。专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞(其具有最广泛的抗原呈递范围，并且可能是最重要的抗原呈递细胞)、巨噬细胞、B细胞和某些活化的上皮细胞。
非专职抗原呈递细胞不组成性表达与原初T细胞(naive T cell)相互作用所需的MHC II类蛋白；这些仅在用某些细胞因子(如IFNγ)刺激非专职抗原呈递细胞时才表达。
树突细胞(DC)是白细胞群，其通过MHC II类和I类抗原呈递途径两者将外周组织中捕获的抗原呈递至T细胞。公知树突细胞是有效的免疫应答诱导剂，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。树突细胞和祖细胞可获自外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、瘤周组织浸润细胞、淋巴结、脾、皮肤、脐带血或任何其他合适的组织或液。例如，通过将细胞因子如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα的组合添加到从外周血收获的单核细胞培养物，可离体分化树突细胞。或者，通过向培养基添加GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或其他诱导树突细胞分化、成熟和增殖的化合物的组合，从外周血、脐带血或骨髓收获的CD34阳性细胞可分化成树突细胞。树突细胞可以方便地分类为“未成熟”细胞和“成熟”细胞，这可以用作去别两种充分表征的表型的简单方法。但是，这个命名不应该被解释为排除所有可能的分化中间阶段。未成熟树突细胞表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，其与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型通常的特征在于这些标志物的更低表达，但是负责T细胞活化的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86和4-1BB)高表达。树突细胞成熟被称为树突细胞活化的状态，在这种情况下，此类抗原呈递树突细胞导致T细胞引发，而未成熟树突细胞的呈递导致耐受。树突细胞成熟主要由具有被天然受体检测的微生物特征的生物分子(细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎细胞因子(TNF、IL-1、IFN)、树突细胞表面上通过CD40L的CD40的连接以及经受应激性细胞死亡而从细胞释放的物质引起。可以通过用细胞因子(如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α)在体外培养骨髓细胞来得到树突细胞。
术语“免疫原性”涉及抗原诱导免疫反应的相对效率。
本发明上下文中的术语“免疫效应功能”包括由免疫系统组分介导的任何功能，这些功能导致例如杀伤病变细胞如肿瘤细胞，或抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤散播和转移。优选地，本发明上下文中的免疫效应功能是T细胞介导的效应功能。在辅助T细胞(CD4+T细胞)的情况下，这些功能包括释放细胞因子如白细胞介素-2和/或活化CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞，并且在CTL的情况下例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除细胞(即以表达抗原为特征的细胞)，产生细胞因子如IFN-γ和TNF-α，以及抗原表达靶细胞的特异性细胞溶解杀伤。
本发明上下文中的术语“免疫反应性细胞”或“免疫效应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应功能的细胞。“免疫反应性细胞”优选能够与抗原(例如在细胞表面上表达的抗原)结合并介导免疫应答。例如，这些细胞分泌细胞因子和/或趋化因子，杀伤微生物，分泌抗体，识别感染的细胞或癌细胞，并任选地消除这些细胞。例如，免疫反应性细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞，嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，“免疫反应性细胞”是T细胞，优选CD4+和/或CD8+ T细胞。根据本发明，术语“免疫反应性细胞”还包括可以在适当的刺激下成熟为免疫细胞(例如T细胞，特别是T辅助细胞或细胞溶解T细胞)的细胞。免疫反应性细胞包括CD34+造血干细胞，未成熟和成熟T细胞以及未成熟和成熟B细胞。当暴露于抗原时，T细胞前体分化为细胞溶解T细胞类似于免疫系统的克隆选择。
优选地，“免疫反应性细胞”或“免疫效应细胞”以一定程度的特异性识别抗原，特别是如果存在于抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)的表面上时。优选地，所述识别使得识别抗原的细胞具有响应性或反应性。如果细胞是辅助T细胞(CD4+ T细胞)，则这种响应性或反应性可能涉及细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的活化。如果细胞是CTL，那么这种响应性或反应性可能涉及通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除细胞(即以表达抗原为特征的细胞)。根据本发明，CTL响应性可包括持续的钙通量，细胞分裂，细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生，活化标志物如CD44和CD69的上调以及抗原表达靶细胞的特异性细胞溶解杀伤。CTL响应性也可以使用精确指示CTL响应性的人工报告物来确定。这种识别抗原并且是响应性或反应性的CTL在本文中也称为“抗原响应性CTL”。
“淋巴样细胞”是任选地在适当修饰后，例如在转移T细胞受体或抗原受体后，能够产生免疫应答(例如细胞免疫应答)的细胞，或者这些细胞的前体细胞，并且包括淋巴细胞(优选T淋巴细胞)、成淋巴细胞和浆细胞。淋巴样细胞可以是如本文所述的免疫反应性细胞或免疫效应细胞。优选的淋巴样细胞是可以被修饰以在细胞表面上表达T细胞受体或抗原受体的T细胞。在一个实施方案中，淋巴样细胞缺少T细胞受体的内源表达。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括T辅助细胞(CD4+ T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL，CD8+ T细胞)，后者包括细胞溶解T细胞。
T细胞属于被称为淋巴细胞的一组白细胞，并且在细胞介导的免疫中起着核心作用。它们可以通过其细胞表面上被称为T细胞受体(TCR)的特殊受体的存在与其他淋巴细胞类型(例如B细胞和自然杀伤细胞)区分开来。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了多种不同的T细胞亚群，每种具有独特的功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化等功能。这些细胞也被称为CD4+T细胞，因为它们在其表面上表达CD4蛋白。当辅助T细胞通过在抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子呈递肽抗原时，其被活化。一旦活化，其迅速分裂并分泌被称为细胞因子的小蛋白，这些小蛋白调节或协助主动免疫应答。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，也参与移植排斥。这些细胞也被称为CD8+ T细胞，因为它们在其表面处表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与存在于几乎身体的每个细胞的表面上的MHC I类缔合的抗原来识别它们的靶标。
大多数T细胞具有作为几种蛋白质的复合物存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两条独立的肽链构成，它们由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并被称为α-TCR链和β-TCR链。γδT细胞(gamma delta T细胞)代表在其表面上具有独特的T细胞受体(TCR)的T细胞的小亚群。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链形成。这组T细胞比αβT细胞少得多(总T细胞的2％)。
所有T细胞都来源于骨髓中的造血干细胞。源自造血干细胞的造血祖细胞存在于胸腺中并通过细胞分裂扩增以产生大量未成熟胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，因此分类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们在发育过程中的进展，它们变成双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)，并且最终成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放到外周组织。
通常可以使用标准程序在体外或离体制备T细胞。例如，可以使用市售的细胞分离系统从哺乳动物如患者的骨髓、外周血或者骨髓或外周血的级分中分离T细胞。或者，T细胞可以来源于相关或不相关的人、非人动物、细胞系或培养物。包含T细胞的样品可以例如是外周血单核细胞(PBMC)。
根据本发明使用的T细胞可表达内源T细胞受体或可能缺乏内源T细胞受体的表达。
可以将编码抗原受体的核酸(如RNA)导入T细胞或具有细胞溶解能力的其他细胞中，特别是淋巴样细胞。
术语“靶向抗原的抗原受体”或类似术语涉及抗原受体，其当存在于免疫效应细胞如T细胞上时识别例如抗原呈递细胞或病变细胞(如癌细胞)的表面上的抗原，以使得免疫效应细胞被刺激、引发和/或扩增或者如上所述发挥免疫效应细胞的效应功能。
术语“抗原特异性T细胞”或类似术语涉及T细胞，其尤其是在提供有抗原受体时，识别例如抗原呈递细胞或病变细胞(如癌细胞)的表面上抗原受体靶向的抗原，并且优选地如上所述发挥T细胞的效应功能。如果细胞杀伤表达抗原的靶细胞，则认为T细胞和其他淋巴样细胞对抗原具有特异性。可以使用多种标准技术中的任何一种(例如在铬释放测定或增殖测定中)来评估T细胞特异性。或者，可以测量淋巴因子(例如干扰素-γ)的合成。
术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白质或分子在免疫反应中对于淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导重要，其中MHC蛋白质或分子结合肽并将其呈递以供T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如入侵微生物的片段)两者。
根据本发明，术语“抗原受体”包括经改造受体，其赋予免疫效应细胞(如T细胞)随意的特异性，例如单克隆抗体的特异性。以这种方式，可以产生大量抗原特异性T细胞用于过继性细胞转移。因此，根据本发明的抗原受体可存在于T细胞上，例如，代替T细胞自身的T细胞受体或除了T细胞自身的T细胞受体之外存在。这样的T细胞不一定需要加工和呈递用于识别靶细胞的抗原，而是可以优选地特异性识别存在于靶细胞上的任何抗原。优选地，所述抗原受体在细胞表面上表达。对于本发明的目的，包含抗原受体的T细胞包括在本文使用的术语“T细胞”内。特别地，根据本发明，术语“抗原受体”包括人工受体，其包含识别(即结合)靶细胞(例如癌细胞)上的靶结构(例如抗原)的单个分子或分子复合物(例如通过将抗原结合位点或抗原结合结构域与靶细胞表面上表达的抗原结合)并且可以赋予在细胞表面上表达所述抗原受体的免疫效应细胞如T细胞特异性。优选地，抗原受体识别靶结构导致表达所述抗原受体的免疫效应细胞的活化。抗原受体可以包含一个或更多个蛋白质单元，所述蛋白质单元包含如本文所述的一个或更多个结构域。术语“抗原受体”优选不包括T细胞受体。根据本发明，术语“抗原受体”优选与术语“嵌合抗原受体(CAR)”、“嵌合T细胞受体”和“人工T细胞受体”同义。
根据本发明，抗原可以被抗原受体通过能够形成抗原结合位点的任何抗原识别结构域(在本文中也简称为“结构域”)识别，例如通过可位于相同或不同的肽链上的抗体和T细胞受体的抗原结合部分。在一个实施方案中，形成抗原结合位点的两个结构域来源于免疫球蛋白。在另一个实施方案中，形成抗原结合位点的两个结构域来源于T细胞受体。特别优选的是抗体可变结构域，如衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)，以及T细胞受体可变结构域，特别是TCRα和β单链。事实上，几乎所有以高亲和力结合给定靶标的物质均可用作抗原识别结构域。
在一个实施方案中，本发明的抗原受体包含形成至少两个结合位点的至少四个免疫球蛋白可变结构域，其中所述两个结合位点可以结合相同或不同表位，所述表位可以位于相同或不同抗原上。在一个实施方案中，抗原受体包含对第一表位具有特异性的免疫球蛋白的重链可变结构域(或区)(VH)(VH(1))，对第一表位具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变结构域(或区)(VL)(VL(1))，对第二表位具有特异性的免疫球蛋白的重链可变结构域(或区)(VH)(VH(2))，以及对第二表位具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变结构域(或区)(VL)(VL(2))，所述第一表位和第二表位可以相同或不同，并且可以位于相同或不同的抗原上。在一个实施方案中，VH(1)能够与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)能够与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，而VH(1)不能与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)不能与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点。然而，在另一个实施方案中，VH(1)能够与VL(1)和VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)能够与VL(2)和VL(1)相互作用并形成抗原结合位点。在后一个实施方案中，VH(1)和VH(2)可以相同或至少衍生自相同的免疫球蛋白，并且VL(1)和VL(2)可以相同或至少衍生自相同的免疫球蛋白。
在一个方面，本发明涉及抗原受体，在本文中也称为组合抗原受体，该受体包含第一肽链和第二肽链，其中第一肽链包含至少第一结构域和第二结构域，以及免疫受体信号传递结构域；第二肽链包含至少第一结构域和第二结构域以及免疫受体信号传递结构域；其中来自第一肽链的第一结构域与来自第二肽链的一个结构域一起形成第一抗原结合位点，并且其中来自第一肽链的第二结构域与来自第二肽链的另一个结构域一起形成第二抗原结合位点。
在一个实施方案中，本发明的组合抗原受体包含在两条肽链中的每条上的与轻链可变结构域连接的重链可变结构域，其中通过不同肽链上的重链可变结构域和轻链可变结构域之间的相互作用发生两个抗原结合位点的形成。在一个实施方案中，本发明的组合抗原受体包含两条肽链，其中一条肽链包含VL(1)和VH(2)，另一条多肽链包含VH(1)和VL(2)。在另一个实施方案中，本发明的组合抗原受体包含在一条肽链上的与重链可变结构域连接的重链可变结构域，以及在另一条肽链上的与轻链可变结构域连接的轻链可变结构域，其中通过不同肽链上的重链可变结构域和轻链可变结构域之间的相互作用发生两个抗原结合位点的形成。在一个实施方案中，本发明的组合抗原受体包含两条肽链，其中一条肽链包含VH(1)和VH(2)，并且另一条肽链包含VL(1)和VL(2)。
在一个实施方案中，本发明的组合抗原受体包含第一肽链，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)优选地从N-末端到C-末端以顺序VH(1)-VL(2)排列，以及第二肽链，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)优选地从N-末端到C-末端以顺序VL(1)-VH(2)排列。免疫受体信号传递结构域优选位于可变区排列的C-末端，并且优选包含位于一条肽链上的T细胞受体α链的恒定区或其一部分，以及位于另一条肽链上的T细胞受体β链的恒定区。
在一个实施方案中，本发明的组合抗原受体包含第一肽链，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)优选地从N-末端到C-末端以顺序VH(1)-VH(2)排列，以及第二肽链，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)优选地从N-末端到C-末端以顺序VL(1)-VL(2)排列。免疫受体信号传递结构域优选位于可变区排列的C-末端，并且优选包含位于一条肽链上的T细胞受体α链的恒定区或其一部分，以及位于另一条肽链上的T细胞受体β链的恒定区或其一部分。
在一个方面，本发明涉及抗原受体，在本文中也称为串联抗原受体(tandemantigen receptor)，该受体包含第一肽链和第二肽链，其中第一肽链包含至少四个结构域和免疫受体信号传递结构域；第二肽链包含免疫受体信号传递结构域；其中来自第一肽链的两个结构域形成第一抗原结合位点，并且其中来自第一肽链的另外两个结构域形成第二抗原结合位点。
在一个实施方案中，本发明的串联抗原受体包含在第一肽链上的重链可变结构域连接于轻链可变结构域连接于另一重链可变结构域连接于轻链可变结构域，其中通过同一肽链上的重链可变结构域和轻链可变结构域之间的相互作用发生两个抗原结合位点的形成。因此，第一肽链包含同一肽链上的VH(1)和VL(1)以及VH(2)和VL(2)。在一个实施方案中，本发明的串联抗原受体可被认为包含在第一肽链上的通过接头肽连接的两个scFv分子。
