JP2016502850A - ヒアルロナンに結合するペプチドタグを使用する組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、1つには、ヒアルロナン(HA)に結合するペプチドタグを使用する組成物及び方法に関連する。前記HAタグは、眼に投与された際に、分子、例えば、タンパク質又は核酸に結合することができ、眼における半減期及び/又は平均滞留時間の増大、及び又は、前記タンパク質又は核酸の眼におけるクリアランスの低下をもたらす。本発明は、眼の疾患、例えば、網膜性血管疾患を、HAペプチドタグに結合したタンパク質又は核酸を投与することにより処置するための方法も包含する。【選択図】 なし
Description
網膜疾患、例えば、血管新生(wet)AMD、糖尿病性網膜症及び網膜静脈閉塞症は、視力喪失をもたらす血管新生成分を有する。臨床試験では、これらの疾患は、抗VEGF治療剤、例えば、ラニビズマブ又はベバシズマブの毎月の硝子体内注入又はアフリベルセプトによる隔月の処置により、効果的に処置され得ることが示されてきた。これらの治療剤の有効性にもかかわらず、毎月又は隔月での処置は、患者及び医師にとっての明らかな健康管理の負担である(Oishi et al. (2011) Eur J Ophthalmol. Nov-Dec;21 (6):777-82)。このため、より低い頻度でも送達されることができ、これらの薬剤による毎月又は隔月での処置により見られるのと同じ治療利益をも提供する、眼の治療に対する必要性が存在する。
眼は、複数の別個の区画、例えば、角膜、眼房水、レンズ、硝子体液、網膜、網膜色素上皮及び脈絡膜を有する複雑な組織である。これらの区画の組成は変動するが、それらは、一般的には、細胞からなることが、文献に記載されており、細胞外巨大分子、例えば、ヒアルロン酸を含む。本発明は、硝子体におけるヒアルロン酸と結合するペプチドタグについて述べており、それが結合した分子が、より長い眼における半減期、より長い眼における保持及び眼の疾患における作用のより長い持続時間を有することを可能にする。
本発明は、眼からの治療用分子のクリアランスを低下させることにより、その眼における半減期を増大させるために、治療用分子に結合し得るペプチドタグを提供する。例えば、ペプチドタグ付き分子は、タグ付けされていない分子に対して、眼における有効性の増大した持続期間を有し、より低い頻度の眼内注入及び改善した患者処置を、臨床的にもたらすであろうことが本願明細書に記載されている。
本発明は、本願明細書に記載されたように、眼におけるヒアルロナン(HA)と結合するペプチドタグに関する。特定の態様では、本発明は、本願明細書に記載されたように、9.0μM以下のKDで、眼におけるヒアルロナン(HA)と結合するペプチドタグに関する。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、9.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、8.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、7.2μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、5.5μM以下のKDでHAと結合する。本発明は、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36の配列を含む、HAと結合するか、又は、結合可能な、単離されたペプチドタグにも関する。
本発明は、タンパク質又は核酸に結合した1つ以上のペプチドタグを含むペプチドタグ付き分子にも関する。この場合、前記ペプチドタグは、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36の配列を含む。ペプチドタグがタンパク質に結合する場合、前記タグは、このようなタンパク質のアミノ酸に結合し得る。前記ペプチドタグが核酸に結合する場合、前記タグは、このような核酸のヌクレオチドに結合し得る。特定の態様では、前記ペプチドタグは、タンパク質分子のN−末端及び/もしくはC−末端に結合し、又は、核酸の5’及び/もしくは3’端に結合すると考えられる。さらに、前記ペプチドタグは、前記タンパク質又は核酸に直接結合してもよいし、又は、前記ペプチドタグは、前記タンパク質又は核酸に、リンカーを介して間接的に結合してもよい。本願明細書に記載されたペプチドタグ付き分子は、医薬として有用であり得ると考えられる。
本発明の特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、タンパク質、例えば、抗体もしくは抗原結合フラグメント、治療用タンパク質、タンパク質受容体又は設計アンキリン反復タンパク質(DARPin)に結合したペプチドタグを含む。本発明の特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、アプタマーに結合したペプチドタグを含む。前記ペプチドタグ付き分子は、VEGF、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL−1β、IL−17A、TNFα、FGFR2及び/又はPDGF−BBと結合すると考えられる。
本発明は、VEGFと結合し、それぞれ配列番号1、2及び3の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号11、12及び13の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。本発明は、C5と結合し、それぞれ配列番号37、38及び39の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号46、47及び48の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。本発明は、因子Pと結合し、それぞれ配列番号53、54及び55の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号65、66及び67の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。本発明は、EPOと結合し、それぞれ配列番号75、76及び77の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号86、87及び88の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。本発明は、TNFαと結合し、それぞれ配列番号108、109及び110の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号117、118及び119の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。本発明は、IL−1βと結合し、それぞれ配列番号189、190及び191の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号198、199及び200の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。
本発明は、それぞれ配列番号7及び配列番号17;それぞれ配列番号40及び配列番号49;それぞれ配列番号59及び配列番号71;それぞれ配列番号81及び配列番号92;それぞれ配列番号111及び配列番号120;又は、それぞれ配列番号193及び配列番号201の配列を有する可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインをさらに含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子にも関する。特定の態様では、本発明は、それぞれ配列番号9及び配列番号19;それぞれ配列番号42及び配列番号51;それぞれ配列番号61及び配列番号73;それぞれ配列番号83及び配列番号85;それぞれ配列番号113及び配列番号122;それぞれ配列番号194及び配列番号202の、重鎖及び軽鎖の配列を有する、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子に関する。より具体的には、前記ペプチドタグ付き分子は、それぞれ、配列番号21及び19;配列番号23及び19;配列番号25及び19;配列番号27及び19;配列番号29及び19;配列番号44及び51;配列番号63及び73;配列番号85及び95;配列番号115及び122;又は、配列番号196及び202の、タグ付き重鎖配列及び軽鎖配列を含む。
本発明は、表1、2、8、8b、9又は9bに記載されたペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子にも関する。より具体的には、特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36、NVS37、NVS70T、NVS71T、NVS72T、NVS73T、NVS74T、NVS75T、NVS76T、NVS77T、NVS78T、NVS80T、NVS81T、NVS82T、NVS83T、NVS84T、NVS1b、NVS1c、NVS1d、NVS1e、NVS1f、NVS1g、NVS1h又はNVS1jである。
本発明は、前記ペプチドタグ、例えば、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36の配列を有するペプチドタグを含む組成物にも関する。本発明は、さらに、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き分子、特に、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36の配列の配列を有するペプチドタグを含むペプチドタグ付き分子に関する。特定の態様では、本願明細書に記載された組成物は、さらに、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアを含む。前記組成物は、眼送達(例えば、眼内)用に配合されてもよいと考えられる。特定の態様では、前記眼送達用組成物は、9.0μM以下のKDで、HAと結合するペプチドタグを含んでもよい。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、9.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、8.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、7.2μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、5.5μM以下のKDでHAと結合する。特定の態様では、前記組成物は、12mg以下の前記ペプチドタグ付き分子を含む。更なる態様では、前記組成物は、投与あたりに、12mg/眼以下のペプチドタグ付き分子を送達するように配合される。特定の態様では、本願明細書に記載された組成物は、6mg/50μl以下のペプチドタグ付き分子を含む。本発明の特定の態様では、前記組成物は、12mg以下の前記ペプチドタグを含むと考えられる。
本発明の別の態様は、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36の配列を含むペプチドタグをコードする核酸分子を提供する。より具体的には、前記核酸分子は、ペプチドタグHA10.1、HA10.2、HA11又はHA11.1をコードしてもよい。本発明の更なる態様は、表1、2、8、8b、9又は9bに記載されたペプチドタグ付き分子をコードする核酸分子を提供する。特定の態様では、前記核酸分子は、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36、NVS37、NVS70T、NVS71T、NVS72T、NVS73T、NVS74T、NVS75T、NVS76T、NVS77T、NVS78T、NVS80T、NVS81T、NVS82T、NVS83T、NVS84T、NVS1b、NVS1c、NVS1d、NVS1e、NVS1f、NVS1g、NVS1h又はNVS1jをコードしてもよい。特定の具体的な態様では、前記核酸分子は、配列番号10、20、22、24、26、28及び/又は30の配列を含む。
本発明は、本願明細書に記載された核酸を含む発現ベクターに関する。より具体的には、例えば、前記発現ベクターは、表1及び2に記載された核酸を含んでもよい。特定の態様では、本発明は、さらに、本願明細書に記載された1つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。この場合、前記宿主細胞は、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36の配列を有するペプチドタグの産生に使用されてもよい。あるいは、本願明細書に記載された1つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞は、表1、2、8、8b、9又は9bに記載されたペプチドタグ付き分子の産生に使用されてもよい。特定の態様では、前記宿主細胞は、哺乳類の細胞であると考えられる。
本願明細書に記載された宿主細胞は、本発明のペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子を産生するために有用であると考えられる。このため、本発明は、さらに、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び/又はペプチドタグ付き分子、例えば、表1、2、8、8b、9又は9bに記載されたペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子を製造するための方法に関する。前記方法は、さらに、前記宿主細胞を、前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子を産生するのに適切な条件下において培養する工程と、前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子をさらに単離する工程とを含むと考えられる。
本発明は、さらに、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び/又はペプチドタグ付き分子を含む組成物に関する。前記ペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子及び/又は組成物は、治療用、より具体的には、眼の治療用に有用であり得ると考えられる。さらに、前記ペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子及び/又は組成物は、対象における網膜血管疾患に関連する状態又は障害を処置するために有用であり得る。特定の態様では、前記網膜血管疾患は、血管新生性加齢黄斑変性(wet AMD)、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症であり得る。あるいは、前記ペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子及び/又は組成物は、対象における黄斑浮腫に関連する状態又は障害を処置するために有用であり得る。特定の態様では、前記黄斑浮腫に関連する状態又は障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、血管新生性加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症である。
本発明の特定の具体的な態様では、抗VEGF抗体又はその抗原結合フラグメントを含むペプチドタグ付き分子を含む組成物は、対象におけるVEGF媒介性障害を処置するために有用であり得る。特定の態様では、前記VEGF媒介性障害は、加齢黄斑変性、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、後水晶体線維形成、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫(例えば、脳腫瘍に関連するもの)、メーグス症候群、関節リウマチ、乾癬及びアテローム硬化症であり得る。特定の具体的な態様では、VEGF媒介性障害を処置するために有用な組成物は、それぞれ配列番号1、2及び3の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号11、12及び13の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含む、抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントを含む。
本発明は、対象における網膜血管疾患に関連する状態又は障害を処置する方法であって、前記対象に、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び/又はペプチドタグ付き分子を含む組成物を投与する工程を含む方法にも関する。特定の具体的な態様では、前記方法は、ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子を含む組成物を投与する工程を含み、前記ペプチドタグが、9.0μM以下のKDでHAと結合する。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、8.0μM以下のKDでHAと結合する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、7.2μM以下のKDでHAと結合する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、5.5μM以下のKDでHAと結合する。
特定の態様では、前記網膜血管疾患に関連する状態又は障害は、血管新生性加齢黄斑変性(wet AMD)、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症である。
本発明は、さらに、対象における黄斑浮腫に関連する状態又は障害を処置する方法であって、前記対象に、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び/又はペプチドタグ付き分子を含む組成物を投与する工程を含む方法に関する。特定の具体的な態様では、前記方法は、ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子を含む組成物を投与する工程を含み、前記ペプチドタグが、9.0μM以下のKDでHAと結合する。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、8.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、7.2μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、5.5μM以下のKDでHAと結合する。特定の態様では、前記黄斑浮腫に関連する状態又は障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、血管新生性加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症である。
本発明は、さらに、対象におけるVEGF媒介性障害を処置する方法であって、前記対象に、抗VEGF抗体又はその抗原結合フラグメントに結合した、9.0μM以下のKDでHAと結合するペプチドタグを含む組成物を投与する工程を含む方法に関する。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、8.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、7.2μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、5.5μM以下のKDでHAと結合する。特定の態様では、前記方法は、対象の眼におけるVEGF媒介性障害を処置することに関する。本発明は、さらに、対象におけるVEGF媒介性障害を処置する方法であって、前記対象に、抗VEGF抗体又はその抗原結合フラグメントに結合した、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36の配列を含むペプチドタグを含む組成物を投与する工程を含む方法に関する。前記抗VEGF抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号1、2及び3の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号12、13及び14の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含むと考えられる。特定の具体的な態様では、前記VEGF媒介性障害は、加齢黄斑変性、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、後水晶体線維形成、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫(例えば、脳腫瘍に関連するもの)、メーグス症候群、関節リウマチ、乾癬及びアテローム硬化症である。
本発明は、眼における分子の半減期、平均滞留時間もしくは最終濃度を増大させ、又は、眼からの分子のクリアランスを低下させる方法であって、対象の眼に、ペプチドタグ付き分子を含む組成物を投与する工程を含み、前記ペプチドタグが、9.0μM以下のKDでHAと結合する方法にも関する。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKdで、HAと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、9.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、8.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、7.2μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、5.5μM以下のKDでHAと結合する。
本発明は、分子の眼における半減期を増大させる方法であって、前記分子を、9.0μM以下のKDでHAと結合するペプチドタグに結合させる工程を含む方法にも関する。特定の態様では、本発明は、分子の眼における平均滞留時間を増大させる方法であって、前記分子を、9.0μM以下のKDでHAと結合するペプチドタグに結合させる工程を含む方法に関する。特定の態様では、本発明は、分子の眼における最終濃度を増大させる方法であって、前記分子を、9.0μM以下のKDでHAと結合するペプチドタグに結合させる工程を含む方法に関する。特定の態様では、本発明は、分子の眼におけるクリアランスを低下させる方法であって、前記分子を、9.0μM以下のKDでHAと結合するペプチドタグに結合させる工程を含む方法に関する。前述の方法それぞれにおいて、前記ペプチドタグは、9.0μM、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、9.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、8.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、7.2μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、5.5μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36の配列を含む。
本発明は、さらに、眼送達用の組成物を製造する方法であって、9.0μM以下のKDでHAと結合するペプチドタグを、前記眼におけるターゲットと結合する分子に結合させる工程を含む方法に関する。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。本発明は、さらに、分子、例えば、タンパク質又は核酸に結合した、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36の配列を含むペプチドタグ付き分子を製造する方法に関する。特定の態様では、前記ペプチドタグを分子に結合させることにより、眼に投与された場合、前記タグを含まない分子と比較して、低下した眼におけるクリアランス、増大した眼における平均滞留時間及び/又は増大した眼における最終濃度を有する、ペプチドタグ付き分子が形成されると考えられる。
定義
特に断らない限り、本願明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、この発明が属する分野において通常の知識を有する者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
特に断らない限り、本願明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、この発明が属する分野において通常の知識を有する者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本願明細書で使用する場合、「抗体」の用語は、全長抗体を意味する。全長抗体は、ジスルフィド結合により相互に結合した、少なくとも2つの重(H)鎖及び少なくとも2つの軽(L)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖には、重鎖可変領域(本願明細書において、VHと省略される)及び重鎖定常領域が含まれる。前記重鎖定常領域には、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3が含まれる。各軽鎖には、軽鎖可変領域(本願明細書において、VLと省略される)及び軽鎖定常領域が含まれる。前記軽鎖定常領域には、1つのドメイン、CLが含まれる。前記VH及びVLの領域は、さらに、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存されている散在領域に細分され得る。各VH及びVLには、3つのCDR及び4つのFRが含まれ、下記順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で、アミノ−末端からカルボキシ−末端に配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。前記抗体の定常領域は、宿主組織又は因子、例えば、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクタ細胞)及び古典的補体系の第1成分(Clq)への免疫グロブリンの結合を媒介する場合がある。
本願明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合フラグメント」の用語は、所定の抗原(例えば、血管内皮細胞増殖因子:VEGF)に特異的に結合する能力を保持している、抗体の1つ以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合能は、完全な抗体のフラグメントにより発揮され得る。前記抗体の抗原結合フラグメントの用語内に包含される結合フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Fabフラグメント、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価のフラグメント;F(ab)2フラグメント、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合により結合された2つのFabフラグメントを含む2価のフラグメント;VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント;抗体の1つのアームのVL及びVHドメインからなるFvフラグメント(scFv);1つのドメイン抗体(dAb)フラグメント(Ward et al., 1989 Nature 341 :544-546)があげられる。前記dAbフラグメントは、VHドメイン又はVLドメイン及び単離された相補性決定領域(CDR)からなる。
