TW202029957A - Aav三質體系統 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種三質體系統，其用於產生重組腺相關病毒。

Description

AAV三質體系統

腺相關病毒(Adeno-associated virus；AAV)為感染人類及諸如靈長類動物、牛類動物、貓類動物及犬類動物之各種其他動物物種的DNA小病毒。其屬於細小病毒科家族(familyParvoviridae )且位於依賴病毒屬(genusDependovirus )中，此係因為AAV之產毒性感染僅在輔助病毒(例如，腺病毒或疱疹病毒)之存在下發生。此較小無包膜病毒含有編碼複製(Rep)及蛋白殼(Cap)蛋白質之集合的4.6千鹼基單股DNA基因組。舉例而言，Rep蛋白質(Rep78、Rep68、Rep52及Rep40)參與AAV基因組之複製、挽救及整合，且Cap蛋白質(VP1、VP2及VP3)提供結構功能且形成病毒體蛋白殼。在5'及3'端處側接Rep及Cap開讀框為145 bp反向末端重複序列(inverted terminal repeat；ITR)。ITR在順式中充當核酸複製之起源且充當病毒之封裝信號。

一旦感染已發生，AAV生命週期存在兩個階段：1)裂解階段及2)溶原階段。藉助於輔助病毒，裂解階段開始。在此階段期間，AAV開始產毒性感染，從而引起基因組複製、病毒基因表現及病毒體產生。在腺病毒輔助之情況下，提供關於AAV表現之輔助功能的腺病毒蛋白質包括E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA。腺病毒藉由為AAV產毒性感染提供適當環境來幫助調節細胞基因表現。參見2008年10月Daya及BernsClinical Microbiology Reviews , 第583-593頁。

AAV為可經工程改造以用於基因療法之萬用病毒。用於基因療法之重組腺相關病毒載體(rAAV) (在其DNA基因組中缺少病毒基因)主要為經工程改造以穿越細胞膜以便將其DNA貨物運輸及遞送至細胞之胞核中的基於蛋白質之奈米粒子。rAAV DNA基因組可形成持續作為經轉導細胞之胞核中之游離基因組的環狀串聯體。因為rAAV DNA不整合至宿主基因組中，其有助於長期基因表現及耐久性，其為rAAV理想用於基因療法的原因中之一者。

已藉由用治療性轉基因表現卡匣置換全部病毒基因，同時保留載體封裝及DNA複製所需的唯一順式元件ITR來將重組形式之AAV (rAAV)研發為載體。參見例如美國專利第4,797,368號；第5,153,414號；第5,139,941號；第5,252,479號；及第5,354,678號；以及國際公開案第WO1991/018088號；第WO1993/024641號及第WO1994/13788號。rAAV產生之早期方法依賴於二質體系統，該二質體系統包含：1) AAV輔助質體(通常涵蓋AAV Rep及Cap編碼區，同時缺少AAV ITR，因此其不能自身複製或封裝)；及2)含ITR之質體(通常涵蓋由AAV ITR限定之所選所關注轉基因，該轉基因提供病毒複製及封裝功能)。輔助質體及攜帶所選基因的含ITR之質體兩者均可引入至適合細胞中以用於藉由瞬時轉染來產生。經轉染細胞可接著感染有諸如腺病毒或單純疱疹病毒之輔助病毒，該輔助病毒轉活化存在於輔助質體上之AAV啟動子，該等AAV啟動子導引AAV Rep及Cap區之轉錄及轉譯。關於Ad輔助病毒，E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA基因可提供rAAV產生所必需之輔助功能。將輔助病毒在產生rAAV時感染至生產細胞中以產生rAAV為有效的；然而，後果為其亦可能產生可誘發宿主之免疫反應的輔助病毒粒子。在某些平台中，可將AAV製造所必需之病毒輔助基因穩定地轉染至製造細胞系(例如，HEK293細胞)中，由此降低來自微量殘餘輔助病毒的宿主免疫系統之抗輔助病毒免疫反應的可能性。

最近，已研發出三質體轉染方法。此方法使用AAV血清型特異性Rep及Cap質體以及含轉基因質體，但藉由在第三質體上提供必需的輔助病毒基因來消除輔助病毒感染之使用(亦即移除或減少病毒編碼序列)，因此降低宿主免疫系統之潛在抗輔助病毒免疫反應。在第三質體上提供病毒輔助基因極大地減少經轉染細胞中之輔助病毒產生，從而僅提供rAAV。黏附性HEK293細胞之多質體瞬時轉染為用於rAAV產生之常用方法。

在多質體系統中，維持適當質體大小為至關重要的。因此，添加核酸序列(亦稱為「填充序列」)以確保質體具有最佳大小可為至關重要的。舉例而言，為阻止含ITR之質體的質體骨架不封裝至載體蛋白殼中，可能需要添加填充序列以使得骨架足夠大以有效地封裝至蛋白殼中。然而，填充序列為「靜默」的且不會在質體經封裝的較小機率中活化免疫系統為至關重要的。

因此，需要用於產生rAAV之改良的基於三質體之系統。質體系統應提供改良的轉染及降低的免疫原性，同時仍保留轉基因之最佳表現。本發明之實施例針對此質體系統。

如先前技術章節中所說明，在此項技術中存在對改良用於基於rAAV之基因治療之rAAV質體系統的較大需求。本發明滿足此需求及其他需求。本發明之實施例大體上係關於一種用於產生rAAV之質體系統，且更具體言之，關於一種基於三質體之系統。

在一個態樣中，本發明係關於一種用於重組腺相關病毒載體(rAAV)產生之質體系統，其包含：(i)含轉基因質體，其包含由5'及3' AAV反向末端重複序列(ITR)側接的至少一種異源核酸序列及在該等ITR外部之填充序列；(ii)質體，其包含AAV複製(Rep)及蛋白殼(Cap)基因序列；及(iii)腺病毒(Ad)輔助質體。

在某些實施例中，該填充序列增加含轉基因質體骨架之大小。在某些實施例中，該填充序列增加該含轉基因質體骨架之大小以使得阻止該含轉基因質體骨架封裝至rAAV蛋白殼中。在某些實施例中，將質體骨架併入該rAAV中低於偵測極限。在某些實施例中，在添加該填充序列之後，該含轉基因質體之骨架大於野生型AAV基因組。

在某些實施例中，該填充序列不含增強子、啟動子、剪接調節子、非編碼RNA、反義序列、編碼序列，或其任何組合。在某些實施例中，該填充序列不含增強子、啟動子、剪接調節子、非編碼RNA、反義序列及編碼序列。在某些實施例中，該填充序列包含發現於人類基因組中之惰性內含子DNA序列。

在某些實施例中，該填充序列包含長度在1000與5000個核苷酸之間的核酸序列，或長度在1000與2000個核苷酸之間的核酸序列。

在某些實施例中，該填充序列包含GAPDH內含子2、其片段或突變體。在某些實施例中，該填充序列包含失活健他黴素(gentamycin)基因。

在某些實施例中，該填充序列包含與SEQ ID NO: 9具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，該填充序列包含SEQ ID NO: 9或其片段。在某些實施例中，該片段長度在800-1000個核苷酸之間。

在某些實施例中，該填充序列由與SEQ ID NO: 9具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸組成。在某些實施例中，該填充序列由SEQ ID NO: 9或其片段組成。在某些實施例中，該片段長度在800-1000個核苷酸之間。

在某些實施例中，該含轉基因質體包含具有與圖3A呈相同次序之結構的質體，其中eGFP及SEAP轉基因可經該至少一種異源核酸序列置換。

在某些實施例中，該含轉基因質體包含具有與圖3B呈相同次序之結構的質體，其中該eGFP轉基因可經該至少一種異源核酸序列置換。

在某些實施例中，該含轉基因質體包含在以下之5'至3'方向上的核酸序列：5' ITR (例如，SEQ ID NO: 2或43)、啟動子(例如，SEQ ID NO: 4)、至少一種異源核酸序列、polyA序列(例如，SEQ ID NO: 8)、3' ITR (例如，SEQ ID NO: 3)及該填充序列(例如，SEQ ID NO: 9)，其中各核酸序列可經以下取代或編碼以下：對應功能片段或其衍生物，或與其具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之序列。

在某些實施例中，該含轉基因質體進一步包含在表現卡匣外部但在該5' ITR與該3' ITR之間的DNA滴度標籤。

在某些實施例中，該含轉基因質體進一步包含以下處的DNA滴度標籤：i)該3' ITR之上游及polyA序列之下游；或ii)該3' ITR之上游及該至少一種異源核酸序列之下游；iii)或該5' ITR之下游及該至少一種異源核酸序列之上游；或iv)該5' ITR之下游及該至少一種異源核酸序列之啟動子之上游；或v)該5' ITR之下游及該3' ITR之上游。

在某些實施例中，該含轉基因質體進一步包含以下處的DNA滴度標籤：i) 3' ITR (例如，SEQ ID NO: 3)之上游及polyA序列(例如，SEQ ID NO: 8)之下游；或ii) 3' ITR (例如，SEQ ID NO: 3)之上游及該至少一種異源核酸序列之下游；iii)或5' ITR (例如，SEQ ID NO: 2或43)之下游及該至少一種異源核酸序列之上游；或iv) 5' ITR (例如，SEQ ID NO: 2或43)之下游及啟動子(例如，SEQ ID NO: 4)之上游；或v) 5' ITR (例如，SEQ ID NO: 2或43)之下游及3' ITR (例如，SEQ ID NO: 3)之上游。

在某些實施例中，該含轉基因質體包含在以下之5'至3'方向上的核酸序列：5' ITR (例如，SEQ ID NO: 2或43)、啟動子(例如，SEQ ID NO: 4)、至少一種異源核酸序列、polyA序列(例如，SEQ ID NO: 8)、3' ITR (例如，SEQ ID NO: 3)及該填充序列(例如，SEQ ID NO: 9)，其中各核酸序列可經以下取代或編碼以下：對應功能片段或其衍生物，或與其具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致性之序列。

在某些實施例中，該含轉基因質體進一步包含在該表現卡匣外部但在該5' ITR與該3' ITR之間的DNA滴度標籤。

在某些實施例中，該含轉基因質體進一步包含以下處的DNA滴度標籤：i)該3' ITR之上游及polyA序列之下游；或ii)該3' ITR之上游及該至少一種異源核酸序列之下游；iii)或該5' ITR之下游及該至少一種異源核酸序列之上游；或iv)該5' ITR之下游及該至少一種異源核酸序列之啟動子之上游；或v)該5' ITR之下游及該3' ITR之上游。

在某些實施例中，該含轉基因質體進一步包含以下處的DNA滴度標籤：i) 3' ITR (例如，SEQ ID NO: 3)之上游及polyA序列(例如，SEQ ID NO: 8)之下游；或ii) 3' ITR (例如，SEQ ID NO: 3)之上游及該至少一種異源核酸序列之下游；iii)或5' ITR (例如，SEQ ID NO: 2或43)之下游及該至少一種異源核酸序列之上游；或iv) 5' ITR (例如，SEQ ID NO: 2或43)之下游及啟動子(例如，SEQ ID NO: 4)之上游；或v) 5' ITR (例如，SEQ ID NO: 2或43)之下游及3' ITR (例如，SEQ ID NO: 3)之上游。

在某些實施例中，該AAV Rep基因序列來自AAV血清型2、5、8、9，或其雜合體。在某些實施例中，該AAV Cap基因序列來自AAV血清型2、5、8、9，或其雜合體。在某些實施例中，包含該Rep及該Cap基因序列之該質體進一步包含啟動子。在某些實施例中，該啟動子為AAV啟動子。在某些實施例中，該啟動子為AAV P5啟動子。

在某些實施例中，該Ad輔助質體包含選自以下之腺病毒基因中之一或多者：E1a、E1b、E2a、E4orf6或VA RNA。

在某些實施例中，該Ad輔助質體包含在以下之5'至3'方向上的核酸序列：SEQ ID NO: 18、17、16及20，其中各核酸序列可經以下取代：對應功能片段或其衍生物，或與其具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列。

在某些實施例中，該Ad輔助質體包含在以下之該5'至3'方向上的核酸序列：SEQ ID NO: 21、16、39、40、22、23及20，其中各核酸序列可經以下取代或編碼以下：對應功能片段或其衍生物，或與其具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列。

在某些實施例中，該Ad輔助質體包含與圖5之任一構築體呈相同次序的結構。

在某些實施例中，該Ad輔助質體包含與SEQ ID NO: 14具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。

在某些實施例中，該Ad輔助質體包含與SEQ ID NO: 15具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。

在某些實施例中，該異源核酸序列為編碼肽、多肽或蛋白質的所關注異源基因。在某些實施例中，該肽、該多肽或該蛋白質為酶、抗體、MHC分子、T細胞受體、B細胞受體、適體、高親和性多聚體、受體結合配位體、靶向肽、治療劑或基因編輯分子。在某些實施例中，該異源核酸序列為核酸序列，諸如反義鏈、siRNA、shRNA、miRNA、EGS、gRNA、sgRNA、核糖核酸酶或適體。