在一个实施方案中，本发明的串联抗原受体包含第一肽链，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)优选地从N-末端到C-末端以顺序VH(1)-VL(1)-VH(2)-VL(2)、VL(1)-VH(1)-VH(2)-VL(2)、VH(1)-VL(1)-VL(2)-VH(2)或VL(1)-VH(1)-VL(2)-VH(2)排列。免疫受体信号传递结构域优选位于可变区排列的C末端，并且优选包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分或者T细胞受体β链的恒定区或其一部分。如果第一肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其一部分，则位于第二肽链上的免疫受体信号传递结构域优选包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分，或者如果第一肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分，则位于第二肽链上的免疫受体信号传递结构域优选包含T细胞受体β链的恒定区或其一部分。
本发明的抗原受体具有至少两个抗原结合位点，因此是至少二价的。如上所述，本发明抗原受体的结合位点可以结合相同或不同的表位，该表位可以位于相同或不同的抗原上。如果结合位点与相同的表位结合，特别是在同一抗原上，则两个结合位点可以是相同的或基本相同的和/或可以由相同或基本相同的结构域形成，其中这样相同或基本相同的结构域可衍生自例如相同的免疫球蛋白。如果结合位点与相同或不同抗原上的不同表位结合，则两个结合位点不同并且由不同结构域形成，其中这样的不同结构域可以衍生自不同的免疫球蛋白。在这样的不同结构域的情况下，优选地具有不同表位特异性的结构域彼此不相互作用或基本上不相互作用，即VH(1)不能与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)不能与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点。因此，VH(1)与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点。如果本发明的组合抗原受体包含两条肽链，其中一条肽链包含VH(1)和VL(2)并且另一条肽链包含VH(2)和VL(1)，则这导致肽链不能通过结构域的分子内相互作用形成抗原结合位点。
本发明抗原受体形成抗原结合位点的两个结构域也可以衍生自T细胞受体，并且可以是其维持抗原特异性结合，特别是与肽-MHC复合物结合的片段或部分，例如T细胞受体的可变区。
根据本发明，术语“T细胞受体的可变区”涉及TCR链的可变结构域。TCRα链和β链的可变区均具有三个高变区或互补决定区(CDR)，而β链的可变区具有通常不接触抗原并且因此不被视为CDR的额外高变区(HV4)。CDR3是负责识别经加工抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也显示与抗原肽的N末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C末端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC。β链的CDR4不被认为参与抗原识别，但已显示与超抗原相互作用。
涉及免疫球蛋白可变结构域的以上公开内容以相应的方式适用于T细胞受体可变结构域。代替对第一表位具有特异性的免疫球蛋白的重链可变结构域(VH)(VH(1))和对第一表位具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL)(VL(1))，本发明的抗原受体可包含对第一表位具有特异性的TCR的TCRα链的可变结构域和对第一表位具有特异性的TCR的TCRβ链的可变结构域。可替代地或另外地，代替对第二表位具有特异性的免疫球蛋白的重链可变结构域(VH)(VH(2))和对第二表位具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL)(VL(2))，本发明的抗原受体可包含对第二表位具有特异性的TCR的TCRα链的可变结构域和对第二表位具有特异性的TCR的TCRβ链的可变结构域。
由于每个抗原结合位点由两个结构域形成，所以每个结构域可分别包含免疫球蛋白或T细胞受体的部分或片段。单独的单个部分或片段可能不能够与抗原结合，但是当两个单个部分或片段缔合时，它们一起形成或重建原始免疫球蛋白或T细胞受体的抗原结合结构并且因此能够结合相同抗原，优选以相同的亲和力。
在抗原识别之后，受体优选簇集(cluster)并且将信号传递到细胞。在这方面，“免疫受体信号传递结构域”或“T细胞信号传导结构域”是涉及在抗原结合后将活化信号传递到T细胞的结构域。这种信号传递可以通过本发明的抗原受体来实现，所述抗原受体包含在一条肽链上的T细胞受体链的恒定区或不变区或者免疫细胞Fc受体链的恒定区或不变区或者所述恒定区或不变区的一部分，例如T细胞受体α链的恒定区或其一部分，并且包含在另一条肽链上的T细胞受体链的相应恒定区或不变区或者免疫细胞Fc受体链的相应恒定区或不变区或者所述恒定区或不变区的一部分，例如T细胞受体β链的恒定区或其一部分。在这方面，CD3复合物表示作为多分子T细胞受体(TCR)复合物的一部分在成熟人T细胞、胸腺细胞和自然杀伤细胞的子集上表达的抗原。T细胞共受体是一种蛋白质复合物，其由四条不同的链构成。在哺乳动物中，复合物包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与T细胞受体(TCR)和ζ链缔合以在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR、ζ链和CD3分子一起构成TCR复合物。CD3负责TCR的信号转导。如Lin和Weiss,Journal of Cell Science 114,243-244(2001)所述，通过结合MHC-呈递的特异性抗原表位活化TCR复合物导致通过Src家族激酶对基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的磷酸化，从而引起募集另外的激酶，其导致T细胞活化，包括Ca2+释放。例如通过固定的抗CD3抗体，CD3在T细胞上的簇集导致T细胞活化，其类似于T细胞受体接合，但不依赖于其克隆典型特异性。
抗原受体信号传递结构域优选至少用于与天然细胞信号转导复合物(例如CD3复合物)相互作用，所述复合物负责将与抗原受体的抗原结合信号传递到细胞中，从而导致免疫细胞活化。信号传递结构域的特性仅限于其具有与天然信号转导复合物相互作用以在抗原结合抗原受体时诱导免疫细胞活化的能力。
优选地，一条肽链上的信号传递结构域将与第二条链上的信号传递结构域形成二聚体，例如通过二硫键。优选的信号传递结构域可以包含T细胞受体链的恒定区或不变区或者免疫细胞Fc受体链的恒定区或不变区或者所述恒定区或不变区的一部分。优选的信号传递结构域可以包含T细胞受体的α、β、γ或δ链的恒定区或其一部分，以及免疫细胞Fc受体的恒定结构域的D2或D3不变区或其一部分。在一些优选实施方案中，第一肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分，并且第二肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其一部分，或者第一肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其一部分，并且第二肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分。在另一个实施方案中，第一肽链包含T细胞受体γ链的恒定区或其一部分，第二肽链包含T细胞受体δ链的恒定区或其一部分，或者第一肽链包含T细胞受体δ链的恒定区或其一部分，并且第二肽链包含T细胞受体γ链的恒定区或其一部分。任选地，可以修饰信号传递结构域，以使得在链之间产生额外的二硫键，从而导致更有效的二聚体形成和更高的二聚体稳定性。
尽管不希望限于特定的作用机制，但认为本发明抗原受体的两条肽链当在免疫细胞表面上表达时由于至少两条链上的单个免疫受体信号传递结构域之间的相互作用(例如二硫键)形成二聚体，并与参与生理T细胞受体信号转导的内源CD3复合物形成复合物。然而，本发明还可以包括与CD3ε或任何其他免疫细胞信号传导结构域(CD3、CD3亚基FcεR)直接融合，而不是TCR Cα和Cβ结构域。在抗原结合后，认为信号传递到细胞中，从而导致免疫细胞的活化和抗原特异性免疫应答的产生。此外，认为与仅能够链内抗原结合的单价受体和二价受体相比，链间抗原结合提供了更稳定的抗原-抗原受体-内源CD3信号转导模块，更高的稳定性继而允许更有效地刺激抗原特异性免疫应答。还认为这种更高的稳定性允许仅使用人来源免疫受体信号传递结构域(例如，使来自另一物种(例如小鼠)的氨基酸序列对来自人的氨基酸序列的替换最小化或没有)的选择。因此，可以避免针对抗原受体本身的任何潜在的不希望的免疫应答。
除了形成抗原结合位点的结构域和包含CD3ζ的免疫受体信号传递结构域或任何其他免疫细胞信号传导结构域以外，根据本发明的抗原受体或其肽链还包含一个或更多个共刺激结构域。共刺激结构域用于在抗原受体与靶向部分结合后增强T细胞如细胞毒性T细胞的增殖和存活。共刺激结构域的特性仅限于在抗原受体与靶向部分结合后其具有增强细胞增殖和存活的能力。合适的共刺激结构域包括CD28，肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员CD137(4-1BB)，受体的TNFR超家族的成员CD134(OX40)以及活化T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子CD278(ICOS)。本领域技术人员将理解，可以使用这些提到的共刺激结构域的序列变体而不会不利地影响本发明，其中这些变体与其在上面建模的结构域相同或相似的活性。这样的变体与得到它们的结构域的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，抗原受体构建体或其肽链包含两个共刺激结构域。尽管特定的组合包括四个提到的结构域的所有可能的变化，但具体的实例包括CD28+CD137(4-1BB)和CD28+CD134(OX40)。
本发明的抗原受体或其肽链可包含以从N末端到C末端方向连接的一个或更多个共刺激结构域和免疫受体信号传递结构域。然而，本发明的抗原受体或其肽链不限于该排列，其他排列也是可以接受的，并且包括免疫受体信号传递结构域和一个或更多个共刺激结构域。
应理解，由于形成抗原结合位点的结构域必须是自由结合抗原的，所以这些结构域在融合蛋白中的布置通常是这样的，以实现该区域在细胞外部的展示。同样地，由于共刺激结构域和免疫受体信号传递结构域用于诱导T细胞的活性和增殖，所以融合蛋白通常将这些结构域展示在细胞内部。抗原受体可以包含额外的元件，例如确保融合蛋白正确输出到细胞表面的信号肽，确保融合蛋白作为整体膜蛋白保持的跨膜结构域，以及赋予形成抗原结合位点的结构域柔性并允许与抗原强结合的铰链结构域(或间隔区)。
任选地，本发明的抗原受体还可以包含接头，该接头可以是可用作氨基酸序列之间的间隔区的随意的氨基酸序列或其他化学化合物。接头通常设计为提供柔性和蛋白酶抗性。例如，接头可以位于本发明组合抗原受体的第一肽链上的第一结构域和第二结构域之间和/或第二肽链上的第一结构域和第二结构域之间。在另一个实施方案中，接头可以位于本发明串联抗原受体的第一肽链上的至少四个结构域中的任意两个之间，即在第一结构域和第二结构域之间和/或第二结构域和第三结构域之间和/或第三结构域和第四结构域之间。任选地，接头可以存在于形成抗原结合位点的结构域和免疫受体信号传递结构域之间。本领域已知的允许结构域形成抗原结合位点或不干扰抗原结合的任何类型的接头均包括在本发明中。在一些具体实施方案中，接头可以是随意的氨基酸序列并且长度可以是至少5、10、15、20、25 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少100个氨基酸残基。氨基酸接头通常富含甘氨酸用于柔性，以及丝氨酸和苏氨酸用于溶解性。在一个实施方案中，接头是四个甘氨酸残基接丝氨酸残基(Gly4Ser)的一个或更多个(1、2、3、4、5、6、7、8或9)个重复。在某些实施方案中，接头可以是抗体或其片段的铰链区。
本发明的抗原受体还可以包含将抗原受体锚定在膜上的另一个结构域，如经典的跨膜结构域。优选地，跨膜结构域并入信号传递结构域中或者是信号传递结构域的一部分。
在另一些实施方案中，本发明的抗原受体或抗原受体的肽链可还包含其他结构域，例如当不是免疫受体信号传递结构域的一部分时，参与或增强抗原结合的另外的结构域，用于膜结合表达或用于分泌的信号序列，提供改善的二聚化的结构域和跨膜结构域。在某些实施方案中，跨膜结构域可以是跨越膜的疏水性α螺旋。
优选地，信号序列或信号肽是允许充分通过分泌途径以及在细胞表面上表达的序列或肽，以使得抗原受体例如可以与存在于胞外环境中的抗原结合。优选地，信号序列或信号肽是可切割的并且可从成熟肽链去除。信号序列或信号肽优选相对于其中产生肽链的细胞或生物体来选择。
在一个特定实施方案中，本发明组合抗原受体的肽链可以包含以下结构：NH2-信号肽-参与抗原结合的第一结构域-任选的接头-参与抗原结合的第二结构域-任选的接头-免疫受体信号传递结构域-COOH。
在一个特定实施方案中，本发明串联抗原受体的第一肽链可以包含以下结构：NH2-信号肽-参与抗原结合的第一结构域-任选的接头-参与抗原结合的第二结构域-任选的接头-参与抗原结合的第三结构域-任选的接头-参与抗原结合的第四结构域-任选的接头-免疫受体信号传递结构域-COOH。
关于本发明的串联抗原受体，参与形成第一肽链的抗原结合位点的第一和第二(从N末端到C末端)结构域也称为“N末端结构域”，并且参与形成第一肽链的抗原结合位点的第三和第四(从N末端到C末端)结构域在本文中也被称为“C末端结构域”。
本发明的示例性抗原受体包括但不限于由具有下表I中列出的结构的第一肽链和第二肽链形成的那些(VH是免疫球蛋白的重链可变区或其一部分；VL是免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分；C1和C2是免疫受体信号传递结构域，其将彼此形成二聚体，例如免疫细胞Fc受体链的恒定区或不变区，或者T细胞受体链的恒定区或不变区，或者所述恒定区或不变区的一部分)：
表I
第一肽链 第二肽链
VH(1)-VL(2)-C1 VL(1)-VH(2)-C2
VH(1)-VH(2)-C1 VL(1)-VL(2)-C2
VH(1)-VH(2)-C1 VL(2)-VL(1)-C2
VH(1)-VL(2)-C1 VH(2)-VL(1)-C2
VH(1)-VL(1)-VH(2)-VL(2)-C1 C2
VL(1)-VH(1)-VH(2)-VL(2)-C1 C2
VH(1)-VL(1)-VL(2)-VH(2)-C1 C2
VL(1)-VH(1)-VL(2)-VH(2)-C1 C2
如上文定义的，抗原受体包含对第一表位具有特异性的免疫球蛋白的重链可变结构域(VH)(VH(1))，对第一表位具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL)(VL(1))，对第二表位具有特异性的免疫球蛋白的重链可变结构域(VH)(VH(2))，以及对第二表位具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL)(VL(2))，该第一表位和第二表位可以相同或不同，并且可以位于相同或不同的抗原上。在一个实施方案中，VH(1)能够与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)能够与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，而VH(1)不能与VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)不能与VL(1)相互作用并形成抗原结合位点。然而，在另一个实施方案中，VH(1)能够与VL(1)和VL(2)相互作用并形成抗原结合位点，并且VH(2)能够与VL(2)和VL(1)相互作用并形成抗原结合位点。在后一个实施方案中，VH(1)和VH(2)可以相同或至少来自相同的免疫球蛋白，并且VL(1)和VL(2)可以相同或至少来自相同的免疫球蛋白。
在一些特定实施方案中，表1中列出的第一肽链和第二肽链的C1结构域和C2结构域分别是T细胞受体α链和β链的恒定区或其一部分。
在一个优选实施方案中，当一条肽链上的两个结构域均是免疫球蛋白重链可变区或其一部分并且另一条链上的两个结构域均是免疫球蛋白轻链可变区或其一部分时，在这两条肽链上的第一结构域和第二结构域之间存在接头。接头可以是10-25个氨基酸长度，更优选15个氨基酸长度的随意的氨基酸序列。在一些特定实施方案中，接头是5聚体氨基酸序列(Gly4Ser)的3个重复。
在本发明的某些实施方案中，第一肽链和第二肽链(例如包含形成抗原结合位点的一个或更多个结构域或者免疫受体信号传递结构域的那些)的氨基酸序列为哺乳动物来源，优选小鼠来源，并且更优选人来源。在一个实施方案中，氨基酸序列为人来源，但是已经通过用在小鼠序列中相应位置中发现的氨基酸替换人序列中的一个或更多个氨基酸而鼠源化。这种替换可以提供更大的二聚化或稳定性或者在抗原结合后将信号传递到细胞中的能力。在又一个实施方案中，氨基酸序列为小鼠来源并且已人源化。
根据本发明，抗原受体可替代如上所述的T细胞受体的功能，并且特别地，可赋予细胞(例如如上所述的T细胞)反应性，例如细胞溶解活性。然而，与如上所述的T细胞受体与抗原肽-MHC复合物的结合相反，抗原受体在某些实施方案中可以与抗原结合，特别是当在细胞表面上表达时。
肽链(包括任何结构域或接头)的氨基酸序列可以被修饰。例如，并且如本领域技术人员所理解的，抗体和T细胞受体的可变区的序列可被修饰而不丧失结合靶标的能力，因此抗原结合位点的氨基酸序列可以进行类似的修饰而不丧失结合靶标的能力。例如，形成抗原结合位点的结构域的氨基酸序列可以与得到其的抗体的可变区相同或高度同源。通过“高度同源”，预期可以进行1至5个，优选1至4个，例如1至3个或1或2个替换。在一个实施方案中，肽链可包含天然氨基酸和非天然氨基酸。在另一个实施方案中，肽链仅包含天然氨基酸。术语“非天然氨基酸”是指具有与20种天然氨基酸种类不同的结构的氨基酸。由于非天然氨基酸具有与天然氨基酸类似的结构，因此非天然氨基酸可以归类为给定天然氨基酸的衍生物或类似物。