さらに、前記Fvフラグメントの2つのドメインであるVL及びVHは、別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え法を使用して、前記VL及びVH領域対が一価の分子を形成する1つのタンパク質鎖を形成するのを可能にする、人工的なペプチドリンカーにより結合され得る(一本鎖Fv(scFv)として公知;例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426;及び、Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照のこと。)。このような一本鎖抗体は、抗体の1つ以上の抗原結合フラグメントを含んでもよい。これらの抗原結合フラグメントは、当業者に公知の従来技術を使用して得られる。前記フラグメントは、完全な抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。
抗原結合フラグメントは、単一のドメイン抗体、maxibody、minibody、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、v−NAR及びビス−scFvにも包含され得る(例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参照のこと。)。抗体の抗原結合部分は、ポリペプチド、例えば、III型フィブロネクチン(Fn3)に基づく足場に移植され得る(例えば、米国特許第6,703,199号明細書を参照のこと。同特許には、フィブロネクチンポリペプチドのmonobodyが記載されている。)。
抗原結合フラグメントは、一対のタンデムFvセグメント(VH−CH1−VH−CH1)を含む一本鎖分子に包含され得る。前記セグメントは、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成する(Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062;及び米国特許第5,641,870号明細書)。
「アミノ酸」の用語は、天然由来及び合成のアミノ酸、ならびに、天然由来のアミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を意味する。天然由来のアミノ酸は、遺伝情報によりコードされているもの、及び、後に修飾されるそれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びO−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然由来のアミノ酸と同じ基礎的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びR基に結合したアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然由来のアミノ酸と同じ基礎的化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の全体的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然由来のアミノ酸に類似する様式で機能する化合物を意味する。
「補体C5タンパク質」又は「C5」の用語は、互換的に使用され、種々の種における補体成分5タンパク質を意味する。例えば、ヒトC5は、配列番号99(表2bを参照のこと。)に示された配列を有する。ヒトC5は、当分野において公知であり、Quidelから得ることができる(Cat.Number A403)。
「網膜性疾患に関連する状態又は障害」の用語は、網膜が変性し、又は、不全になる多数の状態又は疾患を意味する。これには、糖尿病性網膜症(DR)、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、非増殖性糖尿病性網膜症(NPDR)、血管新生性加齢黄斑変性(wet AMD、血管新生性AMD)、網膜静脈閉塞症(RVO)、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症が含まれる。VEGF阻害により処置され得る網膜血管疾患の解剖学的特徴としては、フルオレセイン血管造影により測定される、黄斑浮腫、静脈拡張、血管のねじれ、血管漏出、網膜出血及び微小血管異常(例えば、小動脈瘤、綿花状白斑、IRMA)、毛細管脱落、白血球接着、網膜虚血、視神経乳頭の血管新生、後極の血管新生、虹彩の血管新生、網膜内出血、硝子体出血、斑点状瘢痕、網膜下線維症及び網膜線維症があげられる。
「網膜血管疾患に関連する状態又は障害」の用語は、網膜の異常な血管新生(例えば、増大又は低下)が存在する状態を意味する。網膜血管疾患に関連する状態又は障害としては、血管新生性加齢黄斑変性(wet AMD)、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生及び未熟児網膜症があげられる。
「糖尿病性網膜症に関連する状態又は障害」の用語は、網膜の血管系、網膜の代謝、網膜色素上皮、血液−網膜関門又は、最終糖化産物(AGE)、アルドース還元酵素活性、グリコシル化ヘモグロビン及びプロテインキナーゼCの眼におけるレベルにおける、糖尿病(1型又は2型)の影響の結果として、網膜が変性し、又は、不全になる、数多くの状態のいくつかを意味する。糖尿病性網膜症の患者における視力低下は、網膜虚血、黄斑浮腫、血管漏出、硝子体出血の結果であるか、又は、網膜神経における上昇したグルコースレベルの直接的な影響であり得る。VEGF阻害により処置され得る糖尿病性網膜症の解剖学的特徴としては、小動脈瘤、綿花状白斑、静脈拡張、黄斑浮腫、網膜内の微小血管異常(IRMA)、網膜内出血、血管増殖、視神経乳頭の血管新生、皮膚紅潮及び網膜虚血があげられる。「糖尿病性黄斑浮腫」は、糖尿病性網膜症の対象において起こり、前記疾患のいずれかの段階において起こり得る。
「黄斑浮腫に関連する状態又は障害」の用語は、斑点の膨張又は濃厚化が、網膜血管漏出液の結果である「黄斑浮腫」として生じる、多数の状態又は障害を意味する。黄斑浮腫は、網膜血管疾患の合併症において生じ、又は、多くの場合、同合併症である。黄斑浮腫に関連する具体的な状態又は障害としては、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症があげられる。VEGF阻害による黄斑浮腫の処置は、眼底検査、光干渉断層撮影及び改善した視力により決定され得る。
ポリペプチド配列について、「保存的に修飾された変異体」は、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失又は付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当分野において周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子を除外するものではなく、これらに追加されるものである。下記8つのグループ:1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン(S)、スレオニン(T);及び、8)システイン(C)、メチオニン(M)は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと。)。一部の実施形態では、「保存的配列修飾」又は「保存的修飾」の用語は、前記アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に明らかに影響を及ぼさない、又は、変更しない、アミノ酸修飾を意味するのに使用される。
本願明細書で使用する場合、「DARPin」(設計アンキリン反復タンパク質についての頭字語)の用語は、典型的に高い特異性及び高い親和性のターゲットタンパク質結合を示す、抗体模倣物タンパク質を意味する。それらは、典型的には、天然のアンキリンタンパク質から、遺伝子操作及び誘導され、少なくとも3つの、通常、4つ又は5つの、これらのタンパク質の繰り返しモチーフからなる。その分子量は、4又は5つの反復DARPinそれぞれについて、約14又は18kDa(キロダルトン)である。DARPinの例は、例えば、米国特許第7,417,130号明細書に見出され得る。
「用量」の用語は、対象に、一時に全て(単位用量)を投与される、又は、所定の時間間隔にわたって2回以上投与される、ペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子、タンパク質又は核酸の量を意味する。例えば、用量は、3週間又は1、2、3ヶ月又はそれ以上の経過にわたって、(例えば、1回の投与により、又は、2回又はそれ以上の投与により)対象に投与されたタンパク質(例えば、ペプチドタグ付き分子、例えば、抗VEGF抗原結合フラグメント及びHAと結合しているペプチドタグを含むペプチドタグ付きタンパク質)の量を意味し得る。投与の間隔は、任意の所望の時間であってよく、「投与間隔」と呼ばれる。用量に言及する場合に、「薬学的に有効な」の用語は、所望の効果を提供するのに十分な量の、前記タンパク質(例えば、抗体又は抗原結合フラグメント)、ペプチドタグ又は薬学的に活性な薬剤を意味する。「有効」である量は、年齢及び個体の全体的な状態、具体的な薬剤又は薬学的に活性な薬剤等に応じて、対象間で変動するであろう。このため、全ての患者に適した、正確な「有効」量を特定するのは、常に可能なわけではない。ただし、任意の個体の場合における適切な「有効」用量は、通常の検査を使用して、当業者により決定され得る。
「Epoタンパク質」もしくは「Epo抗原」又は「EPO」もしくは「Epo」の用語は、互換的に使用され、種々の種におけるエリスロポエチンタンパク質を意味する。例えば、ヒトEPOは、表2b:配列番号98に示された配列を有する。ヒト、カニクイザル、マウス、ラット及びウサギのEpoについてのタンパク質配列は、公衆に利用可能である。ヒトEPOも、過剰グリコシル化され得る。
「Epo受容体」又は「EPOR」の用語は、互換的に使用され、エリスロポエチン受容体タンパク質を意味し、種々の種におけるエリスロポエチン受容体タンパク質を意味する。EPORは、Winkelmann J.C., Penny L.A., Deaven L.L., Forget B.G., Jenkins R.B.BIood 76:24-30(1990)に記載されている。
「因子Dタンパク質」又は「因子D抗原」又は「因子D」の用語は、互換的に使用され、種々の種における因子Dタンパク質を意味する。ヒト因子Dの配列は、Johnson et al.(FEBS Lett. 1984 Jan 30;166(2):347- 51)により記載されている。因子Dの抗体は、当分野において公知であり、米国特許第8273352号明細書に記載されている。
「因子Pタンパク質」又は「因子P抗原」又は「因子P」の用語は、互換的に使用され、種々の種における因子Pタンパク質を意味する。例えば、ヒト因子Pは、表2b:配列番号100に示された配列を有する。ヒト因子Pは、Complement Tech、Tyler、TXから得ることができる。カニクイザルの因子Pは、カニクイザルの血清から精製され得る(Nakano et al., (1986) J Immunol Methods 90:77- 83から改良したプロトコル)。因子Pは、「プロパージン」としても当分野において公知である。
「FGFR2」の用語は、種々の種における繊維芽細胞増殖因子受容体2を意味する。FGFR2は、Dionne C.A., Crumley G.R., Bellot F., Kaplow J.M., Searfoss G., Ruta M., Burgess W.H., Jaye M., Schlessinger J.EMBO J. 9:2685-2692(1990)に記載されている。
「ヒアルロナン」又は「ヒアルロン酸」又は「HA」の用語は、細胞外マトリクス中又は細胞表面上に生じる、N−アセチルグルコサミンとグルクロン酸との繰り返し二糖類単位を含む大型のポリマー性グリコサミンを意味する。さらに、ヒアルロナンは、J. Necas, L. Bartosikova, P. Brauner, J. Kolar, Veterinarni Medicina, 53, 2008 (8):397- 411に記載されている。
「ヒアルアドへリン」又は「ヒアルロナン結合タンパク質」又は「HA結合タンパク質」の用語は、ヒアルロナンと結合するタンパク質又はタンパク質ファミリーを意味する。HA結合タンパク質の例は、当分野において公知である(Day, et al. 2002 J Bio.Chem 277:7, 4585及びYang, et al. 1994, EMBO J 13:2, 286-296)(例えば:Link、CD44、RHAMM、アグリカン、ベルシカン、細菌のHA合成酵素、コラーゲンVI及びTSG−6)。多くのHA結合タンパク質及びペプチドフラグメントは、HA結合に関与する長さ約100個のアミノ酸の共通構造ドメインを含む。前記構造ドメインは、「LINKドメイン」と呼ばれる(Yang, et al. 1994, EMBO J 13:2, 286-296及びMahoney, et al. 2001 , J Bio.Chem 276:25, 22764-22771)。例えば、HA結合タンパク質である、TSG−6のLINKドメインは、ヒトTSG−6配列(配列番号30)のアミノ酸残基36−128を含む。
本願明細書で使用する場合、「ヒト抗体」の用語は、フレームワーク及びCDR領域の両方がヒト由来の配列から得られる可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、前記抗体が定常領域を含む場合、前記定常領域も、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系配列又はヒト生殖系配列の変異型から得られる。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基(in vitroにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発により、又は、in vivoにおける体細胞変異により導かれる変異)を含んでもよい。
「ヒトモノクローナル抗体」の用語は、フレームワーク及びCDR領域の両方が、ヒト配列に由来する可変領域を有する、1つの結合特異性を示す抗体を意味する。一実施形態では、前記ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックの非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるB細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持するが、ヒトにおける免疫原性がほとんどない抗体である。これは、例えば、非ヒトCDR領域を保持し、抗体の残り部分をそのヒトカウンターパート(すなわち、定常領域及び可変領域のフレームワーク部分)により置き換えることにより達成され得る。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851 -6855, 1984;Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988;Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988;Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991;及びPadlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994を参照のこと。ヒト遺伝子操作技術の他の例としては、限定されるものではないが、米国特許第5,765,886号明細書に開示されたXoma技術があげられる。
2つ以上の核酸又はポリペプチドの配列についての、「同一」又はパーセント「同一性」の用語は、2つ以上の配列又はサブ配列が同じであることを意味する。比較ウインドウにわたって最大の一致を比較及び整列させるか、又は、下記配列比較アルゴリズムの1つを使用するか、もしくは、手動のアライメント及び目視検査によって測定される領域を指定した際、2つの配列が、特定の割合の、同じ(すなわち、特定の領域にわたって、又は、特定しない場合には配列全体にわたって、60%同一性、場合により、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は99%同一性の)アミノ酸残基又はヌクレオチドを有する場合、2つの配列は「実質的に同一」である。任意に、前記同一性は、長さが少なくとも約50個のヌクレオチド(又は10個のアミノ酸)の領域にわたって、又はより好ましくは、長さが100から500個又は1000個又はそれ以上のヌクレオチド(又は20、50、200個又はそれ以上のアミノ酸)である領域にわたって存在する。
配列比較のために、典型的には、1つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列は、コンピュータに入力され、必要に応じて、配列座標が指定される。配列アルゴリズムのプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、又は、別のパラメータが指定され得る。ついで、前記配列比較アルゴリズムは、前記プログラムパラメータに基づいて、前記参照配列に対する前記試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
本願明細書で使用する場合、「比較ウインドウ」は、20から600、一般的には、約50から約200、より一般的には、約100から約150からなる群から選択される数の連続的な位置のいずれか1つのセグメントに対する参照を含む。そして、前記2つの配列が最適に整列された後に、配列は、同じ数の連続的な位置の参照配列に対して比較されてもよい。比較のための配列のアライメント方法は、当分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith and Waterman(1970)Adv. Appl. Math. 2:482cの局所的ホモロジーアルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似法用検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装(the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wlにおける、GAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA)により、又は、手動アライメント及び目視検査(例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)を参照のこと。)により行われ得る。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの2つの例は、BLAST及びBLAST 2.0のアルゴリズムである。前記2つのアルゴリズムは、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977;及び、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990それぞれに記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公衆に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、照会配列において長さWのショートワードを特定することにより、高いスコアリングの配列ペア(HSP)を特定することを含む。前記特定は、データベース配列における同じ長さのワードと整列させた場合、いくつかの正の値を有する閾値スコアTにマッチするか、又は、同スコアTを満たすかのいずれかである。Tは、近接ワードスコア閾値(Altschul et al、上記)と呼ばれる。これらの最初の近接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。前記ワードヒットは、累積アライメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータM(一対のマッチする残基についての報酬スコア;通常>0)及びN(マッチしない残基についてのペナルティスコア;通常<0)を使用して算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスが、前記累積スコアを算出するために使用される。各方向における前記ワードヒットの伸長は、前記累積アライメントスコアが、その最大達成値からの量Xにより減少し;前記累積スコアが、1つ以上の負のスコアリング残基アライメントの蓄積によりゼロ以下になり;又は、いずれかの配列の端部に達した時点で停止される。BLASTアルゴリズムのパラメータであるW、T及びXは、前記アライメントの感受性及びスピードを決定する。(ヌクレオチド配列についての)BLASTNプログラムは、11のワード長(W)、10の予測(E)、M=5、N=−4及び両鎖の比較を、デフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、3のワード長及び10の予測(E)ならびに、50のBLOSUM62スコアリングマトリクス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照のこと。)アライメント(B)、10の予測(E)、M=5、N=−4及び両鎖の比較を、デフォルトとして使用する
BLASTアルゴリズムは、2つの配列間における類似性の統計学的分析も行う(例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照のこと。)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの測定は、最少合計確率(P(N))である。前記最少合計確率は、2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じるであろう確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における前記最少合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、及び最も好ましくは、約0.001未満である場合、参照配列に類似すると考えられる。
2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、E.Meyers及びW.Millerのアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci., 4:1 1-17, 1988)を使用しても決定され得る。前記アルゴリズムは、PAM120重量残基表(PAM120 weight residue table)、12のギャップ長ペナルティ及び4のギャップペナルティを使用する、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に包含されている。さらに、前記2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Needleman及びWunsch(J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)のアルゴリズムを使用して決定され得る。前記アルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージ(gcg.comのワールド・ワイド・ウェブにおいて利用可能)におけるGAPプログラムに包含されている。前記GAPプログラムは、Blossom62マトリクス又はPAM250マトリクスのいずれか、ならびに、16、14、12、10、8、6又は4のギャップ重み及び1、2、3、4、5又は6の長さ重みを使用する。
上記配列同一性の割合以外に、2つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、第1の核酸によりコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第2の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生じる抗体と、免疫学的に交差反応性であることである。このため、ポリペプチドは、典型的には、例えば、前記2つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合に、第2のポリペプチドに対して実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、前記2つの分子又はその相補体が、以下に記載されるように、ストリンジェントな条件下において互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーが前記2つの核酸配列を増幅するために使用され得ることである。
「単離された抗体」の用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体又は他のタンパク質を実質的に含まない抗体を意味する(例えば、VEGFと特異的に結合する単離された抗体は、VEGF以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない。)。ただし、VEGFと特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有する場合がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料及び/又は化学物質、例えば、細胞上清から単離された抗体を実質的に含まない場合がある。
「IL−1β」の用語は、ヒトにおいて、IL1B遺伝子によりコードされるサイトカインである、インターロイキン−1ベータタンパク質を意味する。例えば、ヒトIL−1βは、表2b:配列番号102に示された配列を有する。
「IL−10」又は「IL10」の用語は、互換的に使用され、インターロイキン−10タンパク質を意味し、種々の種のインターロイキン−10タンパク質を意味する。IL10は、Vieira P., de Waal-Malefyt R., Dang M.-N., Johnson K.E., Kastelein R., Fiorentino D.F., Devries J.E., Roncarolo M.-G., Mosmann T.R., Moore K.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:1172-1176(1991)に記載されている。
「IL−17A」の用語は、インターロイキン17Aを意味し、35kDaの分子量を有する、ジスルフィド結合した、ホモ二量体の分泌型糖タンパク質である、155個のアミノ酸のタンパク質である(Kolls JK, Linden A 2004, Immunity 21 :467-76)。
「アイソタイプ」の用語は、重鎖定常領域の遺伝子により提供される、抗体分類(例えば、IgM、IgE、IgG、例えば、IgG1又はIgG4)を意味する。アイソタイプは、これらの分類の1つの修飾型も含む。この場合、修飾は、Fc機能を変更する、例えば、Fc受容体に対するエフェクタ機能又は結合を増大又は低下させるようになされている。
「結合した」又は「結合する」の用語は、ペプチドタグ、例えば、表1及び2に列記された、HAと結合するペプチドタグの、分子、例えば、タンパク質又は核酸への結合を意味する。前記ペプチドタグのタンパク質又は核酸分子への結合は、例えば、前記分子のアミノ又はカルボキシ末端において生じ得る。前記ペプチドタグは、前記分子のアミノ及びカルボキシ末端の両方にも結合し得る。前記ペプチドタグは、前記タンパク質又は核酸分子それぞれの中の、1つ以上のアミノ酸又は核酸にも結合し得る。さらに、「結合した」は、2つ以上のペプチドタグが互いに会合すること、及び/又は、2つ以上のペプチドタグが分子の異なる部位に会合することも意味し得る。前記ペプチドタグの分子への結合は、当分野において公知の複数の方法、例えば、限定されるものではないが、融合タンパク質としての前記ペプチドタグ及び分子の発現、2つ以上のペプチドタグのタグ及び/又は分子間の「ペプチドリンカー」を介した結合により、あるいは、互いに直接又はジスルフィド結合によるリンカーを介して、翻訳後にペプチドタグを分子に化学的に結合させることにより達成され得る。