在另一態樣中，本發明係關於一種宿主細胞，其包含本文中所描述之質體系統中之任一者。

在另一態樣中，本發明係關於一種rAAV，其藉由本文中所描述之質體系統中之任一者產生。

在另一態樣中，本發明係關於一種允許通用載體滴定之DNA滴度標籤，該DNA滴度標籤包含在含轉基因質體內之異源核酸序列之核酸序列上游或下游的長度為約60個核苷酸至約100個核苷酸的核酸標籤序列，其中該核酸標籤序列可用於至少兩種不同的含轉基因質體中以允許在至少兩種不同類型之AAV載體之間進行通用載體基因組滴定。在某些實施例中，該核酸標籤序列長度為約100個核苷酸。

在某些實施例中，該核酸標籤序列在該含轉基因質體之3' ITR序列上游，而非在該含轉基因質體之表現卡匣內。

在某些實施例中，該核酸標籤序列在該含轉基因質體之5' ITR序列下游，而非在該含轉基因質體之表現卡匣內。

在某些實施例中，該DNA滴度標籤包含SEQ ID NO: 61-70之核酸序列中之任一者。

在另一態樣中，本發明係關於一種用於產生rAAV之方法，其包含用本文中所描述之質體系統中之任一者轉導細胞，以及分離rAAV。在另一態樣中，本發明係關於一種rAAV，其藉由該方法產生。

在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包含本發明之質體系統。

在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含藉由本發明之質體系統產生的rAAV。

在另一態樣中，本發明係關於一種用於將核酸序列遞送或轉移至個體之細胞中之方法，其包含向個體投與藉由本發明之質體系統產生的該rAAV，由此將該核酸序列遞送至該細胞中。在某些實施例中，該個體之細胞在培養物中或存在於個體中。

在另一態樣中，本發明係關於一種用於治療或預防個體中之疾病或病症之方法，其包含向有需要之個體投與藉由本發明之質體系統產生的rAAV。

在另一態樣中，本發明係關於一種宿主細胞，其包含使該宿主細胞與藉由本發明之質體系統產生的rAAV接觸。

在結合隨附描述、申請專利範圍及圖式來閱讀以下說明書時，本發明之此等及其他目標、特徵及優點將變得更顯而易見。

交叉參考

本申請案主張2018年10月25日申請之美國臨時專利申請案第62/750,603號之優先權，該美國臨時專利申請案以全文引用之方式併入本文中。 序列表

本申請案含有序列表，其已呈ASCII格式以電子方式提交且特此以全文引用之方式併入。將2019年10月22日創建之該ASCII複本命名為250478_001858_SL.txt且大小為274,165位元組。

如先前技術章節中所說明，在此項技術中存在對用以產生基於rAAV之基因治療的rAAV產生之鑑別技術的較大需求。本發明滿足此需求及其他需求。本發明之實施例大體上係關於rAAV產生，且更具體言之，關於一種用以產生rAAV的基於三質體之系統。

為促進對本發明之各種實施例之原理及特徵之理解，下文解釋各種說明性實施例。儘管詳細解釋本發明之例示性實施例，但應理解，涵蓋其他實施例。因此，不希望本發明在其範疇內限於以下描述或實例中闡述的構築之細節及組分之配置。本發明能夠具有其他實施例，且能夠以各種方式實踐或實施。另外，在描述例示性實施例時，為了清楚起見，將採用特定術語。

希望各術語涵蓋如由熟習此項技術者所理解之其最廣泛含義，且包括以類似方式操作以實現類似目的之所有技術等效物。應理解，所揭示技術之實施例可在無此等特定細節之情況下實踐。在其他情況下，未詳細展示熟知方法、結構及技術，以便不混淆對此說明書之理解。提及「一個實施例」、「一實施例」、「實例實施例」、「一些實施例」、「某些實施例」、「各種實施例等」指示如此描述之所揭示技術之實施例可包含特定特徵、結構或特性，而非各實施例必需包括特定特徵、結構或特性。另外，重複使用片語「在一個實施例中」未必指同一實施例，但其可為同一實施例。

亦必須指出，如在本說明書及所附申請專利範圍中所使用，除非上下文以其他方式清楚地指定，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數參考物。舉例而言，提及一種組分亦意欲包括複數種組分之組合物。提及含有「一種」成分之組合物意欲包括除了指定成分之外的其他成分。換言之，術語「一(a/an)」及「該」不表示數量之限制，而表示存在所提項中之「至少一個」。

如本文中所使用，術語「及/或」可意謂「及」，其可意謂「或」，其可意謂「非排他性或」，其可意謂「一個」，其可意謂「一些而非全部」，其可意謂「兩者皆不」，及/或其可意謂「兩者皆」。術語「或」意欲意謂包括性「或」。

範圍可在本文中表述為「約」或「大約」或「實質上」一個特定值及/或至「約」或「大約」或「實質上」另一特定值。當表述此範圍時，其他例示性實施例包括一個特定值及/或至另一特定值。此外，術語「約」意謂如由一般熟習此項技術者所測定在特定值之可接受誤差範圍內，其將部分地視如何量測或測定該值(亦即量測系統之限制)而定。舉例而言，根據此項技術中之實踐，「約」可意謂在可接受標準差內。替代地，「約」可意謂給定值之至多±20%，較佳地至多±10%，更佳地至多±5%，且再更佳地至多±1%之範圍。替代地，尤其相對於生物系統或方法，該術語可意謂在量值之一定數量級內，較佳地在2倍內。在特定值描述於本申請案及申請專利範圍中之情況下，除非另外陳述，否則術語「約」為隱含的且在此上下文中意謂在特定值之可接受誤差範圍內。

「包含」、「含有」或「包括」意謂至少已指定的化合物、元素、粒子或方法步驟存在於組合物或製品或方法中，但不排除其他化合物、材料、粒子、方法步驟之存在，即使其他此等化合物、材料、粒子、方法步驟具有與所指定的相同的功能。

貫穿本說明書，各種組分可經鑑別具有特定值或參數，然而，此等項經提供作為例示性實施例。實際上，例示性實施例並不限制本發明之各種態樣及概念，此係因為可實施許多相當的參數、大小、範圍及/或值。術語「第一」、「第二」及其類似者、「主要」、「次要」及其類似者並不表示任何次序、數量或重要性，而用於區分一種要素與另一種要素。

應注意，如「特定地」、「較佳地」、「典型地」、「通常」及「經常」之術語在本文中並不用於限制所主張揭示內容之範疇，或暗示某些特徵對所主張揭示內容之結構或功能為關鍵、基本或甚至至關重要的。實際上，此等術語僅意欲強調可或可不用於本發明之一特定實施例中的替代性或額外特徵。亦應注意，如「實質上」及「約」之術語在本文中用於表示可歸因於任何定量比較、值、量測或其他表示的不定性之固有程度。

本文所揭示之尺寸及價不應理解為嚴格地限於所敍述之精確數值。實際上，除非另外說明，否則各此尺寸均意欲意謂所敍述值與圍繞彼值之功能等效範圍兩者。舉例而言，揭示為「50 mm」之尺寸意欲意謂「約50 mm」。

亦應理解，對一或多個方法步驟之提及不排除額外方法步驟或清楚確認之彼等步驟之間的中間方法步驟之存在。類似地，亦應理解，對組合物中之一或多種組分之提及不排除相較於經清楚鑑別之彼等組分的額外組分之存在。

如本文中所使用，術語「個體(subject)」、「患者」、「受試者(individual)」及「動物」在本文中互換使用，且係指哺乳動物，包括(但不限於)人類及獸醫學動物(例如，貓、犬、奶牛、馬、綿羊、豬等)以及實驗動物模型。在一較佳實施例中，個體為人類。

如本文中所使用，術語「基因療法」包括向患者提供編碼治療性基因(例如，因子VIII/IX/X)之核酸以緩解、減輕或預防與疾病或病況相關聯的一或多種症狀(例如，臨床因素)之復發的任何治療性方法。該術語涵蓋投與包含編碼治療性基因之核酸的任何化合物、藥物、程序或方案以用於維持或改良患有疾病或病況的受試者之健康狀況，該治療性基因包括任何修飾形式之基因(例如，因子VIII/IX/X變異體)。熟習此項技術者將瞭解，可例如基於根據本發明獲得之結果來改變基因療法之過程或基因治療劑之劑量。

如本文中所使用，應用於劑量或量之術語「治療有效」係指在投與至個體以用於治療(例如，預防或改善)病況、病症或病況時足以影響此治療的化合物或醫藥組合物之數量。舉例而言，適用於治療血友病之藥物之治療有效量可為能夠預防或減輕與血友病相關聯之一或多種症狀的量。「治療有效量」將視所投與之化合物或細菌或類似物以及疾病及其嚴重程度及待治療之哺乳動物之年齡、體重、生理條件及反應性而變化。精確劑量將視治療目的而定，且將可由熟習此項技術者使用已知技術來確定(參見例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (第1-3卷, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar, Dosage Calculations (1999)；及Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2003, Gennaro編, Lippincott, Williams & Wilkins)。

如本文中所使用，術語「載體」係指用於將核酸(例如，編碼基因療法構築體)轉移至宿主細胞中的任何媒介。在一些實施例中，載體包括複製子，其用於複製媒介以及目標核酸。在一些實施例中，載體為用於引入目標核酸(例如，編碼治療性基因或治療性基因變異體的經密碼子更改之多核苷酸)之病毒粒子。適用於基因療法之許多經修飾真核病毒在此項技術中已知。舉例而言，腺相關病毒(AAV)尤其良好適用於人類基因療法中，此係因為人類為病毒之天然宿主，尚不知天然病毒促成任何疾病，且病毒引發輕度免疫反應。「重組AAV」(rAAV)及「AAV」貫穿本申請案互換地使用。

術語「質體」係指能夠在給定細菌細胞中自主複製的染色體外環狀DNA。例示性質體包括(但不限於)衍生自以下之彼等：pBR322、pUC、pUC19、pUC57、pJ241或pJ247、pBluescript、pREP4、pCEP4、pCI及p Poly (Lathe等人, Gene 57 (1987)，193-201)。質體亦可藉由標準分子生物學技術(Sambrook等人, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), N. Y.)進行工程改造。該等質體亦可包含選擇基因以便選擇或鑑別經轉染細胞(例如，藉由細胞營養缺陷型之互補或藉由抗生素抗性)、穩定元件(例如，cer序列)或整合元件(例如，LTR病毒序列及轉座子)。

如本文中所使用，術語「質體骨架」係指典型地含有複製起點(例如，SEQ ID NO: 20及26)及抗生素選擇基因的DNA序列，該複製起點及抗生素選擇基因為僅藉由適當質體轉化的宿主之特異性生長所必需。在某些實施例中，此等元件並不意欲封裝於rAAV蛋白殼中。

如本文中所使用，術語「基因」係指編碼多肽鏈的DNA分子之片段(例如，編碼區)。在一些實施例中，基因藉由緊接在編碼區之前、在編碼區之後及/或插入編碼區之區域定位，該等區域涉及產生多肽鏈(例如，調節元件，諸如啟動子、增強子、多腺苷酸化序列、5'-非轉譯區、3'-非轉譯區或內含子)。

如本文中所使用，術語「調節元件」係指在細胞中提供編碼序列之表現的核酸序列，諸如啟動子、增強子、終止子、多腺苷酸化序列、內含子等。

如本文中所使用，術語「啟動子元件」係指幫助控制編碼序列之表現的核酸序列。通常，啟動子元件位於基因之轉譯起始位點之5'。然而，在某些實施例中，啟動子元件可位於內含子序列內或編碼序列之3'。在一些實施例中，適用於基因療法之啟動子衍生自目標蛋白質之天然基因。在一些實施例中，適用於基因療法之啟動子對目標生物體之特定細胞或組織中的表現具有特異性(例如，肝特異性啟動子) (Wu Z等人, Molecular Therapy 16(2):280-9. Choi VW等人, Molecular Therapy Methods & Clinical Development 2015. 2:15022)，該等文獻均出於所有預期目的以全文併入本文中。在又其他實施例中，複數個充分表徵之啟動子元件中之一者用於本文中所描述之基因療法中。充分表徵之啟動子元件之非限制性實例包括CMV早期啟動子(例如，hCMVie (SEQ ID NO: 4))、3-肌動蛋白啟動子及甲基CpG結合蛋白質2 (MeCP2)啟動子。在一些實施例中，啟動子為組成型啟動子，其實質上驅動目標蛋白質之恆定表現。在其他實施例中，啟動子為誘導型啟動子，其回應於特定刺激(例如，暴露於特定治療劑或藥劑)而驅動目標蛋白質之表現。對於針對AAV介導之基因療法設計啟動子的綜述，參見Gray等人(Human Gene Therapy 22:1143-53 (2011))，其內容出於所有目的明確地以全文引用之方式併入。