本发明还包括本文所述的抗原受体和肽链的衍生物。根据本发明，“衍生物”是蛋白质和肽的经修饰形式。这样的修饰包括任何化学修饰，并且包括与抗原受体或肽链缔合的任何分子(例如碳水化合物、脂质和/或蛋白质或肽)的单个或多个替换、缺失和/或添加。在一个实施方案中，蛋白质或肽的“衍生物”包括由糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白水解切割或与抗原结合得到的那些经修饰类似物。术语“衍生物”还延伸至所述抗原受体和肽链的所有功能性化学等同物。优选地，经修饰的抗原受体或其肽链具有提高的结合或二聚化能力和/或提高的免疫活化能力。
与本发明的抗原受体系统结合使用的细胞优选为T细胞，特别是细胞毒性淋巴细胞，优选地选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞。一旦活化，这些细胞毒性淋巴细胞中的每一种都触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过以下方式中的任一种或两种触发靶细胞的破坏。首先，活化后，T细胞释放细胞毒素，例如穿孔素、颗粒酶(granzyme)和颗粒溶素(granulysin)。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，而颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发胱天蛋白酶级联，其诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次，凋亡可以通过T细胞和靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导。尽管可以使用异源细胞或同种异体细胞，但细胞毒性淋巴细胞优选是自体细胞。
术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白质，优选涉及抗原受体例如抗体或B细胞受体(BCR)。免疫球蛋白的特征在于具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠的结构域，即免疫球蛋白结构域。该术语涵盖膜结合免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合免疫球蛋白也称为表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其通常是BCR的一部分。可溶性免疫球蛋白通常被称为抗体。免疫球蛋白通常包含多条链，通常是通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链。这些链主要由免疫球蛋白结构域构成，例如VL(可变轻链)结构域、CL(恒定轻链)结构域和CH(恒定重链)结构域CH1、CH2、CH3和CH4。存在五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即α、δ、ε、γ和μ，其是不同种类的抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的原因。与可溶性免疫球蛋白的重链相比，膜或表面免疫球蛋白的重链包含在其羧基端的跨膜结构域和短的胞质结构域。在哺乳动物中存在两种类型的轻链，即λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型中基本上是保守的，其中可变部分是高度不同的并且是抗原识别的原因。
术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其中间散布着更保守的区域，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指单分子组分的抗体分子的制备物(preparation)。单克隆抗体显示单一的结合特异性和亲和力。在一个实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的从非人动物(例如，小鼠)获得的B细胞。
本文中使用的术语“重组抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从相对于免疫球蛋白基因为转基因的或转染色体的动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；(b)从转化以表达抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)中分离的抗体；(c)从重组体、组合的抗体文库中分离的抗体；以及(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。
本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可包含不被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
术语“人源化抗体”是指具有基本上来源于非人物种的免疫球蛋白之抗原结合位点的分子，其中所述分子的其余的免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或仅移植到可变结构域中的适当框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的或通过一个或更多个氨基酸替换进行修饰，例如，修饰为使其与人免疫球蛋白更类似。一些形式的人源化抗体保留全部CDR序列(例如包含来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。另一些形式具有相对于原始抗体改变的一个或更多个CDR。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与来源于特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而该链的其余区段与另一抗体中的相应序列同源。通常来说，轻链和重链两者的可变区模拟来源于一种哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一物种的抗体的序列同源。这样的嵌合形式的一个明显的优点在于可以使用容易获得的B细胞或来自非人宿主生物体的杂交瘤由目前已知的来源方便地获得可变区，而与其组合的恒定区来自例如人细胞制备物。尽管可变区具有易于制备的优点并且特异性不受来源的影响，在抗体注射时，为人的恒定区引发人对象免疫应答的可能性将比来自非人来源的恒定区低。然而，该定义不限于该具体实例。
抗体可来源于不同的物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。
本文中所述的抗体包括IgA，例如IgA1或IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM和IgD抗体。在多个实施方案中，所述抗体是IgG1抗体，更特别是IgG1、κ或IgG1、λ同种型(即，IgG1、κ、λ)；IgG2a抗体(例如IgG2a、κ、λ)；IgG2b抗体(例如IgG2b、κ、λ)；IgG3抗体(例如IgG3、κ、λ)或IgG4抗体(例如IgG4、κ、λ)。
本文中所述的抗原受体可包含一种或更多种抗体的抗原结合部分。术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“结合部分”)或抗体的“抗原结合片段”(或简称为“结合片段”)或类似术语是指保留与抗原特异性结合的能力的抗体的一个或更多个片段。已表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗体结合部分”中涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)和(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由单独的基因编码，但是可以使用重组方法通过使得它们能够形成为单个蛋白质链的合成接头将它们连接，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体还旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”中。另一个实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；以及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。所述结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白进一步公开于US 2003/0118592和US 2003/0133939中。使用本领域技术人员已知的常规方法获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式根据用途对片段进行筛选。
单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其与接头肽连接。接头可以将VH的N端与VL的C端连接，反之亦然。二价(或双价)单链可变片段(di-scFv、bi-scFv)可以通过连接两个scFv来改造。这可以通过产生具有两个VH和两个VL区的单个肽链来完成，从而得到串联scFv。
结合本发明，术语“结合结构域”或简称为“结构域”表征了任选地当与另一个结构域相互作用时与给定靶结构/抗原/表位结合/相互作用的结构，例如抗体结构。因此，根据本发明的这些结构域表示“抗原结合位点”。
抗体和抗体衍生物可用于提供结合结构域，例如抗体片段，特别是用于提供VL和VH区。
可能存在于抗原受体中的抗原的结合结构域具有结合(靶向)抗原的能力，即结合(靶向)存在于抗原中的表位，优选位于抗原的胞外结构域中的表位的能力。优选地，抗原的结合结构域对抗原具有特异性。优选地，抗原的结合结构域与在细胞表面上表达的抗原结合。在一些特别优选的实施方案中，抗原的结合结构域与存在于活细胞表面上的抗原的天然表位结合。
出于本发明的目的，本文中所述的所有抗体和抗体的衍生物例如抗体片段涵盖在术语“抗体”中。
抗体可以通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交方法是优选的，但是原则上可以使用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化或者使用抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是一种非常成熟的方法。分离用于融合的经免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(partner)(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的其他优选的动物系统是大鼠和兔系统(例如Spieker-Polet等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:9348(1995)中描述的，也参见Rossi等，Am.J.Clin.Pathol.124:295(2005))。
为了产生抗体，可以用衍生自抗原序列(即所述抗体针对的序列)、重组表达的抗原或其片段的富集制备物和/或表达所述抗原的细胞的载体缀合肽免疫接种小鼠。或者，可以用编码抗原或其片段的DNA免疫接种小鼠。在使用抗原的纯化或富集制备物的免疫接种不产生抗体的情况下，也可以用表达所述抗原的细胞(例如，细胞系)免疫接种小鼠以促进免疫应答。
可以在免疫方案的过程中监测免疫应答，其中血浆和血清样品通过尾静脉或眼眶后出血获得。具有足够的免疫球蛋白滴度的小鼠可以用于融合。可以在处死和去除脾脏前3天用抗原表达细胞对小鼠进行腹膜内或静脉内加强免疫以提高特异性抗体分泌杂交瘤的比率。
为了产生产生单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自经免疫小鼠的脾细胞和淋巴结细胞并将其融合至合适的永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。然后筛选所得的杂交瘤以产生抗原特异性抗体。然后可以通过ELISA针对分泌抗体的杂交瘤对各孔进行筛选。通过使用抗原表达细胞的免疫荧光和FACS分析，可以鉴定对抗原具有特异性的抗体。可以将分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次进行筛选，并且如果仍然对单克隆抗体呈阳性，则可以通过有限稀释进行亚克隆。然后可以将稳定的亚克隆体外培养以在组织培养基中产生抗体用于表征。
可以使用标准结合测定(例如，ELISA、Western印迹、免疫荧光和流式细胞术分析)来测定抗体和其他结合剂结合抗原的能力。
根据本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。
根据本发明，在标准测定中，如果试剂对于预定靶标具有显著的亲和力并且与所述预定靶标结合，则所述试剂(例如抗原受体)能够结合(靶向)所述预定靶标。“亲和力”或“结合亲和力”常常通过平衡解离常数(KD)测量。优选地，术语“显著的亲和力”是指以10-5M或更低、10-6M或更低、10-7M或更低、10-8M或更低、10-9M或更低、10-10M或更低、10-11M或更低或者10-12M或更低的解离常数(KD)与预定靶标结合。
在标准测定中，如果试剂对于靶标没有显著的亲和力并且不与所述靶标显著地结合(特别是不可检测地结合)，则所述试剂(基本上)不能结合(靶向)所述靶标。优选地，如果试剂以高达2μg/ml，优选10μg/ml，更优选20μg/ml，特别是50μg/ml或100μg/ml或更高的浓度存在，则所述试剂不与所述靶标可检测地结合。优选地，如果试剂与靶标以与预定靶标(所述试剂能够与其结合)结合之KD相比至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍高的KD结合，则所述试剂对于所述靶标没有显著的亲和力。例如，如果试剂与所述试剂能够结合的靶标结合的KD为10-7M，则与所述试剂对其不具有显著的亲和力的靶标结合的KD将为至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M。
在标准测定中，如果试剂能够与预定靶标结合，而其(基本上)不能与其他靶标结合，即对其他靶标没有显著的亲和力并且不与其他靶标显著地结合，则所述试剂对于所述预定靶标是特异性的。优选地，如果对这样的其他靶标的亲和力和与这样的其他靶标结合不显著地超过对与预定靶标无关的蛋白质(例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或人血清白蛋白(HSA))的亲和力或与其结合，则所述试剂对于所述预定靶标是特异性的。优选地，如果试剂与预定靶标以与所述试剂对其不为特异性的靶标结合之KD相比至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍低的KD结合，则所述试剂对于所述靶标是特异性的。例如，如果试剂与所述试剂对其为特异性的靶标结合的KD为10-7M，则与所述试剂对其不为特异性的靶标结合的KD将为至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M。
可以使用任何合适的方法通过实验确定试剂与靶标的结合，参见例如Berzofsky等，“Antibody-Antigen Interactions”In Fundamental Immunology,Paul,W.E.编辑,Raven Press New York,N Y(1984),Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and CompanyNew York,N Y(1992)，以及本文中所述的方法。亲和力可使用常规技术容易地确定，例如通过平衡透析；通过使用BIAcore 2000仪器，使用制造商概述的一般程序；通过使用放射性标记的靶抗原的放射免疫测定；或通过本领域技术人员已知的其他方法。亲和力数据可例如通过Scatchard等,Ann N.Y.Acad.ScL,51:660(1949)的方法分析。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH)下测量，则测量的具体抗体-抗原相互作用的亲和力可以不同。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD、IC50)的测量优选用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行。
本发明可涉及在体外或体内将编码抗原受体的核酸引入(即转染)入细胞例如T细胞中。
出于本发明的目的，术语“转染”包括将核酸引入细胞中或通过细胞摄取核酸，其中所述细胞可存在于对象(例如，患者)中。因此，根据本发明，本文中所述的用于转染核酸的细胞可以体外或体内存在，例如，细胞可以形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，如果转染的遗传物质仅是瞬时表达的，则其是足够的。由于在转染过程中引入的核酸通常不整合到核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂稀释或降解。允许核酸的附加型扩增的细胞大大降低了稀释率。如果希望转染的核酸实际上保留在细胞及其子代细胞的基因组中，则必须发生稳定的转染。可以将RNA转染入细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。
根据本发明，可使用可用于将核酸引入(即转移或转染)到细胞中的任何技术。优选地，通过标准技术将核酸例如RNA转染到细胞中。这样的技术包括电穿孔、脂质转染(lipofection)和显微注射。在本发明的一个特别优选的实施方案中，通过电穿孔将RNA引入细胞中。电穿孔或电渗透涉及由外部施加的电场引起的细胞质膜的电导率和渗透性的显著增加。其通常作为将某种物质引入细胞中的方式用于分子生物学中。根据本发明，优选的是，将编码蛋白质或肽的核酸引入细胞中导致所述蛋白质或肽的表达。