「ペプチドリンカー」の用語は、前記ペプチドタグを分子に共有結合させるように機能するアミノ酸配列を意味する。前記ペプチドリンカーは、ペプチドタグ及び/もしくはタンパク質のアミノ又はカルボキシ末端の一方又は両方、又は、核酸分子に共有結合してもよい。前記ペプチドリンカーは、タンパク質又は核酸分子それぞれの配列内のアミノ酸又は核酸にコンジュゲートされてもよい。ペプチドリンカーは、例えば、長さが約2から25個の残基でもよいと考えられる。
本願明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」の用語は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。
本願明細書において、「核酸」の用語は、「ポリヌクレオチド」の用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態におけるそれらのポリマーを意味する。前記用語は、公知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基もしくは結合を含む核酸を包含する。前記核酸は、合成、天然由来及び非天然由来であり、参照核酸と類似する結合特性を有し、前記参照ヌクレオチドに類似する態様で代謝される。このような類似体の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホラミデータ、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(PNA)があげられる。
特に断らない限り、特定の核酸配列は、暗黙の内に、その保存的に修飾された変異体(例えば、変性コドン置換)及び相補配列ならびに明確に示された配列も包含する。具体的には、以下に詳述されるように、変性コドン置換は、1つ以上の選択された(又は全ての)コドンの第3位置が混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基により置換されている配列を生成することにより達成されてもよい(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991;Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985;及び、Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994)。
「クリアランス」の用語は、単位時間あたりに消失する物質(例えば、マトリクス、組織、血漿、又は、他の物質(例えば、薬剤又は、例えば、ペプチドタグ付き分子等))の容積であることを意味する(Shargel, L and Yu, ABC: Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, 4th Edition(1999))。「眼におけるクリアランス」は、眼からの物質、例えば、ペプチドタグ付き分子のクリアランスを意味する。
「操作可能に結合した」の用語は、2つ以上のポリヌクレオチド(例えば、DNA)セグメント間の機能的関係を意味する。典型的には、前記用語は、転写される配列に対する転写調節配列の機能的関係を意味する。例えば、プロモータ又はエンハンサ配列は、それが、適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に操作可能に結合する。一般的には、転写される配列に操作可能に結合するプロモータ転写調節配列は、前記転写される配列に対して物理的に連続している。すなわち、それらは、シス作用性である。ただし、一部の転写調節配列、例えば、エンハンサは、物理的に連続している必要がないか、又は、それらにより転写が増大するコード配列に近接して配置される必要がない。
本願明細書で使用する場合、「最適化された」の用語は、ヌクレオチド配列が、産生細胞又は生物(一般的には、真核生物の細胞、例えば、Pichiaの細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)又はヒト細胞)において好ましいコドンを使用して、アミノ酸配列をコードするように変更されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、本来開始ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を完全に、又は、可能な限り高く維持するように操作される。前記開始ヌクレオチド配列は、「親」配列としても公知である。本願明細書において、前記最適化された配列は、哺乳類の細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。ただし、他の真核生物の細胞又は原核生物の細胞におけるこれらの配列の最適化された発現は、本願明細書においても想定されている。前記最適化されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列は、最適化とも呼ばれる。
「PDGF−BB」の用語は、血小板由来の増殖因子サブユニットBを意味する。このタンパク質は、Josephs S.F., Ratner L, Clarke M.F., Westin E.H., Reitz M.S., Wong-Staal F.Science 225:636-639(1984)に記載されている。
「ペプチドタグ」又は「タンパク質タグ」の用語は、種々の眼の区画、例えば、硝子体、網膜、RPE、脈絡膜、眼房水、小柱網、角膜又は毛様体において見出された分子と結合する、短いタンパク質配列、ペプチドフラグメント又はペプチド模倣物を意味するように、互換的に使用される。例えば、前記ペプチドタグに結合する眼の分子は、構造的な硝子体、網膜及びRPEのタンパク質、例えば、コラーゲン及びラミニン:細胞外タンパク質、例えば、エラスチン、フィブロネクチン及びビトロネクチン;可溶性タンパク質、例えば、アルブミン;膜貫通タンパク質、例えば、インテグリン;ならびに、炭水化物含有分子、例えば、ヒアルロン酸、グルコサミングリカン及び他の細胞外プロテオグリカンを含み得る。ペプチドタグの具体例としては、例えば、HAと結合するペプチドタグ(すなわち、HA結合ペプチドタグ)があげられる。本発明のペプチドタグ、例えば、HAと結合するペプチドタグは、ペプチドタグに結合していない同じ分子(すなわち、タグ付けされていない分子)と比較して、眼における半減期(T1/2又はt1/2)を増大させ、及び/又は、平均眼平均滞留時間を増大させ、及び/又は、眼におけるクリアランス速度を低下させ、及び/又は、ペプチドタグ付き分子(例えば、タンパク質又は核酸)の投与間隔を長くし得る。
ペプチドタグは、当分野において公知の複数の方法、例えば、限定されるものではないが、融合タンパク質としての前記タンパク質タグの発現、2つ以上のタンパク質タグのタグ間のペプチドリンカーを介した結合、又は、互いに直接又はジスルフィド結合によるリンカーを介して、翻訳後にペプチドタグを化学的に結合させることにより、多量体を形成するように結合し得る。「ペプチドタグ付き分子」の用語は、本発明の1つ以上のペプチドタグに結合している分子を意味する。前記分子は、限定されるものではないが、タンパク質又は核酸でもよい。「タグ付き抗体」又は「ペプチドタグ付き抗体」の用語は、本発明の1つ以上のタンパク質タグに結合している、抗体又はその抗原結合フラグメントを意味する。「ペプチドタグ付き抗原結合フラグメント」の用語は、本発明の1つ以上のタンパク質タグに結合している抗原結合フラグメントを意味する。
本願明細書で使用する場合、「半減期」の用語は、薬剤の濃度が1/2に低下するのに必要とされる時間を意味する(Rowland M and Towzer TN: Clinical Pharmacokinetics. Concepts and Applications. Third edition (1995)及び、Bonate PL and Howard DR (Eds): Pharmacokinetics in Drug Development, Volume 1 (2004))。
本願明細書で使用する場合、「平均滞留時間」又は「MRT」の用語は、薬剤(例えば、ペプチドタグ付き分子)が、身体、例えば、特定の臓器又は組織(例えば、眼)に残存する平均時間である。
本願明細書で使用する場合、「Ctrough」の用語は、投与期間全体を通してマトリクス又は組織において測定された薬剤の最も低い濃度を意味する。前記濃度は、繰り返しの用量投与の直前に最も頻繁に生じる。
本願明細書で使用する場合、「タンパク質」の用語は、1つ以上の直鎖状に配置されたアミノ酸から構成され、球状の形態に折り畳まれている、いずれかの有機化合物を意味する。ポリマー鎖におけるアミノ酸は、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル及びアミノ基間において、ペプチド結合により互いに結合されている。「タンパク質」の用語は、限定されるものではないが、さらに、ペプチド、一本鎖ポリペプチド又は、主にアミノ酸の2つ以上の鎖からなるいずれかの複合体分子を含む。それは、さらに、限定されるものではないが、糖タンパク質又は他の公知の翻訳後修飾を含む。それは、さらに、天然のタンパク質の公知の天然又は人工の化学修飾、例えば、限定されるものではないが、糖鎖操作、ペグ化、ヘシル化(hesylation)等、非天然アミノ酸の包含及び別の分子との化学結合のためのアミノ酸修飾を含む。
本願明細書で使用する場合、「組換えヒト抗体」の用語は、組換え法により調製、発現、生成又は単離された全てのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニック又はトランスクロモゾーマルである動物(例えば、マウス)又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、前記ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、ならびに、他のDNA配列に対する配列であるヒト免疫グロブリン遺伝子の全部又は一部のスプライシングを含むいずれかの他の手段により調製、発現、生成又は単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク及びCDR領域がヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。ただし、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、in vitro変異誘発(又は、ヒトIg配列に対する動物トランスジェニックが使用される場合、in vivo体細胞性変異誘発)に供され得る。このため、前記組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系VH及びVL配列に由来し、同配列に関連するが、in vivoにおいて、ヒト抗体の生殖系レパートリ内には天然には存在し得ない配列である。
「組換え宿主細胞」(又は、単に「宿主細胞」)の用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。このような用語は、特定の対象となる細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味することを意図すると理解されるべきである。特定の修飾が変異又は環境影響のいずれかにより続く世代において生じる場合があるため、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、それでも、本願明細書で使用する場合、前記「宿主細胞」の用語の範囲内に含まれる。
「対象」の用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物(例えば、哺乳類及び非哺乳類)、例えば、非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル)、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類を含む。言及した場合を除いて、「患者」又は「対象」の用語は、本願明細書において互換的に使用される。本願明細書で使用する場合、「cyno」又は「カニクイザル」の用語は、カニクイザル(Macaca fascicularis)を意味する。
「最終濃度」の用語は、実験又は研究の最後において測定された前記ペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子等の濃度を意味する。「最終薬剤濃度の増大」は、前記ペプチドタグ付き分子の最終濃度の少なくとも25%の増大を意味する。
本願明細書で使用する場合、網膜血管疾患に関連するいずれかの状態もしくは障害、糖尿病性網膜症に関連するいずれかの状態もしくは障害、及び/又は、黄班浮腫に関連するいずれかの状態もしくは障害の「処置すること」又は「処置」の用語は、一態様において、前記疾患又は障害を改善すること(すなわち、前記疾患の進行又はその臨床的兆候の少なくとも1つを遅延もしくは停止もしくは低下させること)を意味する。別の態様では、「処置すること」又は「処置」は、患者により認識できない場合があるものを含む、少なくとも1つの肉体的パラメータを緩和又は改善することを意味する。さらに別の態様では、「処置すること」又は「処置」は、前記疾患又は障害を、肉体的(例えば、認識できる兆候の安定化)、生理学的(例えば、肉体的パラメータの安定化)のいずれか又は両方で調節することを意味する。さらに別の態様では、「処置すること」又は「処置」は、前記疾患又は障害の開始又は進行又は進展を予防又は遅延させることを意味する。それが本願明細書に記載された指標、例えば、網膜血管疾患に関連する状態もしくは障害、糖尿病性網膜症に関連する状態もしくは障害、及び/又は、黄班浮腫に関連する状態もしくは障害に関連する場合、「予防」は、以下に記載されたように、悪化に対するリスクがある患者における、視覚機能、網膜解剖学、網膜血管疾患パラメータ、尿病性網膜症の疾患パラメータ及び/又は黄班浮腫の疾患パラメータにおける悪化を予防又は遅延させるいずれかの作用を意味する。より具体的には、網膜血管疾患に関連する状態もしくは障害、糖尿病性網膜症に関連する状態もしくは障害、及び/又は、黄班浮腫に関連する状態もしくは障害の「処置」は、視覚機能及び/又は網膜解剖学の改善又は保存をもたらす、又は、もたらすと考えられるいずれかの作用を意味する。疾患の処置及び/又は予防を評価するための方法は、当分野において公知であり、本願明細書において以下に記載されている。
「TNFα」の用語は、内毒素又は他の刺激への応答において、多くの細胞種、例えば、単球及びマクロファージにより産生される天然由来の哺乳類のサイトカインである、腫瘍壊死因子アルファ(カケクチンとしても公知)を意味する。TNFαは、炎症、免疫及び病態生理学的反応の主要なメディエータである(Grell, M., et al.(1995)Cell, 83: 793-802)。可溶性のTNFαは、前駆体膜貫通タンパク質の開裂により形成される(Kriegler, et al.(1988)Cell 53: 45-53)。分泌型の17kDaポリペプチドは、可溶性のホモ三量体複合体を構築する(Smith, et al.(1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954;TNFαのレビューについては、Butler, et al.(1986), Nature 320:584; Old(1986), Science 230: 630を参照のこと。)。ヒトTNFαについての配列は、表2bに記載されており、配列番号101の配列を有する。
「TSG−6」の用語は、腫瘍壊死因子誘導遺伝子6を意味する。TSG−6は、HA結合性タンパク質ファミリーのメンバーであり、LINKドメインを含む(Lee et al. J Cell Bio(1992)116:2, 545-57)。TSG−6由来のLINKドメインは、本願明細書において、「TSG−6 LINKドメイン」とも呼ばれる。
「ベクター」の用語は、それに結合している別のポリヌクレオチドを輸送可能なポリヌクレオチド分子を意味することが意図される。ベクターの1つのタイプは、「プラスミド」である。前記プラスミドは、更なるDNAセグメントがライゲートされていてもよい、環状の二本鎖DNAループを意味する。別の種類のベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノ関連ウイルスベクター(AAV又はAAV2)である。この場合、更なるDNAセグメントは、ウイルスゲノム内にライゲートされてもよい。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律的な複製が可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)は、前記宿主細胞内への導入に基づいて、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得ることにより、宿主のゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に結合している遺伝子の発現を指揮可能である。このようなベクターは、本願明細書において、「組換え発現ベクター」(又は単に、「発現ベクター」)とも呼ばれる。一般的には、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、前記プラスミドが、ベクターの最も一般的に使用される形態であるため、互換的に使用される場合がある。ただし、本発明は、このような他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス)を含むことを意図する。前記ベクターは、同等の機能を果たす。
「VEGF」の用語は、Leung et al., Science 246:1306 (1989)及びHouck et al., Mol. Endocrin. 5:1806(1991)に記載されたように、165個のアミノ酸の血管内皮細胞増殖因子ならびに、関連する121、189及び206個のアミノ酸の血管内皮細胞増殖因子を意味し、それらの増殖因子の天然由来の対立形質及び処理形態を伴う。ヒトVEGFについての配列は、表2bに記載されており、配列番号97の配列を有する。
「VEGF媒介性障害」の用語は、VEGFの関与を必要とする、いずれかの障害、症状又は疾患の開始、進行もしくは持続を意味する。代表的なVEGF媒介性障害としては、限定されるものではないが、加齢黄斑変性、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫(例えば、脳腫瘍に関連するもの)、メーグス症候群、関節リウマチ、乾癬及びアテローム硬化症があげられる。
本願明細書で使用する場合、「治療用タンパク質」の用語は、疾患、状態又は障害の治療、予防又は改善をするのに有用なタンパク質を意味する。
本願明細書で使用する場合、「タンパク質受容体」の用語は、細胞受容体であり、リガンドと結合するタンパク質を意味する。
本発明は、1つには、タンパク質又は核酸の眼における半減期及び/又は平均滞留時間を増大させるペプチドタグの発見に基づいている。特定の態様では、本発明のペプチドタグは、抗体及び抗原結合フラグメント、治療用タンパク質、タンパク質受容体、DARPinならびに/又はアプタマーの、眼における半減期及び/又は平均滞留時間を増大させる。本発明は、眼のタンパク質(例えば、HA及び/又はVEGF)と特異的に結合し、眼における増大した半減期及び/又は平均滞留時間を示す、長く作用する抗体分子の発見にも関連する。本発明は、タンパク質タグに結合している、完全なIgG型抗体及び抗原結合フラグメント(例えば、Fabフラグメント)の両方に関する。
ペプチドタグ
多くの要因が、タンパク質のin vivoにおける半減期に影響を及ぼし得る。例えば、腎臓でのろ過、肝臓での代謝、タンパク質分解酵素(プロテアーゼ)による分解及び免疫原性応答(例えば、抗体によるタンパク質の中和ならびに、マクロファージ及び樹状細胞による取り込み)である。各種の戦略が、抗体、抗原結合フラグメント又は抗体模倣物の血清半減期を延長させるために使用され得る。例えば、ポリシアル酸(PSA)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、アルブミン結合リガンド及び炭水化物のシールドを結合させることにより;血清タンパク質、例えば、アルブミン、IgG、FcRn及びトランスフェリンに結合するタンパク質への遺伝子融合により;血清タンパク質、例えば、ナノボディ、Fab、DARPin、avimer、アフィボディ及びアンチカリンに結合する他の結合部分に(遺伝的又は化学的に)結合させることにより;アルブミンもしくはアルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質、抗体のFc領域への遺伝子融合により;又は、ナノキャリア、遅効性製剤又は医療機器内への組み込みによる。
多くの要因が、タンパク質のin vivoにおける半減期に影響を及ぼし得る。例えば、腎臓でのろ過、肝臓での代謝、タンパク質分解酵素(プロテアーゼ)による分解及び免疫原性応答(例えば、抗体によるタンパク質の中和ならびに、マクロファージ及び樹状細胞による取り込み)である。各種の戦略が、抗体、抗原結合フラグメント又は抗体模倣物の血清半減期を延長させるために使用され得る。例えば、ポリシアル酸(PSA)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、アルブミン結合リガンド及び炭水化物のシールドを結合させることにより;血清タンパク質、例えば、アルブミン、IgG、FcRn及びトランスフェリンに結合するタンパク質への遺伝子融合により;血清タンパク質、例えば、ナノボディ、Fab、DARPin、avimer、アフィボディ及びアンチカリンに結合する他の結合部分に(遺伝的又は化学的に)結合させることにより;アルブミンもしくはアルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質、抗体のFc領域への遺伝子融合により;又は、ナノキャリア、遅効性製剤又は医療機器内への組み込みによる。
本発明は、眼におけるヒアルロナンと特異的に結合するペプチドタグを提供する。ヒアルロナンは、身体における多くの臓器、組織において、種々のサイズで存在する。例えば、ヒトの眼及び滑液はそれぞれ、0.14〜0.338mg/ml及び1.42〜3.6mg/mlの最高濃度のヒアルロナン濃度を含む。一方、他の組織/体液は、非常に低い濃度のヒアルロナンを含む。例えば、血清では、ヒアルロナン濃度は、0.00001〜0.0001mg/mlである(Laurent and Fraser, 1986 Ciba Found Symp. 1986;124:9-29)。眼以外におけるヒアルロナンは、急速に分解され、代謝回転される、主に低分子量のポリマーからなる。ヒトにおいて、ヒアルロナンは、血中で2.5〜5分の半減期を有する(Fraser JR, Laurent TC, Pertoft H, Baxter E. Biochem J. 1981 Nov 15;200(2):415-24)。対照的に、眼におけるヒアルロナンは、主に高分子量のポリマー(>0.5×10^5ダルトン)からなり、数日又は数週間のより遅い代謝回転速度を有する(Laurent and Fraser, Exp. Eye Res. 1983; 36, 493-504)。眼におけるヒアルロナンのサイズ及び代謝回転のこれらの違いにより、前記眼におけるヒアルロナンは、HA結合性のペプチドタグに結合した硝子体内タンパク質及び核酸に対する持続性放出の足場として機能すると推定される。
推定のヒアルロナン結合タンパク質は、当分野において記載されており(J. Necas, L. Bartosikova, P. Brauner, J. Kolar. Veterinarni Medicina, 53, 2008 (8): 397-411)、例えば、腫瘍壊死因子誘導遺伝子6タンパク質(TSG6)、ヒアルロナン媒介性運動性受容体(RHAMM)、CD44抗原、ヒアルロナン及びプロテオグリカン結合タンパク質4、ニューロカンコアタンパク質、スタビリン−2及びヒトグリアヒアルロン酸結合タンパク質である。ただし、試験されたほとんどの推定のヒアルロナン結合タンパク質は、HAと結合せず、前記推定のHA結合タンパク質に結合したタンパク質又は核酸の眼における半減期を増大させなかった。本発明は、眼におけるHAと結合し、タンパク質又は核酸の眼における半減期を延長させ、タンパク質又は核酸の眼における最終濃度を増大させ、眼においてタンパク質又は核酸の眼におけるクリアランスを低下させ、及び/又は、タンパク質又は核酸の眼における平均滞留時間を増大させるのに適している、ペプチドタグの驚くべき発見に基づいている。本発明の特定の態様では、前記ペプチドタグは、9.0μM以下、8.5μM以下、8.0μM以下、7.5μM以下、7.0μM以下、6.5μM以下、6.0μM以下、5.5μM以下、5.0μM以下、4.5μM以下、4.0μM以下、3.5μM以下、3.0μM以下、2.5μM以下、2.0μM以下、1.5μM以下、1.0μM以下、0.5μM以下、又は100nM以下のKDで、眼におけるHAと結合する。より具体的な態様では、例えば、前記ペプチドタグは、8.0μM以下、7.2μM以下、6.0μM以下又は5.5μM以下のKDで、眼におけるHAと結合する。本発明の一部の態様では、HAと結合する前記ペプチドタグは、LINKドメインを有する。本発明の特定の他の態様では、前記LINKドメインは、TSG−6 LINKドメインである。本発明のさらに他の態様は、タンパク質分解的開裂及び/又はグリコシル化にも抵抗性を有する、前記ペプチドタグの修飾型の発見に基づいている。より具体的には、本発明は、HAと結合するか、又は、結合可能な、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含むペプチドタグを含んでもよい。配列番号32、33、34、35又は36の配列を含む前記ペプチドタグは、対象の眼におけるHAと結合するか、又は、結合可能であると考えられる。前記ペプチドタグは、表1に列記されたペプチドタグのいずれか1つであり得ると考えられる。より具体的には、前記ペプチドタグは、HA10、HA10.1、HA10.2、HA11又はHA11.1であり得る。
特定の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号32、33、34、35又は36の、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97又は98個の連続するアミノ酸を含む配列を有し得る。特定の他の態様では、ペプチドタグは、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含むペプチドタグのトランケート変異体であると考えられる。アミノ酸は、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含む前記ペプチドタグのN−末端、C−末端又は両方から開裂して、ペプチドタグHA10、HA10.1、HA10.2、HA11又はHA11.1のトランケート変異体を産生してもよい。前記配列は、配列番号32、33、34、35又は36のN−末端から、最初のN−末端システイン(ただし、このN−末端システインは含まない)まで開裂してもよいとさらに考えられる。前記配列は、配列番号32、33、34、35又は36のC−末端から、最初のC−末端システイン(ただし含まない)まで開裂してもよいとさらに考えられる。前記配列は、配列番号32、33、34、35又は36のN−末端及びC−末端の両方から、最初のN−末端システイン(ただし、このC−末端システインは含まない)及び最初のC−末端システインまで(ただし、このC−末端システインは含まない)開裂してもよいとさらに考えられる。例えば、配列番号32について、当業者は、N−末端から22個までのアミノ酸(太字)、及び/又は、C−末端から6個までのアミノ酸(下線)を除去し得た。
GVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGY PIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAK(配列番号32)
GVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGY PIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNPHAK(配列番号32)