如本文中所使用，術語「轉基因」廣泛係指引入至動物之基因組中之任何核酸，包括(但不限於)具有可能通常不存在於基因組中之序列的基因或核酸、存在但通常不在給定基因組中轉錄及轉譯(「表現」)的基因，或吾人期望引入至基因組中的任何其他基因或核酸。此可包括可能通常存在於非轉基因基因組中，但吾人期望對其表現進行更改，或吾人期望以非突變形式或經更改形式或變異體形式引入的基因。轉基因可特異地靶向所定義基因座，可隨機整合於染色體內，或其可染色體外複製DNA。轉基因可包括一或多個轉錄調節序列及可為所選核酸之最佳表現所必需的任何其他核酸，諸如內含子。轉基因長度可少至幾個核苷酸，但長度較佳為至少約50、100、150、200、250、300、350、400或500個核苷酸或甚至更長，且可為例如整個病毒基因組。轉基因可為編碼或非編碼序列或其組合。轉基因通常包含能夠在適當條件下驅動一或多個轉基因之表現的調節元件。

如本文中所使用，在涉及諸如編碼序列及/或控制序列之核酸序列時，術語「異源」表示通常不接合在一起及/或通常不與特定細胞締合的序列。因此，「異源」核酸序列意謂核酸序列係來自除AAV以外之生物體或以合成方式衍生。在某些實施例中，異源核酸序列(例如，所關注異源基因)可編碼多肽，諸如(但不限於)凝血因子、酶、抗體或其他所關注多肽。在某些實施例中，異源核酸序列可編碼具有結構或治療性功能之RNA，諸如(但不限於)反義鏈、siRNA、shRNA、miRNA、EGS、gRNA、sgRNA、核糖核酸酶或適體。類似地，出於本發明之目的，藉由通常不存在於細胞中之構築體轉化的細胞將被視為異源的。

「可操作地連接」係指以實體方式連接以使得序列中之一者之功能受另一者影響的兩個或更多個核酸序列元件之締合。舉例而言，若兩個序列經定位以使得調節DNA序列影響編碼DNA序列之表現(亦即，編碼序列或功能RNA在啟動子之轉錄控制下)，則據稱調節DNA序列「可操作地連接至」編碼RNA或多肽之DNA序列或「與」該DNA序列「締合」。編碼序列可以正義或反義定向可操作地連接至調節序列。

如本文中所使用，術語「核酸」係指去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其呈單股或雙股形式之聚合物及其互補序列。術語涵蓋含有合成的、天然存在的及非天然存在的已知核苷酸類似物或經修飾骨架殘基或鍵的核酸，其具有與參考核酸類似之結合特性且其以與參考核苷酸類似之方式代謝。此等類似物之實例包括(但不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸及肽核酸(PNA)。

術語「胺基酸」係指天然存在及非天然之胺基酸，包括以類似於天然存在之胺基酸的方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸包括由基因密碼編碼之彼等胺基酸，以及稍後經修飾之彼等胺基酸，例如羥基脯胺酸、y-羧基麩胺酸及O-磷絲胺酸。天然存在之胺基酸可包括例如D-胺基酸及L-胺基酸。本文中所使用之胺基酸亦可包括非天然胺基酸。胺基酸類似物係指具有與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構(亦即，與氫、羧基、胺基及R基團結合之任何碳)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸或甲硫胺酸甲基鋶。此等類似物具有經修飾R基團(例如，正白胺酸)或經修飾肽骨架，但保持與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物係指結構不同於胺基酸之一般化學結構，但以類似於天然存在之胺基酸的方式起作用的化學化合物。胺基酸在本文中可由其通常已知的三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名法委員會(Biochemical Nomenclature Commission)所推薦之單字母符號來提及。同樣，核苷酸可由其通常可接受之單字母代碼來提及。

如本文中所使用，術語「衍生物」係指相較於對應全長野生型核酸、肽或蛋白質，包含一或多個突變及/或化學修飾之核酸、肽或蛋白質或變異體或其類似物。涉及核酸之化學修飾之非限制性實例包括例如對鹼基部分、糖部分、磷酸酯部分、磷酸酯-糖骨架或其組合之修飾。

編碼可能適用於本文中所描述之質體系統的突變體基因構築體的核酸序列可與野生型(亦即，未突變)序列一致，或可為不同編碼序列，由於基因密碼之冗餘或簡併，該序列編碼與野生型編碼序列相同的多肽。一般熟習此項技術者將認識到，核酸中之各密碼子(除通常為甲硫胺酸之唯一密碼子的AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子的TGG以外)可經修飾以產生功能上一致的分子。因此，編碼相同多肽之核酸之各變型就表現產物而言在各所描述序列中為隱含的，但就實際基因療法構築體而言並非如此。

關於胺基酸序列，一般熟習此項技術者將認識到，更改、添加或缺失編碼序列中之單個胺基酸或較小百分比之胺基酸之核酸或肽序列的個別取代、缺失或添加為「經保守修飾之變異體」，其中該更改引起胺基酸經化學上類似之胺基酸取代。提供功能上類似之胺基酸的保守取代表在此項技術中為熟知的。此等經保守修飾之變異體另外為且不排除本發明之多晶型變異體、種間同源物及對偶基因。提供功能上類似之胺基酸之保守胺基酸取代在此項技術中為熟知的。視特定胺基酸(例如，催化、結構或空間重要胺基酸)之功能性而定，可將胺基酸之不同分組視為對彼此之保守取代。

在兩個或更多個核酸或肽序列之情形下，術語「一致」或「一致性」百分比(%)係指相同或具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即，當針對最大對應性在比較窗口或指定區域上進行比較時，在指定區域上的約60%一致性，較佳65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性)的兩個或更多個序列或子序列，如使用具有下文描述之默認參數的BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法或藉由人工比對及目視檢查所量測。

如此項技術中所已知，若干不同程式可用於鑑別蛋白質(或如下文所論述之核酸)是否與已知序列具有序列一致性或相似性。使用此項技術中已知之標準技術，較佳使用默認設定或藉由檢查來測定序列一致性及/或相似性，該等標準技術包括(但不限於)：Smith及Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)之局部序列一致性演算法；Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)之序列一致性比對演算法；Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988)之相似性方法之檢索；此等演算法之電腦化實施方案(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis)；由Devereux等人, Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984)所描述之Best Fit序列程式。較佳地，藉由FastDB基於以下參數計算一致性百分比：錯配罰分1；空隙罰分1；空隙大小罰分0.33；及接合罰分30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis」、Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, 第127-149頁(1988), Alan R. Liss, Inc，以上所有者以引用之方式併入。

根據本發明，可在此項技術內採用習知分子生物學、微生物學及重組DNA技術。此等技術在文獻中充分解釋。參見例如Sambrook, Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (本文中「Sambrook等人, 1989」)；DNA Cloning :A Practical Approach, 第I卷及第II卷(D. N. Glover編.1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編.1984)；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J.Higgins編.(1985))；Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins編(1984))；Animal Cell Culture (R.I. Freshney編. (1986))；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986))；B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；F.M. Ausubel等人(編),Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)；等。本發明之質體系統

在一個態樣中，本發明提供一種三質體系統，其用於工程改造且產生重組腺相關病毒載體(rAAV)。在某些實施例中，三個質體骨架均相同。在某些實施例中，三個質體骨架中之至少一者不同。在某些實施例中，所有三個質體骨架不同。在某些實施例中，所有三個質體骨架不同以防止可能引起完整AAV基因組之重構的重組出現。在某些實施例中，三個質體包含基於例如(而不限於) pUC19、pBR322、pUC57、pJ241或pJ247之質體骨架。在某些實施例中，三個質體包含基於pUC19、pJ241及pJ247之質體骨架。

在某些實施例中，一個質體充當用於rAAV產生構築體之含轉基因質體，第二質體充當AAV Rep-Cap構築體，且第三質體充當腺病毒(Ad)輔助構築體。各類型之例示性質體展示於圖1中。用於 rAAV 產生之含轉基因質體

用於rAAV產生之含轉基因質體經工程改造以攜載所關注之至少一種異源核酸序列(例如，反義RNA分子、shRNA、miRNA、核糖核酸酶或編碼所關注多肽之基因)，其中AAV基因組之內部部分經表現卡匣內之所關注異源核酸序列置換。如本文中所使用，「表現卡匣」意謂能夠導引特定異源核酸序列在適當宿主細胞(例如，哺乳動物)中之表現的核酸序列，其可包括可操作地連接至所關注核酸序列之啟動子，該所關注核酸序列可操作地連接至終止信號。包括所關注異源核酸序列之表現卡匣可為嵌合的。表現卡匣亦可為天然存在但已以適用於異源表現之重組形式獲得的表現卡匣。

在某些實施例中，含轉基因質體不包含抗生素抗性基因。在某些實施例中，含轉基因質體不包含胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因(例如，SEQ ID NO: 71及73)。雖然抗生素抗性基因常用作用於質體產生之選擇標記物，但包括抗生素抗性基因(例如，胺苄青黴素抗性基因)可能引起安全性問題。舉例而言，可存在水平基因至患者之細菌的轉移，此將在該基因不存在於質體中之情況下得以防止。避免使用涉及具有重要臨床用途之抗生素的抗生素選擇標記物以便避免使抗生素抗性特質散佈至環境微生物(例如，胺苄青黴素)之不必要風險為尤其重要的。吾人亦應避免使用造成患者之重大超敏反應的抗生素之抗生素抗性基因，此係因為在醫藥組合物中可能存在殘餘抗生素(例如，青黴素及其他P-內醯胺抗生素)。

根據本發明之例示性含轉基因質體展示於圖2、圖3A、圖3B、圖15A及圖15B以及SEQ ID NO: 1、42、71及73或與SEQ ID NO: 1、42、71及73具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之質體中。圖2、圖3A、圖3B、圖15A及圖15B提供本發明之含轉基因質體之元件的次序之一實例。

根據SEQ ID NO: 71及73之含轉基因質體為有利的，此係因為其移除胺苄青黴素抗性基因之所有痕跡，且亦包括充當額外填充序列之失活健他黴素抗性基因(例如，移除來自開讀框之起始密碼子)。

使用已知技術來構築含轉基因質體以至少提供在轉錄之方向上的操作性連接組分、包括轉錄起始區、所關注DNA及轉錄終止區之控制元件。控制元件經選擇以在哺乳動物細胞中起作用。含有操作性連接組分之所得構築體側接(5'及3')有功能AAV反向末端重複序列(ITR)序列。質體中亦可包括諸如多腺苷酸化位點之終止信號。

ITR已經展示為用於封裝所需的唯一順式元件，從而允許完全清除病毒基因以形成rAAV。儘管由於ITR內之D序列之存在，滾環DNA複製機制主要擴增(亦即，複製)由ITR側接之轉基因表現卡匣DNA序列，但由於側接D序列域之缺失，即使在較低頻率下，質體DNA骨架(例如，複製起點、抗生素抗性基因表現卡匣等)亦可封裝至載體蛋白殼中。在封裝大小相似於或小於野生型病毒基因組(約4.7千鹼基)之基因組時，AAV為高效的。吾人可藉由將骨架之大小增加至不利於使骨架封裝至蛋白殼中之程度來阻止質體骨架之封裝。骨架之擴大可藉由額外「填充」序列(亦即，填充組分)來實現，從而使得質體骨架大小大於野生型AAV基因組。在不希望受理論束縛之情況下，表明經擴大質體骨架之存在可能降低rAAV將質體骨架封裝至載體蛋白殼中的機率。在一些實施例中，藉由使用填充序列來形成經擴大質體骨架。

在某些實施例中，就生物活性而言，填充序列為靜默的，因為其不含增強子、啟動子、剪接調節子、非編碼RNA、反義序列及/或編碼序列中之至少一者。在某些實施例中，增強子、啟動子、剪接調節子、非編碼RNA、反義序列及編碼序列中之每一者均缺失。

在某些實施例中，填充序列包含發現於人類基因組中之惰性內含子DNA序列。藉由利用來自人類基因組之DNA序列，在將質體封裝至蛋白殼中之情況下，填充序列將誘發免疫反應之機率較低。填充序列不包括開讀框亦為至關重要的。

填充序列應足夠大以使質體骨架之大小大於rAAV之最佳封裝大小，使得不將質體骨架封裝至載體蛋白殼中。填充序列可由至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少900個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個或至少10000個核苷酸組成。在某些實施例中，填充序列包含長度在1000與5000個核苷酸之間的核酸。在某些實施例中，填充序列包含長度在1000與2000個核苷酸之間的核酸。在某些實施例中，填充序列包含長度在800與1500個核苷酸之間的核酸。在某些實施例中，填充序列包含長度在800與1000個核苷酸之間的核酸。

在一較佳實施例中，填充序列包含人類GAPDH內含子2 (NG007073.2)。在不希望受理論束縛之情況下，使用人類GAPDH內含子2具有較低免疫原性，此係因為該人類GAPDH內含子2已存在於人類基因組中且因此在其經偶然封裝時不應誘發免疫反應。GAPDH內含子2理想的作為填充序列，此係因為其為單一的天然存在之序列。不需要包括任何額外核苷酸或將超過一個序列連接在一起，此將導致DNA序列之非天然支持。

在某些實施例中，填充序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 9或其片段具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，填充序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 9或其片段。

在某些實施例中，填充序列包含失活健他黴素基因。在某些實施例中，健他黴素基因經修飾以使其不表現。舉例而言，可移除起始密碼子。

在某些實施例中，填充序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 72或其片段具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，填充序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 72或其非功能性片段。