可使用多种方法以将抗原受体构建体引入T细胞中，包括基于非病毒的DNA转染、基于转座子的系统和基于病毒的系统。基于非病毒的DNA转染具有低插入诱变的风险。基于转座子的系统可以较不包含整合元件的质粒更有效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ-逆转录病毒和慢病毒载体。γ-逆转录病毒相对容易产生，有效且永久地转导T细胞，并且从原代人T细胞的整合观点来看已被初步证明是安全的。慢病毒载体也有效且永久地转导T细胞，但制造更昂贵。它们也比基于逆转录病毒的系统潜在地更安全。
为了在体内转染细胞，可使用包含编码抗原受体的核酸的药物组合物。将核酸靶向特定细胞例如T细胞的递送载体可被施用于患者，从而导致在体内发生的转染。
根据本发明，优选的是以裸形式或在载体中施用编码抗原受体的核酸。考虑用于本发明的载体(例如脂质载体)包括可以例如通过与核酸形成复合物或形成核酸被封闭或包封在其中的囊泡而与核酸(例如RNA)缔合的任何物质或载体。与裸核酸相比，这可导致核酸的稳定性增加。特别地，血液中核酸的稳定性可增加。例如，可以使用具有确定的粒径的纳米颗粒RNA制剂，例如来自RNA和脂质体的脂质复合物(lipoplex)，例如包含DOTMA和DOPE或DOTMA和胆固醇的脂质复合物。
本文中使用的术语“纳米颗粒”是指具有使得颗粒适用于特别是核酸的全身性(特别是肠胃外)施用的直径，通常小于1000纳米(nm)的直径的任何颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径小于600nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径小于400nm。
本文中使用的术语“纳米颗粒制剂”或类似术语是指包含至少一种纳米颗粒的任何物质。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是纳米颗粒的均匀集合体。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是分散体或乳液。通常，当将至少两种不混溶的材料组合时，形成分散体或乳液。
术语“脂质复合物”或“核酸脂质复合物”，特别是“RNA脂质复合物”是指脂质和核酸(特别是RNA)的复合物。当将常常也包含中性“辅助”脂质的阳离子脂质体与核酸混合时，自发形成脂质复合物。
阳离子脂质、阳离子聚合物和其他带正电荷的物质可与带负电荷的核酸形成复合物。这些阳离子分子可以用于与核酸复合，从而分别形成例如所谓的脂质复合物或聚合复合物(polyplex)，并且已经显示这些复合物将核酸递送到细胞中。
用于本发明的纳米颗粒核酸制备物可以通过多种方案和由多种核酸络合化合物获得。脂质、聚合物、寡聚物或两亲物是典型的络合剂。在一个实施方案中，络合化合物包含选自鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚-L-赖氨酸、聚-L-精氨酸或组蛋白的至少一种试剂。
根据本发明，鱼精蛋白可用作阳离子载体剂。术语“鱼精蛋白”是指富含精氨酸且发现特别是与多种动物(如鱼)的精细胞中的DNA(代替体细胞组蛋白)缔合的相对低分子量的任何各种强碱性蛋白质。特别地，术语“鱼精蛋白”是指在鱼精子中发现的强碱性蛋白质，其可溶于水，不通过热凝固，并且在水解时主要产生精氨酸。以纯化形式，它们用于长效胰岛素制剂并中和肝素的抗凝作用。
根据本发明，本文中使用的术语“鱼精蛋白”意在包括获得或衍生自天然或生物来源的任何鱼精蛋白氨基酸序列，包括其片段和所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式。此外，该术语涵盖人工的和为特定目的而特别设计的且不能从天然或生物来源分离的(合成)多肽。
根据本发明使用的鱼精蛋白可以是硫酸化鱼精蛋白或盐酸鱼精蛋白。在一个优选实施方案中，用于产生本文中描述纳米颗粒的鱼精蛋白来源是鱼精蛋白5000，其在等渗盐溶液中包含超过10mg/ml(5000个肝素中和单位/ml)的鱼精蛋白。
脂质体是常常具有一个或更多个形成囊泡的脂质(例如磷脂)双层的微观脂质囊泡并且能够包封药物。在本发明的上下文中可应用不同类型的脂质体，包括但不限于多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)、大单层囊泡(LUV)、空间稳定的脂质体(SSL)、多囊囊泡(MV)和大多囊囊泡(LMV)以及本领域已知的其他双层形式。脂质体的尺寸和片层性(lamellarity)将取决于制备方式，并且待使用的囊泡类型的选择将取决于优选的施用方式。存在几种其他形式的超分子组织，其中脂质可存在于水性介质中，包括由单层构成的层状相、六角相和倒六角相、立方相、胶束、反胶束。这些相也可以与DNA或RNA的组合获得，并且与RNA和DNA的相互作用可显著影响相态。所描述的相可存在于本发明的纳米颗粒核酸制剂中。
为了由核酸和脂质体形成核酸脂质复合物，可以使用任何合适的形成脂质体的方法，只要其提供设想的核酸脂质复合物即可。脂质体可使用标准方法形成，例如反向蒸发法(REV)、乙醇注射法、脱水-再水化法(DRV)、超声或其他合适的方法。
在脂质体形成之后，脂质体的尺寸可以设置为获得具有基本上均匀的尺寸范围的脂质体群体。
形成双层的脂质通常具有两个烃链(特别是酰基链)和极性或非极性的头部基团。形成双层的脂质由天然存在的脂质或合成来源构成，包括磷脂例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中两个烃链的长度通常为约14-22个碳原子，并且具有不同的不饱和程度。用于本发明组合物的其他合适的脂质包括糖脂和固醇例如胆固醇及其也可以用于脂质体的各种类似物。
阳离子脂质通常具有亲脂性部分，例如固醇、酰基或二酰基链，并且具有总的净正电荷。脂质的头部基团通常携带正电荷。阳离子脂质优选具有1至10价的正电荷，更优选1至3价的正电荷，并且更优选1价的正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基二(十八烷基)铵(DDAB)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、二(十八烷基)二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-1,3-二甲基羟基乙基铵(DMRIE)和2,3-二油酰氧基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)。优选的是DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。最优选的是DOTMA。
此外，鉴于结构稳定性等，本文中所述的纳米颗粒优选进一步包含中性脂质。鉴于核酸-脂质复合物的递送效率，可以适当地选择中性脂质。中性脂质的实例包括但不限于1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、固醇和脑苷脂。优选的是DOPE和/或DOPC。最优选的是DOPE。在阳离子脂质体包含阳离子脂质和中性脂质两者的情况下，鉴于脂质体的稳定性等，可以适当地确定阳离子脂质与中性脂质的摩尔比。
根据一个实施方案，本文中所述的纳米颗粒可包含磷脂。磷脂可以是甘油磷脂。甘油磷脂的实例包括但不限于三种类型的脂质：(i)两性离子磷脂，其包括例如天然、部分氢化或完全氢化形式的磷脂酰胆碱(PC)、卵黄磷脂酰胆碱、大豆来源的PC、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)鞘磷脂(SM)；(ii)带负电荷的磷脂：其包括例如磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)二棕榈酰PG、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)；合成衍生物，其中缀合物使两性离子磷脂带负电荷，例如甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)的情况；和(iii)阳离子磷脂，其包括例如磷酸单酯经O-甲基化以形成阳离子脂质的磷脂酰胆碱或鞘磷脂。
核酸与脂质载体的缔合可以例如通过如下发生：载体的核酸填充间隙空间，以使得载体物理地捕获核酸，或者通过共价、离子或氢键合，或者通过经由非特异性键吸附。无论缔合方式如何，核酸必须保留其治疗(即编码)特性。
根据本发明，在一个实施方案中编码抗原受体的核酸是RNA，优选mRNA。RNA优选通过体外转录获得。
本文中使用的术语“核酸”旨在包括DNA和RNA，例如基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。核酸分子可为单链或双链。RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。根据本发明，核酸优选是分离的核酸。
核酸可包含在载体中。本文中使用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体例如λ噬菌体、病毒载体例如腺病毒或杆状病毒载体，或人工染色体载体例如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC)。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒以及病毒载体，并且通常包含用于在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或在体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的期望编码序列和合适的DNA序列。克隆载体通常用于改造和扩增某个期望的DNA片段，并且可缺少用于表达期望的DNA片段所需的功能性序列。
在本发明的上下文中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并优选完全或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2’-位上具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而与天然存在的RNA不同的经修饰RNA。这样的改变可以包括将非核苷酸物质添加至例如RNA的末端或内部，例如RNA的一个或更多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并且优选涉及“mRNA”，所述mRNA意指“信使RNA”并且涉及可使用DNA作为模板产生的“转录物”并编码肽或蛋白质。mRNA通常包含5’非翻译区(5’-UTR)、蛋白质或肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。mRNA在细胞中和在体外具有有限的半衰期。优选地，使用DNA模板通过体外转录产生mRNA。在本发明的一个实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成获得。体外转录方法是技术人员已知的。例如，存在多种可商购的体外转录试剂盒。
在本发明的一个实施方案中，RNA是自我复制的RNA，例如单链自我复制的RNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是正义单链RNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是病毒RNA或来源于病毒RNA的RNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是甲病毒属基因组RNA或来源于甲病毒属基因组RNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是病毒基因表达载体。在一个实施方案中，病毒是塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)。在一个实施方案中，自我复制的RNA包含一个或更多个转基因，所述转基因中的至少一个编码本文中所述的试剂。在一个实施方案中，如果RNA是病毒RNA或来源于病毒RNA，则转基因可部分或完全替换病毒序列，例如编码结构蛋白的病毒序列。在一个实施方案中，自我复制的RNA是体外转录的RNA。
为了增加根据本发明使用的RNA的表达和/或稳定性，可对其进行修饰，优选地不改变所表达的肽或蛋白质的序列。
根据本发明使用的在RNA的上下文中的术语“修饰”包括RNA不天然存在于所述RNA中的任何修饰。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5'-三磷酸。可以通过用磷酸酶处理RNA来实现这样的未加帽的5'-三磷酸的去除。
根据本发明的RNA可具有经修饰天然存在或合成的核糖核苷酸以增加其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，5-甲基胞苷部分或完全，优选完全替代胞苷。可替代地或另外地，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，假尿苷部分或完全，优选完全替代尿苷。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA。术语“5'-帽”是指存在于mRNA分子的5'端上的帽结构，并且通常由通过不寻常的5'至5'三磷酸键联连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7-位上甲基化。术语“常规5'-帽”是指天然存在的RNA 5'-帽，优选是指7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中，术语“5'-帽”包括5'-帽类似物，其类似于RNA帽结构并且被修饰以具有使RNA(如果连接至其上)稳定的能力，优选在体内和/或在细胞中。
提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA可通过在所述5'-帽或5'-帽类似物的存在下体外转录DNA模板来实现，其中所述5'-帽被共转录地并入产生的RNA链中，或者RNA可例如通过体外转录产生，并且可使用加帽酶(例如，牛痘病毒的加帽酶)将5'-帽连接至转录后的RNA。
RNA可包含另外的修饰。例如，本发明中使用的RNA的另外的修饰可以是天然存在的聚(A)尾的延伸或截短或者5'-或3'-非翻译区(UTR)的改变，例如引入与所述RNA的编码区无关的UTR，例如插入一个或更多个，优选两个拷贝的来源于球蛋白基因的3'-UTR，例如α2球蛋白、α1球蛋白、β球蛋白，优选β-球蛋白，更优选人β-球蛋白。
因此，为了增加根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可对其进行修饰以与聚A序列共同存在，所述聚A序列优选具有10至500、更优选30至300、甚至更优选65至200并且特别是100至150个腺苷残基的长度。在一个特别优选的实施方案中，聚A序列具有约120个腺苷残基的长度。此外，将两个或更多个3'-非翻译区(UTR)并入RNA分子的3'-非翻译区中可以导致翻译效率提高。在一个具体实施方案中，3'-UTR来源于人β-球蛋白基因。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子的活性、量或数目的一半所需的时间。在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可影响RNA的“表达持续时间”。可以预期，具有长半衰期的RNA将表达延长的时间段。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码被转录成RNA的过程。随后，RNA可被翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中RNA(特别是mRNA)在无细胞体系中体外合成的过程，优选使用适当的细胞提取物。优选地，将克隆载体应用于产生转录物。这些克隆载体通常被称为转录载体并且根据本发明涵盖在术语“载体”中。
根据本发明的术语“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过该过程，信使RNA的链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白质。
根据本发明，核酸可单独存在或与其他核酸(其可为同源或异源的)组合存在。在一些优选的实施方案中，核酸与表达控制序列功能地连接，所述表达控制序列相对于所述核酸可为同源或异源的。术语“同源的”意指核酸也是天然功能连接的，术语“异源的”意指核酸不是天然功能连接的。
如果核酸和表达控制序列以所述核酸的表达或转录处于所述表达控制序列的控制下或受所述表达控制序列的影响这样的方式彼此共价连接，则它们彼此“功能”连接。如果将核酸翻译成功能性蛋白质，则随着表达控制序列与编码序列功能连接，诱导所述表达控制序列导致所述核酸的转录，而不引起编码序列的移码或所述编码序列不能被翻译成期望的蛋白质或肽。
根据本发明，术语“表达控制序列”或“表达控制元件”包含启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件。在本发明的一些具体实施方案中，可以调控表达控制序列。表达控制序列的精确结构可根据物种或细胞类型而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5'-非转录序列以及5'-和3'-非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5'-非转录表达控制序列包含启动子区域，其包含用于功能连接的核酸之转录控制的启动子序列。表达控制序列还可包含增强子序列或上游活化子序列。
根据本发明，术语“表达”以其最一般性的含义使用并且包括例如通过转录和/或翻译产生RNA和/或肽或蛋白质。关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别涉及肽或蛋白质的产生。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。根据本发明，术语表达还包括“不正常表达”或“异常表达”。