本発明のペプチドタグは、分子に結合して、前記分子の眼における半減期を延長させることができ、例えば、前記分子は、タンパク質又は核酸でもよい。本願明細書に記載されたタンパク質タグにより修飾され得るタンパク質及び核酸の具体例としては、限定されるものではないが、抗体、抗原結合フラグメント、治療用タンパク質、タンパク質受容体、DARPin及び/又はアプタマーならびに多価の組み合わせタンパク質及び核酸があげられる。特定の態様では、これらのタンパク質及び核酸は、眼におけるターゲットタンパク質、例えば、VEGF、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、Il−1β、IL−17A、TNFα、IL−10又はFGFR2と結合する。特定の理論に拘束されるものではないが、本発明のペプチドタグは、眼におけるターゲットタンパク質と結合するタンパク質又は核酸に結合した場合、タグ付けされていない分子に対して、眼におけるクリアランスを低下させ、平均滞留時間を増大させ、半減期(T1/2)を増大させ、及び/又は、タグ付き分子(例えば、タンパク質又は核酸)の眼における最終薬剤濃度を増大させる。
本発明は、眼におけるHAと結合するか、又は、結合可能なペプチドタグを、分子(例えば、タンパク質又は核酸)に結合させることが、前記タグを含まない分子と比較して、ペプチドタグ付き分子の生物物理学的特性を明らかに改善するという驚くべき発見にも関する。前記ペプチドタグ付き分子の生物物理学的特性は、ペプチドタグを含まない分子と比較して、統計学的に有意な量(すなわち、p<0.05)を改善すると考えられる。例えば、限定されるものではないが、タグ付けされていない型の前記分子に対して、改善された溶解性、改善された等電点(pI)及び/又はそのターゲットに対する前記ペプチドタグ付き分子の改善された結合親和性である。具体的な態様では、本発明は、分子の溶解性を増大させる方法であって、眼におけるHAと結合するペプチドタグに、前記分子を結合させる工程を含む方法に関する。具体的な態様では、本発明は、分子のpIを増大させる方法であって、眼におけるHAと結合するペプチドタグに、前記分子を結合させる工程を含む方法に関する。特定の態様では、前記ペプチドタグの分子への結合は、タグ付けされていない分子と比較して、3倍までpIを増大させる。他の態様では、前記ペプチドタグ付き分子のpIは、タグ付けされていない分子と比較して、2.8、2.5、2.0、1.75、1.5、1.0又は0.5倍まで増大する。
具体的な態様では、本発明は、そのターゲットへの分子の結合親和性を増大させる方法であって、眼におけるHAと結合するペプチドタグに、前記分子を結合させる工程を含む方法に関する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグの分子への結合は、135倍、130倍、120倍、110倍、100倍、90倍、80倍、75倍、50倍、40倍、30倍、20倍、15倍 10倍、7.5倍、5倍、4倍、2倍、1.75倍、主なターゲットに対する前記分子の結合親和性を改善する。前記ぺプチドタグ付き分子は、9.0μM、8.0μM、6.0μM又は5.5μM以下のKDで、眼におけるHAと結合すると考えられる。配列番号32、33、34、35又は36の配列を含むペプチドタグは、前記タグを含まない分子と比較した場合、結合した分子の生物物理学的特性を統計学的に有意な程度に改善するとも考えられる。眼におけるHAに対する結合親和性を改善するために、複数のペプチドタグが、本願明細書に記載された方法のいずれかに使用されてもよいとさらに考えられる。より具体的には、例えば、1.0μM、0.9μM、0.8μM、0.7μM、0.6μM、0.5μM、0.4μM、0.3μM、0.2μM又は0.1μM以下のKDでHAと結合する、2つ以上のペプチドタグを含むペプチドタグ付き分子である。
本発明の特定の態様では、1つのペプチドタグが、分子、例えば、タンパク質又は核酸分子に結合すると考えられる。本発明の他の態様では、2、3、4又はそれ以上のペプチドタグが、前記タンパク質又は核酸に結合してもよいと考えられる。前記ペプチドタグが、前記タンパク質のカルボキシ−末端又はアミノ−末端のいずれかに結合すると考えられる。前記ペプチドタグは、抗体もしくはその抗原結合フラグメントの重鎖もしくは軽鎖に結合してもよく、あるいは、両鎖に結合してもよいとも考えられる。ペプチドタグは、前記核酸分子の5’及び/又は3’に結合してもよいと考えられる。複数のタグが鎖状につながれ、及び/又は、複数のタンパク質鎖に結合し(例えば、重鎖及び軽鎖に結合し)てもよい。前記タンパク質タグ及び/又はタンパク質及び/又は核酸は、翻訳後に、互いに直接又はジスルフィド結合、ペプチドリンカー等を介してのいずれかで化学的に結合してもよいとも考えられる。タンパク質タグをタンパク質(例えば、抗体及び抗原結合フラグメント)又は核酸に結合するペプチドリンカー及び方法は、当分野において公知であり、本願明細書に記載されている。
ペプチドタグ付き分子
本発明の別の態様は、ペプチドタグ付き分子を含む。本発明の特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、HAと結合するか、又は、結合可能なペプチドタグを含んでもよい。特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、9.0μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、8.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、7.2μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、5.5μM以下のKDでHAと結合する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含んでもよい。前記ペプチドタグは、タンパク質である分子又は核酸である分子に結合するとも考えられる。タンパク質タグに結合し得る分子の例は、本願明細書に記載されている。
本発明の別の態様は、ペプチドタグ付き分子を含む。本発明の特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、HAと結合するか、又は、結合可能なペプチドタグを含んでもよい。特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、9.0μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、8.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、7.2μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、5.5μM以下のKDでHAと結合する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含んでもよい。前記ペプチドタグは、タンパク質である分子又は核酸である分子に結合するとも考えられる。タンパク質タグに結合し得る分子の例は、本願明細書に記載されている。
タンパク質分子
本発明は、本発明のペプチドタグに結合し得るタンパク質を提供する。本発明の特定の態様では、前記タンパク質は、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、Fab、scFv、Fcトラップ等)、治療用タンパク質(EPO、インスリン、サイトカイン等)、タンパク質受容体(例えば、EPO受容体、FGFR2等)であるタンパク質又はDARPinでもよい。本発明の特定の態様では、前記タンパク質は、VEGF、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL−1β、IL−17A、TNFα、IL−10又はFGFR2と結合するか、又は、結合可能である。さらに、前記タンパク質の結合は、眼において起こると考えられる。
本発明は、本発明のペプチドタグに結合し得るタンパク質を提供する。本発明の特定の態様では、前記タンパク質は、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、Fab、scFv、Fcトラップ等)、治療用タンパク質(EPO、インスリン、サイトカイン等)、タンパク質受容体(例えば、EPO受容体、FGFR2等)であるタンパク質又はDARPinでもよい。本発明の特定の態様では、前記タンパク質は、VEGF、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL−1β、IL−17A、TNFα、IL−10又はFGFR2と結合するか、又は、結合可能である。さらに、前記タンパク質の結合は、眼において起こると考えられる。
本発明の一態様は、VEGFと結合するタンパク質を含む。数多くのVEGF結合タンパク質が、当分野において公知であり、本願明細書に記載されている。例えば、表1、9及び9bを参照のこと。特定の態様では、抗VEGF結合タンパク質は、NVS4、NVS80、NVS81、NVS82、NVS83、NVS84又はNVS85の配列を有してもよい。特定の具体的な態様では、例えば、本発明は、VEGFと特異的に結合する抗体及び抗原結合フラグメントも提供する。本発明のVEGF抗体及び抗原結合フラグメントとしては、限定されるものではないが、米国特許出願公開第20120014958号明細書又は国際公開第1998045331号パンフレットにおいて単離され、記載された抗体及びフラグメント、ならびに、本願明細書、例えば、表1及び実施例に記載された抗体及び抗原結合フラグメントがあげられる。本願明細書に記載されたタンパク質タグに結合することができ、本願明細書に記載された方法に使用することができる、他の抗VEGF抗体、VEGFアンタゴニスト及びVEGF受容体アンタゴニストとしては、例えば、ラニビズマブ(Ferrara N, Damico L, Shams N, Lowman H, Kim R. Retina. 2006 Oct;26(8):859-70)、ベバシズマブ(Ferrara N, Hillan KJ, Gerber HP, Novotny W. Nat Rev Drug Discov. 2004 May;3(5):391-400)、アフリベルセプト(Stewart MW, Grippon S, Kirkpatrick P. Nat Rev Drug Discov. 2012 Mar 30; 11 (4):269-70)、KH902(Zhang M, Zhang J, Yan M, Li H, Yang C, Yu D. Mol Vis. 2008 Jan 10; 14:37-49)、MP0112(Campochiaro PA, Channa R, Berger BB, Heier JS, Brown DM, Fiedler U, Hepp J, Stumpp MT. Am J Ophthalmol. 2013 Apr; 155(4):697-704)、ペガプタニブ(Gragoudas ES, Adamis AP, Cunningham ET Jr, Feinsod M, Guyer DR. N Engl J Med. 2004 Dec 30;351 (27):2805-16)、CT−322(Dineen SP, Sullivan LA, Beck AW, Miller AF, Carbon JG, Mamluk R, Wong H, Brekken RA. BMC Cancer. 2008 Nov 27;8:352. doi: 10.1186/1471 -2407-8-352)ならびに、米国特許出願公開第20120014958号明細書に記載された抗VEGF抗体及びフラグメントがあげられる。
本発明の具体的な態様は、VEGFタンパク質と特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、配列番号7のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む抗体を提供する。本発明は、VEGFタンパク質と特異的に結合する抗体であって、前記抗体、抗原結合フラグメントが、配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体も提供する。本発明は、VEGFタンパク質と特異的に結合する抗体であって、前記抗体、抗原結合フラグメントが、配列番号21、23、25、27又は29のアミノ酸配列を含むペプチドタグ付き重鎖を有する抗体も提供する。本発明は、VEGFタンパク質(例えば、ヒト、カニクイザル、ラット及び/又はマウスのVEGF)に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、以下の表1に列記されたVH CDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む抗体も提供する。特に、本発明は、VEGFタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、以下の表1に列記されたVH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する、1、2、3又はそれ以上のVH CDRを含む(あるいは、表1に列記されたVH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する、1、2、3又はそれ以上のVH CDRからなる)抗体を提供する。
本発明は、VEGFタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、配列番号17のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体を提供する。本発明は、VEGFタンパク質と特異的に結合する抗体であって、前記抗体、抗原結合フラグメントが、配列番号19のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体も提供する。本発明は、VEGFタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、以下の表1に列記されたVL CDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む抗体も提供する。特に、本発明は、VEGFタンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記抗体が、以下の表1に列記されたVL CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する、1、2、3又はそれ以上のVL CDRを含む(あるいは、表1に列記されたVL CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する、1、2、3又はそれ以上のVL CDRからなる)抗体を提供する。
本発明の別の態様は、本願明細書に記載されたペプチドタグに結合し得る更なるタンパク質を提供する。特定の態様では、前記タンパク質は、因子P、因子D、Epo、C5、TNFα、Il−1β、Il−17a及び/又はFGFR2と結合する抗体又は抗原結合フラグメントである。特定の態様では、前記タンパク質は、治療用タンパク質、例えば、エリスロポエチン、インスリン、ヒト成長因子、インターロイキン−10、補体因子H、CD35、CD46、CD55、CD59、補体因子I、補体受容体1−関連(CRRY)、神経成長因子、アンギオスタチン、色素上皮誘導因子、エンドスタチン、毛様体神経栄養因子、補体因子1阻害剤、補体因子様−1、補体因子I等でもよい。他の態様では、前記タンパク質は、受容体、例えば、EPORでもよい。ペプチドタグに結合し得るタンパク質の更なる例は、表2、8及び8bに提供される。より具体的には、前記タンパク質は、NVS70、NVS71、NVS72、NVS73、NVS74、NVS75、NVS76、NVS77、NVS78又はNVS90でもよい。
本発明の他のタンパク質は、変異しており、さらに、表1、2、8b又は9bに記載された配列に対して、少なくとも60、70、80.85、90、95、96、97、98又は99パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、それは、1、2、3、4又は5個以下のアミノ酸が表1、2、8b又は9bに記載された配列において変異している、変異アミノ酸配列を含む。
本発明は、本願明細書に記載されたタンパク質分子をコードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳類の細胞中での発現に最適化され得る。
核酸分子
本発明は、本発明のペプチドタグに結合し得る核酸を提供する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する核酸は、mRNA又はRNAi剤、リボザイム又はアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するRNAi剤は、siRNA、shRNA、マイクロRNA(すなわち、miRNA)、抗マイクロRNAオリゴヌクレオチド、アプタマー等でもよい。特定の具体的な態様では、前記核酸分子は、アプタマーでもよい。特に、前記アプタマーは、PDGF−BBと結合し得る。より具体的には、前記核酸は、NVS79でもよい。
本発明は、本発明のペプチドタグに結合し得る核酸を提供する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する核酸は、mRNA又はRNAi剤、リボザイム又はアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するRNAi剤は、siRNA、shRNA、マイクロRNA(すなわち、miRNA)、抗マイクロRNAオリゴヌクレオチド、アプタマー等でもよい。特定の具体的な態様では、前記核酸分子は、アプタマーでもよい。特に、前記アプタマーは、PDGF−BBと結合し得る。より具体的には、前記核酸は、NVS79でもよい。
ペプチドリンカー
本発明の特定の態様では、前記タンパク質タグは、リンカーにより分子に結合させてもよい。より具体的には、前記タンパク質タグは、最適化された長さ及び/又はアミノ酸組成を有するペプチドリンカー(例えば、(Glyn−Sern)n又は(Sern−Glyn)nリンカー)により、タンパク質又は核酸に結合させてもよい。ペプチドリンカー長は、結合したタンパク質の折り畳み及び相互作用の態様にかなりの影響を及ぼし得ることが公知である。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第2005/0100543号、同第2005/0175606号、同第2007/0014794号明細書ならびに国際公開第2006/020258号及び同第2007/024715号パンフレットを参照のこと。これらの文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。
本発明の特定の態様では、前記タンパク質タグは、リンカーにより分子に結合させてもよい。より具体的には、前記タンパク質タグは、最適化された長さ及び/又はアミノ酸組成を有するペプチドリンカー(例えば、(Glyn−Sern)n又は(Sern−Glyn)nリンカー)により、タンパク質又は核酸に結合させてもよい。ペプチドリンカー長は、結合したタンパク質の折り畳み及び相互作用の態様にかなりの影響を及ぼし得ることが公知である。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第2005/0100543号、同第2005/0175606号、同第2007/0014794号明細書ならびに国際公開第2006/020258号及び同第2007/024715号パンフレットを参照のこと。これらの文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。
前記ペプチドリンカーの配列は、長さが少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75個又はそれ以上のアミノ酸残基でもよい。前記ペプチドリンカーの配列には、天然由来又は非天然由来のアミノ酸が含まれてもよい。一部の態様では、前記リンカーは、グリシンポリマーである。一部の態様では、アミノ酸であるグリシン及びセリンは、前記リンカー配列内のアミノ酸を構成する。特定の態様では、前記リンカー領域は、グリシン繰り返し(GlySerGly3)nのセットを含み、nは、1以上の正の整数である。より具体的には、前記リンカー配列は、GlySerGlyGlyGly(配列番号31)でもよい。あるいは、前記リンカー配列は、GlySerGlyGly(配列番号124)でもよい。特定の他の態様では、前記リンカー領域の配向は、グリシン繰り返し(SerGly3)nのセットを含み、nは、1以上の正の整数である。
前記ペプチドリンカーは、限定されるものではないが、(Gly4Ser)4又は(Gly4Ser)3も含み得る。アミノ酸残基であるGlu及びLysが、より良好な溶解性のために、前記Gly−Serペプチドリンカー内に散在し得る。特定の態様では、前記ペプチドリンカーは、(Gly3Ser)、(Gly2Ser)又は(GlySer)の複数の繰り返しを含んでもよい。特定の態様では、前記ペプチドリンカーは、(SerGly3)、(SerGly2)又は(SerGly)の複数の繰り返しを含んでもよい。他の態様では、前記ペプチドリンカーは、(Gly3Ser)+(Gly4Ser)+(GlySer)の組み合わせ及び複合体を含んでもよい。さらに他の態様では、Serは、Alaにより置き換えられ、例えば、(Gly4Ala)又は(Gly3Ala)であり得る。さらに他の態様では、前記リンカーは、モチーフ(GluAlaAlaAlaLys)nを含み、nは、1以上の正の整数である。特定の態様では、ペプチドリンカーは、開裂性リンカーも含み得る。
ペプチドリンカーは、可変性の長さのものであり得る。特に、ペプチドリンカーは、長さが約5から約50個のアミノ酸;長さが約10から約40個のアミノ酸;長さが約15から約30個のアミノ酸;又は、長さが約15から約20個のアミノ酸である。ペプチドリンカーの長さの変化は、活性を保持又は増大させて、活性試験において優れた効果を生じさせ得る。ペプチドリンカーは、当分野において公知の技術を使用して、ポリペプチド及びタンパク質の配列内に導入され得る。例えば、PCR変異誘発が使用され得る。修飾は、DNA配列分析により確認され得る。プラスミドDNAは、産生されるポリペプチドの適切な産生のために、宿主細胞を形質転換するのに使用され得る。
ペプチドリンカー、ペプチドタグ及びタンパク質(例えば、抗体もしくは抗原結合フラグメント)又は核酸、又は、それらの組み合わせは、同じベクター中でコードされ、同じ宿主細胞中で発現及び構築され得る。あるいは、各ペプチドリンカー、タンパク質タグ及びタンパク質又は核酸は、別々に生成され、ついで、互いにコンジュゲートされ得る。ペプチドリンカー、ペプチドタグ及びタンパク質又は核酸は、当分野において公知の方法を使用して、前記構成成分をコンジュゲートすることにより調製され得る。部位特異的コンジュゲートは、ソルターゼ媒介性酵素的コンジュゲートを使用して達成され得る(Mao H, Hart SA, Schink A, Pollok BA. J Am Chem Soc. 2004 Mar 10; 126(9):2670-1)。各種の結合剤又は架橋剤が、共有的コンジュゲートに使用され得る。架橋剤の例としては、プロテインA、カルボジイミド、N−スクシンイミジル−S−アセチル−チオアセテート(SATA)、5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)、o−フェニレンジマレイミド(oPDM)、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)及びスルホスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(スルホ−SMCC)があげられる(例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686;Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと。)。他の方法としては、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132;Brennan et al., 1985 Science 229:81-83)及びGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載されたものがあげられる。コンジュゲート剤は、両方ともPierce Chemical Co.(Rockford、IL)から入手できる、SATA及びスルホ−SMCCである。
延長した半減期を有する操作及び修飾された分子
ペプチドタグ付き分子の産生
本発明は、他の分子、例えば、他のタンパク質又は核酸と、組換え的に融合(すなわち、結合)し得るか、又は、化学的にコンジュゲート(例えば、共有的コンジュゲート及び非共有的コンジュゲートの両方)し得る、ペプチドタグを提供する。特定の態様では、1、2、3、4又はそれ以上のペプチドタグが、タンパク質又は核酸と、組換え的に融合し、結合し、又は、化学的にコンジュゲートしてもよい。特定の態様では、前記ペプチドタグは、HAと結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、HAと結合し、LINKドメインを含む。他の多様では、前記ペプチドタグは、HAと結合し、TSG−6 LINKドメインを含む。より具体的には、前記ペプチドタグは、HA10(配列番号32)、HA10.1(配列番号33)、HA10.2(配列番号34)、HA11(配列番号35)又はHA11.1(配列番号36)でもよいと考えられる。さらに、前記タンパク質は、本願明細書に記載されたタンパク質、抗体又は抗原結合フラグメントのいずれか、例えば、限定されるものではないが、上記及び表1、2、2b、8b及び9b、ならびに、米国特許出願公開第20120014958号明細書、国際公開第2012015608号、同第2012149246号パンフレット、米国特許第8273352号明細書、国際公開第1998045331号パンフレット、米国特許出願公開第2012100153号明細書及び国際公開第2002016436号パンフレットに記載されたタンパク質、抗体及び抗原結合フラグメントでもよい。
ペプチドタグ付き分子の産生
本発明は、他の分子、例えば、他のタンパク質又は核酸と、組換え的に融合(すなわち、結合)し得るか、又は、化学的にコンジュゲート(例えば、共有的コンジュゲート及び非共有的コンジュゲートの両方)し得る、ペプチドタグを提供する。特定の態様では、1、2、3、4又はそれ以上のペプチドタグが、タンパク質又は核酸と、組換え的に融合し、結合し、又は、化学的にコンジュゲートしてもよい。特定の態様では、前記ペプチドタグは、HAと結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、HAと結合し、LINKドメインを含む。他の多様では、前記ペプチドタグは、HAと結合し、TSG−6 LINKドメインを含む。より具体的には、前記ペプチドタグは、HA10(配列番号32)、HA10.1(配列番号33)、HA10.2(配列番号34)、HA11(配列番号35)又はHA11.1(配列番号36)でもよいと考えられる。さらに、前記タンパク質は、本願明細書に記載されたタンパク質、抗体又は抗原結合フラグメントのいずれか、例えば、限定されるものではないが、上記及び表1、2、2b、8b及び9b、ならびに、米国特許出願公開第20120014958号明細書、国際公開第2012015608号、同第2012149246号パンフレット、米国特許第8273352号明細書、国際公開第1998045331号パンフレット、米国特許出願公開第2012100153号明細書及び国際公開第2002016436号パンフレットに記載されたタンパク質、抗体及び抗原結合フラグメントでもよい。