含轉基因質體可使用來自各種AAV血清型中之任一者的ITR來構築。此等ITR鹼基配對以允許合成互補DNA股。ITR保持在此等質體中之功能性以允許複製且封裝含有所關注異源核酸序列之rAAV。AAV質體之末端重複序列內的突變在產生功能AAV載體方面良好耐受。參見例如Samulski等人, 1983；Muzyczka等人, 1984；及美國專利第9,163,259號，該美國專利出於所有目的全文併入本文中。即使具有兩個ITR中之一者的質體缺失，AAV序列可經挽救、複製且產生感染性病毒體，只要構築體中之現有ITR含有完整AAV ITR序列即可。

AAV ITR區之核酸序列為已知的。ITR無需具有野生型核酸序列，但可例如藉由核苷酸之插入、缺失或取代而更改。另外，AAV ITR可衍生自若干AAV血清型中之任一者，包括(而不限於) AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，或其嵌合體。此外，側接AAV載體中之所選核酸序列的5'及3' ITR無需一致或衍生自相同AAV血清型或分離物，只要其如預期那般起作用，亦即允許切除且挽救來自宿主細胞基因組之所關注序列。儘管SEQ ID NO: 2及43用作此文件中所描述的rAAV之5' ITR序列之一實例，但預期攜載末端解析位點之任何5' ITR序列將產生具有相同功能性之載體。同樣，儘管SEQ ID NO: 3用作此文件中所描述的rAAV之3' ITR序列之一實例，但預期攜載末端解析位點之任何3' ITR序列將產生具有相同功能性之載體 。

在某些實施例中，5' ITR序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 43或其功能片段或衍生物具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，5' ITR包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 43或其功能片段或衍生物。

在某些實施例中，3' ITR序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 3或其功能片段或衍生物具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，3' ITR包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 3或其功能片段或衍生物。

在某些實施例中，包含如上文所描述之填充序列的含轉基因質體可操作地連接至表現卡匣。

在某些實施例中，表現卡匣包含啟動子。在某些實施例中，至少一種異源核酸序列(例如，所關注異源基因)可操作地連接至Pol II啟動子(構成性、細胞特異性或誘導性)，使得異源核酸序列能夠在適當或所要條件下在患者之目標細胞中表現。構成性、細胞特異性及誘導性啟動子之眾多實例為此項技術中已知的，且技術者可易於針對特定預期用途來選擇啟動子，例如針對肌肉細胞特異性表現來選擇肌肉特異性骨骼a-肌動蛋白啟動子或肌肉特異性肌酸激酶啟動子/增強子，針對較強的連續或接近連續表現量(例如，hCMVie (SEQ ID NO: 4))來選擇構成性CMV啟動子，或針對誘導表現來選擇誘導性蛻皮激素啟動子。誘導表現允許熟習此項技術者控制所合成的蛋白質之量。以此方式，有可能改變治療性產物之濃度。熟知誘導性啟動子之其他實例為：類固醇啟動子(例如，雌性激素及雄性激素啟動子)及金屬硫蛋白啟動子。在某些實施例中，啟動子為pol III啟動子。在某些實施例中，啟動子為U6啟動子。在某些實施例中，啟動子為H1啟動子。在某些實施例中，基因表現卡匣不具有啟動子。

在某些實施例中，含轉基因質體為多順反子，亦即攜載超過一個基因。與將針對所表現之各基因形成唯一mRNA轉錄本的啟動子不同，多順反子質體同時表現來自相同mRNA之兩個或更多個單獨蛋白質。在此等情況下，多個基因藉由允許對各基因進行單獨轉譯之元件(例如，內部核糖體進入位點(IRES)或2A肽)分離。

儘管SEQ ID NO: 6用作此文件中所描述的rAAV之IRES序列之一實例，但預期攜載末端解析位點之任何5' ITR序列將產生具有相同功能性之載體。

IRES藉由充當另一核糖體募集位點來允許自mRNA之內部區域開始轉譯。在某些實施例中，IRES序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 6或其功能片段或衍生物具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，IRES包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 6或其功能片段或衍生物。

在某些實施例中，含轉基因質體編碼2A肽。形成2A肽(參見下表1中之非限制性實例)以克服IRES元件之一些缺點。特定而言，2A肽「自裂解」，此係因為此等肽被認為藉由使核糖體跳過在2A元件之C端處之肽鍵之合成來起作用，從而在2A序列之末端與下一肽下游之間產生分離。「裂解」在發現於C端上之甘胺酸殘基與脯胺酸殘基之間發生，意謂上游順反子將具有添加至末端之少量額外殘基，而下游順反子將以脯胺酸開始。2A裂解在真核細胞中較普遍，且一些科學家報導接近100%裂解。特異性2A肽之選擇將最終視諸如細胞類型或實驗條件之若干因素而定，一般熟習此項技術者將理解選擇哪一個。 表1 四種常見2A肽之實例。

肽	胺基酸序列*
T2A：	(GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 74)
P2A：	(GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 75)
E2A：	(GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 76)
F2A：	(GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 77)

*可將(GSG)殘基添加至肽之5'末端以改良裂解效率。

在一實施例中，質體包含來自AAV之5'及3' ITR，其中ITR包圍至少一個基因。在某些實施例中，填充序列定位於3' ITR之下游。在某些實施例中，填充序列在5' ITR之上游。ITR可來自AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及/或AAV11，或其嵌合體。在某些實施例中，ITR來自AAV血清型AAV2及/或AAV5。在某些實施例中，ITR可為SEQ ID NO: 2、3或43或其功能片段或衍生物。在一些實施例中，基因為報導基因，諸如(且不限於) eGFP (例如，SEQ ID NO: 5)及/或SEAP (例如，SEQ ID NO:7)。在一些實施例中，填充序列為GAPDH內含子2或其片段或變異體。在一些實施例中，填充序列為SEQ ID NO: 9或其片段。供用於質體中以產生ssAAV (圖3A)及scAAV (圖3B) rAAV之例示性基因構築體展示於圖3中。Rep-Cap 質體

第二質體包含AAV複製(Rep)及蛋白殼(Cap)基因序列。AAV Rep-Cap質體包括主要AAV基因開讀框(open reading frame；ORF) Rep基因及Cap基因兩者。已展示Rep蛋白質具有許多功能，尤其包括：DNA複製之AAV起點之識別、結合及產生切口；DNA解旋酶活性；及對AAV (或其他異源)啟動子之轉錄的調節。Cap蛋白質提供必要封裝功能且組裝至病毒蛋白殼殼體中。AAV輔助功能在本文中用於補充自AAV載體缺失的反式AAV功能。Rep及Cap基因經轉譯以產生多種不同蛋白質(AAV生命週期所需之Rep78、Rep68、Rep52、Rep40；VP1、VP2、VP3-蛋白殼蛋白質)。Rep及/或Cap基因可衍生自AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及/或AAV11，或其嵌合體。在某些實施例中，AAV Rep及/或Cap基因編碼經基因工程改造之AAV及/或經化學修飾之AAV。參見例如突變為較小免疫原性之AAV病毒體，諸如U.S. 7,259,151中所敍述之彼等，其出於所有預期目的以引用之方式併入本文中。可基於AAV血清型之向性來選擇AAV血清型之選擇。下表2提供最廣泛使用之AAV血清型之向性的實例(而非限制)。AAV之向性亦可經由假型化(亦即，將蛋白殼與來自不同病毒血清型之ITR的基因組混合)修飾。此等血清型使用斜線表示，使得AAV2/5指示含有攜載封裝於來自血清型5之蛋白殼中的血清型2之ITR之基因組的病毒。使用此等假型化病毒可改良轉導效率，以及改變向性。舉例而言，不藉由AAV2有效轉導之神經元，吾人可使用在大腦中更廣泛分佈且經展示具有經改良轉導效率的AAV2/5。吾人亦可使用衍生自多種不同血清型之雜交蛋白殼，該等雜交蛋白殼亦更改病毒向性。舉例而言，相較於任何野生型血清型，含有衍生自八種血清型之雜交蛋白殼的AAV-DJ顯示更高的活體外轉導效率；在活體內，其在廣泛範圍之細胞類型內顯示極高感染力。突變體AAV-DJ8顯示AAV-DJ之特性，但具有增強之大腦攝取。已描述若干AAV輔助質體，諸如編碼Rep及Cap基因表現產物兩者之常用質體pAAV/Ad及pIM29+45。參見例如Samulski等人(1989) J. Virol. 63:3822-3828；及McCarty等人(1991) J. Virol. 65:2936-2945及美國專利第5,139,941號；第6,001,650號；第6,376,237號；第7,259,151號，其中之每一者出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。 表2 AAV血清型之組織向性

組織	最佳血清型
心臟	AAV1、AAV8、AAV9
腎臟	AAV2
肝臟	AAV7、AAV8、AAV9
神經系統	AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9
肺臟	AAV4、AAV5、AAV6、AAV9
胰臟	AAV8
感光細胞	AAV2、AAV5、AAV8
RPE (視網膜色素上皮)	AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8
骨胳肌肉	AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9

根據本發明之一例示性Rep-Cap質體展示於以下中：圖4A、圖4B、圖14A及圖14B；及SEQ ID NO: 24、31、33、35、37、41、59及60，或與SEQ ID NO: 24、31、33、35、37、41、59或60具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之質體。圖4A、圖4B、圖14A及圖14B提供本發明之AAV Rep-Cap質體之質體中的元件之次序之實例。

在某些實施例中，Rep基因可衍生自AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及/或AAV11，或其嵌合體。在某些實施例中，AAV Rep基因為經基因工程改造之AAV及/或經化學修飾之AAV。在某些實施例中，Rep基因包括來自AAV血清型2 (Rep2)及/或Rep5之基因，其包括嵌合體(例如，AAV Rep2/5)。

在某些實施例中，Cap基因可衍生自AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及/或AAV11，或其嵌合體。在某些實施例中，AAV Cap基因為經基因工程改造之AAV及/或經化學修飾之AAV。在前述實施例中之任一者中，Cap基因可來自與Rep基因相同之AAV血清型或與Rep基因不同之AAV血清型。在前述實施例中之任一者中，質體進一步包含來自AAV血清型2、5、8及/或9 (分別為Cap2、Cap5、Cap8及Cap9)中之任一者的Cap基因，包括包含來自彼等血清型之Cap蛋白質之混合物的嵌合蛋白質。

在某些實施例中，Rep-Cap質體包括(但不限於)來自AAV血清型2且作為自超過1種血清型合併之嵌合Rep蛋白質(例如，Rep2/5)的Rep基因序列，及來自包括AAV2、AAV5、AAV8及/或AAV9之任何AAV蛋白殼血清型的蛋白殼基因序列。

在某些實施例中，Rep基因序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 11、12、28或30或其功能片段或衍生物具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，Rep基因序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 11、12、28或30或其功能片段或衍生物。

在某些實施例中，Cap基因序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 13、29、32或36或其功能片段或衍生物具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，Cap基因序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 13、29、32或36或其功能片段或衍生物。

在某些實施例中，啟動子序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 34或其功能片段或衍生物具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，啟動子序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 34或其功能片段或衍生物。

在一實施例中，Rep-Cap質體進一步包含用以控制本文中所描述之AAV Rep及Cap蛋白質之表現的AAV啟動子。該啟動子可為藉由已知考慮因素選擇的任何所要啟動子，該等已知考慮因素諸如功能性連接至啟動子之核酸之表現水平及將使用載體之細胞類型。亦即，啟動子可為組織/細胞特異性的。啟動子可為原核、真核、真菌、核、粒線體、病毒或植物啟動子。啟動子對藉由載體轉導之細胞類型可為外源或內源的。啟動子可包括例如細菌啟動子；已知的較強啟動子，諸如SV40或誘導性金屬硫蛋白啟動子；或AAV啟動子，諸如AAV P5啟動子。另外，可利用用於靶向基因表現之嵌合調節啟動子。此項技術中所已知的此等調節系統之實例包括基於四環素之調節系統，其利用tet反式活化蛋白質(tTA)，一種含有融合於大腸桿菌之tet抑制劑之VPl 6活化域的嵌合蛋白質；基於EPTG之調節系統；基於CID之調節系統；及基於蛻皮激素之調節系統。其他啟動子包括衍生自肌動蛋白基因、免疫球蛋白基因、巨細胞病毒(CMV) (例如，hCMVie (SEQ ID NO: 4))、腺病毒、牛乳頭瘤病毒之啟動子；腺病毒啟動子，諸如腺病毒主要晚期啟動子、誘導性熱休克啟動子、呼吸道融合病毒、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcomas virus；RSV)等。該啟動子可為AAV血清型中之任一者之啟動子，且可為pl9啟動子或p40啟動子。在某些實施例中，啟動子可為AAV2 P5啟動子或AAV5 P5啟動子或AAV P5啟動子。此外，保持啟動子活性的P5啟動子之小片段可易於藉由標準程序來測定，包括例如在P5啟動子中構築一系列缺失，將缺失連接至報導基因，以及確定報導基因是否經表現，亦即經轉錄及/或經轉譯。潛在啟動子之實例可發現於WO2005017101中，其出於所有預期目的以引用之方式併入本文中。在某些實施例中，AAV啟動子來自AAV血清型2。包含AAV2啟動子P5之例示性P5-Rep-Cap質體展示於圖4B及圖14B中及SEQ ID NO: 34中。