根据本发明，“不正常表达”或“异常表达”意指与参照，例如对象不患有与某种蛋白质(例如，肿瘤抗原)不正常或异常表达有关的疾病的状态相比，表达改变，优选提高。表达提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％或至少100％或更多。在一个实施方案中，表达仅存在于病变组织中，而健康组织中的表达受到抑制。
术语“特异性表达”意指蛋白质基本上仅在特定组织或器官中表达。例如，在胃黏膜中特异性表达的肿瘤抗原意指所述蛋白质主要在胃黏膜中表达并且不在其他组织中表达或在其他组织或器官类型中不在很大程度上表达。因此，仅在胃黏膜细胞中表达和在任何其他组织例如睾丸中在显著较小的程度上表达的蛋白质在胃黏膜细胞中特异性表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原也可在正常条件下在多于一种组织类型或器官中，例如在2或3种组织类型或器官中，但优选在不超过3种不同组织或器官类型中特异性表达。在这种情况下，然后肿瘤抗原在这些器官中特异性表达。例如，如果肿瘤抗原在正常条件下在肺和胃中优选以大约相同的程度表达，则所述肿瘤抗原在肺和胃中特异性表达。
根据本发明，术语“编码……的核酸”意指如果存在于合适的环境中，优选在细胞内，核酸可被表达以产生其编码的蛋白质或肽。
根据本发明的术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包含2个或更多个，优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选9个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选21个或更多个，并且多至优选8、10、20、30、40或50个，特别是100个通过肽键共价连接的氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大的肽，优选具有多于100个氨基酸残基的肽，但通常术语“肽”、“肽链”和“蛋白质”是同义词并且在本文中可互换使用。
如上所述，本文中所述的肽链和抗原受体的氨基酸序列可以被修饰以获得所述氨基酸序列的变体。因此，本发明包括本文中所述的肽和蛋白质序列的变体，并且包括天然存在的氨基酸序列的变体，从而产生功能上等同于所述序列的序列，例如表现出与所述序列的性质相同或相似的性质的氨基酸序列。重要的性质是保持抗原受体与其靶标的结合或将抗原结合信号转导至细胞例如T细胞。在一个实施方案中，变体分子或序列在免疫学上等同于其亲本分子或序列。
根据本发明的术语“变体”特别是指突变体、剪接变体、构象变体、同工型、等位基因变体、种变体(species variant)和种同源物(species homolog)，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列中的改变，其显著性常常不明显。全基因测序常常鉴定出给定基因的多种等位基因变体。种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”应涵盖任何翻译后经修饰变体和构象变体。
术语“免疫学上等同”意指例如关于免疫效应类型表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学效应的免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列。在本发明的上下文中，术语“免疫学上等同”优选地关于用于治疗的抗原受体的免疫学效应或特性使用。
本领域技术人员将理解，特别地，可对CDR序列、高变区和可变区的序列进行修饰而不丧失与靶标结合的能力。例如，CDR区可与亲本抗体区域相同或高度同源。“高度同源”，可以考虑可在CDR中进行1至5个，优选1至4个，例如1至3个或者1或2个替换。
出于本发明的目的，氨基酸序列的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。在蛋白质的N-末端和/或C-末端处包含缺失的氨基酸缺失变体也被称为N-末端和/或C-末端截短变体。
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或更多个氨基酸残基插入到氨基酸序列的特定位点中，尽管随机插入并对所产生的产物进行合适的筛选也是可能的。
氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸(例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸)的氨基端和/或羧基端融合。
氨基酸缺失变体的特征在于从序列中除去一个或更多个氨基酸，例如除去1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。该缺失可在蛋白质的任何位置中。
氨基酸替换变体的特征在于除去序列中的至少一个残基并在该位置中插入另一个残基。优选在氨基酸序列中在同源蛋白质或肽之间不保守的位置处进行修饰和/或用具有相似性质的其他氨基酸替换氨基酸。优选地，蛋白质变体中的氨基酸改变是保守氨基酸改变，即，替换带相同电荷或不带电荷的氨基酸。保守氨基酸改变包括替换在其侧链中相关的氨基酸家族中的一个。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被一起分为芳香族氨基酸。
优选地，给定氨基酸序列和所述给定氨基酸序列变体的氨基酸序列之间的相似性程度(优选同一性)将为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地对于氨基酸区域给出相似性程度或同一性，其为参照氨基酸序列整个长度的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。例如，如果参照氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选对于至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸(优选连续氨基酸)给出相似性程度或同一性。在一些优选的实施方案中，对于参照氨基酸序列的整个长度给出相似性程度或同一性。可用本领域已知的工具用于确定序列相似性(优选序列同一性)的比对，优选使用最佳序列比对，例如使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS::needle，矩阵：Blosum62，空位开放(Gap Open)10.0，空位延伸(Gap Extend)0.5进行。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语“百分比同一性”旨在表示在最佳比对后获得的待比较的两个序列之间相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯粹统计学的，并且两个序列之间的差异随机分布并覆盖其全长。两个氨基酸序列之间的序列比较通过在对其最佳比对之后比较这些序列常规地进行，所述比较通过区段或通过“比较窗”进行以鉴定和比较局部区域的序列相似性。除手动产生之外，用于比较的序列的最佳比对可通过以下产生：Smith和Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源性算法，Neddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法，Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85,2444的相似性搜索法，或通过使用这些算法的计算机程序(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.)。
同一性百分比通过以下计算：确定进行比较的两个序列之间的相同的位置数，将该数除以比较的位置数，并将获得的结果乘以100从而获得这两个序列之间的百分比同一性。
根据本发明，同源氨基酸序列表现出至少40％，特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％并且优选至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸残基同一性。
根据本发明，氨基酸序列、肽或蛋白质的变体、片段、部分、一部分或衍生物优选分别具有衍生其的氨基酸序列、肽或蛋白质的功能特性，即它是功能上等同的。在一个实施方案中，氨基酸序列、肽或蛋白质的变体、片段、部分、一部分或衍生物分别在功能上等同于(例如在免疫学上等同于)衍生其的氨基酸序列、肽或蛋白质。在一个实施方案中，功能特性是与抗原结合或在细胞内转导结合信号的特性。
根据本发明，术语“衍生”意指特定实体(特别是特定序列)存在于衍生其的对象(特别是生物体或分子)中。在氨基酸序列，特别是特定序列区域的情况下，“衍生”特别意指相关氨基酸序列衍生自其存在的氨基酸序列。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选是指完整的细胞，即未释放其正常细胞内组分(例如酶、细胞器或遗传物质)的具有完整膜的细胞。完整的细胞优选是活细胞，即能够执行其正常代谢功能的活细胞。优选地，根据本发明，所述术语涉及可以用外源核酸转染的任何细胞。优选地，当细胞转染有外源核酸并转移至接受者时可以在所述接受者中表达所述核酸。术语“细胞”包括细菌细胞；其他可用的细胞是酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。合适的细菌细胞包括来自革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)、变形杆菌属(Proteus)和假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)以及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。合适的真菌细胞包括来自木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)和曲霉属(Aspergillus)物种的细胞。合适的酵母细胞包括来自酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolicd))以及汉逊酵母属(Hansenula)物种的细胞。合适的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、293HEK等。然而，也可以使用两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和在本领域中使用的用于表达异源蛋白质的任何其他细胞。特别优选哺乳动物细胞用于过继转移，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类动物的细胞。细胞可来源于大量组织类型，并且包括原代细胞和细胞系，例如免疫系统的细胞，特别是抗原呈递细胞(例如树突细胞和T细胞)、干细胞(例如造血干细胞和间充质干细胞)以及其他细胞类型。根据本发明使用的特别优选的细胞是免疫反应性或免疫效应细胞，特别是T细胞。
包含核酸分子的细胞优选表达由所述核酸编码的肽或蛋白质。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体扩增的过程。在本发明的上下文中，该术语优选地用于其中淋巴细胞受抗原刺激、增殖并且扩增识别所述抗原的特定淋巴细胞的免疫应答的情况下。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。术语“引发”是指其中T细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化为效应T细胞的过程。
本文中所述的分子(例如核酸、肽链或抗原受体)或细胞可为重组的和/或分离的。
本文中使用的术语“分离的”旨在是指基本上不含其他分子例如其他细胞物质的实体。术语“分离的”优选意指分离的实体已经与其天然环境分开。分离的实体可处于基本上纯化的状态。术语“基本上纯化的”优选意指实体基本上不含在自然界中或在体内与其缔合的其他物质。
在本发明的上下文中，术语“重组”意指“通过基因工程制备”。优选地，在本发明的上下文中，“重组对象”例如重组细胞不是天然存在的。
本文中使用的术语“天然存在”是指对象可以存在于自然界中这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界来源中分离且未经人在实验室中有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
术语“自体”用于描述来源于相同对象的任何事物。例如，“自体移植”是指来源于同一对象的组织或器官的移植。这样的程序是有利的，因为它们克服了否则会导致排斥的免疫学障碍。
术语“同种异体”用于描述来源于同一物种的不同个体的任何事物。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被认为是彼此同种异体的。
术语“同基因”用于描述来源于具有相同基因型的个体或组织(即同卵双生或相同近交品系的动物或其组织)的任何事物。
术语“异源”用于描述由多个不同要素组成的事物。作为一个实例，将一个个体的骨髓转移至不同的个体构成异源移植。异源基因是来源于除所述对象以外的来源的基因。
本文中使用的“降低”或“抑制”意指引起水平总体降低优选5％或更大、10％或更大、20％或更大、更优选50％或更大、并且最优选75％或更大的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全抑制，即减少至零或基本上减少至零。
诸如“增加”或“提高”的术语优选涉及增加或提高约至少10％、优选至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少80％，并且最优选至少100％。
由于本发明的抗原受体可以被改造以靶向几乎任何抗原，包括疾病特异性抗原，因此本发明的抗原受体具有广泛的治疗用途。因此，本发明涉及本发明的抗原受体、其肽链、编码其的核酸和其他相关分子在治疗和预防方法中的用途。一个这样的用途是产生抗原特异性免疫细胞，其可以被施用于患者以预防或治疗疾病，所述疾病的特征在于可以被免疫细胞中表达的本发明抗原受体结合的一种或更多种抗原的表达。优选地，所述疾病是癌症。此外，本发明的抗原受体和相关分子也可以用于选择性地根除表达预定抗原的细胞，以及用于针对其中表达预定抗原的疾病的免疫或疫苗接种，所述抗原可以被本发明抗原受体的至少一个抗原结合位点结合。
在一个实施方案中，治疗或预防疾病的方法包括向患者施用有效量的编码本发明抗原受体的核酸，其中抗原受体的至少一个抗原结合位点能够结合与待治疗或预防的疾病有关的抗原(例如，病毒或肿瘤抗原)。在另一个实施方案中，治疗或预防疾病的方法包括向患者施用有效量的重组免疫效应细胞或所述免疫效应细胞的扩增群。所述免疫效应细胞或细胞群重组地表达本发明的抗原受体，其中抗原受体的至少一个抗原结合位点能够结合与待治疗或预防的疾病有关的抗原。在一些优选的实施方案中，所述疾病是癌症并且所述抗原是肿瘤相关抗原。
在另一个实施方案中，本发明提供了针对与特定抗原有关的疾病或针对表达特定抗原的致病生物体的免疫或疫苗接种的方法，所述方法包括向患者施用有效量的编码本发明抗原受体的核酸，其中抗原受体的至少一个抗原结合位点能够结合特异性抗原。在另一个实施方案中，本发明提供了针对与特定抗原有关的疾病或针对表达特定抗原的致病生物体的免疫或疫苗接种的方法，所述方法包括向患者施用有效量的重组免疫效应细胞或所述免疫效应细胞的扩增群，所述免疫效应细胞或细胞群重组地表达本发明的抗原受体，其中抗原受体的至少一个抗原结合位点能够与特异性抗原结合。
在某些实施方案中，免疫效应细胞群可以是克隆扩增群。重组免疫效应细胞或其群以抗原特异性方式提供治疗性或预防性免疫效应功能。优选地，本发明的抗原受体在免疫效应细胞的细胞表面上表达。
结合本发明的治疗和预防方法使用的细胞优选为免疫效应细胞，并且所述免疫效应细胞优选为T细胞。特别地，本文中使用的细胞是细胞毒性淋巴细胞，优选地选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞。在活化/刺激后，这些细胞毒性淋巴细胞中的每一个都触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过以下手段中的任一者或两者触发靶细胞的破坏。首先，在活化后，T细胞释放细胞毒素例如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，并且颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发胱天蛋白酶级联，这诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次，凋亡可以通过T细胞与靶肿瘤细胞之间的Fas-Fas配体相互作用来诱导。T细胞和其他细胞毒性淋巴细胞将优选是自体细胞，尽管可以使用异源细胞或同种异体细胞。
因此，本文中所述的药剂、组合物和方法可以用于治疗患有疾病(例如，特征在于存在表达抗原的病变细胞的疾病)的对象。特别优选的疾病是癌症疾病。
本文中所述的药剂、组合物和方法也可用于免疫或疫苗接种以预防本文中所述的疾病。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病常常被解释为与特定症状和病征有关的医疗状况。疾病可由最初来自外部来源(例如感染性疾病)的因素引起，或者其也可由内部功能障碍(例如自身免疫病)引起。在人中，“疾病”常常更广泛地用于指导致患病个体疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡的任何状况，或与所述个体接触的那些的类似问题。在此更广的意义上，它有时包括损伤、残疾、障碍、综合症、感染、单独的症状、不正常行为以及结构和功能的非典型变化，而在其他情况下和出于其他目的，这些可被认为是可区分的类别。疾病通常不仅在身体上而且情感上影响个体，因为感染和患有许多疾病可以改变一个人对生活的看法和一个人的个性。根据本发明，术语“疾病”包括感染性疾病和癌症疾病，特别是本文中所述的那些形式的癌症。本文中对癌症或特定形式癌症的任何提及还包括其癌症转移。