特定の具体的な態様では、本発明は、抗体又は抗原結合フラグメントと、ペプチドタグとを含むペプチドタグ付き分子を提供する。特に、本発明は、本願明細書に記載された抗体の抗原結合フラグメント(例えば、Fabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、(Fab’)2フラグメント、VHドメイン、VH CDR、VLドメイン又はVL CDR)と、ペプチドタグとを含むペプチドタグ付き分子を提供する。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを、抗体又は抗原結合フラグメントと結合、融合又はコンジュゲートするための方法は、当分野において公知であり、当業者に公知の標準的な分子生物学的技術を使用して行われてもよい。例えば、米国特許第5,336,603号、同第5,622,929号、同第5,359,046号、同第5,349,053号、同第5,447,851号及び同第5,112,946号明細書;欧州特許第307,434号及び同第367,166号明細書;国際公開第96/04388号及び同第91/06570号パンフレット;Ashkenazi et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539;Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600;及び、Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1 1337- 11341;Hermanson (2008) Bioconjugate Techniques (2nd edition). Elsevier, Incを参照のこと。
更なる融合タンパク質が、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング及び/又はコドンシャッフリング(まとめて、「DNAシャッフリング」と呼ばれる)の技術により生成されてもよい。DNAシャッフリングは、本発明の抗体もしくはそのフラグメントの活性を変化させるために使用されてもよいし(例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体もしくはそのフラグメント)、及び/又は、ペプチドタグもしくはタンパク質の活性を変化させるために使用されてもよい(例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有するペプチドタグ及び/もしくはタンパク質)。一般的には、米国特許第5,605,793号、同第5,811,238号、同第5,830,721号、同第5,834,252号及び同第5,837,458号明細書;Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33;Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82;Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76;及び、Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313, (Pluckthun, 2012), (Wittrup, 2001), (Levin and Weiss, 2006)を参照のこと。抗体もしくはそのフラグメント又は前記コードされた抗体もしくはそのフラグメントは、組換え前に、エラープローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入又は他の方法によるランダム変異誘発に供されることにより変化させてもよい。眼における治療ターゲット(例えば、タンパク質であるVEGF)に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、1つ以上の異種分子及び/又はHAと結合するペプチドタグの、1つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメント等により組み換えられてもよい。
さらに、前記抗体もしくは抗原結合フラグメント及び/又はペプチドタグは、マーカー配列、例えば、精製を容易にするペプチドに融合され得る。例えば、前記マーカーのアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、中でも、例えば、pQEベクター(QIAGEN(登録商標),Inc.、9259 Eton Avenue、Chatsworth、CA、91311)において提供されるマーカーである。それらの多くは市販されている。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821 -824に記載されたように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、前記融合タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製に有用な他のタグとしては、限定されるものではないが、ヘマグルチニンタグ及び「フラッグ」タグがあげられる。前記ヘマグルチニンタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する(Wilson et al., 1984, Cell 37:767)。
他の実施形態では、抗体もしくは抗原結合フラグメント及び/又はペプチドタグは、診断剤又は検出剤にコンジュゲートされてもよい。このような抗体及び/又はペプチドタグは、臨床試験法の一部として、疾患又は障害の開始、進行、進展及び/又は重症度をモニター又は診断する、例えば、具体的な治療の効果を決定するのに有用であり得る。このような診断及び検出は、前記抗体を、検出物質、例えば、限定されるものではないが、種々の酵素、例えば、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ;補欠分子族、例えば、限定されるものではないが、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチン;蛍光物質、例えば、限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリスリン;発光物質、例えば、限定されるものではないが、ルミノール;生体発光物質、例えば、限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン;放射性物質、例えば、限定されるものではないが、ヨウ素(131I、125I、123I及び121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In及び111In)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及び117Tin;ならびに、種々の陽電子放出断層撮影法を使用する陽電子放出金属、ならびに、非放射性常磁性金属イオンに結合させることにより達成され得る。
抗体又は抗原結合フラグメント及びペプチドタグは、固体支持体にも結合し得る。前記固体支持体は、ターゲット抗原の免疫アッセイ又は精製に特に有用である。このような固体支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニル又はポリプロピレンがあげられる。
前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子のその特異的ターゲットへの結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、放射性免疫アッセイ(REA)、FACS分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)又はウェスタンブロットアッセイにより確認され得る。これらのアッセイはそれぞれ、一般的に、特定の所望のタンパク質−リガンド複合体の存在を、所望の前記複合体に特異的な標識化試薬(例えば、抗体)を使用することにより検出する。
ペプチドタグに結合した抗VEGF抗体及び抗原結合フラグメント
本発明は、抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントに結合することにより、前記抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントの眼における半減期を延長する、ペプチドタグも提供する。
本発明は、抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントに結合することにより、前記抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントの眼における半減期を延長する、ペプチドタグも提供する。
特定の態様では、前記ペプチドタグは、HAと結合するペプチドタグであり、抗VEGF抗体に結合する。一態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、9.0μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。一態様では、前記ペプチドタグは、8.0μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、7.2μM以下のKDでHAと結合する。一態様では、前記ペプチドタグは、5.5μM以下のKDでHAと結合する。HAと結合する前記ペプチドタグは、LINKドメイン、TSG−6 LINKドメイン又は、配列番号32、33、34、35もしくは36の配列を有する特定のペプチドタグであり得る。特定の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号1、2及び3の配列を有する重鎖CDRを含む、VEGF結合抗体又は抗原結合フラグメント(例えば、Fab等)に結合する。他の態様では、ペプチドタグは、それぞれ配列番号11、12及び13の配列を有する軽鎖CDRを含む、VEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、ペプチドタグは、それぞれ配列番号1、2及び3の配列を有する重鎖CDR、ならびに、それぞれ配列番号11、12及び13の配列を有する軽鎖CDRを含む、VEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、ペプチドタグは、配列番号7の配列を有する可変重鎖を含む、VEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、ペプチドタグは、配列番号17の配列を有する可変軽鎖を含む、VEGF結合抗体又はその抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、ペプチドタグは、それぞれ配列番号7及び17の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、VEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、ペプチドタグは、配列番号9の配列を有する重鎖を含む、VEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、ペプチドタグは、配列番号19の配列を有する軽鎖を含む、VEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、ペプチドタグは、それぞれ配列番号9及び29の配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、VEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、ペプチドタグは、それぞれ配列番号9及び29の配列を有する重鎖及び軽鎖を含む、VEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号21、23、25、27又は29の配列を有してもよい。他の具体的な態様では、前記ペプチドタグに結合するVEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号21及び19;それぞれ配列番号23及び19;それぞれ配列番号25及び19;それぞれ配列番号27及び19;それぞれ配列番号29及び19;それぞれ配列番号163及び164の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグに結合するVEGF結合抗原結合フラグメントは、配列番号166の配列を有するscFVである。
特定の態様では、それぞれ配列番号1、2及び3の配列を有する重鎖CDR、ならびに、それぞれ配列番号11、12及び13の配列を有する軽鎖CDRを含む、VEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントは、前記軽鎖、前記重鎖に結合したペプチドタグを有してもよく、及び/又は、一方の鎖もしくは両方の鎖に複数のタグを有してもよい。より具体的には、前記ペプチドタグ付きVEGF結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号173及び174;それぞれ175及び176;それぞれ177及び178;それぞれ179及び180;それぞれ181及び182の配列を有する重鎖及び軽鎖を有していてもよい。
配列番号32、33、34、35又は36の配列を有するペプチドタグは、ラニビズマブ(Ferrara et al., 2006)、ベバシズマブ(Ferrara et al., 2004)、MP0112(Campochiaro et al, 2013)、KH902(Zhang et al., 2008)又は、アフリベルセプト(Stewart et al., 2012)に結合してもよい。
ペプチドタグに結合する他の抗体又は抗原結合フラグメント
本発明は、C5、因子P、EPO、因子D、TNFα又はIl−1βと結合する抗体又は抗原結合フラグメントに結合することにより、前記抗体又は抗原結合フラグメントの眼における半減期を延長する、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含むペプチドタグも提供する。特定の態様では、配列番号32、33、34、35又は36の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号37、38及び39の配列を有する重鎖CDRを含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメント(例えば、Fab等)に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号46、47及び48の配列を有する軽鎖CDRを含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号37、38及び39の配列を有する重鎖CDR、ならびに、それぞれ配列番号46、47及び48の配列を有する軽鎖CDRを含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号40の配列を有する可変重鎖を含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号49の配列を有する可変軽鎖を含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号40及び49の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号44の配列を有してもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するC5結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号44及び51の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
本発明は、C5、因子P、EPO、因子D、TNFα又はIl−1βと結合する抗体又は抗原結合フラグメントに結合することにより、前記抗体又は抗原結合フラグメントの眼における半減期を延長する、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含むペプチドタグも提供する。特定の態様では、配列番号32、33、34、35又は36の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号37、38及び39の配列を有する重鎖CDRを含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメント(例えば、Fab等)に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号46、47及び48の配列を有する軽鎖CDRを含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号37、38及び39の配列を有する重鎖CDR、ならびに、それぞれ配列番号46、47及び48の配列を有する軽鎖CDRを含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号40の配列を有する可変重鎖を含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号49の配列を有する可変軽鎖を含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号40及び49の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、C5結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号44の配列を有してもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するC5結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号44及び51の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
特定の態様では、配列番号32、33、34、35又は36の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号75、76及び77の配列を有する重鎖CDRを含む、Epo結合抗体又は抗原結合フラグメント(例えば、Fab等)に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号86、87及び88の配列を有する軽鎖CDRを含む、Epo結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号75、76及び77の配列を有する重鎖CDR、ならびに、それぞれ配列番号86、87及び88の配列を有する軽鎖CDRを含む、Epo結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号81の配列を有する可変重鎖を含む、Epo結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号92の配列を有する可変軽鎖を含む、Epo結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号81及び92の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、Epo結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号85の配列を有してもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するEpo結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号85及び95の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
特定の態様では、配列番号32、33、34、35又は36の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号53、54及び55の配列を有する重鎖CDRを含む、因子P結合抗体又は抗原結合フラグメント(例えば、Fab等)に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号65、66及び67の配列を有する軽鎖CDRを含む、因子P結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号53、54及び55の配列を有する重鎖CDR、ならびに、それぞれ配列番号65、66及び67の配列を有する軽鎖CDRを含む、因子P結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号59の配列を有する可変重鎖を含む、因子P結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号71の配列を有する可変軽鎖を含む、因子P結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号59及び71の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、因子P結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号63の配列を有していてもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合する因子P結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号63及び73の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
特定の態様では、配列番号32、33、34、35又は36の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号108、109及び110の配列を有する重鎖CDRを含む、TNFα結合抗体又は抗原結合フラグメント(例えば、Fab等)に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号117、118及び119の配列を有する軽鎖CDRを含む、TNFα結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号108、109及び110の配列を有する重鎖CDR、ならびに、それぞれ配列番号117、118及び119の配列を有する軽鎖CDRを含む、TNFα結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号111の配列を有する可変重鎖を含む、TNFα結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号120の配列を有する可変軽鎖を含む、TNFα結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号111及び120の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、TNFα結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号113の配列を有してもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するTNFα結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号115および122の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
特定の態様では、配列番号32、33、34、35又は36の配列を有するペプチドタグは、それぞれ配列番号189、190及び191の配列を有する重鎖CDRを含む、IL−1β結合抗体又は抗原結合フラグメント(例えば、Fab等)に結合する。他の態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号198、199及び200の配列を有する軽鎖CDRを含む、IL−1β結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。より具体的には、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号189、190及び191の配列を有する重鎖CDR、ならびに、それぞれ配列番号198、199及び200の配列を有する軽鎖CDRを含む、IL−1β結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号193の配列を有する可変重鎖を含む、IL−1β結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。さらに他の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号201の配列を有する可変軽鎖を含む、IL−1β結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。更なる態様では、前記ペプチドタグは、それぞれ配列番号193及び201の配列を有する可変重鎖及び可変軽鎖を含む、IL−1β結合抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。特定の態様では、前記ペプチドタグに結合する重鎖は、配列番号194の配列を有していてもよい。より具体的には、前記ペプチドタグに結合するTNFα結合抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号196及び202の配列を有するペプチドタグ付き重鎖及び軽鎖を有する。
特定の態様では、配列番号32、33、34、35又は36の配列を有するペプチドタグは、国際公開第2010/015608号又は同第2012/149246号パンフレットに記載されたC5、Epo又は因子Pと結合する抗体又は抗原結合フラグメントに結合する。同文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。
相同タンパク質
本発明は、本願明細書に記載された配列に相同なタンパク質及びペプチドタグも提供する。より具体的には、本発明は、表1、2、8、8b、9及び9bに記載された配列に相同なアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。前記タンパク質又はペプチドタグは、眼における各ターゲットに結合し、表1、2、8、8b、9、9b及び実施例に記載された、それらのタンパク質及びペプチドタグの所望の機能的特性を保持している。
本発明は、本願明細書に記載された配列に相同なタンパク質及びペプチドタグも提供する。より具体的には、本発明は、表1、2、8、8b、9及び9bに記載された配列に相同なアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。前記タンパク質又はペプチドタグは、眼における各ターゲットに結合し、表1、2、8、8b、9、9b及び実施例に記載された、それらのタンパク質及びペプチドタグの所望の機能的特性を保持している。
例えば、本発明は、抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントと、本願明細書に記載された配列に相同なペプチドタグとを提供する。より具体的には、本発明は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変ドメインが、配列番号7のアミノ酸配列に対して、少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含み;前記軽鎖可変ドメインが、配列番号17のアミノ酸配列に対して、少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含み;前記抗体が、VEGFに特異的に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の特定の態様では、前記重鎖及び軽鎖の配列は、さらに、Kabatにより定義された、例えば、それぞれ配列番号1、2、3、11、12及び13のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3の配列を含む。本発明の特定の他の態様では、前記重鎖及び軽鎖の配列は、さらに、chothiaにより定義された、例えば、それぞれ配列番号4、5、6、14、15及び16のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3の配列を含む。