用於Rep-Cap質體之適合質體骨架包括但不限於：pHLP19、pUC18、pUC19及pAAV-RC2，亦參見美國專利第6,001,650號及第6,156,303號中所描述之質體骨架，該兩個美國專利之全部內容出於所有目的以引用之方式併入本文中。在某些實施例中，Rep-Cap質體骨架為pUC19。Ad 輔助質體

在一實施例中，Ad輔助質體包含腺病毒基因，該等腺病毒基因包括(但不限於) Ad2及/或Ad5。在一實施例中，Ad輔助質體包含Ad5基因。因為Ad5對rAAV為高效輔助病毒，故使用Ad5基因序列。眾所周知，腺病毒基因之完全互補不為輔助功能所需的。實際上，更期望不具有完全互補。舉例而言，不能夠進行DNA複製及後期基因合成的腺病毒突變體已經展示為容許AAV複製。Ito等人, (1970) J. Gen. Virol. 9: 243；Ishibashi等人, (1971) Virology 45: 317。因此，Ad輔助質體經設計成具有最小大小，以僅攜載rAAV產生所需之Ad基因且充當減小質體大小的構築體。已顯示，在E1區中有缺陷或具有缺失E4區之腺病毒不能支援AAV複製。因此，E1A及/或E4區有可能直接或間接地為AAV複製所需的。Laughlin等人, (1982) J. Virol. 41: 868；Janik等人, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1925；Carter等人, (1983) Virology 126: 505。其他經表徵Ad突變體包括：E1B (Laughlin等人(1982), 見上文；Janik等人(1981), 見上文；Ostrove等人, (1980) Virology 104: 502)；E2A (Handa等人, (1975) J. Gen. Virol. 29: 239；Strauss等人, (1976) J. Virol. 17: 140；Myers等人, (1980) J. Virol. 35: 665；Jay等人, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：2927；Myers等人, (1981) J. Biol. Chem. 256: 567)；E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, 在I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen編, 1990)中)；E3 (Carter等人(1983), 見上文)；及E4 (Carter等人(1983), 見上文；Carter (1995))。雖然對由在E1B編碼區中具有突變之腺病毒提供的輔助功能之研究已產生衝突結果，但Samulski等人, (1988) J. Virol. 62: 206-210最近報導E1B55k為AAV病毒體產生所需的，而E1B19k則不為所需的。另外，國際公開案WO 97/17458及Matshushita等人, (1998) Gene Therapy 5: 938-945描述編碼各種Ad基因之輔助蛋白質。尤佳的輔助功能質體包含腺病毒VA RNA編碼區、腺病毒E4 ORF6編碼區、腺病毒E2A 72 kD編碼區、腺病毒E1A編碼區及缺乏完整E1B55k編碼區之腺病毒E1B區。此等質體之實例描述於國際公開案第WO 01/83797號中。在此段落中所敍述之各參考物出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。

根據本發明之例示性Ad輔助質體展示於圖5及SEQ ID NO: 14及15，或與SEQ ID NO: 14及15具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之質體中。圖5提供本發明之Ad輔助質體之質體中的元件之次序之實例。

在某些實施例中，Ad輔助質體可包括(而不限於) E2a、E4 (orf6)、VA1 RNA基因及小病毒VP蛋白殼基因單元之腺病毒基因序列。在某些實施例中，Ad輔助質體可包括VA、E4及E2A基因。因為對有多少質體可有效轉染至細胞以用於rAAV產生存在限制，故具有攜載此等Ad基因之減小大小的質體可有助於增加用於轉染的所有三個質體之莫耳含量，因此增加產生更高產量rAAV的機率。

在一實施例中，Ad輔助質體包含E2A；E4 ORF 1、2、3、4及6/7；以及VA (「短Ad輔助質體」)。例示性短Ad輔助質體展示於圖5之上部圖中。此處所描述之短質體用以在轉染之步驟期間減小「質體負載」，使得所有三個質體之總質體複本數可增加以得到更高數目的質體模板以用於rAAV產生之基因表現及複製。減小的質體負載出人意料地適用於較大批次。此可能不為小型研究規模生產中之關鍵參數，但可在按比例擴大時更為關鍵。此例示性短Ad輔助質體為大約12 kb。在另一實施例中，Ad輔助質體包含E2A；E4 ORF 1、2、3、4及6/7；以及VA，以及編碼蛋白酶及纖維之基因及啟動子pVIII (「長Ad輔助質體」)。一例示性長Ad輔助質體展示於圖5之下部圖中。此例示性長Ad輔助質體為大約18 kb。

短構築體與長構築體之間的差異展示於圖5中。三個必需基因元件之定向不同。長型式攜載來自腺病毒基因組之額外元件，該腺病毒基因組可具有影響rAAV產生之功能。短型式含有已知能夠支援rAAV產生之最小基因序列。

在某些實施例中，VA序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 16或48至50或其功能片段或衍生物具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，VA序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 16或48至50，或其功能片段或衍生物。

在某些實施例中，E4序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 17、40、47或55-58或其功能片段或衍生物具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，E4序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 17、40、47或55至58，或其功能片段或衍生物。

在某些實施例中，E2A序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO: 18、39、46或51或其功能片段或衍生物具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。在某些實施例中，E2A序列包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO: 18、39、46或51，或其功能片段或衍生物。

用於Ad輔助質體之適合質體包括(但不限於) pJ241，亦參見美國專利第6,001,650號及第6,156,303號中所描述之質體，該兩個美國專利之全部內容以引用之方式併入本文中。在某些實施例中，Ad輔助質體骨架為pUC57。額外基因

在另一實施例中，所有三個質體含有選擇標記物。選擇標記物之一實例包括(但不限於)陽性選擇標記物，諸如包括(但不限於)以下之抗性基因：G418 (具有neor)、嘌呤黴素(puromycin) (具有puror)、潮黴素B (hygromycin B) (具有hygr)、殺稻瘟菌素S (blasticidin S) (與bsrr)、黴酚酸及6-硫基(鳥嘌呤) (具有gpt)及更昔洛韋(gancyclovir)或1 (2'-去氧-2'-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU) (具有HSV-tk)、健他黴素及/或康黴素(kanamycin) (具有kanr)。在另一實施例中，所有三個質體上之藥物選擇標記物為康黴素。在某些實施例中，康黴素基因包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 19或25，或其功能片段或衍生物。在某些實施例中，健他黴素基因包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 44或72，或其功能片段或衍生物。

在一實施例中，三個質體中之一或多者攜載一或多個報導基因。若干報導基因為此項技術中已知的且一些為可商購的(參見Alam及Cook，見上文)。報導基因可插入尤其適於生物體及分子生物學操縱之質體內。所關注啟動子可插入至選殖位點中以使得報導基因之表現在啟動子之控制下(參見Rosenthal, N., Methods Enzymol. 152: 704-720(1987)；及Shiau, A.及史密斯, J. M., Gene 67: 295-299 (1988))。使用已知方法來將此等質體引入至細胞類型或整個生物體中(見Sambrook等人, Molecular Biology, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；及Nolan, In: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))。報導基因之實例包括(但不限於) P-半乳糖(LacZ)、螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶、長腹水蚤螢光素酶、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、分泌性胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)、強化型藍螢光蛋白(CFP)、綠色螢光蛋白(GFP)、增強型GFP (eGFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、增強型YFP (eYFP)、藍色螢光蛋(BFP)、增強型BFP (eBFP)、來自香菇珊瑚(Discosoma coral) (DsRed)之紅色螢光蛋白，及/或MmGFP (Zemicka-Goetz等人(1997) Development 124：1133-1137)或一般熟習此項技術者所熟悉之其他報導基因。在另一實施例中，三個質體中之一或多者攜載包含eGFP及SEAP二者之報導構築體，其中內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site；IRES)定位於eGFP與SEAP之間。在此實施例中，定位於胞核中之eGFP可用於確定rAAV之載體轉導向性，而在細胞外部分泌之SEAP可容許在活體外環境的培養基中或在活體內環境的個體血流中定量量測轉導效率。基於lacZ 基因經選殖基因破壞，LacZ可使得能夠對所要純系進行基於顏色之選擇。

在一實施例中，各質體包含唯一DNA滴度標籤。在某些實施例中，DNA滴度標籤僅出現於含轉基因質體中。在某些實施例中，DNA滴度標籤出現於所有質體系統中。可包括此唯一DNA滴度標籤以使得能夠例如經由基於qPCR (或ddPCR)之載體基因組滴定分析進行通用載體基因組滴定，以定量所存在載體之量。在某些實施例中，DNA滴度標籤可在表現卡匣外部但在2個ITR之間，以確保其經封裝。舉例而言，DNA滴度標籤可在3' ITR序列之上游。作為另一實例，DNA滴度標籤可在5' ITR序列之下游。在某些實施例中，DNA滴度標籤經構築以使得其不在個體之基因組內以內源性方式出現。舉例而言，可將該序列對照個體之DNA進行比較(例如，經由Blast檢索或其他比對檢索工具)。亦可分析用於運行qPCR分析之引物以確保其不鑑別發現於用於封裝病毒體之寄主細胞中的任何序列。

DNA滴度標籤可具有允許高效qPCR分析且亦在質體中佔據最少量之基因組空間的大小。在某些實施例中，DNA滴度標籤序列長度為約60個核苷酸至約100個核苷酸(例如，SEQ ID NO: 10)，且基於不存在於人類或標準實驗室動物中之序列來設計。在某些實施例中，DNA滴度標籤序列為約60個核苷酸至約80個核苷酸、約65個核苷酸至約95個核苷酸、約70個核苷酸至約90個核苷酸或約75個核苷酸至約85個核苷酸。在某些實施例中，DNA滴度標籤序列為約60個核苷酸至約70個核苷酸、約65個核苷酸至約75個核苷酸、約70個核苷酸至約80個核苷酸、約75個核苷酸至約85個核苷酸、約80個核苷酸至約90個核苷酸、約85個核苷酸至約95個核苷酸或約90個核苷酸至約100個核苷酸。在某些實施例中，DNA滴度標籤序列為至少約60個核苷酸、至少約65個核苷酸、至少約70個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約80個核苷酸、至少約85個核苷酸、至少約90個核苷酸、至少約95個核苷酸或至少約100個核苷酸。在某些實施例中，DNA滴度序列之鏈段長度為100個核苷酸。在某些實施例中，由於總質體大小及封裝限制，100個核苷酸之滴度標籤在快速qPCR分析中可為有利的且允許高效封裝。

編碼DNA滴度標籤的核酸序列之非限制性實例包括SEQ ID NO: 61-70。異源核酸序列

可向個體之一或多個細胞或組織投與藉由本發明之質體製得的重組AAV。因此，本發明包涵遞送可適用於調節個體之細胞或組織的異源核酸序列。舉例而言，rAAV可上調或下調細胞或組織之活性或產物。

在某些實施例中，異源核酸序列可為編碼一或多種肽、多肽或蛋白質的所關注異源基因。在某些實施例中，異源核酸序列可編碼與所關注特異性目標結合的肽、多肽或蛋白質，其可適用於治療或預防個體之疾病。此等異源核酸序列及相關肽、多肽或蛋白質之實例包括(但不限於)基因編碼抗體、MHC分子、T細胞受體、B細胞受體、適體、高親和性多聚體、受體結合配位體或靶向肽。適用於本發明之抗體可涵蓋單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異結合抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分之融合蛋白、人類化抗體，以及包含所需特異性之抗原識別位點的免疫球蛋白分子之任何其他經修飾組態，包括抗體之糖基化變異體、抗體之胺基酸序列變異體及經共價修飾之抗體。抗體可為鼠類、大鼠、人類或任何其他來源(包括嵌合或人類化抗體)。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM (或其亞類)，且該抗體不必為任何特定類別。視其重鏈之恆定域之抗體胺基酸序列而定，可將免疫球蛋白歸為不同類別。存在五種主要類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等中之若干可進一步分為亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白之亞單元結構及三維組態為熟知的。