根据本发明待治疗的疾病优选为涉及抗原的疾病。根据本发明，“涉及抗原的疾病”、“与抗原表达或提高的表达有关的疾病”或类似表述意指抗原在病变组织或器官的细胞中表达。与健康组织或器官中的状态相比，在病变组织或器官的细胞中的表达可提高。在一个实施方案中，仅病变组织中发现表达，而未发现健康组织中的表达，例如表达受到抑制。根据本发明，涉及抗原的疾病包括感染性疾病和癌症疾病，其中疾病相关抗原优选分别为感染物质抗原和肿瘤抗原。优选地，涉及抗原的疾病优选是涉及优选在细胞表面上表达抗原的细胞的疾病。
术语“健康”或“正常”是指非病理状况，并且优选意指未感染或非癌性。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述通常特征在于不受调节的细胞生长的个体的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体地，这样的癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、神经外胚层癌、脊柱轴肿瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明的术语“癌症”还包括癌转移。优选地，“癌症疾病”的特征在于表达肿瘤抗原的细胞和癌细胞表达肿瘤抗原。
在一个实施方案中，癌症疾病是特征在于间变性、侵入性和转移性的恶性疾病。恶性肿瘤可与非癌性良性肿瘤形成对比，恶性肿瘤在其生长方面不是自限性的，能够侵入邻近组织，并且可能能够扩散到远处组织(转移)，而良性肿瘤没有这些特性。
根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指由细胞(称为瘤细胞或肿瘤细胞)的异常生长形成的肿胀或病灶。“肿瘤细胞”意指通过快速、不受控制的细胞增殖而生长并且在引发新生长的刺激停止后继续生长的异常细胞。肿瘤显示出部分或完全缺乏与正常组织相协调的结构组织和功能，并且通常形成不同的组织团块，其可为良性的、恶变前的或恶性的。
根据本发明，“癌”是来源于上皮细胞的恶性肿瘤。该群代表最常见的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。
“腺癌”是起源于腺组织的癌症。该组织也是被称为上皮组织的较大组织类别的一部分。上皮组织包括皮肤、腺体和存在于身体的腔和器官的多种其他组织。上皮在胚胎学上来源于外胚层、内胚层和中胚层。为了分类为腺癌，细胞不一定需要是腺体的一部分，只要它们具有分泌特性即可。这种形式的癌可以在包括人的一些高级哺乳动物中发生。良好分化的腺癌倾向于类似于它们来自的腺组织，而低分化的腺癌可能不倾向于类似于它们来自的腺组织。通过对来自活组织检查的细胞进行染色，病理学家将确定肿瘤是否是腺癌或某种其他类型的癌症。由于腺体在体内普遍存在的性质，腺癌可以出现在身体的许多组织中。尽管每个腺体可能不分泌相同的物质，但只要细胞具有外分泌功能，它就被认为是腺体，并且因此其恶性形式被命名为腺癌。恶性腺癌侵入其他组织并且为此常常转移给定足够的时间。卵巢腺癌是最常见的卵巢癌类型。它包括浆液性和粘液性腺癌、透明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。
淋巴瘤和白血病是来源于造血(血液形成)细胞的恶性肿瘤。
胚细胞肿瘤或胚细胞瘤是类似未成熟组织或胚胎组织的肿瘤(通常是恶性的)。许多这些肿瘤在儿童中最常见。
“转移”意指癌细胞从其初始部位扩散至身体的另一部分。转移的形成是非常复杂的过程并且依赖于恶性细胞与原发性肿瘤脱离，侵袭胞外基质，穿透内皮基底膜进入体腔和血管，然后在通过血液输送后，浸润靶器官。最后，新肿瘤在靶部位处的生长依赖于血管发生。由于肿瘤细胞或组分可保留并产生转移潜能，因此即使在移除原发性肿瘤后仍常发生肿瘤转移。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及“远处转移”，其涉及远离原发性肿瘤和局部淋巴结系统的转移。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及淋巴结转移。
当人再次感染其过去感染的病症时，出现复发或再发生。例如，如果患者患有肿瘤疾病，已经接受了所述疾病的成功治疗并且再次发生所述疾病，则所述新发生的疾病可被认为是复发或再发生。然而，根据本发明，肿瘤疾病的复发或再发生可以但不一定发生在原始肿瘤疾病的部位。因此，例如，如果患者患有卵巢肿瘤并且已接受成功治疗，则复发或再发生可以是出现卵巢肿瘤或在与卵巢不同的部位处出现肿瘤。肿瘤的复发或再发生还包括其中肿瘤出现在与原始肿瘤部位不同的位置处以及在原始肿瘤部位的情况。优选地，患者已接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤，并且在与原始肿瘤部位不同的部位处的肿瘤是继发性或转移性肿瘤。
可以通过本发明治疗或预防的感染性疾病是由感染物质引起的，包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫(helminth)和寄生虫。
人和非人脊椎动物两者的感染性病毒包括逆转录病毒、RNA病毒和DNA病毒。已经在人中发现的病毒的实例包括但不限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III))；和其他分离物，例如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如，引起胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒(bunga virus)、白蛉病毒(phlebo virus)和内罗病毒(Nairo virus))；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠弧病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、环状病毒(orbiviurses)和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxyiridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原体、丁型肝炎的病原体(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷随体)、非甲非乙型肝炎的病原体(1类＝内部传播；2类＝肠胃外传播(即丙型肝炎)；诺瓦克和相关病毒，以及星状病毒)。
预期的逆转录病毒包括简单的逆转录病毒和复杂的逆转录病毒两者。复杂的逆转录病毒包括慢病毒、T细胞白血病病毒和泡沫病毒亚群。慢病毒包括HIV-1，但也包括HIV-2、SIV、绵羊髓鞘脱落病毒(Visna virus)、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马感染性贫血病毒(EIAV)。T细胞白血病病毒包括HTLV-1、HTLV-II、猿T细胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)、猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
可以通过本发明治疗或预防的细菌感染或疾病是由细菌引起的，所述细菌包括但不限于在其生命周期中具有细胞内阶段的细菌，例如分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、麻风分枝杆菌(M leprae)或非洲分枝杆菌(M.africanum))、立克次氏体属(Rickettsia)、支原体、衣原体和军团菌。预期的细菌感染的其他实例包括但不限于由如下引起的感染：革兰氏阳性芽孢杆菌属(例如，李斯特菌属(Listeria)、芽孢杆菌属例如炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)物种)；革兰氏阴性芽孢杆菌属(例如，巴尔通体属(Bartonella)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Hemophilus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属、普罗威登斯菌属(Providencia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、弧菌属(Vibrio)和耶尔森氏菌属(Yersinia)物种)；螺旋体细菌(例如，疏螺旋体属(Borrelia)物种，包括引起莱姆病(Lyme disease)的伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))；厌氧细菌(例如，放线菌属(Actinomyces)和梭菌属(Clostridium)物种)；革兰氏阳性和阴性球菌，肠球菌属(Enterococcus)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、肺炎球菌属(Pneumococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、奈瑟氏菌属(Neisseria)物种。感染性细菌的具体实例包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分支杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A族链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B族链球菌)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、Streptococcus aecalis、牛链球菌(Streptococcus bovis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusantracis)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneunmoniae)、多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatuin)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次氏体属和以色列放线菌(Actinoyyces israelli)。
可以通过本发明治疗或预防的真菌疾病包括但不限于曲霉病(aspergilliosis)、隐球菌病(crytococcosis)、孢子丝菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病、组织胞浆菌病、芽生菌病、接合菌病和念珠菌病。
可以通过本发明治疗或预防的寄生虫病包括但不限于阿米巴病、疟疾、利什曼原虫、球虫、贾第虫病、隐孢子虫病、弓形体病和锥虫病。还包括由多种蠕虫引起的感染，例如但不限于蛔虫病、钩虫病、鞭虫病、类圆线虫病、弓蛔虫病(toxoccariasis)、旋毛虫病、盘尾丝虫病、丝虫病和恶丝虫病。还包括由多种吸虫引起的感染，例如但不限于血吸虫病、肺吸虫病和华支睾吸虫病。
术语“治疗”或“治疗性治疗”涉及改善健康状态和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。所述治疗可消除个体中的疾病、阻止或减缓个体中的疾病的发展、抑制或减缓个体中的疾病的发展、降低个体中的症状的频率或严重程度、和/或减少目前患有或先前患过疾病的个体中的复发。
术语“预防性治疗”或“预防治疗”涉及旨在预防个体发生疾病的任何治疗。术语“预防性治疗”或“预防治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可患有或易患疾病或病症(例如，癌症)但可患有或可不患有所述疾病或病症的人、非人灵长类动物或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不指示特定年龄，因此包括成年、老年、儿童和新生儿。在本发明的一些优选实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。根据本发明，术语“患者”意指用于治疗的对象，特别是患病对象。
“处于风险中”意指鉴定为与一般群体相比具有高于正常患病(特别是癌症)几率的对象(即患者)。此外，曾经患有或目前患有疾病(特别是癌症)的对象是患病风险增加的对象，如此对象可继续患病。目前患有或曾经患有癌症的对象的癌症转移风险也增加。
术语“免疫疗法”涉及包括特定免疫反应或应答的治疗。
在本发明的上下文中，诸如“保护”、“防止”、“预防性”、“预防”或“保护性”的术语涉及对象中疾病的发生和/或传播的预防或治疗或者两者，并且特别涉及使对象患病的几率最小化或延缓疾病的发展。例如，如上所述，处于肿瘤风险中的人将是用于治疗以预防肿瘤的候选者。
免疫疗法的预防性施用，例如，本发明的药剂或组合物的预防性施用优选保护接受者免于患病。免疫疗法的治疗性施用，例如，本发明的药剂或组合物的治疗性施用可导致抑制疾病的进展/发展。这包括疾病进展/发展的减慢，特别是疾病进展的中断，这优选地导致疾病的消除。
免疫疗法可使用多种技术中的任一种来进行，其中本文中提供的药剂优选地发挥从患者中除去抗原表达细胞的作用。这样的除去可能由于在对抗原或表达抗原的细胞呈特异性的患者中增强或诱导免疫应答而发生。
术语“免疫”或“疫苗接种”描述了出于治疗或预防原因诱导免疫应答目的的治疗对象的过程。
术语“体内”涉及对象中的情况。
本发明的抗原受体、肽链、核酸、重组细胞、免疫效应细胞(优选T细胞)以及本文中所述的其他化合物和药剂可以以任何合适的药物组合物的形式施用。
本发明的药物组合物优选为无菌的并且包含有效量的本文中所述的药剂和任选的本文中讨论的另外的药剂以产生期望的反应或期望的效果。
药物组合物通常以均匀剂型提供并且可以以本身已知的方式制备。药物组合物可以例如是溶液或混悬液的形式。
药物组合物可包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、稀释剂和/或赋形剂，其全部优选为可药用的。术语“可药用”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的材料的无毒性。
不可药用盐可用于制备可药用盐并且包括在本发明中。这类可药用盐以非限制性方式包括由以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。可药用盐还可制备为碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。
用于药物组合物的合适的缓冲物质包括乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。
用于药物组合物的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞(thimerosal)。
可注射制剂可包含可药用赋形剂，例如乳酸林格液(Ringer Lactate)。
术语“载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，其中将活性组分组合以促进、增强或实现应用。根据本发明，术语“载体”还包括适用于向患者施用的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。
可用于肠胃外施用的载体物质是例如无菌水、林格液(Ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘，以及特别是生物相容的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。
当在本文中使用术语“赋形剂”时旨在表明可存在于药物组合物中且不是活性成分的所有物质，例如载体、黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
本文中所述的药剂和组合物可通过任何常规途径施用，例如，通过肠胃外施用，包括通过注射或输液。施用优选为肠胃外，例如静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内。
适于肠胃外施用的组合物通常包含活性化合物的无菌水性或非水性制备物，其优选与接受者的血液等张。相容性载体和溶剂的实例是林格液和等张氯化钠溶液。此外，通常使用无菌的不挥发性油类作为溶液或混悬液介质。
本文中所述的药剂和组合物以有效量施用。“有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病或特定病症的情况下，期望的反应优选地涉及抑制疾病的进程。这包括减缓疾病的进展，以及特别是中断或逆转疾病的进展。治疗疾病或病症中的期望的反应也可以是延迟或预防所述疾病或所述病症的发作。
本文中所述的有效量的药剂或组合物将取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、体型大小和体重)、治疗持续时间、伴随治疗的类型(如果存在的话)、具体施用途径和类似因素。因此，本文中所述的药剂的施用剂量可取决于多个这样的参数。在患者对初始剂量反应不足的情况下，可使用更高剂量(或者通过不同的更局部的施用途径来实现有效地更高剂量)。
可以将本文中所述的药剂和组合物施用(例如，体内)于患者以治疗或预防多种疾病，例如本文中所述的那些。优选的患者包括患有可以通过施用本文中所述的药剂和组合物而得以消除或改善的疾病的人患者。这包括涉及特征在于抗原表达的细胞的疾病。
例如，在一个实施方案中，本文中所述的药剂可以用于治疗患有癌症疾病(例如，本文中所述的特征在于存在表达抗原的癌细胞的癌症疾病)的患者。
根据本发明描述的药物组合物和治疗方法还可用于免疫或疫苗接种以预防本文中所述的疾病。