他の実施形態では、前記VH及び/又はVLのアミノ酸配列は、表1及び2において説明された前記配列に対して、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上同一でもよい。他の実施形態では、前記VH及び/又はVLのアミノ酸配列は、1、2、3、4又は5個以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除いて同一でもよい。表1及び2に記載されたもののVH及びVL領域に対して、<100%の配列同一性を有するVH及びVL領域を有する抗体は、表1及び2に記載された核酸分子(例えば、それぞれ配列番号7及び配列番号17をコードする核酸分子等)の変異誘発(例えば、部位直接的又はPCR媒介性変異誘発)によって得られ、続けて、本願明細書及び米国特許出願公開第20120014958号明細書に記載された機能性アッセイを使用して、コードされた変異抗体の保持された機能を試験する。
他の実施形態では、全長の重鎖及び/又は全長の軽鎖のアミノ酸配列は、表1及び2において説明された前記配列に対して、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上同一でもよい。表1及び2に記載された前記重鎖及び軽鎖(例えば、配列番号9、21、23、25、17又は29のいずれかの重鎖及び配列番号19の軽鎖)に対して、高い(すなわち、80%以上)同一性を有する重鎖及び軽鎖を有する抗体が、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の変異誘発(例えば、部位直接的又はPCR媒介性変異誘発)によって得られ、続けて、本願明細書に記載された機能性アッセイを使用して、コードされた変異抗体の保持された機能を試験する。
他の実施形態では、前記全長の重鎖及び/又は全長の軽鎖のヌクレオチド配列は、表1及び2において説明された前記配列に対して、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上同一でもよい。
他の実施形態では、前記重鎖の可変領域及び/又は前記軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列は、表1及び2において説明された前記配列に対して、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上同一でもよい。前記可変性は、CDR又はフレームワーク領域にあってもよいと考えられる。
他の実施形態では、前記重鎖の可変領域及び/又は前記軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列は、表1及び2において説明された前記配列に対して、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上同一でもよい。前記可変性は、CDR又はフレームワーク領域にあってもよいと考えられる。
さらに、本発明は、表1に記載された前記配列に相同なアミノ酸配列を含むペプチドタグであり、前記ペプチドタグが、HAに結合し、本願明細書に記載されたそれらのペプチドタグの所望の機能的特性を保持する、ペプチドタグも提供する。より具体的には、前記ペプチドタグのアミノ酸配列は、表1に説明された配列に対して、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上同一でもよく、本願明細書に記載されたそれらのペプチドタグの所望の機能的特性を保持する。
本願明細書で使用する場合、2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、前記配列により共有される同一位置の数の関数である(すなわち、%同一性は、同一の位置数/位置の総数×100に等しい。)。前記ギャップは、前記2つの配列の最適なアライメントに導入される必要がある。2つの配列間の、配列比較及びパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例示に記載される数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
さらに又はあるいは、本発明のタンパク質の配列は、さらに、例えば、関連する配列を特定するために、公衆データベースに対して検索を行うための「問い合わせ配列」として使用され得る。例えば、このような検索は、Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10のBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用して行われ得る。
保存的修飾を有するタンパク質
本発明の範囲内には、保存的修飾を有する単離されたペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子がさらに含まれる。より具体的には、本発明は、表1のペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子に対して保存的修飾を有する、ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子に関する。本発明の範囲内には、保存的修飾を有する単離された抗体又は抗原結合フラグメントも含まれる。特定の態様では、本発明のペプチドタグ付き抗体は、CDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む重鎖可変領域、ならびに、CDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む軽鎖可変領域を有し、これらのCDR配列の1つ以上が、本願明細書に記載された抗体、又は、その保存的修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、前記抗体が、本発明の抗体の所望の機能的特性を保持している。例えば、本発明は、CDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む重鎖可変領域、ならびに、CDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む軽鎖可変領域からなる、VEGF結合単離抗体又はその抗原結合フラグメントに結合し、前記重鎖可変領域CDR1のアミノ酸配列が、配列番号1及びその保存的修飾配列であり;前記重鎖可変領域CDR2のアミノ酸配列が、配列番号2及びその保存的修飾配列であり;前記重鎖可変領域CDR3のアミノ酸配列が、配列番号3及びその保存的修飾配列であり;前記軽鎖可変領域CDR1のアミノ酸配列が、配列番号11及びその保存的修飾配列であり;前記軽鎖可変領域CDR2のアミノ酸配列が、配列番号12及びその保存的修飾配列であり;前記軽鎖可変領域CDR3のアミノ酸配列が、配列番号13及びその保存的修飾配列であり;及び、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、VEGFに特異的に結合する、ペプチドタグを提供する。
本発明の範囲内には、保存的修飾を有する単離されたペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子がさらに含まれる。より具体的には、本発明は、表1のペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子に対して保存的修飾を有する、ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子に関する。本発明の範囲内には、保存的修飾を有する単離された抗体又は抗原結合フラグメントも含まれる。特定の態様では、本発明のペプチドタグ付き抗体は、CDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む重鎖可変領域、ならびに、CDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む軽鎖可変領域を有し、これらのCDR配列の1つ以上が、本願明細書に記載された抗体、又は、その保存的修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、前記抗体が、本発明の抗体の所望の機能的特性を保持している。例えば、本発明は、CDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む重鎖可変領域、ならびに、CDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む軽鎖可変領域からなる、VEGF結合単離抗体又はその抗原結合フラグメントに結合し、前記重鎖可変領域CDR1のアミノ酸配列が、配列番号1及びその保存的修飾配列であり;前記重鎖可変領域CDR2のアミノ酸配列が、配列番号2及びその保存的修飾配列であり;前記重鎖可変領域CDR3のアミノ酸配列が、配列番号3及びその保存的修飾配列であり;前記軽鎖可変領域CDR1のアミノ酸配列が、配列番号11及びその保存的修飾配列であり;前記軽鎖可変領域CDR2のアミノ酸配列が、配列番号12及びその保存的修飾配列であり;前記軽鎖可変領域CDR3のアミノ酸配列が、配列番号13及びその保存的修飾配列であり;及び、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、VEGFに特異的に結合する、ペプチドタグを提供する。
他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳類の細胞中での発現に最適化されており、全長の重鎖配列及び/又は全長の軽鎖配列を有し、これらの配列の1つ以上が、本願明細書に記載された抗体又はその保存的修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、前記抗体が、本発明のVEGF結合抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、哺乳類の細胞中での発現に最適化された単離された抗体であって、例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含み、前記可変重鎖が、配列番号7のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み;前記可変軽鎖が、配列番号17のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み;前記抗体が、VEGFに特異的に結合する、単離された抗体を提供する。本発明は、ペプチドタグに結合しており、哺乳類の細胞中での発現に最適化された単離された抗体であって、例えば、可変重鎖及び可変軽鎖と、ペプチドタグとを含み、前記可変重鎖が、配列番号7のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み;前記可変軽鎖が、配列番号17のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み;前記ペプチドタグが、配列番号32、33、34、35及び36から選択されるアミノ酸配列を含み、前記抗体が、VEGFに特異的に結合し、前記ペプチドタグが、HAに特異的に結合する、単離された抗体をさらに提供する。本発明は、哺乳類の細胞中での発現に最適化された単離された抗体であって、重鎖及び軽鎖と、ペプチドリンカーと、ペプチドタグとからなり、前記重鎖が、配列番号9のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み;前記軽鎖が、配列番号19のアミノ酸配列及びその保存的修飾配列を含み;前記ペプチドタグが、配列番号32、33、34、35及び36から選択されるアミノ酸配列を含み;前記抗体が、VEGFに特異的に結合し、前記ペプチドタグが、HAに特異的に結合する、単離された抗体を提供する。より具体的には、本発明は、ペプチドタグに結合している単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記結合している抗体又はフラグメントが、哺乳類の細胞中での発現に最適化されており、配列番号21、23、25、27及び29ならびにその保存的修飾配列から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号19のアミノ酸配列を有する軽鎖とからなり、前記単離された抗体が、VEGFに特異的に結合し、前記ペプチドタグが、HAに特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明の抗体及びタグを製造する方法
抗体及びペプチドタグをコードする核酸
本発明は、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び/又はペプチドタグ付き分子をコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。特定の態様では、本発明は、ペプチドタグ付きタンパク質、例えば、表1、2、2b、8b及び9bに記載された前記ペプチドタグ付きタンパク質をコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。より具体的には、本発明は、NVS1、NVS2、NVS3、NVS4、NVS36、NVS37、NVS70、NVS70T、NVS71、NVS71T、NVS72、NVS72T、NVS72、NVS73T、NVS74、NVS74T、NVS75、NVS75T、NVS76、NVS76T、NVS77、NVS77T、NVS78、NVS78T、NVS79、NVS79T、NVS80、NVS80T、NVS81、NVS81T、NVS82、NVS82T、NVS83、NVS83T、NVS84、NVS84T、NVS1b、NVS1c、NVS1d、NVS1e、NVS1f、NVS1g、NVS1h又はNVS1jをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明において、配列番号32、33、34、35及び/又は36のペプチド配列を有する、少なくとも1つのペプチドタグをコードする核酸分子も提供される。より具体的には、例えば、前記ペプチドタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号102、103、104、105及び/又は106のヌクレオチド配列を含んでもよい。
抗体及びペプチドタグをコードする核酸
本発明は、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び/又はペプチドタグ付き分子をコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。特定の態様では、本発明は、ペプチドタグ付きタンパク質、例えば、表1、2、2b、8b及び9bに記載された前記ペプチドタグ付きタンパク質をコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。より具体的には、本発明は、NVS1、NVS2、NVS3、NVS4、NVS36、NVS37、NVS70、NVS70T、NVS71、NVS71T、NVS72、NVS72T、NVS72、NVS73T、NVS74、NVS74T、NVS75、NVS75T、NVS76、NVS76T、NVS77、NVS77T、NVS78、NVS78T、NVS79、NVS79T、NVS80、NVS80T、NVS81、NVS81T、NVS82、NVS82T、NVS83、NVS83T、NVS84、NVS84T、NVS1b、NVS1c、NVS1d、NVS1e、NVS1f、NVS1g、NVS1h又はNVS1jをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明において、配列番号32、33、34、35及び/又は36のペプチド配列を有する、少なくとも1つのペプチドタグをコードする核酸分子も提供される。より具体的には、例えば、前記ペプチドタグをコードするヌクレオチド配列は、配列番号102、103、104、105及び/又は106のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明は、本願明細書に記載されたタンパク質、例えば、抗VEGF、抗EPO、抗C5、抗因子P、抗TNFα又は抗IL−1βの抗体又は抗原結合フラグメントを含むタンパク質、上記ペプチドタグ及び/又はペプチドタグ付き分子をコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。より具体的には、本発明の核酸の一部は、配列番号7に示された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、及び/又は、配列番号17に示された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の具体的な実施形態では、前記核酸分子は、表1又は表2において特定されたものである。本発明の一部の他の核酸分子は、表1又は表2において特定されたもののヌクレオチド配列に対して、実質的に同一(例えば、少なくとも65、80%、95%又は99%)であるヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現された場合、これらのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、ターゲット抗原結合能、例えば、抗VEGF、抗EPO、抗C5、抗因子P、抗TNFα又は抗IL−1βの標的抗原結合能を示し得る。
本発明では、上記で説明した抗体の重鎖又は軽鎖由来の、少なくとも1つのCDR領域及び、通常3つ全てのCDR領域をコードするポリヌクレオチドも提供される。一部の他のポリヌクレオチドは、上記で説明した抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変領域配列の全て又は実質的に全てをコードする。前記コードの縮重のために、各種の核酸配列が、免疫グロブリンのアミノ酸配列それぞれをコードしてもよい。
本発明の核酸分子は、前記抗体の可変領域及び定常領域の両方をコードし得る。本発明の核酸の一部は、(例えば、NVS4の重鎖に対して実質的に同一の)元の重鎖配列に対して、実質的に同一(例えば、少なくとも80%、90%又は99%)である、修飾された重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。一部の他の核酸配列は、(例えば、NVS4の軽鎖に対して実質的に同一の)元の軽鎖配列に対して、実質的に同一(例えば、少なくとも80%、90%又は99%)である、修飾された軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。
前記ポリヌクレオチド配列は、新たに固相DNA合成により、又は、VEGF抗体又はその結合フラグメントをコードする既存の配列(例えば、以下の実施例に記載された配列)のPCR変異誘発により産生され得る。核酸の直接的な化学合成は、当分野において公知の方法、例えば、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル法;Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル法;Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホラミダイト法;及び、米国特許第4,458,066号明細書の固体支持体法により達成され得る。PCRによりポリヌクレオチド配列に変異を誘導することは、例えば、PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990;Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991;及び、Eckert et al., PCR Methods and Applications 1 :17, 1991に記載されたように行われ得る。
本発明では、上記ペプチドタグ、タンパク質、抗体もしくは抗原結合フラグメント又はペプチドタグ付き分子、例えば、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントを産生するための、発現ベクター及び宿主細胞も提供される。より具体的には、本発明は、配列番号32、33、34、35及び/もしくは36の配列を有するペプチドタグをコードする核酸を含む発現ベクター、あるいは、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き分子をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。特定の態様では、前記発現ベクターは、表1、2、8又は9に記載されたペプチドタグ付き分子、例えば、NVS1、NVS2、NVS3、NVS4、NVS36、NVS37、NVS70、NVS70T、NVS71、NVS71T、NVS72、NVS72T、NVS72、NVS73T、NVS74、NVS74T、NVS75、NVS75T、NVS76、NVS76T、NVS77、NVS77T、NVS78、NVS78T、NVS79、NVS79T、NVS80、NVS80T、NVS81、NVS81T、NVS82、NVS82T、NVS83、NVS83T、NVS84、NVS84T、NVS1b、NVS1c、NVS1d、NVS1e、NVS1f、NVS1g、NVS1h又はNVS1jのいずれか1つをコードする核酸を含む。
種々の発現ベクターが、前記ペプチドタグ、前記タンパク質、前記抗体鎖もしくは抗原結合フラグメント又はペプチドタグ付き抗体もしくは抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させるために使用され得る。ウイルス系及び非ウイルス両方の発現ベクターが、哺乳類の宿主細胞中で前記抗体を産生するために使用され得る。非ウイルスベクター及び系としては、タンパク質又はRNAを発現させるための発現カセットを典型的に含むプラスミド、エピソームベクター及びヒト人工染色体(例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照のこと。)があげられる。例えば、哺乳類(例えば、ヒト)細胞において前記ペプチドタグ又はVEGFポリヌクレオチド及びポリペプチドを発現させるため有用な非ウイルスベクターとしては、pThioHis A、B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B&C(Invitrogen、San Diego、CA)、MPSVベクター及び、他のタンパク質を発現させるために当分野において公知の数多くの他のベクターがあげられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、SV40、パピローマウイルス、HBPエプスタインバーウイルスに基づくベクター、ワクシニアウイルスベクター及びSemliki Forestウイルス(SFV)に基づくベクターがあげられる。Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995;及び、Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照のこと。
ウイルスベクターを生成するための方法は、当分野において周知であり、当業者であれば、本発明のウイルスベクターを生成し得る(例えば、米国特許第7,465,583号明細書を参照のこと。)。
前記発現ベクターの選択は、ベクターが発現することが意図された宿主細胞に依存する。典型的には、前記発現ベクターは、抗体鎖もしくはフラグメント、ペプチドタグ又はペプチドタグ付き抗体鎖もしくはフラグメントをコードするポリヌクレオチドに操作可能に結合した、プロモータ及び他の調節配列(例えば、エンハンサ)を含む。一部の実施形態では、誘導性プロモータが、誘導条件下以外での挿入された配列の発現を妨げるために使用される。誘導性プロモータとしては、例えば、アラビノース、lacZ、メタロチオネインのプロモータ又はヒートショックプロモータがあげられる。形質転換された生物の培養は、その発現生成物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列の集合を不利に扱うことなく、非誘導条件下において展開され得る。プロモータに加えて、他の調節エレメントも、抗体鎖もしくはフラグメント、ペプチドタグ又はペプチドタグ付き抗体鎖もしくはフラグメントの効率的な発現に必要とされ、又は、望まれる場合がある。これらのエレメントとしては、典型的には、ATG開始コドン及び隣接リボソーム結合部位又は他の配列があげられる。さらに、発現効率は、使用する細胞系に適したエンハンサの包含により増大され得る(例えば、Scharf et al, Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994;及び、Bittner et al, Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照のこと。)。例えば、SV40エンハンサ又はCMVエンハンサが、哺乳類の宿主細胞中での発現を増大させるために使用されてもよい。
前記発現ベクターは、挿入されたペプチドタグ、抗体又はペプチドタグ付き抗体の配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように配置された分泌シグナル配列も提供し得る。より頻繁に、このような挿入された配列は、前記ベクターに包含させる前に、シグナル配列に結合させる。抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメイン又はペプチドタグ付き抗体ドメインをコードする配列を受容するように使用されるベクターは、場合により、定常領域又はその一部もコードする。このようなベクターは、前記定常領域を含む融合タンパク質として可変領域の発現を可能にすることにより、完全な抗体又は抗原結合フラグメントの産生をもたらす。典型的には、このような定常領域は、ヒトである。
前記ペプチドタグ、抗体鎖又はペプチドタグ付き分子(例えば、ペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメント)を保有及び発現するための宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。E.coliは、本発明のポリヌクレオチドをクローニング及び発現させるために有用な1つの原核生物の宿主である。使用するのに適した他の微生物宿主としては、桿菌、例えば、Bacillus subtilis及び他の腸内細菌科、例えば、Salmonella、Serratia及び種々のPseudomonas種があげられる。これらの原核生物宿主においては、それが、発現ベクターも作ることができる。前記発現ベクターは、典型的には、前記宿主細胞に適した発現制御配列(例えば、複製起点)を含む。さらに、任意の数の各種の周知のプロモータ、例えば、ラクトースプロモータ系、トリプトファン(trp)プロモータ系、ベータ−ラクタマーゼプロモータ系又はファージラムダ由来のプロモータ系が存在するであろう。前記プロモータは、典型的には、任意にオペレータ配列により発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了するための、リボソーム結合部位配列等を有する。他の微生物、例えば、酵母も、本発明の抗体又はペプチドタグ付き分子(例えば、ペプチドタグ付き抗体もしくは抗原結合フラグメント)又はペプチドタグを発現させるために使用され得る。バキュロウイルスベクターとの組み合わせにおいて、昆虫細胞も使用され得る。