在某些實施例中，異源核酸序列(例如，所關注異源基因)可編碼可適用於治療或預防個體中之疾病的肽、多肽或蛋白質。舉例而言，異源核酸序列可編碼用於治療疾病Y之蛋白質X。蛋白質X可例如取代突變蛋白質或用以阻斷突變蛋白質。此等核酸序列及相關疾病包括(但不限於)：編碼葡萄糖-6-磷酸酵素的核酸序列，其與1A型肝糖儲存缺乏症相關聯；編碼磷酸烯醇丙酮酸-羧激酶的DNA，其與Pepck缺乏症相關聯；編碼半乳糖-1磷酸酯尿嘧啶轉移酶的DNA，其與半乳糖血症相關聯；編碼苯丙胺酸羥化酶的DNA，其與苯酮尿症相關聯；編碼支鏈α-酮酸去氫酶的DNA，其與楓糖漿尿病相關聯；編碼延胡索醯乙醯乙酸酯水解酶的DNA，其與1型酪胺酸血症相關聯；編碼甲基丙二醯基-CoA變位酶的DNA，其與甲基丙二酸酸血症相關聯；編碼中鏈醯基CoA去氫酶的DNA，其與中鏈乙醯CoA缺乏症相關聯；編碼鳥胺酸轉胺酶的DNA，其與鳥胺酸轉胺酶缺乏症相關聯；編碼精胺琥珀酸合成酶的DNA，其與瓜胺酸血症相關聯；編碼低密度脂蛋白受體蛋白質的DNA，其與家族性高膽固醇血症相關聯；編碼UDP-葡萄糖醛糖基轉移酶的DNA，其與克里格勒-納賈爾病(Crigler-Najjar disease)相關聯；編碼腺苷脫胺酶的DNA，其與嚴重合併性免疫缺失疾病相關聯；編碼次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶的DNA，其與痛風及雷-納二氏症候群(Lesch-Nyan syndrome)相關聯；編碼生物素酶的DNA，其與生物素酶缺乏症相關聯；編碼α-半乳糖-A的DNA，其與法布立病(Fabry disease)相關聯；編碼β-葡糖腦苷脂酶的DNA，其與高雪氏病(Gaucher disease)相關聯；編碼β-葡糖苷酸酶的DNA，其與斯利症候群(Sly syndrome)相關聯；編碼過氧化體膜蛋白質70 kDa的DNA，其與澤爾韋格症候群(Zellweger syndrome)相關聯；編碼膽色素原脫胺酶的DNA，其與急性間歇卟啉症相關聯；編碼α-1抗胰蛋白酶的DNA，其用於治療α-1抗胰蛋白酶缺乏症(肺氣腫)；編碼C1-酯酵素的DNA，其用於治療遺傳性血管性水腫(HAE)；編碼苯丙胺酸羥化酶的DNA，其用於治療苯酮尿症；編碼酸性α-葡糖苷酶的DNA，其用於治療患有龐培氏病(Pompe disease)；編碼ATP7B的DNA，其用於治療威爾森氏病(Wilson's disease)；編碼α-L-艾杜糖苷的DNA，其用於治療I型黏多糖病(MPSI)；編碼艾杜糖醛硫酸酯酶的DNA，其用於治療II型黏多糖病(MPSII)；編碼乙醯肝素硫酸醯胺酶的DNA，其用於治療IIIA型黏多糖病(MPSIIIA)；編碼N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶的DNA，其用於治療IIIB型黏多糖病(MPSIIIB)；編碼乙醯肝素-α-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶的DNA，其用於治療IIIC型黏多糖病(MPSIIIC)；編碼N-乙醯基葡糖胺6-硫酸酯酶之DNA，其用於治療IIID型黏多糖病(MPSIIID)；編碼半乳糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶的DNA，其用於治療IVA型黏多糖病(MPSIVA)；編碼β-半乳糖苷酶的DNA，其用於治療IVB型黏多糖病(MPSIVB)；編碼N-乙醯基半乳胺糖-4-硫酸酯酶的DNA，其用於治療VI型黏多糖病(MPSVI)；編碼β-葡糖苷酸酶的DNA，其用於治療VII型黏多糖病(MPSVII)；編碼玻尿酸酶的DNA，其用於治療IX型黏多糖病(MPSIX)；編碼紅血球生成素的DNA，其用於治療因地中海貧血症或腎衰竭所致之貧血；編碼血管內皮生長因子的DNA、編碼血管生成素-1的DNA及編碼纖維母細胞生長因子的DNA，其用於治療局部缺血病；編碼凝血調節蛋白及組織因子路徑抑制劑的DNA，其用於治療如例如動脈粥樣硬化、血栓或栓塞中所見之血管閉塞；編碼芳族胺基酸去羧酶(AADC)的DNA及編碼酪胺酸羥化酶(TH)的DNA，其用於治療帕金森氏病(Parkinson's disease)；編碼β腎上腺素激導性受體的DNA、編碼磷醯胺之反義鏈的DNA或編碼磷醯胺之突變體形式的DNA、編碼肌(內)細胞質網腺苷三磷酸酶-2 (SERCA2)的DNA及編碼賁門腺苷酸環化酶的DNA，其用於治療充血性心臟衰竭；編碼腫瘤抑制基因(諸如p53)的DNA，其用於治療各種癌症；編碼細胞介素(諸如各種介白素中之一者)的DNA，其用於治療炎症及免疫病症及癌症；編碼肌縮蛋白或微小肌營養不良蛋白的DNA及編碼肌營養相關蛋白(utrophin)或微小肌營養相關蛋白(miniutrophin)的DNA，其用於治療肌肉萎縮症；編碼ABCA4的DNA，其用於治療斯特格特氏病(Stargardt's disease)；以及編碼胰島素的DNA，其用於治療糖尿病。

在某些實施例中，異源核酸序列(例如，所關注異源基因)可編碼肽、多肽或蛋白質，該肽、多肽或蛋白質編碼凝血蛋白，其可將該等蛋白質遞送至患有血液病症(例如，血友病)的個體之細胞。此等核酸及相關聯肽、多肽或蛋白質之實例包括(但不限於)編碼個體之因子IX以用於治療B型血友病、編碼個體之因子VIII以用於治療A型血友病、編碼因子VII以用於治療因子VII缺乏症、編碼因子X以用於治療因子X缺乏症、編碼因子XI以用於治療因子XI缺乏症、編碼因子XIII以用於治療因子XIII缺乏症及編碼蛋白C以用於治療蛋白質C缺乏症的DNA。

本發明亦包括以下之表現：經工程改造之人工DNA結合域肽、轉錄活化子或轉錄抑制子及核酸酶，其可與宿主細胞基因組相互作用以影響基因性及/或後天性疾病之上調或下調基因表現量。

本發明亦包括異源核酸序列之表現，該等異源核酸序列包括(但不限於)：反義鏈、siRNA、shRNA、miRNA、EGS、gRNA、sgRNA、核糖核酸酶或適體，其可與可改變基因性及/或後天性疾病的蛋白質之基因表現或活性的細胞DNA、RNA及/或蛋白質相互作用。

本發明亦包括用於細胞療法的中間物及/或關鍵原材料之表現，該中間物及/或關鍵原料包括(但不限於)待用於感染細胞以產生經基因工程改造之細胞療法材料或藥品的rAAV。

本發明亦包括異源核酸序列，其為用於修飾細胞中之所關注(亦即，目標)基因組基因座的基因編輯分子。此等修飾包括(但不限於)基因中之目標基因座處的基因序列之破壞、缺失、修復、突變、添加、更改或修飾。基因編輯分子之實例包括(但不限於)核酸內切酶(諸如鋅指核酸酶(zinc finger nuclease；ZFn))、轉錄活化子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease；TALEN)、巨核酸酶、限制性核酸內切酶、重組酶及成簇規律間隔短回文重複序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat；CRISPR)/CRISPR-相關(Cas)蛋白質。遞送 rAAV

可藉由向有需要之個體投與藉由本發明之質體製得的有效量之rAAV而將本文中所描述之重組AAV以治療上適用之濃度用於治療及/或預防所關注疾病。用藉由本發明之質體製得的rAAV治療的個體亦可投與有具有已知療效的其他治療劑或裝置以用於治療或預防疾病。

向個體遞送rAAV可藉由肌肉內注射或藉由投與至個體之血流中來進行。投與至血流中可藉由藉助於隔離肢體灌注(外科技術中熟知之技術)向靜脈、動脈或任何其他血管管道中將突變體病毒體注射至血流來進行，該方法基本上使得技術者能夠在投與rAAV之前將肢體與全身循環隔離。此外，對於某些病況，可能需要將突變體病毒體遞送至個體之CNS。「CNS」意謂脊椎動物之大腦及脊髓之所有細胞及組織。因此，該術語包括(但不限於)神經元細胞、膠細胞、星形膠質細胞、腦脊髓液(CSF)、間隙空間、骨、軟骨、腦內室、顱內、大池注射、鞘內、頸內動脈、鼻內及其類似者。可藉由使用針頭、導管或相關裝置，使用此項技術中已知之神經外科技術(諸如藉由立體定向注射)注射至例如腦室區中以及注射至紋狀體(例如，紋狀體之尾核或殼核)、脊髓及肌神經結或小腦小葉而將活體外轉導之rAAV或細胞直接遞送至CNS或大腦。參見例如Stein等人, J Virol 73:3424-3429, 1999；Davidson等人, PNAS 97:3428-3432, 2000；Davidson等人, Nat. Genet. 3:219-223, 1993；及Alisky及Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000，該等文獻出於所有目的各自全文併入本文中。對於投與至眼睛，方法可包括視網膜下、玻璃體內、經鞏膜或顱內。 表3 用於本發明之質體的例示性序列

序列ID	描述
SEQ ID NO: 1	單股ITR轉基因質體
SEQ ID NO: 2	5' ITR
SEQ ID NO: 3	3' ITR
SEQ ID NO: 4	hCMVie
SEQ ID NO: 5	eGFP
SEQ ID NO: 6	IRES
SEQ ID NO: 7	SEAP
SEQ ID NO: 8	SV40 polyA
SEQ ID NO: 9	GAPDH填充序列
SEQ ID NO: 10	DNA滴度標籤
SEQ ID NO: 11	Rep2/5
SEQ ID NO: 12	Rep2
SEQ ID NO: 13	Cap9
SEQ ID NO: 14	完整短ad輔助質體
SEQ ID NO: 15	完整長Ad輔助質體
SEQ ID NO: 16	VA基因
SEQ ID NO: 17	E4基因
SEQ ID NO: 18	E2A
SEQ ID NO: 19	康黴素抗性基因(互補)
SEQ ID NO: 20	pUC起點(互補)
SEQ ID NO: 21	P_Amp (互補)
SEQ ID NO: 22	Term_bla (互補)
SEQ ID NO: 23	Rpo_C (互補)
SEQ ID NO: 24	pRep2/5-Cap5質體
SEQ ID NO: 25	康黴素抗性基因(互補)
SEQ ID NO: 26	複製起點；RNA酶H裂解點
SEQ ID NO: 27	lac啟動子(互補)
SEQ ID NO: 28	Rep5 BamHI片段(互補)
SEQ ID NO: 29	Cap5/VP1片段(互補)
SEQ ID NO: 30	Rep2之起始位點(互補)
SEQ ID NO: 31	pRep2-Cap2質體
SEQ ID NO: 32	Cap2
SEQ ID NO: 33	pUC19-Kan-Rep2Cap2質體
SEQ ID NO: 34	AAV2/P5啟動子(互補)
SEQ ID NO: 35	pRep2-Cap8質體
SEQ ID NO: 36	Cap8基因(互補)
SEQ ID NO: 37	pRep2-Cap9質體
SEQ ID NO: 38	lac啟動子
SEQ ID NO: 39	E2A基因(互補)
SEQ ID NO: 40	E4基因(互補)
SEQ ID NO: 41	pUC19-Kan-Rep2Cap9質體
SEQ ID NO: 42	自互補ITR轉基因質體
SEQ ID NO: 43	截斷之5' ITR
SEQ ID NO: 44	健他黴素抗性基因(互補)
SEQ ID NO: 45	pHelper質體
SEQ ID NO: 46	E2A互補
SEQ ID NO: 47	E4 (互補)
SEQ ID NO: 48	VA (互補)
SEQ ID NO: 49	VA2 RNA (互補)
SEQ ID NO: 50	VA1 RNA (互補)
SEQ ID NO: 51	E2A-BP
SEQ ID NO: 52	L4 100K
SEQ ID NO: 53	hAdV2，33-100kD
SEQ ID NO: 54	不完整L4 pVIII
SEQ ID NO: 55	E4 orf 6/7 (互補)
SEQ ID NO: 56	E4 orf 4 (互補)
SEQ ID NO: 57	E4 orf 3
SEQ ID NO: 58	E4 orf 2 (互補)
SEQ ID NO: 59	pAAV-RC
SEQ ID NO: 60	pUC19-Kan-Rep2Cap8質體
SEQ ID NO: 61	DNA滴度標籤
SEQ ID NO: 62	DNA滴度標籤
SEQ ID NO: 63	DNA滴度標籤
SEQ ID NO: 64	DNA滴度標籤
SEQ ID NO: 65	DNA滴度標籤
SEQ ID NO: 66	DNA滴度標籤
SEQ ID NO: 67	DNA滴度標籤
SEQ ID NO: 68	DNA 滴度標籤
SEQ ID NO: 69	DNA滴度標籤
SEQ ID NO: 70	DNA滴度標籤
SEQ ID NO: 71	單股ITS轉基因質體
SEQ ID NO: 72	失活健他黴素抗性基因(互補)
SEQ ID NO: 73	自互補ITS轉基因質體
SEQ ID NO: 74	T2A
SEQ ID NO: 75	P2A
SEQ ID NO: 76	E2A
SEQ ID NO: 77	F2A