本发明的药物组合物可与补充免疫增强物质例如一种或更多种佐剂一起施用，并且可包含一种或更多种免疫增强物质以进一步提高其效力，优选实现免疫刺激的协同效应。术语“佐剂”涉及延长或增强或加快免疫应答的化合物。取决于各种类型的佐剂，各种机制在这方面是可能的。例如，允许DC成熟的化合物，例如，脂多糖或CD40配体形成第一类合适的佐剂。通常，影响“危险信号”类型(LPS、GP96、dsRNA等)或细胞因子(例如GM-CSF)的免疫系统的任何药剂可以用作能够以可控方式增强和/或影响免疫应答的佐剂。CpG寡脱氧核苷酸也可以任选地用于该情况，尽管如上所述，它们在某些情况下发生的副作用应被考虑。特别优选的佐剂是细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-α，或生长因子例如hGH。另外已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油如
Figure BDA0003702799390000591
最优选
Figure BDA0003702799390000592
ISA51。脂肽例如Pam3Cys也适合用作本发明药物组合物中的佐剂。
药物组合物可以局部或全身施用，优选全身施用。
术语“全身施用”是指施用药剂，以使得所述药剂以显著量广泛分布于个体体内并产生期望的效果。例如，药剂可在血液中产生其期望效果和/或经由血管系统到达其期望的作用部位。典型的全身施用途径包括通过将药剂直接引入血管系统中来施用或经口、经肺部或肌内施用，其中药剂被吸附，进入血管系统，并经由血液被运送到一个或更多个期望的作用部位。
根据本发明，优选的全身施用是通过肠胃外施用。术语“肠胃外施用”是指施用药剂，以使得所述药剂不经过肠。术语“肠胃外施用”包括静脉内施用、皮下施用、皮内施用或动脉内施用，但不限于此。
施用也可例如经口、腹膜内或肌内进行。
本文中提供的药剂和组合物可单独使用或与常规治疗方案例如手术、辐照、化学治疗和/或骨髓移植(自体、同基因、同种异体或不相关)组合使用。
以下通过附图和实施例详细描述本发明，这些附图和实施例仅用于说明目的并且不意味着限制。由于描述和实施例，技术人员可以获得同样包括在本发明中的其他实施方案。
附图说明
图1包含TCR-CD3复合物的图示。TCR和CD3亚基由胞外域、柄区(stalk region)、跨膜结构域和带有ITAM的胞质结构域组成。CD4或CD8共同受体的表达决定了CD4+或CD8+ T细胞亚群的定型。基于胞质内CD3免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)被表示为柱体(改编自“The T cell receptor facts book",MP Lefranc,G Lefranc,2001)。
图2示出了连续几代CAR的设计。不同代CAR的示意图(1G，第一代，2G，第二代，3G，第三代)。第一代包含胞外scFv和介导即时效应物功能例如IFNγ分泌或细胞毒性的胞质CD3ζ链/ZAP70，第二代另外包含促进增殖的CD28/PI3K，第三代进一步包含维持细胞存活的4-1BB或OX40/TRAF(Casucci,M.等(2011)2:378-382)。
图3包含T细胞针对抗原重定向的不同受体形式的示意图。Cα/β是TCR的恒定结构域，其也用作通过细胞膜将结合抗原信号传递至细胞质中募集的CD3复合物的信号传导结构域的信号传递结构域；VH和VL分别是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区，并且它们是两条肽链上形成抗原结合位点的结构域的代表。
左侧：由抗原特异性scFv片段、IgG1衍生的间隔区结构域、CD28共刺激和CD3ζ信号传导结构域(经典单链CAR)组成的第二代CAR；中间：基于scFv与鼠TCRβ链的恒定结构域的连接和鼠TCRα链的恒定结构域(单价非组合抗原受体)的共表达的新CAR样式；右侧：由TCRα/β链(mu，鼠)组成的鼠TCR。异二聚体CD3δε和同二聚体CD3ζζ由Cα结构域募集，而CD3γε由Cβ结构域募集。
图4A和B示出了本文中所述的某些抗原受体的结构。结构域的命名如图3的图例中所述。串联抗原受体(串联AR)包含含有4个形成2个抗原结合位点的可变抗体片段的链。组合内/组合间AR能够与抗原链内和链间结合。组合间AR允许仅通过链间结合结合抗原。单价非组合AR表示基于内源CD3募集的新的AR-设计的单价原型，二价非组合AR是CAR，所述设计已经由Gross等,1992 FASEB J.,(6)3370-3378提出并且将与每个抗原的结合限制为单链。单价组合AR充当参照AR或阴性对照以通过在CAR设计中通过scFv片段提供更高价来证明功能的益处。
图5是示出了T细胞中抗原受体的相对表达水平的直方图。已经在流式细胞术分析中通过利用针对密蛋白6特异性抗体IMAB206的互补位的独特型抗体验证了在CAR RNA电穿孔T细胞上的表达。用Dylight-640直接标记流式细胞术抗体，以平均荧光强度(MFI)给出表达水平。
图6A至6C是示出了为免疫细胞活化的指标的IFN-γ产生的相对诱导水平的直方图。图6A：在CD8+ T细胞的ELISA中检测IFN-γ产生，所述CD8+ T细胞用不同抗原受体表达构建体和对照电穿孔并且与Cl6阴性和阳性未成熟树突细胞(iDC)共培养。能够进行链间抗原结合的二价抗原受体显示出良好的IFN-γ产生(组合间AR 2GS、3GS、4GS)。可变结构域之间的接头长度的变化对受体功能没有显著影响，但3GS接头与2GS接头和4GS接头相比似乎稍微更好。截短二价抗原受体的N-末端可变结构域以获得单价抗原受体(单价组合AR)显著降低了受体功能，证明了二价抗原结合对优异的受体功能的重要性。抗原受体结构中的鼠恒定结构域导致略微改善的IFN-γ产生(组合间AR Mu 3GS)。图6B：图6A中公开的那些的重复实验，示出了类似的结果，但是用从不同供体获得的T细胞来证明结果的供体独立性。图6C：基本上图6A和6B中公开的实验的重复。与单价抗原受体(单价非组合AR)相比并且与仅具有链内抗原结合的抗原受体(二价非组合AR)相比，串联抗原受体和组合内/组合间抗原受体(使得能够通过链内和链间VH/VL结构域组合进行抗原识别)各自导致更高的IFN-γ表达诱导。
图7是示出了经CAR Cl6修饰的T细胞对卵巢癌细胞Sk-ov-3的细胞毒性效力的直方图。肿瘤细胞用增加量的Cl6 RNA电穿孔，CD8+ T细胞用不同的抗原受体表达构建体电穿孔。通过细胞裂解测量的T细胞效应物功能随Sk-ov-3细胞中表达的Cl6量的减少而降低。与单价非组合抗原受体和经典scCAR相比，重组表达二价抗原受体(串联AR和组合间AR)的T细胞的细胞毒性不太依赖于靶细胞上的抗原密度。
图8A-8D是示出了如通过针对作为APC的iDC的细胞增殖确定的免疫细胞活化结果的直方图。图8A和8B：CFSE标记的CD4+(图8A)和CD8+ T细胞(图8B)分别针对Cl6阴性未成熟树突细胞(iDC)的增殖。在用分子CD80和41BBL顺式共刺激(即电穿孔入T细胞)后，经典单链嵌合抗原受体(经典scCAR)在不存在其同源抗原的情况下显示背景增殖。对于未用任何靶细胞孵育的T细胞也观察到了这种情况，表明非特异性增殖是表达经典scCAR的T细胞的内在特征(数据未示出)。用Cl6阴性细胞系Sk-Ov-3也观察到这种结果。图8C和8D：CFSE标记的CD4+(图8C)和CD8+ T细胞(图8D)分别针对Cl6+iDC的增殖。当用表达组合间AR的构建体电穿孔时，CD4+ T细胞针对Cl6加载的iDC增殖。经典scCAR设计导致较少增殖。对于CD8+ T细胞两者，经典scCAR和组合间AR显示出几乎相同的良好增殖。
图9A-9B是示出了如通过针对作为APC的肿瘤细胞的细胞增殖确定的免疫细胞活化结果的直方图。CFSE标记的CD4+(图9A)和CD8+(图9B)T细胞针对用共刺激分子CD80和41BBL(反式共刺激)电穿孔的Cl6+卵巢癌细胞系Ov-90的增殖。当用类似于iDCCl6+的组合间AR电穿孔时，CD4+ T细胞能够针对Ov-90Cl6+CD80+41BBL+增殖。单价和二价抗原受体均导致CD8+T细胞的增殖。增殖量与经典scCAR相当。T细胞的顺式共刺激进一步增强T细胞增殖。
图10是示出了IFN-γ产生的抗原剂量依赖性诱导的直方图。在CD8+T细胞的ELISA中检测IFN-γ产生，所述CD8+ T细胞用不同的抗原受体表达构建体和对照电穿孔，并且与用0.01μg-1μg范围内的相关全长Cl6RNA和1μg不相关gp100电穿孔的未成熟树突细胞(iDC)共培养。对二价抗原受体的细胞因子分泌进行评估，所述细胞因子分泌依赖于与顺序组合间>组合间/组合内>二价非组合AR配对的组合链的假定量。在高抗原密度(1μg Cl6)下，经典CAR引发最高量的IFNγ分泌，随后是组合间和组合间/组合内AR。二价非组合AR与单价组合AR和单价非组合AR相比功能略差。二价非组合AR仅依赖于不变的人C结构域之间的链配对，而单价组合AR实现人C结构域和小鼠V结构域之间的更好的链配对。因为链间配对通过小鼠C结构域而不是较弱的人C结构域促进这一事实，因此单价非组合AR比二价非组合AR更具功能性。这对于该测定中应用的任何抗原剂量来说也是如此。值得注意的是，当降低抗原密度(0.1μg、0.01μg的Cl6 RNA-电穿孔细胞)时，在与经典CAR相比时，组合间AR对于施加相关抗原脉冲的iDC RNA变得越来越具有反应性。这与针对C16电穿孔肿瘤细胞系Skov-3的抗原剂量依赖性细胞毒性测定(图7)中所示的类似趋势一致。
图11是示出了IFN-γ产生的抗原剂量依赖性诱导的直方图。在图11A中，示出了经典CAR和新的组合经典CAR的样式的比较。两种CAR均依赖于通过融合的CD3ζ信号传导部分的信号传导，而不依赖于T细胞中的内源性CD3复合物。图11B示出了在CD8+ T细胞的ELISA中检测IFN-γ产生，所述CD8+ T细胞用密蛋白6特异性经典CAR和新的组合经典CAR电穿孔，两者均携带CH2-CH3-抗体结构域以及CD28和CD3ζ作为信号传递结构域。将它们与用0.002μg-2μg范围内的相关全长Cl6 RNA和2μg不相关gp100电穿孔的未成熟树突细胞(iDC)共培养。在较高的抗原密度(2μg-0.2μg Cl6)下，两种CAR样式均引起相等高量的IFNγ分泌。对于较低的抗原密度，经典CAR在分泌IFNγ方面似乎略微更有效。重要的是，组合经典CAR在与经典CAR相同的滴定抗原范围内具有功能。
具体实施方式
实施例
本文中使用的技术和方法在本文中描述或以本身已知的方式实施，并且如例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y中所述。除非特别说明，否则包括使用试剂盒和试剂的所有方法均根据制造商的信息实施。
实施例1：T细胞中抗原受体的表达
使用C16scFv独特型特异性抗体电穿孔入CD8+ T细胞后一天评估各种抗原受体构建体的表达。测试表达的构建体或构建体组合是(i)仅鼠T细胞受体α链的恒定结构域(mCα)；(ii)仅VH-VL-mCβ(scFv-mCβ)；(iii)VH-VL-CH2-CH3-CD28-CD3ζ(经典scCAR)；(iv)mCα和VH-VL-mCβ(单价非组合AR)；(v)VH-VL-mCα和VH-VL-mCβ(二价非组合AR)；(vi)VL-VH-mCα和VH-VL-mCβ(组合内/组合间AR)；(vii)mCα和VH-VL-VH-VL-mCβ(串联AR)；(viii)VH-hCα和VL-hCβ(单价组合AR)；(ix)VH-(GGGGS)3-VH-hCα和VL-(GGGGS)3-VL-hCβ(组合间AR 3GS)；以及(x)VH-(GGGGS)3-VH-mCα和VL-(GGGGS)3-VL-mCβ(组合间AR Mu 3GS)(“m”或“Mu”表示鼠来源，“h”表示人恒定结构域来源)。这些不同的抗原受体构建体示意性地示于图4A-4B中。图5中的数据表示来自如下的结果：二价非组合、组合内/组合间和单价组合抗原受体的两个单独的测量；串联和结合间抗原受体的五次测量；以及经典scCAR和单价非组合抗原受体的多达10次测量。将每个样品的MFI值归一化为相应的阴性对照(mCα或scFv-mCβ设置为1)。
如图5所示，经典scCAR设计显示出最佳表达。具有人(hC)或鼠(mC)恒定结构域的单价非组合、二价非组合、组合内/组合间和组合间抗原受体显示出类似的表达。与除经典scCAR以外的其他构建体相比，单价组合AR显示出减少的表面染色，而串联抗原受体显示出增加的表面染色。
实施例2：IFN-γ分泌测定
在实验第1天，从一个健康供体的血沉棕黄层中分离新鲜的外周血单核细胞(“PBMC”)。从3/4的PBMC中，使用MACS分选分离CD14+细胞。MACS流通，然后对剩余的PBMC进行MACS分选以得到CD8+ T细胞。通过在第1、3、6天施用IL-4&GM-CSF(1000U/ml)使CD14+细胞向未成熟的树突细胞分化(“iDC”)。将CD8+ T细胞转移到OKT3包被的6孔板上。在第3天，将T细胞转移至新的6孔板。在第7天，将iDC用不相关的和Cl6 IVT RNA电穿孔。随后将OKT3活化的T细胞用对照或各个图中所示和实施例1中所述的抗原受体构建体电穿孔。出于质量保证，在第8天使用用Dylight 650标记的C16抗原受体独特型特异性抗体分析T细胞上的抗原受体表面表达。随后将电穿孔的T细胞和抗原电穿孔的iDC在96孔板中以10:1的E:T比例一式两份共培养20小时。在第9天，取出培养物上清液并使用来自eBioscience的IFN-γReady Set Go！试剂盒(#88-7316-88)在夹心ELISA中分析分泌的IFN-γ的量。使用TecanSunrise ELISA读数仪检测吸光度。
如图6A所示，用Cl6阳性或阴性iDC培养的模拟(mCα)电穿孔T细胞未显示出非特异性IFN-γ产生。在抗原受体阳性T细胞中，当与Cl6阴性靶细胞一起培养时，仅经典scCAR阳性细胞产生可检测的细胞因子背景。当与Cl6+iDC一起培养时，可以观察到来自单价抗原受体阳性细胞的IFN-γ产生。在此，经典scCAR产生大量的IFN-γ。当仅用一条组合抗原受体链的阴性对照进行电穿孔时，在这种情况下，VH-VH-Cα不能观察到IFN-γ产生。该对照证明两条链均是抗原识别和随后的T细胞活化所需的。相比之下，当与用单价AR(组合和非组合)产生的相比时，组合间AR(3GS)显示出IFN-γ产生的显著提高。与3个重复相比，不同接头长度(可变结构域之间Gly4Ser接头的2或4个重复)对功能没有较大影响。
重要的是，组合抗原受体结构中N末端可变结构域的截短显示出效应物功能的强烈降低。该观察结果清楚地证明了二价抗原结合支持T细胞活化。单价组合AR与二价组合AR之间的功能的显著增加也强烈指示，除了由链间可变结构域介导的链配对的改进以外，跨越两条链的抗原结合本身的发生率进一步使受体链配对稳定，并且因此改善了向内源性CD3复合物中的并入和随后的T细胞活化/功能。从双链T细胞受体公知，链的异二聚化是有效向CD3复合物中并入的基本先决条件。
鼠残基整合到组合AR结构中能够进一步增加活化，这推断是由于与人TCR恒定Cα/β结构域相比，鼠TCR恒定Cα/β结构域的已知更强的相互作用。因此，通过与可变结构域结合的链间抗原或通过单个链上T细胞受体恒定结构域二聚化的抗原受体肽链的改善的异二聚化改善了抗原受体整合到内源性CD3复合物中并因此改善了T细胞功能。这些结果是用不同的T细胞供体高度可重现的(参见图6B)。
值得注意的是，在该实验中经典scCAR证实了针对Cl6阴性iDC的IFN-γ产生的非特异性背景。该结果也是可重现的并且与Long等((2015)Nat.Med.,(21)581-590)公布的通过经典scCAR-CD28-CD3ζ融合样式讨论滋养信号传导的数据一致。Long等观察到不同抗原特异性的几种经典scCAR的抗原非依赖性活化。假定经典scCAR阳性T细胞的非特异性背景活化不是T细胞供体特异性效应。
此外，如图6C所示，一起测试二价非组合抗原受体和组合内/组合间抗原受体与串联二价抗原受体的IFN-γ产生。为了比较，在图中还示出了阴性对照、单价非组合AR和作为阳性对照的经典scCAR。与单价抗原受体相比，串联二价抗原受体显示出改善。与相关的组合内/组合间抗原受体VL-VH-Cα+VH-VL-Cβ相比，二价非组合抗原受体VH-VL-Cα+VH-VL-Cβ引起较低的IFN-γ产生。这些观察结果证实了这样的假设，即由V结构域配对和抗原与不同链上的可变结构域结合两者所赋予的链间相互作用使异二聚体拓扑结构稳定并提供了更稳健的受体依赖性T细胞信号传导响应。
实施例3：细胞毒性测定
在实验的第1天，从两个健康供体的两个血沉棕黄层分离新鲜的PBMC。对PBMC进行MACS分选以得到CD8+ T细胞。将CD8+ T细胞转移到OKT3包被的6孔板上。将它们在含有50U/ml IL-2的培养基中进行培养。在第3天，将T细胞转移到新的6孔板上并更换培养基。在第7天，用不同量的Cl6 RNA和10μg荧光素酶RNA对卵巢癌细胞系Sk-Ov-3进行RNA电穿孔。如图7所示和以上实例1中所述，用不相关经典scCAR、相关Cl6特异性经典scCAR、单价非组合抗原受体和串联抗原受体以及本发明的组合间抗原受体对OKT3活化的T细胞进行电穿孔。出于质量保证，在第8天使用用Dylight 650标记的C16抗原受体独特型特异性抗体分析T细胞上的抗原受体表面表达。随后将抗原受体电穿孔的T细胞和抗原电穿孔的Sk-Ov-3在96孔板中以30:1的E:T比例一式三份共培养3小时。孵育3小时后，将荧光素添加到每种培养物。通过TECAN读数仪中荧光素信号的减少(由于释放的荧光素酶引起的其转化而导致)来检测特异性裂解。
Sk-Ov-3数据深刻地证明，本发明的二价抗原受体(组合间AR和串联AR)与经典scCAR和单价非组合AR相比显示出显著的改善。与所有其他抗原受体构建体相比，经典scCAR设计显示出针对C16电穿孔Sk-Ov-3细胞的约77％的最佳裂解。然而，应当提及，10μg抗原RNA是非生理状况并且不能精确地反映体内情况。在低抗原剂量下，单价非组合AR不能以令人满意的方式裂解肿瘤细胞(9.2％)。相比之下，与经典scCAR设计(48.1％)相比，组合间AR(3GS)仍显示出良好的特异性裂解(41.3％)，并且最终，对于大量细胞毒性效应物功能而言不太依赖于抗原密度。
实施例4：增殖测定
在实验第1天，从健康供体的血沉棕黄层中分离新鲜的PBMC。从3/4的PBMC中，使用MACS分选分离CD14+细胞，并且将剩余的PBMC冷冻。通过在第1、3、6天施用IL-4&GM-CSF(1000U/ml)使CD14+细胞分化成iDC。在第7天，将iDC用不相关的和C16 IVT-RNA电穿孔。将冷冻的PBMC在同一天解冻并进行MACS分选以得到CD4+和CD8+细胞。在没有任何预先活化(OKT3)的情况下，如图8A-8D所示，将原初T细胞(分别为6×106和7×106个细胞)相继分别用对照、经典、单价和二价抗原受体构建体电穿孔，所述构建体描述于实施例1中。在独立的一组T细胞应答者中，相同的抗原受体构建体也与共刺激分子41BBL和CD80一起被电穿孔以实现自体共刺激或顺式共刺激，这被证明改善了效应物功能。