一部の好ましい実施形態では、哺乳類の宿主細胞が、本発明のペプチドタグ、ペプチドタグ付き分子及び/又は本願明細書に記載されたタグ付けされていない分子(例えば、ペプチドタグ付き抗体もしくは抗原結合フラグメント)を発現及び産生するために使用される。例えば、それらは、内在性の免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株(例えば、実施例に記載される1D6.C9メラノーマハイブリドーマクローン)又は、外来性の発現ベクターを有する哺乳類の細胞株(例えば、以下に例示されるSP2/0メラノーマ細胞)のいずれかであり得る。これらは、任意の正常な致死又は正常もしくは異常な不死の動物又はヒト細胞を含む。例えば、完全な免疫グロブリンを分泌可能な数多くの適切な宿主細胞株が開発されており、当業者に公知であり、CHO細胞株、種々のCos細胞株、Hela細胞、メラノーマ細胞株、形質転換されたB細胞及びハイブリドーマを含む。ポリペプチドを発現するための哺乳類の組織細胞培養の使用は、一般的に、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において検討されている。哺乳類の宿主細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモータ及びエンハンサ(例えば、Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照のこと。)ならびに、必須の処理情報部位、例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳類の遺伝子又は哺乳類のウイルス由来のプロモータを含む。適切なプロモータは、構成型、細胞種特異型、段階特異型及び/又は変調型もしくは調節型でもよい。有用なプロモータとしては、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモータ、構成型アデノウイルス主要後期プロモータ、デキサメタゾン誘導型MMTVプロモータ、SV40プロモータ、MRP polIIIプロモータ、構成型MPSVプロモータ、テトラサイクリン誘導型CMVプロモータ(例えば、ヒト媒介初期CMVプロモータ)、構成型CMVプロモータ及び、当分野において公知のプロモータ−エンハンサの組み合わせがあげられる。
所望のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の種類に応じて変わる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核生物の細胞に一般的に使用される。一方、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは、他の細胞宿主に使用されてもよい(一般的には、上記Sambrook,et al.,を参照のこと。)。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、インジェクション及びマイクロインジェクション、バリスティック法、ウイロゾーム、イムノリポソーム、ポリカチオン:核酸コンジュゲート、裸のDNA、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質VP22への融合(Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997)、DNAの薬剤による増大した取り込み及びex vivoにおける形質導入があげられる。組換えタンパク質の長期で、高収量の産生のために、安定した発現が、多くの場合望まれるであろう。例えば、前記ペプチドタグ、前記抗体鎖もしくは抗原結合フラグメント又は前記ペプチドタグ付き抗体鎖もしくは抗原結合フラグメントを安定して発現する細胞株は、ウイルスの複製起点又は内在性の発現エレメント及び選択可能なマーカー遺伝子を含む、本発明の発現ベクターを使用して調製され得る。前記ベクターの導入後、細胞を、濃縮された培地中で、1〜2日間増殖させてもよく、その後、それらは、選択培地に移される。前記選択可能なマーカーの目的は、選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在により、選択培地中で、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖が可能となる。抵抗性を有する安定的に形質導入された細胞は、細胞種に適した組織培養技術を使用して増殖され得る。本発明は、さらに、本願明細書に記載されたペプチドタグ及び/又はペプチドタグ付き分子を産生するための方法を提供する。この場合、本願明細書に記載されたペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子を産生可能な宿主細胞が、1つ以上のペプチドタグ及び/又はペプチドタグ付き分子の産生に適した条件下で培養される。前記方法は、さらに、本発明のペプチドタグ及び/又はペプチドタグ付き分子を単離する工程を含んでもよい。
本発明のペプチドタグ、タンパク質及び/又は抗体もしくは抗原結合フラグメントペプチドタグをコードする核酸配列を含む発現ベクターは、眼に対して遺伝子を送達するために使用され得る。本発明の特定の態様では、前記発現ベクターは、本発明の1つ以上のペプチドタグに結合している抗体をコードし、眼に対する送達に適している。本発明の他の態様では、前記抗体又は抗原結合フラグメント及びペプチドタグは、眼に対する送達に適した1つ以上の発現ベクターにおいてコードされる。眼に対して遺伝子産物を送達するための方法は、当分野において公知である(例えば、米国特許出願公開第05/0220768号明細書を参照のこと。)。
モノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体(mAb)は、各種の技術(例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼ―ション技術のような従来のモノクローナル抗体の方法論を含む)により産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための多くの技術、例えば、Bリンパ球のウイルス又はガン遺伝子の形質転換が使用され得る。例えば、本発明の抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントを産生する方法は、本願明細書、実施例及び国際公開第20120014958号パンフレットに記載されている。
モノクローナル抗体(mAb)は、各種の技術(例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼ―ション技術のような従来のモノクローナル抗体の方法論を含む)により産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための多くの技術、例えば、Bリンパ球のウイルス又はガン遺伝子の形質転換が使用され得る。例えば、本発明の抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントを産生する方法は、本願明細書、実施例及び国際公開第20120014958号パンフレットに記載されている。
ハイブリドーマを調製するための動物系としては、マウス、ラット及びウサギの系があげられる。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、確立された手法である。融合用の免疫化脾臓細胞の単離のための免疫化プロトコル及び技術は、当分野において公知である。融合パートナー(例えば、マウスのメラノーマ細胞)及び融合手法も公知である。
本発明のキメラ又はヒト化抗体は、上述したように、調製されたマウスのモノクローナル抗体の配列に基づいて調製され得る。重鎖及び軽鎖の免疫グロブリンをコードするDNAは、所望のマウスハイブリドーマから得られ、標準的な分子生物学的技術を使用して、非マウス(例えば、ヒト)の免疫グロブリン配列を含むように操作される。例えば、キメラ抗体を形成するために、マウスの可変領域を、当分野において公知の方法を使用して、ヒト定常領域に結合させ得る(例えば、Cabilly et al.に対する米国特許第4,816,567号明細書を参照のこと。)。ヒト化抗体を形成するために、マウスのCDR領域が、当分野において公知の方法を使用して、ヒトフレームワーク内に挿入され得る。例えば、Winterに対する米国特許第5225539号明細書ならびに、Queen et al.に対する米国特許第5530101号;同第5585089号;同第5693762号及び同第6180370号明細書を参照のこと。
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。VEGFに対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろ、ヒト免疫系の一部を有するトランスジェニック又はトランスクロモゾームマウスを使用して生成され得る。これらのトランスジェニック及びトランスクロモゾームマウスは、本願明細書において、それぞれ、HuMAbマウス及びKMマウスと呼ばれ、まとめて、本願明細書において、「ヒトIgマウス」と呼ばれるマウスを含む。
HuMAbマウス(登録商標)(Medarex,Inc.)は、非再編成のヒト重鎖(μ及びγ)及びκ軽鎖の免疫グロブリン配列をコードする、ヒト免疫グロブリン遺伝子の小遺伝子座、ならびに内在性のμ及びκ鎖の遺伝子座を不活性化する標的変異を含む(例えば、Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859を参照のこと。)。したがって、マウスは、マウスIgM又はκの低下した発現を示し、免疫応答において、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子は、クラス転換及び体細胞変異を受けて、高親和性のヒトIgGκモノクローナルを産生する(上記Lonberg, N. et al., 1994;Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 1 13:49-101;Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93及び、Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546においてレビューされる)。HuMAbマウスの調製及び使用ならびに、このようなマウスが有するゲノム修飾は、さらに、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295;Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656;Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724;Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:1 17-123; Chen, J. et al, 1993 EMBO J. 12: 821 -830;Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920;Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591;及び、Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されている。それら全ての内容は、その全体が参照により具体的に組み込まれる。さらに、米国特許第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,789,650号;同第5,877,397号;同第5,661,016号;同第5,814,318号;同第5,874,299号;及び同第5,770,429号明細書(全て、Lonberg及びKay);米国特許第5,545,807号明細書(Surani et al);国際公開第92103918号、同第93/12227号、同第94/25585号、同第97113852号、同第98/24884号及び同第99/45962号パンフレット(全て、Lonberg及びKay)、ならびに、国際公開第01/14424号パンフレット(Korman et al)を参照のこと。
別の実施形態では、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子及びトランスクロモゾームにヒト免疫グロブリン配列を有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖トランスクロモゾームを有するマウスを使用して産生され得る。本願明細書において「KMマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、国際公開第02/43478号パンフレット(Ishida et al)に詳細に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系が、当分野において利用可能であり、本発明の抗体を産生するために使用され得る。例えば、ゼノマウス(Abgenix,Inc.)と呼ばれる別のトランスジェニック系が使用され得る。このようなマウスは、米国特許第5,939,598号;同第6,075,181号;同第6,114,598号;同第6,150,584号及び同第6,162,963号明細書(Kucherlapati et al)に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモゾーム動物系が、当分野において利用可能であり、本発明のVEGF抗体を産生するために使用され得る。例えば、「TCマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖トランスクロモゾーム及びヒト軽鎖トランスクロモゾームの両方を有するマウスが使用され得る。このようなマウスは、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖及び軽鎖のトランスクロモゾームを有するウシが、当分野において記載されており(Kuroiwa et al, 2002 Nature Biotechnology 20:889-894)、本発明のVEGF抗体を産生するために使用され得る。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするための、ファージディスプレイ法を使用しても調製され得る。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当分野において確立されており、又は、以下の例に記載されている。例えば、米国特許第5,223,409号;同第5,403,484号;及び同第5,571,698号明細書(Ladner et al);米国特許第5,427,908号及び同第5,580,717号明細書(Dower et al);米国特許第5,969,108号及び同第6,172,197号明細書(McCafferty et al);ならびに、米国特許第5,885,793号;同第6,521,404号;同第6,544,731号;同第6,555,313号;同第6,582,915号及び同第6,593,081号明細書(Griffiths et al)を参照のこと。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫化に基づいて生じ得るようにヒト免疫細胞が再構成されている、SCIDマウスを使用しても調製され得る。このようなマウスは、例えば、米国特許第5,476,996号及び同第5,698,767号明細書に記載されている(Wilson et al)。
変化したタンパク質およびペプチドタグを操作する方法
上述したように、本願明細書に示されたペプチドタグ、タンパク質、抗体及び抗原結合フラグメントは、記載されたアミノ酸配列を修飾することにより、新たなペプチドタグ、タンパク質、抗体及び抗原結合フラグメントを形成するために使用され得る。このため、本発明の別の態様では、本発明のペプチドタグ付き抗体の構造的特徴が、本発明のペプチドタグ付き抗体の少なくとも1つの機能的特性、例えば、ヒトVEGFへの結合性を保持し、及び、VEGFの1つ以上の機能的特性の阻害性(例えば、VEGF受容体へのVEGFの結合阻害)も保持する、構造的に関連するペプチドタグ付き抗体を形成するために使用される。
上述したように、本願明細書に示されたペプチドタグ、タンパク質、抗体及び抗原結合フラグメントは、記載されたアミノ酸配列を修飾することにより、新たなペプチドタグ、タンパク質、抗体及び抗原結合フラグメントを形成するために使用され得る。このため、本発明の別の態様では、本発明のペプチドタグ付き抗体の構造的特徴が、本発明のペプチドタグ付き抗体の少なくとも1つの機能的特性、例えば、ヒトVEGFへの結合性を保持し、及び、VEGFの1つ以上の機能的特性の阻害性(例えば、VEGF受容体へのVEGFの結合阻害)も保持する、構造的に関連するペプチドタグ付き抗体を形成するために使用される。
例えば、本発明の抗体の1つ以上のCDR領域又はその変異は、上述したように、公知のフレームワーク領域及び/又は他のCDRと、組換えによって組み合わされ、更に組換え操作された本発明の抗体を形成する。他の種類の修飾は、先のセクションに記載されたものを含む。操作法のための開始材料は、本願明細書において提供されたVH及び/もしくはVL配列の1つ以上、又は、それらの1つ以上のCDR領域である。前記操作された抗体を形成するために、本願明細書において提供されるVH及び/もしくはVL配列の1つ以上、又は、それらの1つ以上のCDR領域を有する抗体を、実際に調製する(すなわち、タンパク質として発現させる)必要はない。むしろ、前記配列に含まれる情報が開始材料として使用されて、元の配列に由来する「第2世代」配列を形成し、ついで、前記「第2世代」配列は、タンパク質として調製及び発現される。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号1のCDR1配列、配列番号2のCDR2及び/又は配列番号3のCDR3配列を有する重鎖可変領域抗体配列;ならびに、配列番号11のCDR1配列、配列番号12のCDR2配列及び/又は配列番号13のCDR3配列を有する軽鎖可変領域抗体配列からなり;前記重鎖可変領域抗体配列及び/又は前記軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基が変更されていることにより、少なくとも1つの変更された抗体配列を形成し;変更された抗体配列をタンパク質として発現する、ペプチドタグ付き抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントを調製するための方法を提供する。
前記変更された抗体配列は、米国特許出願公開第20050255552号明細書に記載された、固定されたCDR3配列又は最少必須結合決定因子、ならびに、CDR1及びCDR2配列上の多様性を有する、抗体ライブラリをスクリーニングすることによっても調製され得る。前記スクリーニングは、抗体ライブラリから抗体をスクリーニングするのに適したいずれかのスクリーニング技術、例えば、ファージディスプレイ技術に基づいて行われ得る。
標準的な分子生物学的技術は、変更されたペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子の配列を調製し、及び発現させるために使用され得る。前記変更された配列によりコードされる前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子は、前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子、例えば、本願明細書に記載されたタンパク質又はペプチドタグ付き抗体、例えば、NVS1、NVS2、NVS3、NVS4、NVS36又はNVS37の機能的特性の1つ、いくつか又は全てを保持するものである。
本発明の抗体又はペプチドタグを操作する方法の特定の実施形態では、変異は、VEGF抗体コード配列又はペプチドタグの全部又は一部に沿ってランダム又は選択的に導入することができ、得られた修飾VEGF抗体又はペプチドタグは、本願明細書に記載された結合活性及び/又は他の機能的特性についてスクリーニングされ得る。変異法は、当分野において記載されている。例えば、Shortによる国際公開第02/092780号パンフレットには、飽和変異誘発、合成ライゲーションアッセンブリ又はそれらの組み合わせを使用して抗体変異を形成及びスクリーニングするための方法が記載されている。あるいは、Lazar et alによる国際公開第03/074679号パンフレットには、抗体の物理化学的特性を最適化するためのコンピュータスクリーニング法を使用する方法が記載されている。
本発明の特定の実施形態では、抗体及びペプチドタグは、アミド分解部位を除去するように操作されてもよい。アミド分解は、ペプチド又はタンパク質における構造的及び機能的変化を引き起こすことが公知である。アミド分解は、低下した生体活性ならびに、タンパク質医薬品の薬物動態及び抗原性における変化をもたらし得る(Anal Chem. 2005 Mar 1 ;77(5):1432-9)。本発明の特定の他の態様では、抗体及びペプチドタグは、プロテアーゼ開裂部位を付加又は除去をするように操作され得る。ペプチドタグ修飾の例は、表4及び実施例に記載される。
前記変更された抗体の機能的特性は、当分野において利用可能な、及び/又は、本願明細書に記載された、標準的なアッセイ、例えば、実施例において説明されたものを使用して評価され得る。
他の抗体型
ラクダ抗体
ラクダ及びヒトコブラクダ(Camelus bactrianus及びCalelus dromaderius)族のメンバー、例えば、アメリカ大陸メンバー、例えば、ラマ種(Lama paccos、Lama glama及びLama vicugna)から得られた抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性及びヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられてきた。天然に見出された哺乳類のこの族由来の特定のIgG抗体は、軽鎖を欠いているため、他の動物由来の抗体についての2つ重鎖及び2つの軽鎖を有する、典型的な4つの鎖の4つの要素からなる構造とは構造的に異なる。国際特許出願第PCT/EP93/02214号(1994年3月3日に公開された国際公開第94/04678号パンフレット)を参照のこと。
ラクダ抗体
ラクダ及びヒトコブラクダ(Camelus bactrianus及びCalelus dromaderius)族のメンバー、例えば、アメリカ大陸メンバー、例えば、ラマ種(Lama paccos、Lama glama及びLama vicugna)から得られた抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性及びヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられてきた。天然に見出された哺乳類のこの族由来の特定のIgG抗体は、軽鎖を欠いているため、他の動物由来の抗体についての2つ重鎖及び2つの軽鎖を有する、典型的な4つの鎖の4つの要素からなる構造とは構造的に異なる。国際特許出願第PCT/EP93/02214号(1994年3月3日に公開された国際公開第94/04678号パンフレット)を参照のこと。
VHHとして特定される小さい単一の可変ドメインであるラクダ抗体の領域は、ターゲットに対して高い親和性を有する小さなタンパク質を産生し、「ラクダ抗体」として公知の低分子量抗体由来タンパク質をもたらす遺伝子操作により得ることができる。1998年6月2日に発行された米国特許第5,759,808号明細書を参照のこと。Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261;Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788;Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448;Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62;及び、Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520も参照のこと。ラクダ抗体及び抗原結合フラグメントの操作されたライブラリは、例えば、Ablynx、Ghent、Belgiumから入手できる。非ヒト起源の他の抗体と同様に、ラクダ抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により厳密に類似する配列を得るために、組換え的に変更され得る。すなわち、ナノボディは、「ヒト化」され得る。
前記ラクダナノボディは、ヒトIgG分子の分子量の約1/10の分子量を有し、前記タンパク質の物理的直径は、数ナノメートルにすぎない。サイズが小さいことによる1つの結果は、より大きい抗体タンパク質に対しては機能的に反応しない抗原部位に結合するラクダ抗体の能力である。すなわち、ラクダのナノボディは、古典的な免疫学的技術を使用した別の方法では陰性の抗原を検出する試薬として、及び、有望な治療剤として有用である。このため、小さいサイズのさらに別の結果は、ラクダのナノボディが、ターゲットタンパク質の溝又は狭い窪みにおける特異的な部位への結合の結果として阻害することができ、このため、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量薬物の機能により厳密に類似する能力を有し得ることである。
前記低分子量及びコンパクトなサイズは、さらに、ラクダのナノボディが、非常に熱安定性であり、極端なpH及びタンパク質分解に対して安定であり、抗原性に乏しいことをもたらす。別の結果は、ラクダのナノボディが組織内の循環系から速やかに移動することである。ナノボディは、さらに、血液脳関門を横切る薬剤輸送を促進し得る。2004年8月19日に公開された米国特許出願公開第20040161738号明細書を参照のこと。さらに、これらの分子は、原核生物の細胞、例えば、E.coliにおいて完全に発現され、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現され、機能的である。
したがって、本発明の特徴は、例えば、VEGFに対して高い親和性を有する、ラクダ抗体又はナノボディである。本願明細書における特定の実施形態では、前記ラクダ抗体又はナノボディは、ラクダ科動物において天然に産生される、すなわち、他の抗体について本願明細書に記載された技術を使用して、VEGF又はそのペプチドフラグメントで免疫化されたラクダ科により産生される。あるいは、ラクダのナノボディは、適切なターゲットによるパニング手法を使用して、適切に変異したラクダのナノボディタンパク質を提示するファージのライブラリから得られる(すなわち、例えば、選択により産生)。得られたナノボディは、さらに、遺伝子操作によりカスタマイズされ得る。前記ラクダのナノボディは、タグ付けされていないラクダのナノボディに対して、平均滞留時間、最終薬剤濃度を増大させ、及び/又は、投与間隔を伸ばすために、本願明細書に記載されたペプチドタグに結合し得る。特定の態様では、前記ラクダの抗体又はナノボディは、例えば、国際特許出願第PCT/EP93/02214号に記載されているように、本発明のヒト抗体の重鎖又は軽鎖のCDR配列を、ナノボディ又は単一ドメイン抗体のフレームワーク配列内にグラフト化することにより得られる。
二重特異性分子及び多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドタグを含む二重特異性又は多重特異性分子を特徴とする。より具体的には、本発明は、ペプチドタグと、2つ以上のタンパク質及び/又は核酸分子とを含む二重特異性又は多重特異性の分子を特徴とすると考えられる。例えば、多重特異性分子は、本発明のペプチドタグ、抗体又はその抗原結合フラグメント及び核酸分子を含んでもよい。
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドタグを含む二重特異性又は多重特異性分子を特徴とする。より具体的には、本発明は、ペプチドタグと、2つ以上のタンパク質及び/又は核酸分子とを含む二重特異性又は多重特異性の分子を特徴とすると考えられる。例えば、多重特異性分子は、本発明のペプチドタグ、抗体又はその抗原結合フラグメント及び核酸分子を含んでもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質(例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンド)に誘導体化され、又は、そのような分子と結合して、少なくとも2つの異なる結合部位又はターゲット分子に結合する二重特異性分子を生成し得る。本発明の抗体は、実際に、2つ以上の他の機能性分子に誘導体化され、又は、そのような分子に結合することによって、3つ以上の異なる結合部位及び/又はターゲット分子に結合する多重特異性分子を生成し得る。このような多重特異性分子は、本願明細書で使用する場合、「二重特異性分子」の用語に包含されることも意図する。本発明の抗体は、二重特異性分子がもたらされるように、1つ以上の他の結合分子、例えば、別の抗体、抗原結合フラグメント、ペプチド又は結合模倣体に、(例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有会合又は別の方法により)機能的に結合して、本発明の二重特異性分子を形成し得る。