實例

亦藉助於以下實例來描述及論證本發明。然而，說明書中任何位置之此等及其他實例之使用僅為說明性的，且決不限制本發明或任何例示性術語之範疇及含義。同樣，本發明不限於此處所描述之任何較佳實施例。實際上，本發明之許多修改及變化在閱讀本說明書時可對熟習此項技術者顯而易見，且可在不背離本發明之精神或範疇的情況下進行此等變化。因此，本發明僅受所附申請專利範圍之項目以及彼等申請專利範圍所授權之等效物的完整範疇限制。實例 1 ： Cap 蛋白質之 活體外表現

此實例研究相較於來自攜載Rep2及Cap2基因(Agilent)之對照基於pAAV RC2之質體的相同蛋白殼蛋白質之表現量，來自基於pUC19之質體的AAV293 (Agilent)細胞中蛋白殼蛋白質之活體外表現(圖4A)。

以Rep2Cap2-pAAV-RC (亦即，如圖4A中所示之pAAV-RC2)開始，在pAAV-RC背景中形成具有不同Rep及Cap基因之四個質體之第一集合。pAAV-RC2用於產生Rep2/5Cap5-pAAV-RC、Rep2Cap8-pAAV-RC及Rep2Cap9-pAAV-RC (圖4A)。

在pUC19-Kan背景中形成四個質體之第二集合，其中相同複製及蛋白殼蛋白質作為第一集合。因此，Rep2Cap2-pUC19-Kan、Rep2/5Cap5-pUC19-Kan、Rep2Cap8-pUC19-Kan及Rep2Cap9-pUC19-Kan (圖4A及圖14A)。

對於實驗，以1:1之比率將8個質體中之每一者與Ad輔助質體pHelper (Agilent) (例如，SEQ ID NO: 45)單獨轉染。

經由西方墨點法使用單株B1抗體將來自基於pUC19-Kan之質體的Cap蛋白質之表現量與來自基於pAAV-RC2之質體的相同Cap蛋白質之表現量進行比較(圖6)。陽性對照AAV2參考標準材料(reference standard material；RSM)及AAV8 RSM為含有AAV2及AAV8 Cap蛋白質之參考標準材料，而陰性對照為來自不具有任何Cap攜帶質體之HEK293的細胞裂解物。對於基於pUC19之質體及基於pAAV-RC2之質體兩者，蛋白殼蛋白質之表現量為AAV5＞AAV8＞AAV9＞AAV2。

圖7為使用減少之樣品進行之西方墨點分析，以更清楚地特異性分析Cap蛋白質VP1-VP3之量。

隨後，將AAV2 P5啟動子添加至Rep2Cap2 pUC19-Kan、Rep2Cap8 pUC19-Kan及Rep2Cap9 pUC19-Kan質體(例如，圖4B及圖14B)。圖8展示在與上文所描述相同的條件下測試的使用P5啟動子表現的來自AAV血清型2、8及9的Cap蛋白質相比於不具有P5啟動子之彼等蛋白質的表現量。已發現，P5啟動子產生較高水準之蛋白殼蛋白質表現。以1:1之比率投與含轉基因質體及Ad輔助質體。實例 2 ：短及長 Ad 輔助質體之功能測試

此實例之目的為測試短Ad輔助質體及長Ad輔助質體對比市售pHelper之功能。各質體經單獨測試以確保在以組合方式使用其之前，每一者均均起作用。

圖9展示在HEK293宿主細胞系統中使用短Ad輔助質體(SEQ ID NO: 14)之陽性測試結果。藉由將短輔助質體與攜載GFP作為ITR之間的轉基因的含pTRUF11轉基因質體及攜載AAV Rep2及Cap2基因之Agilent RC2質體共轉染來測試短Ad輔助質體(SEQ ID NO: 14)。陰性對照由以下組成：1)市售Ad輔助質體(pHelper)及Agilent質體RC2，及2)pHelper及pTRUF11；陽性對照由以下組成：pHelper、pTRUF11及Agilent RC2質體。在48小時之後，HEK293細胞經Triton X-100裂解且用苯甲酸酶核酸酶處理以減少DNA及RNA。將含有AAV粒子之細胞裂解物在經歷qPCR之前用DNA酶I處理且連續稀釋，以測定每毫升細胞裂解物之病毒基因組複本數。圖9展示qPCR分析之結果，其中柱1及2表示陰性對照，柱3展示陽性對照，且柱4展示在將短Ad輔助質體與2個其他質體一起使用以產生rAAV時獲得的病毒基因組複本數。

進行類似實驗以測試根據本發明之長Ad輔助質體(SEQ ID NO: 15) (圖10)。圖10展示如藉由qPCR所測定之以下各者的每毫升細胞裂解物之病毒基因組複本數：陰性對照(柱1)、陽性對照(柱2)、短Ad輔助質體(SEQ ID NO: 14)+Rep-Cap攜帶質體+ITR-GFP攜帶質體(柱3)及長Ad輔助質體+Rep-Cap攜帶質體+ITR-GFP攜帶質體(柱4)。因此，長Ad輔助質體亦引起AAV之產生。實例 3 ：使用三質體系統之 rAAV 病毒 體產生

測試根據本發明之單股(ss)及自互補(sc)-ITR攜帶質體形成rAAV病毒體的能力。在此實驗中，將質體共轉染至HEK293細胞(Agilent)中。對於各轉染，以1:1:1莫耳比使用Ad輔助質體、Rep-Cap質體及含轉基因質體，且每10 cm板使用10 ug之總DNA。陰性對照為可商購的Ad輔助質體(Agilent)及可商購的Rep-Cap攜帶質體(Agilent)，而陽性對照使用不同ITR攜帶質體(ATCC)。圖11之上部圖展示ss-ITR攜帶質體之每毫升細胞裂解物之病毒基因組複本數(如上藉由qPCR量測)，而下部圖展示sc-ITR攜帶質體之每毫升細胞裂解物的病毒基因組複本數。在兩個圖中，柱1展示陰性對照之複本數，柱2表示陽性對照，且柱3表示根據本發明之質體。

隨後，將根據本發明之三個質體共轉染至HEK293細胞中(再次，1:1:1比率)以用於qPCR分析。陰性對照(圖12之柱1)為可商購的Ad輔助質體及ITR攜帶質體。陽性對照(圖12之柱2)包括可商購的Rep-Cap攜帶質體。柱3-6對應於來自經相同可商購的Ad輔助質體及ITR攜帶質體與編碼來自AAV血清型2、5、8或9 (在圖之頂部上指出)之Rep及Cap蛋白質的基於pUC19之質體轉染之細胞的AAV基因組複本數。圖12之柱7-10對應於來自經根據本發明的Ad輔助質體、基於pUC19之Rep-Cap攜帶質體及ITR攜帶質體轉染之細胞的AAV基因組複本數。圖12之柱11為對應於來自經根據本發明的Ad輔助質體及ss-ITR質體及可商購的Rep-Cap攜帶質體轉染之細胞的AAV基因組複本數之另一陽性對照。實例 4 ： rAAV 之純化及產生

用包含根據本發明之三個質體的質體系統共轉染HEK293細胞。使細胞化學裂解，且收集細胞集結粒及培養基。細胞裂解物經澄清提純且用核酸酶處理。使經澄清裂解物在適當親和柱上運行(例如，對於包含AAV8蛋白殼之質體系統，親和柱為AVB；對於包含AAV9之質體系統，親和柱為AAV9-POROS CaptureSelect)。在緩衝液交換之後，自管柱溶離rAAV。藉助於實例且非限制，rAAV接著藉由qPCR特徵化，以測定病毒基因組複本數(參見圖9至圖13、圖16)。可藉由銀染色以測定純度及一致性，藉由鱟變形細胞裂解物(Limulus amebocyte lysate；LAL)分析以量測內毒素活性及微生物污染，且藉由活體外轉導分析以測定生物活性來進一步評估rAAV。其他特徵化分析包括用以測試病毒基因組之大小及整合性之鹼性電泳、用以檢查蛋白殼之ELISA、用以確定rAAV粒子之感染力的感染性中心分析以及用以觀測rAAV粒子之電子顯微法。亦可藉由使用適當抗體來進行用於特異性蛋白質之西方墨點法(參見圖6至圖8)。實例 5 ：使用標籤滴定載體基因組

雖然諸如polyA序列之序列可用於qPCR定量，但其使用此等序列進行通用滴定並不理想。舉例而言，各轉基因可使用不同polyA序列(例如，SV40、bGH polyA等)，由此阻止將其用於定量所有轉基因平台上之載體。因此，針對其普遍地定量任何轉基因卡匣之能力來測試在轉基因卡匣外部之單獨DNA滴度標籤(亦即不作為轉基因mRNA轉錄物之部分轉錄)。

在3' ITR序列之上游包括100個核苷酸DNA滴度標籤。此相同滴度標籤可用於任何含轉基因質體中以用於rAAV產生以允許經由qPCR技術進行通用載體基因組滴定，其可用作任何項目之單一參考標準。針對相同批次之AAV使用SV40 polyA或100個核苷酸DNA滴度標籤作為目標序列比較qPCR滴定結果。

使用作為單股(SEQ ID NO: 1)或自互補(SEQ ID NO: 42)含轉基因質體之含轉基因質體來產生兩種不同病毒載體：rAAV8-ssITR (SEQ ID NO: 1)及rAAV8-scITR (SEQ ID NO: 42)。使用兩個不同目標序列來獲得類似qPCR滴度，從而指示100個核苷酸DNA滴度標籤與SV40 polyA同等良好的工作，該SV40 polyA已廣泛用於基於qPCR之載體滴定的領域中(圖13A (rAAV8-ssITR)及圖13B (rAAV8-scITR))。實例 6 ：使用標籤滴定載體基因組

為進一步確認DNA滴度標籤之效用，在兩個額外病毒載體：rAAV9-ssITR (SEQ ID NO: 71)及rAAV9-scITR (SEQ ID NO: 73)中之3' ITR序列之上游包括用於實例5中之相同100個核苷酸DNA滴度標籤。

雖然上文揭示若干可能的實施例，但本發明之實施例不如此受限。此等例示性實施例並不意欲窮盡性或不必要地限制本發明之範疇，而經選擇及描述以便解釋本發明之原理以使得熟習此項技術者可實踐本發明。實際上，根據前述描述，除本文中所描述之彼等修改以外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言亦將變得顯而易見。此等修改意欲屬於所附申請專利範圍之範疇內。此外，本文中所採用之術語僅出於描述例示性實施例而使用，且因為本發明之各種實施例之範疇將僅受所附申請專利範圍及其等效物限制，故該術語不意欲為限制性的。因此，本發明之範疇由以下申請專利範圍而非前述描述及上文所論述之實施例來指示，且在其等效物之意義及範圍內出現之所有變化均意欲包涵於其中。

本文中所引用之所有專利、申請案、公開案、測試方法、文獻及其他材料均以全文引用之方式併入本文中，如同在本說明書中實體存在那般。

圖1描繪根據本發明之一些實施例的用於產生rAAV之例示性三質體系統。

圖2描繪根據本發明之一些實施例的併入eGFP及SEAP作為轉基因之用於rAAV產生的例示性含轉基因質體。

圖3A至圖3B：展示用於單股(ss) (圖3A)及自互補(sc) rAAV (圖3B)產生的含轉基因質體之例示性基因構築體。

圖4A至圖4B：圖4A描繪根據本發明之一些實施例的併入不同AAV Rep及Cap基因的例示性AAV Rep-Cap質體。圖4B描繪併入來自AAV血清型2之啟動子的例示性AAV Rep-Cap質體。

圖5描繪短(上部圖)及長(下部圖)實施例中之例示性Ad輔助質體。

圖6為展示來自根據本發明之質體的不同AAV血清型的Cap蛋白質之表現量的西方墨點。

圖7為展示來自根據本發明之質體的不同AAV血清型的Cap蛋白質之表現量的西方墨點。將單株B1純系用於墨點分析。

圖8為展示來自根據本發明之質體的不同AAV血清型的Cap蛋白質之AAV P5驅動表現量的西方墨點。-：不具有P5啟動子之質體構築體；+：具有P5啟動子之質體構築體。將單株B1純系用於墨點分析。

圖9展示使用根據本發明之短Ad輔助質體的病毒基因組複本數之qPCR分析之結果。1：陰性對照1 (pHelper+pAAV-RC2 (Agilent))；2：陰性對照2 (pHelper+pTRUF11)；3：陽性對照(pHelper+pAAV-RC2+pTRUF11)；4：短Ad輔助測試(短輔助(SEQ ID NO: 14)+pAAV-RC2+pTRUF11)。

圖10展示使用根據本發明之長Ad輔助質體的病毒基因組複本數之qPCR分析之結果。1：陰性對照1 (pTRUF11+pAAV-RC2 (Rep2Cap2(Agilent))；2：陽性對照2 (pHelper+pAAV-RC2+pTRUF11)；3：短Ad輔助測試(短輔助(SEQ ID NO: 14)+pUC19-Rep2Cap8+pITRss (SEQ ID NO: 1))；4：長Ad輔助測試(長輔助(SEQ ID NO: 15)+pUC19-Rep2Cap8+pITRss (SEQ ID NO: 1))。