出于质量保证，在第8天通过FACS染色分析T细胞上的抗原受体和41BBL+CD80表达。随后用增殖标志物CFSE标记T细胞。随后将电穿孔的T细胞和iDC以及卵巢癌细胞系OV-90在96孔板中以10:1的E:T比例一式两份共培养5天。在第5天，将培养的细胞在96孔板中用经APC-Cy7标记的CD4或CD8抗体染色。通过FACS经由由于增殖的子细胞中的稀释而引起的CFSE信号降低来检测T细胞的增殖。通过较小的调整，使用Flowjo实施的增殖工具评估子种群大小。增殖细胞的总和被描述为子代。
对于用Cl6阴性细胞系Sk-Ov-3和Cl6阴性iDC培养的细胞评估T细胞背景增殖。独立于电穿孔的抗原受体构建体，CD4+和CD8+ T细胞均不针对Cl6阴性细胞增殖。在顺式共刺激后，仅经典scCAR改造的T细胞非特异性地针对Cl6阴性iDC和Sk-OV-3(Sk-Ov-3数据未示出)增殖。与CD8+T细胞相比，CD4+ T细胞总体不太有效地针对Cl6+细胞增殖(参见图8C至8D)。当使用Cl6+Ov-90肿瘤细胞作为靶细胞时尤其如此(图9A至9B)。
与iDC共培养的T细胞的结果证明了组合间抗原受体的总体良好功能。在没有顺式共刺激的CD4+ T细胞中，组合间抗原受体显示出优异的增殖并且甚至优于经典scCAR设计。通过CAR独特型染色分析，该效果不是由于经典scCAR的表面表达降低所致。对于CD8+ T细胞，组合间抗原受体设计显示出针对Cl6加载的iDC的显著增殖(70％)。T细胞的顺式共刺激可以进一步增强T细胞应答。
有趣的是，未观察到针对Cl6+卵巢癌细胞系OV-90的细胞增殖(数据未示出)。这推断是由于在肿瘤细胞表面上缺乏共刺激分子。为了补偿这种共刺激的缺乏，将Ov-90细胞用CD80和41BBL RNA电穿孔。在这种情况下，可以检测到CD4+和CD8+ T细胞的增殖(参见图9A和9B)。值得注意的是，对于CD4+细胞，这仅是组合间AR设计的情况(15％)。对于CD8+细胞，增殖模式看起来不同。单价非组合AR、经典scCAR和组合间AR响应与60％增殖细胞相当。在顺式共刺激后，特别是CD4+ T细胞的增殖提高。
数据清楚地表明，当共刺激时，二价抗原受体构建体(组合间AR)能够针对Cl6+肿瘤细胞系增殖。通常，组合间AR比单价非组合AR在针对装载有同源靶抗原的iDC增殖方面好得多。当针对Cl6阴性iDC进行顺式共刺激时，经典scCAR倾向于非特异性应答，表明对抗原非依赖性T细胞信号传导具有较高的易感性。
实施例5：抗原滴定的IFNγ分泌测定
在实验第1天，从一个健康供体的血沉棕黄层中分离新鲜的外周血单核细胞(“PBMC”)。从3/4的PBMC中，使用MACS分选分离CD14+细胞。MACS流通，然后对剩余的PBMC进行MACS分选以得到CD8+ T细胞。通过在第1、3、6天施用IL-4&GM-CSF(1000U/ml)使CD14+细胞向未成熟的树突细胞(“iDC”)分化。将CD8+ T细胞转移到OKT3包被的6孔板上。在第3天，将T细胞转移至新的6孔板。在第7天，将iDC用不相关的和Cl6 IVT RNA剂量依赖性地电穿孔。随后将OKT3活化的T细胞用对照或各个图中所示和实施例1中所述的抗原受体构建体电穿孔。出于质量保证，在第8天使用用Dylight 650标记的C16抗原受体独特型特异性抗体分析T细胞上的抗原受体表面表达。随后将电穿孔的T细胞和抗原电穿孔的iDC在96孔板中以10:1的E:T比例一式两份共培养20小时。在第9天，取出培养物上清液并使用来自eBioscience的IFN-γReady Set Go！试剂盒(#88-7316-88)在夹心ELISA中分析分泌的IFN-γ的量。使用Tecan Sunrise ELISA读数仪检测吸光度。结果示于图10中。
评估二价抗原受体的细胞因子分泌量，所述量取决于假定的以有利于稳定表达和随后的T细胞信号传导的组合方式配对的倾向。我们推测观察到组合间AR的排他性组合V结构域链间配对，而组合间/组合内AR可以以不太有利的链内配对比例共存。在高抗原密度(1μg Cl6)下，按照所预期的，经典CAR通过组合间和组合间/组合内AR引发最大量的IFNγ分泌。二价非组合AR与单价组合AR和单价非组合AR参照相比功能略差。二价非组合AR仅依赖于不变的人C结构域之间的链配对，而单价组合AR实现了人C结构域和小鼠V结构域之间的更好的链配对。与预期结果一致，单价非组合AR也比二价非组合AR更具功能性，因为链间配对(尽管其在此也限于C结构域这一事实)通过小鼠C结构域促进，而非较弱的人C结构域。对于该测定中应用的任何抗原剂量也是如此。
值得注意的是，当降低抗原密度(0.1μg、0.01μg Cl6 RNA电穿孔细胞)时，与经典CAR相比，组合间AR对于用相关RNA脉冲的iDC变得越来越具有反应性。这与针对C16电穿孔肿瘤细胞系Skov-3的抗原剂量依赖性细胞毒性测定(图7)中所示的类似趋势一致。
在抗原滴定的IFNγ分泌测定中还将经典CAR与新的组合经典AR相比较(图11)。这两种嵌合抗原受体均包含CH2-CH3-抗体结构域以及CD28和CD3ζ作为信号传递结构域。将它们与用0.002μg-2μg范围内的相关全长Cl6 RNA和2μg不相关gp100电穿孔的未成熟树突细胞(iDC)共培养。在较高的抗原密度(2μg-0.2μg Cl6)下，这两种CAR样式均引起相等高量的IFNγ分泌。对于较低的抗原密度，经典CAR在分泌IFNγ方面似乎略微更有效。重要的是，组合经典CAR在与降低至非常低量的内源性表达的密蛋白6的经典CAR相同的滴定抗原范围内具有功能性。然而，与基于TCR Cα/Cβ的组合AR设计相比，这种组合AR样式显然导致与经典CAR相比相同但不是更好的T细胞信号传导，推测是由于外源CD3ζ依赖性而非内源CD3非依赖性信号传导。假设前一种机制分别独立于TCR或CAR的内源CD3募集，这转而将调节T细胞活化的量。

Claims (52)

1.抗原受体，所述受体包含第一肽链和第二肽链，其中，
所述第一肽链包含至少第一结构域和第二结构域以及免疫受体信号传递结构域；
所述第二肽链包含至少第一结构域和第二结构域以及免疫受体信号传递结构域；
其中来自所述第一肽链的第一结构域与来自所述第二肽链的一个结构域一起形成第一抗原结合位点，并且
其中来自所述第一肽链的第二结构域与来自所述第二肽链的另一个结构域一起形成第二抗原结合位点。
2.根据权利要求1所述的受体，其中所述免疫受体信号传递结构域包含T细胞受体链的恒定区或不变区或者免疫细胞Fc受体链的恒定区或不变区或者所述恒定区或不变区的一部分。
3.根据权利要求1或2所述的受体，其中所述第一肽链和/或所述第二肽链还包含在所述第一结构域和所述第二结构域之间和/或所述第一结构域和所述第二结构域与所述免疫受体信号传递结构域之间的接头。
4.根据权利要求3所述的受体，其中所述接头是随意的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的受体，其中所述第一结构域和/或所述第二结构域各自包含免疫球蛋白链的可变区或T细胞受体链的可变区或所述可变区的一部分。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的受体，其中，
(i)所述第一肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分，并且所述第二肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其一部分，或者
(ii)所述第一肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其一部分，并且所述第二肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的受体，其中所述免疫受体信号传递结构域为人来源。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的受体，其中来自所述第一肽链的第一结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且来自所述第二肽链的与来自所述第一肽链的第一结构域形成抗原结合位点的结构域包含对所述抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的受体，其中来自所述第一肽链的第二结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且来自所述第二肽链的与来自所述第一肽链的第二结构域形成抗原结合位点的结构域包含对所述抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的受体，其中所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点与相同抗原或不同抗原结合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的受体，其中所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点与相同抗原上的不同表位结合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的受体，其中所述抗原是疾病特异性抗原，优选肿瘤抗原。
13.根据权利要求12所述的受体，其中所述抗原在细胞表面上表达。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的受体，其中，
来自所述第一肽链的第一结构域和第二结构域各自包含免疫球蛋白的重链可变区或其一部分；以及
来自所述第二肽链的第一结构域和第二结构域各自包含免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的受体，其中，
来自所述第一肽链的N末端结构域与来自所述第二肽链的N末端结构域一起形成抗原结合位点；以及
来自所述第一肽链的C末端结构域与来自所述第二肽链的C末端结构域一起形成抗原结合位点。
16.肽链，其包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域和所述第二结构域各自包含免疫球蛋白的重链可变区或其一部分或者各自包含免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分，并且其中所述肽链还包含免疫受体信号传递结构域。
17.抗原受体，所述受体包含第一肽链和第二肽链，其中：
所述第一肽链包含至少四个结构域和免疫受体信号传递结构域；
所述第二肽链包含免疫受体信号传递结构域；
其中来自所述第一肽链的两个结构域形成第一抗原结合位点，并且
其中来自所述第一肽链的另外两个结构域形成第二抗原结合位点。
18.根据权利要求17所述的受体，其中所述免疫受体信号传递结构域包含T细胞受体链的恒定区或不变区或者免疫细胞Fc受体链的恒定区或不变区或者所述恒定区或不变区的一部分。
19.根据权利要求17或18所述的受体，其中所述第一肽链还包含在所述四个结构域中的至少两个之间的接头和/或所述四个结构域与所述免疫受体信号传递结构域之间的接头。
20.根据权利要求19所述的受体，其中所述接头是随意的氨基酸序列。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的受体，其中所述四个结构域各自包含免疫球蛋白链的可变区或T细胞受体链的可变区或所述可变区的一部分。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的受体，其中，
(i)所述第一肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分，并且所述第二肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其一部分，或者
(ii)所述第一肽链包含T细胞受体β链的恒定区或其一部分，并且所述第二肽链包含T细胞受体α链的恒定区或其一部分。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的受体，其中所述免疫受体信号传递结构域为人来源。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的受体，其中形成所述第一抗原结合位点的结构域之一包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且形成所述第一抗原结合位点的另一个结构域包含对所述抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的受体，其中形成所述第二抗原结合位点的结构域之一包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且形成所述第二抗原结合位点的另一个结构域包含对所述抗原具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
26.根据权利要求17至25中任一项所述的受体，其中所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点与相同抗原或不同抗原结合。
27.根据权利要求17至26中任一项所述的受体，其中所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点与相同抗原上的不同表位结合。
28.根据权利要求17至27中任一项所述的受体，其中所述抗原是疾病特异性抗原，优选肿瘤抗原。
29.根据权利要求28所述的受体，其中所述抗原在细胞表面上表达。
30.根据权利要求17至29中任一项所述的受体，其中，
所述四个结构域的两个N末端结构域一起形成抗原结合位点；以及
所述四个结构域的两个C末端结构域一起形成抗原结合位点。
31.根据权利要求17至30中任一项所述的受体，其中，
所述四个结构域的所述两个N末端结构域中的一个包含免疫球蛋白的重链可变区或其一部分，并且所述四个结构域的所述两个N末端结构域中的另一个包含免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分；以及
所述四个结构域的所述两个C末端结构域中的一个包含免疫球蛋白重链可变区或其一部分，并且所述四个结构域的所述两个C末端结构域中的另一个包含免疫球蛋白的轻链可变区或其一部分。
32.肽链，其包含至少4个结构域和免疫受体信号传递结构域，
其中来自所述肽链的两个结构域形成第一抗原结合位点，并且来自所述肽链的另外两个结构域形成第二抗原结合位点。
33.重组细胞，其表达在权利要求1至15的任一项中限定的所述第一肽链、所述第二肽链或者所述第一肽链和第二肽链两者，或者表达权利要求16所述的肽链。
34.重组细胞，其表达在权利要求17至31的任一项中限定的所述第一肽链或所述第一肽链和第二肽链两者，或者表达权利要求32所述的肽链。
35.产生表达抗原受体的细胞的方法，所述受体包含第一肽链和第二肽链，所述方法包括：
(a)提供细胞；
(b)提供第一遗传构建体，所述第一遗传构建体编码包含至少第一结构域和第二结构域以及免疫受体信号传递结构域的第一肽链；
(c)提供第二遗传构建体，所述第二遗传构建体编码包含至少第一结构域和第二结构域以及免疫受体信号传递结构域的第二肽链；
(d)将所述第一遗传构建体和所述第二遗传构建体引入到所述细胞中；以及
(e)使得所述构建体在所述细胞中表达；
其中来自所述第一肽链的第一结构域能够与来自所述第二肽链的一个结构域一起形成第一抗原结合位点，以及
其中来自所述第一肽链的第二结构域能够与来自所述第二肽链的另一个结构域一起形成第二抗原结合位点。
36.产生表达抗原受体的细胞的方法，所述受体包含第一肽链和第二肽链，所述方法包括：
(a)提供细胞；
(b)提供第一遗传构建体，所述第一遗传构建体编码包含至少四个结构域和免疫受体信号传递结构域的第一肽链；
(c)提供第二遗传构建体，所述第二遗传构建体编码包含免疫受体信号传递结构域的第二肽链；
(d)将所述第一遗传构建体和所述第二遗传构建体引入到所述细胞中；以及
(e)使得所述构建体在所述细胞中表达；
其中来自所述第一肽链的两个结构域能够形成第一抗原结合位点，并且
其中来自所述第一肽链的另外两个结构域能够形成第二抗原结合位点。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述抗原受体的表达在细胞表面处。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述第一肽链和所述第二肽链在单个遗传构建体上提供。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
41.通过权利要求35至40中任一项所述的方法产生的重组细胞。
42.核酸，其编码在权利要求1至15的任一项中限定的所述第一肽链、所述第二肽链或者所述第一肽链和第二肽链两者，或者编码权利要求16所述的肽链。
43.核酸，其编码在权利要求17至31的任一项中限定的所述第一肽链或所述第一肽链和第二肽链两者，或者编码权利要求32所述的肽链。
44.根据权利要求42或43所述的核酸，其中所述核酸是DNA或RNA。
45.药物组合物，其包含权利要求1至15或17至31中任一项所述的抗原受体，权利要求33、34或41所述的重组细胞，或者权利要求42至44中任一项所述的核酸；以及可药用载体。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，其用作药物。
47.根据权利要求45所述的药物组合物，其用于治疗以表达被所述抗原受体结合的至少一种抗原为特征的疾病。
48.根据权利要求47所述的药物组合物，其中所述抗原是肿瘤抗原。
49.根据权利要求47或48所述的药物组合物，其中所述疾病是癌症。
50.用于治疗疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的权利要求45所述的药物组合物，其中所述疾病的特征在于表达被所述抗原受体结合的至少一种抗原。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述疾病是癌症。
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