圖11展示使用用於rAAV產生之對應含轉基因質體產生的含有單股(上部圖)或自互補(下部圖) DNA基因組之rAAV的每毫升細胞裂解物之病毒基因組複本數。對於上部圖：1：陰性對照(pHelper+AAV-RC2)；2：陽性對照(pHelper+pAAV-RC2+pTRUF11)；3：ssITR (pHelper+pAAV-RC2+ssITR) (SEQ ID NO: 1)。對於下部圖：1：陰性對照(pHelper+AAV-RC2)；2：陽性對照(pHelper+pAAV-RC2+pTRUF11)；3：scITR (pHelper+pAAV-RC2+scITR (SEQ ID NO: 42)。

圖12展示根據本發明之三質體系統的多個蛋白殼血清型之每毫升細胞裂解物之病毒基因組複本數，以及陽性及陰性對照。1：陰性對照(pHelper+pTRUF11)；2：陽性對照(pHelper+pTRUF11+pAAV-RC2)；3：pHelper+pTRUF11+pUC19-P5-Rep2Cap2 (SEQ ID NO: 31)；4：pHelper+pTRUF11+pUC19-Rep2/5Cap5 (SEQ ID NO: 24)；5：pHelper+pTRUF11+pUC19-P5-Rep2Cap8 (SEQ ID NO: 35)；6：pHelper+pTRUF11+pUC19-P5-Rep2Cap9 (SEQ ID NO: 37)；7：短輔助(SEQ ID NO: 14)+ssITR (SEQ ID NO: 1)+pUC19-P5-Rep2Cap2 (SEQ ID NO: 31)；8：短輔助(SEQ ID NO: 14)+ssITR (SEQ ID NO: 1)+pUC19-Rep2/5Cap5 (SEQ ID NO: 24)；9：短輔助(SEQ ID NO: 14)+ssITR (SEQ ID NO: 1)+pUC19-P5-Rep2Cap8 (SEQ ID NO: 35)；10：短輔助(SEQ ID NO: 14)+ssITR (SEQ ID NO: 1)+pUC19-P5-Rep2Cap9 (SEQ ID NO: 37)；11：短輔助(SEQ ID NO: 14)+ssITR (SEQ ID NO: 1)+pAAV-RC2。

圖13A至圖13B展示使用用於qPCR分析之SV40 polyA及長度為100核苷酸的DNA滴度標籤兩者的單股ITR (ssITR)轉基因質體(圖13A)及自互補ITR (scITR)質體的每毫升裂解物之病毒基因組複本數。

圖14A至圖14B：圖14A描繪根據本發明之一些實施例的併入不同AAV Rep及Cap基因的例示性AAV Rep-Cap質體。圖14B描繪根據本發明之一些實施例的併入不同AAVrep及cap基因且併入P5啟動子的例示性AAV Rep-Cap質體。

圖15：展示用於單股(ss) (圖15A)及自互補(sc) rAAV (圖15B)產生的含轉基因質體之例示性基因構築體。兩個經修飾質體含有具有較高可顯影性之經改良質體骨架。

圖16：展示使用用於qPCR分析之長度為100核苷酸的DNA滴度標籤的經修飾單股ITR (ssITR)轉基因質體(圖16A)及經修飾自互補ITR (scITR)質體的每毫升裂解物之病毒基因組複本數。

Claims (52)

1. 一種用於重組腺相關病毒載體(rAAV)產生之質體系統，其包含： (i)    含轉基因質體，其包含由5'及3' AAV反向末端重複序列(ITR)側接的至少一種異源核酸及在該等ITR外部之填充序列； (ii)   質體，其包含AAV複製(Rep)及蛋白殼(Cap)基因序列；及 (iii)  腺病毒(Ad)輔助質體。
2. 如請求項1之質體系統，其中該填充序列增加含轉基因質體骨架之大小，使得該含轉基因質體不封裝至rAAV蛋白殼中。
3. 如請求項1或2之質體系統，其中該含轉基因質體之該骨架大於野生型AAV基因組。
4. 如請求項1至3中任一項之質體系統，其中該填充序列不含增強子、啟動子、剪接調節子、非編碼RNA、反義序列、編碼序列，或其任何組合。
5. 如請求項4之質體系統，其中該填充序列不含增強子、啟動子、剪接調節子、非編碼RNA、反義序列及編碼序列。
6. 如請求項1至5中任一項之質體系統，其中該填充序列包含發現於人類基因組中之惰性內含子DNA序列。
7. 如請求項1至6中任一項之質體系統，其中該填充序列包含長度在1000與5000個核苷酸之間的核酸序列，或長度在1000與2000個核苷酸之間的核酸序列。
8. 如請求項1至7中任一項之質體系統，其中該填充序列包含GAPDH內含子2、其片段或突變體。
9. 如請求項1至8中任一項之質體系統，其中該填充序列包含與SEQ ID NO: 9具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。
10. 如請求項1至9中任一項之質體系統，其中該填充序列由與SEQ ID NO: 9具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸組成。
11. 如請求項1至8中任一項之質體系統，其中該填充序列包含SEQ ID NO: 9或其片段。
12. 如請求項1至8中任一項之質體系統，其中該填充序列由SEQ ID NO: 9或其片段組成。
13. 如請求項1至12中任一項之質體系統，其中該含轉基因質體包含具有與圖3A呈相同次序之結構的質體，其中eGFP及SEAP轉基因可經該至少一種異源核酸置換。
14. 如請求項1至12中任一項之質體系統，其中該含轉基因質體包含具有與圖3B呈相同次序之結構的質體，其中該eGFP轉基因可經該至少一種異源核酸置換。
15. 如請求項1至12中任一項之質體系統，其中該含轉基因質體包含在以下之5'至3'方向上的核酸序列：SEQ ID NO: 2、4、至少一種異源核酸、8、3及該填充序列，其中各核酸序列可經以下取代或編碼以下：對應功能片段或其衍生物，或與其具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列。
16. 如請求項1至15中任一項之質體系統，其中該含轉基因質體進一步包含在表現卡匣外部但在5' ITR與3' ITR之間的DNA滴度標籤。
17. 如請求項1至15中任一項之質體系統，其中該含轉基因質體進一步包含以下處的DNA滴度標籤：i)該3' ITR之上游及polyA序列之下游；或ii)該3' ITR之上游及該至少一種異源核酸序列之下游；iii)或該5' ITR之下游及至少一種異源核酸序列之上游；或iv)該5' ITR之下游及該至少一種異源核酸序列之啟動子之上游；或v)該5' ITR之下游及該3' ITR之上游。
18. 如請求項1至15中任一項之質體系統，其中該含轉基因質體進一步包含以下處的DNA滴度標籤：i) SEQ ID NO: 3之上游及SEQ ID NO: 8之下游；或ii)SEQ ID NO: 3之上游及該至少一種異源核酸序列之下游；iii)或SEQ ID NO: 2之下游及該至少一種異源核酸序列之上游；或iv) SEQ ID NO: 2之下游及SEQ ID NO: 4之上游；或v) SEQ ID NO: 2之下游及SEQ ID NO: 3之上游。
19. 如請求項1至12中任一項之質體系統，其中該含轉基因質體包含在以下之5'至3'方向上的核酸序列：SEQ ID NO: 43、4、至少一種異源核酸序列、8、3及該填充序列，其中各核酸序列可經以下取代或編碼以下：對應功能片段或其衍生物，或與其具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列。
20. 如請求項19之質體系統，其中該含轉基因質體進一步包含在該表現卡匣外部但在該5' ITR與該3' ITR之間的DNA滴度標籤。
21. 如請求項19或請求項20之質體系統，其中該含轉基因質體進一步包含以下處的DNA滴度標籤：i)該3' ITR之上游及polyA序列之下游；或ii)該3' ITR之上游及該至少一種異源核酸序列之下游；iii)或該5' ITR之下游及該至少一種異源核酸序列之上游；或iv)該5' ITR之下游及該至少一種異源核酸序列之啟動子之上游；或v)該5' ITR之下游及該3' ITR之上游。
22. 如請求項19至20中任一項之質體系統，其中該含轉基因質體進一步包含以下處的DNA滴度標籤：i) SEQ ID NO: 3之上游及SEQ ID NO: 8之下游；或ii)SEQ ID NO: 3之上游及該至少一種異源核酸序列之下游；iii)或SEQ ID NO: 43之下游及該至少一種異源核酸序列之上游；或iv) SEQ ID NO: 43之下游及SEQ ID NO: 4之上游；或v) SEQ ID NO: 43之下游及SEQ ID NO: 3之上游。
23. 如請求項1至22中任一項之質體系統，其中該AAV Rep基因序列來自AAV血清型2、5、8、9，或其雜合體。
24. 如請求項1至23中任一項之質體系統，其中該AAV Cap基因序列來自AAV血清型2、5、8、9，或其雜合體。
25. 如請求項1至24中任一項之質體系統，其中包含該Rep及Cap基因序列之該質體進一步包含啟動子。
26. 如請求項25之質體系統，其中該啟動子為AAV啟動子。
27. 如請求項26之質體系統，其中該啟動子為AAV P5啟動子。
28. 如請求項1至27中任一項之質體系統，其中該Ad輔助質體包含選自以下之腺病毒基因中之一或多者：E1a、E1b、E2a、E4orf6或VA RNA。
29. 如請求項28之質體系統，其中該Ad輔助質體包含在以下之5'至3'方向上的核酸序列：SEQ ID NO: 18、17、16及20，其中各核酸序列可經以下取代：對應功能片段或其衍生物，或與其具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列。
30. 如請求項28之質體系統，其中該Ad輔助質體包含在以下之5'至3'方向上的核酸序列：SEQ ID NO: 21、16、39、40、22、23及20，其中各核酸序列可經以下取代或編碼以下：對應功能片段或其衍生物，或與其具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列。
31. 如請求項1至28中任一項之質體系統，其中該Ad輔助質體包含與圖5之任一構築體呈相同次序的結構。
32. 如請求項1至28中任一項之質體系統，其中該Ad輔助質體包含與SEQ ID NO: 14具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。
33. 如請求項1至28中任一項之質體系統，其中該Ad輔助質體包含與SEQ ID NO: 15具有至少約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致性之核酸。
34. 如請求項1至33中任一項之質體系統，其中該異源核酸序列為編碼肽、多肽或蛋白質的所關注異源基因。
35. 如請求項34之質體系統，其中該肽、該多肽或該蛋白質為酶、抗體、MHC分子、T細胞受體、B細胞受體、適體、高親和性多聚體、受體結合配位體、靶向肽、治療劑或基因編輯分子。
36. 如請求項1至35中任一項之質體系統，其中該異源核酸為核酸序列，諸如反義鏈、siRNA、shRNA、miRNA、EGS、gRNA、sgRNA、核糖核酸酶或適體。
37. 一種宿主細胞，其包含如請求項1至36中任一項之質體系統。
38. 一種重組腺相關病毒載體(rAAV)，其藉由如請求項37之宿主細胞產生。
39. 一種允許通用載體滴定之DNA滴度標籤，該DNA滴度標籤包含在含轉基因質體內之異源核酸序列之核酸序列上游或下游的長度為約60個核苷酸至約100個核苷酸的核酸標記序列，其中該核酸標籤序列可用於至少兩種不同的含轉基因質體中以允許在至少兩種不同類型之AAV載體之間進行通用載體基因組滴定。
40. 如請求項39之DNA滴度標籤，其中該核酸標籤序列長度為約100個核苷酸。
41. 如請求項39或請求項40之DNA滴度標籤，其中該核酸標籤序列在該含轉基因質體之3' ITR序列上游，而非在該含轉基因質體之表現卡匣內。
42. 如請求項39或請求項40之DNA滴度標籤，其中該核酸標籤序列在該含轉基因質體之5' ITR序列下游，而非在該含轉基因質體之表現卡匣內。
43. 如請求項39至42中任一項之DNA滴度標籤，其中該DNA滴度標籤包含SEQ ID NO: 61-70之核酸序列中之任一者。
44. 一種用於產生重組腺相關病毒載體(rAAV)之方法，其包含用如請求項1至36中任一項之質體系統轉導細胞，以及分離該rAAV。
45. 一種重組腺相關病毒載體(rAAV)，其藉由如請求項44之方法產生。
46. 一種組合物，其包含如請求項1至36中任一項之質體系統。
47. 一種醫藥組合物，其包含如請求項38或請求項45之rAAV。
48. 一種如請求項38或請求項45之rAAV之用途，其用於製造用於將核酸序列遞送或轉移至個體之細胞中的藥劑。
49. 如請求項48之用途，其中該個體之細胞在培養物中或存在於該個體中。
50. 一種如請求項38或請求項45之rAAV之用途，其用於製造用於治療或預防個體中之疾病或病症的藥劑。
51. 一種轉導宿主細胞之活體外方法，其包含使該宿主細胞與如請求項38或請求項45之rAAV接觸。
52. 一種用於將核酸序列遞送或轉移至個體之細胞中之活體外方法，其包含使如請求項38或請求項45之rAAV與培養物中之該個體之細胞接觸，由此將該核酸序列遞送至該細胞中。

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