したがって、本発明は、VEGFに対する少なくとも1つの第1の結合特異性と、第2のターゲットエピトープに対する第2の結合特異性とを含む、二重特異性分子を含む。例えば、前記第2のターゲットエピトープは、前記第1のターゲットエピトープとは異なる、VEGFの別のエピトープである。あるいは、前記第2のターゲットエピトープは、眼における別の分子のエピトープである。あるいは、前記第2のターゲットエピトープは、HAのエピトープである。
さらに、前記二重特異性分子が多重特異性である発明について、前記分子は、さらに、前記第1及び第2のターゲットエピトープに加えて、第3の結合特異性を含み得る。あるいは、前記第2のターゲットエピトープは、眼における別の分子のエピトープである。
一実施形態では、二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも1つの抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv又は一本鎖Fv等を含み得る。前記抗体は、Ladner et alの米国特許第4,946,778号明細書に記載された、軽鎖もしくは重鎖の二量体又は任意のその最小フラグメント、例えば、Fvもしくは一本鎖構築物でもあり得る。
二重特異性抗体(ディアボディ)は、VH及びVLドメインが一本のペプチド鎖上に発現しており、同じ鎖上の前記2つのドメイン間で対合させるのに十分短いリンカーにより結合されている、二価の二重特異性分子である。前記VH及びVLドメインは、別の鎖の相補ドメインとペアとなることにより、2つの抗原結合部位を形成する(例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448;Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123を参照のこと。)。ディアボディは、VHA−VLB及びVHB−VLA(VH−VL型)又はVLA−VHB及びVLB−VHA(VL−VH型)のいずれかを有する、2つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることにより産生され得る。それらの大部分は、細菌において可溶型で発現され得る。一本鎖のディアボディ(scDb)は、2つのディアボディ形成するポリペプチド鎖を約15個のアミノ酸残基のリンカーにより結合させることにより産生される(Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4): 128-30;Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36を参照のこと。)。scDbは、細菌において、可溶性の活性な単量体型で発現され得る(Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30;Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1 ):21-36;Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105;Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21を参照のこと。)。ディアボディは、Fcに融合して、「ジ−ディアボディ」を作ることができる(Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65を参照のこと。)。
本発明の二重特異性分子に使用され得る他の抗体は、マウス、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体である。
二重特異性分子は、当分野において公知の方法を使用して、結合特異性の構成をコンジュゲートすることにより調製され得る。例えば、前記二重特異性分子の各結合特異性は、別々に生成され、ついで、互いにコンジュゲートされ得る。前記結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、各種の結合剤又は架橋剤が、共有的コンジュゲートに使用され得る。架橋剤の例としては、プロテインA、カルボジイミド、N−スクシンイミジル−S−アセチル−チオアセテート(SATA)、5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)、o−フェニレンジマレイミド(oPDM)、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)及びスルホスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(スルホ−SMCC)が含まれる(例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686;Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと。)。他の方法としては、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132;Brennan et al., 1985 Science 229:81-83及び、Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375に記載されたものがあげられる。コンジュゲート剤は、SATA及びスルホ−SMCCであり、共にPierce Chemical Co.(Rockford、IL)から入手できる。
前記結合特異性が抗体である場合、それらは、前記2つの重鎖のC−末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートされ得る。具体的な実施形態では、前記ヒンジ領域は、コンジュゲート前に、奇数、例えば、1つのスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
あるいは、両結合特異性は、同じベクターにおいてコードされ、同じ宿主細胞において発現及びアッセンブリされ得る。この方法は、前記二重特異性分子が、mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2、リガンド×Fab、ペプチドタグ×mAb、ペプチドタグ×Fab融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二重特異性分子は、1つの一本鎖抗体及び結合決定因子を含む一本鎖分子、又は、2つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも2つの一本鎖分子を含んでもよい。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第5,260,203号明細書;米国特許第5,455,030号明細書;米国特許第4,881,175号明細書;米国特許第5,132,405号明細書;米国特許第5,091,513号明細書;米国特許第5,476,786号明細書;米国特許第5,013,653号明細書;米国特許第5,258,498号明細書;及び米国特許第5,482,858号明細書に記載されている。
その特異的ターゲットに対する前記二重特異性又は多価分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、放射性免疫アッセイ(REA)、FACS分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)又はウェスタンブロットアッセイにより確認され得る。これらのアッセイはそれぞれ、一般的に、特定の所望のタンパク質−抗体複合体の存在を、所望の前記複合体に特異的な標識化試薬(例えば、抗体)を使用することにより検出する。
別の態様では、本発明は、VEGFに結合する、本発明の抗体の少なくとも2つの同一又は異なる抗原結合部分を含む多価分子を提供する。更なる態様では、本発明は、HAに結合する、本発明のペプチドタグの少なくとも2つの同一又は異なる抗原結合部分を含む多価化合物を提供する。前記抗原結合部分は、タンパク質融合又は共有もしくは非共有結合により、互いに結合し得る。あるいは、結合方法は、前記多重特異性分子について記載されている。四価の化合物は、例えば、本発明の抗体を、本発明の抗体の定常領域(例えば、Fc又はヒンジ領域)に結合する抗体と架橋することにより得ることができる。
三量体化ドメインは、例えば、Boreanの欧州特許第1012280号明細書に記載されている。五量体化分子は、例えば、国際特許出願第PCT/EP97/05897号に記載されている。
予防的及び治療的使用
多くの眼の疾患、具体的には、例えば、網膜血管疾患は、毎週、隔週又は毎月での硝子体内注入を必要とする治療剤により処置される。前記処置の方法及び頻度は、医師及び患者に対する、明らかな健康管理上の負担を引き起こす。さらに、硝子体内注入による眼内炎及び眼内圧のリスクによる、頻繁な硝子体内注入に関連する患者に対する明らかなリスクも存在する。特定の場合、例えば、緑内障には、これらの治療剤の投与は困難であり、臨床において通常使用されない。このため、四半期又はより低い頻度で投与される治療剤を投与する能力が、目に見える結果における最良の改善を提供し、一方、頻繁な硝子体内注入に関連する処置の負担及びリスクを低下させるであろう。
多くの眼の疾患、具体的には、例えば、網膜血管疾患は、毎週、隔週又は毎月での硝子体内注入を必要とする治療剤により処置される。前記処置の方法及び頻度は、医師及び患者に対する、明らかな健康管理上の負担を引き起こす。さらに、硝子体内注入による眼内炎及び眼内圧のリスクによる、頻繁な硝子体内注入に関連する患者に対する明らかなリスクも存在する。特定の場合、例えば、緑内障には、これらの治療剤の投与は困難であり、臨床において通常使用されない。このため、四半期又はより低い頻度で投与される治療剤を投与する能力が、目に見える結果における最良の改善を提供し、一方、頻繁な硝子体内注入に関連する処置の負担及びリスクを低下させるであろう。
網膜性疾患、例えば、血管新生(wet)AMD、糖尿病性網膜症及び網膜静脈閉塞症は、視力喪失をもたらす血管新生成分を有する。臨床試験では、これらの疾患が、眼の生物学的治療剤(例えば、ラニビズマブもしくはベバシズマブのような抗VEGF治療剤)の毎月の硝子体内注入、又は、アフリベルセプトによる隔月の処置により、効果的に処置され得ることが示されてきた。これらの治療剤の効果にもかかわらず、毎月又は隔月の処置は、患者及び担当医にとって、明らかな健康管理上の負担となる(Oishi et al.(2011))。このため、より低い頻度で送達することができ、毎月又は隔月での処置に見られるのと同じ処置利益も提供することができる眼の治療に対する必要性が頻繁に存在する。抗VEGF治療剤は、一般的には、ほとんどの患者に安全で、十分許容性であるが、硝子体内法による眼内炎のわずかなリスクが存在する(Day et al., 2011)。現在の臨床データは、抗原結合フラグメント(例えば、Fab)であるラニビズマブと比較して、全長IgGであるベバシズマブには、眼以外での有害事象を増大させる傾向があり得ることを示している。ラニビズマブと比較したベバシズマブの全身性有害事象の主な違いおよび潜在的な原因は、循環においてVEGFがより高度に抑制されることによるベバシズマブのより高い全身性暴露である(Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials (CATT) Research Group, Martin DF, Maguire MG, Fine SL, Ying GS, Jaffe GJ, Grunwald JE, Toth C, Redford M, Ferris FL 3rd. Ophthalmology. 2012 Jul; 119(7):1388-98)。このため、より低い頻度で投与され得る抗VEGF治療剤は、硝子体内法の回数の低下及びVEGFのより低い全身性抑制によって、安全性の利益を有し得る。
重要なMARINA臨床試験(Rosenfeld et al., 2006)では、ラニビズマブの毎月の注入は、最良矯正視力(BCVA)において、10〜15letterの得点をもたらす。一方、処置を受けなかった患者は、平均約10letterの視力を失った。wet AMD患者におけるその後の試験において、より少ない硝子体内処置によって視力得点を維持することができるかどうかを見るために、異なる投与パラダイムが評価された(PIER、PRONTO、EXCITE、SUSTAIN、HORIZON、CATT)。これらの臨床試験から、より低い頻度の投与計画と比較して、毎月の投与の方が優れた目に見える結果をもたらすことが示されてきた(Patel et al., 2011)。毎月又は隔月より低い頻度での注入を必要とする患者において、毎月又は隔月の投与計画により達成される効果も維持することをもたらす、より長い作用持続期間を有する抗VEGF治療剤に対する必要性が存在する。
VEGFに加えて、他の血管新生促進性、炎症性又は増殖因子メディエータが、網膜性疾患、例えば、血管新生(wet)AMD、糖尿病性網膜症及び網膜静脈閉塞症等に関与する。これらの血管新生促進性、炎症性又は増殖因子メディエータ分子の例としては、限定されるものではないが、PDGF(Boyer, 2013)、アンギオポエチン(Oliner et al., 2012)、S1P(Kaiser, 2013)、インテグリンανβ3、ανβ5、α5β1(Kaiser et al., 2013;Patel, 2009a;Patel, 2009b)、ベタセルリン(Anand-Apte et al., 2010)、アペリン/APJ(Hara et al., 2013)、エリスロポエチン(Watanabe et al., 2005; Aiello, 2005)、補体因子D、TNFα及び、遺伝子関連試験によるAMDリスクに結びつくタンパク質(例えば、補体経路のタンパク質、例えば、C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及びC3aならびにHtrA1、ARMS2、TIMP3、HLA、IL8、CX3CR1、TLR3、TLR4、CETP、LIPC、COL10A1及びTNFRSF10A(Nussenblatt et al., 2013)があげられる。これらの分子及び経路を効果的に標的とする治療剤が開発された場合、目に見える結果の改善を提供する一方、頻繁な硝子体内注入に伴う処置の負担及びリスクを低下させることに対する必要性が存在し得る。別の網膜疾患は、ドルーゼンの存在、網膜上の黄班として見られるデブリの堆積により特徴付けられる、最も一般的な型のAMDであるDry AMDである。Dry AMDは、より重篤な型、例えば、血管新生(wet)AMD又は地図状萎縮に進展するおそれがある。Dry AMD及び地図状萎縮は、慢性疾患であるため、治療剤は、潜在的に長い年数投与されなければならないであろう。このため、目に見える結果を改善する一方、同時に頻繁な硝子体内注入に伴う処置の負担及びリスクを低下させる必要性が存在する。緑内障、ドライアイ又はブドウ膜炎を含むが、限定されるものではない他の眼の疾患も、硝子体内に送達される治療剤によって処置される可能性がある。
本発明は、眼からの治療用分子のクリアランスを遅延させることにより、その眼における半減期を増大させるために、治療用分子に結合し得るペプチドタグを提供する。本発明は、タグ付けされてない分子に対して、効果の増大した持続期間を有し、臨床における、より低い頻度での眼内注入及び改善された患者の処置をもたらすであろう、ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子に関する。
本願明細書に記載されたペプチドタグ付き分子は、医薬として使用され得る。特に、本発明のペプチドタグ付き分子は、対象における網膜血管疾患に関連する状態又は障害を処置するために使用されてもよい。例えば、本願明細書に記載されたVEGFと結合するペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントは、有効量の本発明のタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与することによる、増大したVEGFレベル及び/又は活性に関連する眼の疾患又は障害の処置のために、治療的に有用な濃度で使用され得る。
本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、網膜血管疾患に関連する状態又は障害を処置する方法を提供する。本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、糖尿病性網膜症(DR)に関連する状態又は障害を処置する方法を提供する。本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与する、黄班浮腫に関連する状態又は障害を処置する方法を提供する。本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、糖尿病性黄班浮腫(DME)を処置する方法も提供する。本発明は、さらに、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)を処置する方法を提供する。さらに、本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、加齢黄班変性(AMD)、網膜静脈閉塞症(RVO)、血管性浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生及び/又は未熟児網膜症を処置する方法を提供する。さらに、本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、VEGF媒介性障害を処置する方法に関する。前記ペプチドタグ付き分子は、9.0μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含むと考えられる。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。前記ペプチドタグ付き分子は、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントであると考えられる。一態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、8.0μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む。一態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、7.2μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む。一態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、6.0μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む。一態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、5.5μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含んでもよい。更なる態様では、前述の方法は、前記投与工程前に、このような状態又は障害を有する対象を診断する工程をさらに含む。
一態様では、本発明は、有効量の本発明のペプチドタグ付き分子を、それを必要とする対象に投与することにより、抗VEGF治療剤に不応性の対象におけるVEGF媒介性障害を処置する方法に関する。前記ペプチドタグ付き分子は、9.0μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含むと考えられる。例えば、前記ペプチドタグは、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、HAと結合し得る。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含んでもよい。本願明細書で使用する場合、「抗VEGF治療剤に不応性」は、公知の抗VEGF治療剤、例えば、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト又はペガプタニブ治療剤により、十分な生理学的応答を達成できないことを意味する。このような患者は、ラニビズマブ、ベバシズマブもしくはアフリベルセプトの3回の硝子体内注入(又は、前述の治療剤のいずれかの組み合わせの3回の硝子体内注入)後に、異常な中心網膜厚み(斑点の中心1mm2の面積)において、20%未満の低下を有する。一実施形態では、抗VEGF治療剤に不応性の患者は、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト又はペガプタニブ治療剤の使用にもかかわらず、視力の連続的な悪化を経験する。別の実施形態では、抗VEGF治療剤に不応性の患者は、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト又はペガプタニブ治療剤の使用にもかかわらず、網膜の肥厚化を経験する。一部の実施形態では、抗VEGF治療剤に不応性の患者は、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト又はペガプタニブ治療剤を受けたのにもかかわらず、ごくわずかな解剖学的改善しか示さない。
本発明のペプチドタグ付き分子(例えば、ペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメント)は、特に、網膜血管疾患に関連する状態又は障害(例えば、DR、DME、NPDR、PDR、加齢黄斑変性(AMD)、網膜静脈閉塞症(RVO)、血管性浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生及び/又は未熟児網膜症)の進展を予防し、網膜血管疾患に関連する黄斑浮腫を治療又は予防し、現在の抗VEGF剤(例えば、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト)に必要とされる頻繁な注入と比較して硝子体内注入の頻度を低下させ、網膜血管疾患の進展による視力損失を改善するために使用され得る。本発明のペプチドタグ付き分子(例えば、ペプチドタグ付き抗体又は抗原結合フラグメント)は、例えば、網膜血管疾患を有する患者の処置のための、他の抗VEGF治療剤、他の抗PDGF治療剤、他の抗補体治療剤又は他の抗EPO治療剤又は他の抗炎症治療剤との組み合わせでも使用され得る。
網膜血管疾患、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症及びVEGF媒介性障害ならびに、網膜血管疾患に関連する他の状態又は障害の治療及び/又は予防は、眼科医又は医療専門家により、視覚機能及び/又は網膜解剖学の臨床的に関連する測定を使用して決定され得る。網膜血管疾患に関連する状態又は障害の処置は、視覚機能及び/又は網膜解剖学の改善又は保持をもたらす、又は、もたらすと考えられる、いずれかの行為(例えば、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き抗VEGF抗体の投与)を意味する。さらに、網膜血管疾患に関連する状態又は障害に関する場合、その予防は、悪化のリスクを有する患者において、視覚機能、網膜解剖学及び/又は本願明細書に記載された網膜血管疾患パラメータの悪化を予防又は遅延させる、いずれかの行為(例えば、本願明細書に記載されたペプチドタグ付き抗VEGF抗体の投与)を意味する。
視覚機能は、例えば、視力、低照度での視力、視野、中心視野、周辺視覚、対比感度、暗順応、光ストレス回復、色識別、読取り速度、補助機器への依存性(例えば、大きな活字、拡大装置、望遠鏡)、顔認識、自動車運転時の熟練度、日常生活の1つ以上の動作を行う能力、及び/又は、視覚機能に関連する患者報告満足度を含んでもよい。
視覚機能の例示となる測定としては、Snellen視力、ETDRS視力、低照度視力、Amslerグリッド、Goldmann視野、Humphrey視野、マイクロ視野計、Pelli−Robsonチャート、SKILLカード、Ishiharaカラープレート、Farnsworth D15又はD100カラー試験、標準的な網膜電位図検査、多局所網膜電位図検査、読取り速度に対する検証試験、顔認識、運転刺激及び患者報告満足度があげられる。このため、血管疾患及び/又は黄斑浮腫の処置は、ETDRSスケールにおいて、視覚の2以上のライン(又は10文字)を得ること、又は、2以上のラインを失わないこと基づいて達成されるということができる。さらに、血管疾患及び/又は黄斑浮腫の処置は、対象が、読取り速度(1分あたりのワード)において、少なくとも10%の増大を示す場合又は10%の低下を示さない場合に生じるということができる。さらに、血管疾患及び/又は黄斑浮腫の処置は、対象が、ishihara試験において正確に特定されたプレートの割合、又は、Farnsworth試験において正確に並べられたディスクの割合において、少なくとも20%の増大を示す場合又は20%の低下を示さない場合に生じるということができる。さらに、網膜血管疾患及び/又は黄斑浮腫の処置は、対象が、例えば、予め特定された程度の暗順応に対する時間において、少なくとも10%の低下を示す場合又は10%以上の増大を示さない場合に生じるということができる。さらに、網膜血管疾患及び/又は黄斑浮腫の処置は、対象が、例えば、資格を有する医療専門家(すなわち、眼科医)により決定される視野角として表現される視野の暗点の総面積の、少なくとも10%の低下を示す場合又は10%以上の増大を示さない場合に生じるということができる。
治療又は予防され得る網膜組織の望ましくない態様としては、例えば、小動脈瘤、黄斑浮腫、綿花状白斑、網膜内微小血管異常(IRAM)、毛細血管脱落、白血球接着、網膜虚血、視神経乳頭の血管新生、後極の血管新生、虹彩の血管新生、網膜内出血、硝子体出血、斑点状瘢痕、網膜下線維症及び網膜線維症、静脈拡張、血管のねじれ、血管漏出があげられる。このため、例えば、黄斑浮腫の処置は、光学干渉断層撮影法により測定された場合、中心網膜サブフィールドの厚みにおける20%以上の低下により決定され得る。
網膜解剖学を評価する例示となる手段としては、眼底検査、眼底撮影法、フルオレセイン血管造影、インドシアニングリーン血管造影、光学干渉断層撮影法(OCT)、スペクトルドメイン光学干渉断層撮影法、走査レーザ眼底検査、共焦点顕微鏡、補償光学、眼底自己蛍光、生検、剖検及び免疫組織化学があげられる。このため、血管疾患及び/又は黄班浮腫は、フルオレセイン血管造影により決定される場合、対象において、漏出面積における10%の低下時に処置されたと言うことができる。
本発明の治療剤により処置される対象は、糖尿病に関連する状態を処置する公知の方法による他の治療剤、例えば、全ての形式のインスリン及び高血圧剤も投与され得る。
眼の疾患、例えば、加齢黄斑変性(AMD)、網膜静脈閉塞症(RVO)、血管性浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生及び/又は未熟児網膜症の治療及び/又は予防は、眼科医又は医療専門家により、上記測定のいずれかによる視覚機能及び/又は網膜解剖学の臨床的に関連する測定を使用して決定され得る。本願明細書に記載された測定は、本願明細書における全ての眼の疾患に適用されるわけではないが、当業者は、所定の眼の疾患を処置するために使用され得る、視覚機能及び/又は網膜解剖学の臨床的に関連する測定を認識するであろう。
本発明の治療剤が別の薬剤と共に投与される場合、その2つは、いずれかの順序で連続的に、又は、同時に投与され得る。一部の態様では、本発明のタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントは、第2の薬剤(例えば、ルセンティス)による治療も受けている対象に投与される。他の態様では、前記結合分子は、外科的処置と共に投与される。
本発明のタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントとの組み合わせ処置に適した薬剤としては、VEGF、VEGF受容体の活性を調節することができる当該分野で既知の薬剤、他の受容体チロシンキナーゼ阻害剤又はHIF−1媒介性経路を調節する他の実体があげられる。これらの経路を阻害することが報告されている他の薬剤としては、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、アフリベルセプト、パゾパニブ、ソラフィニブ、スニチニブ及びラパマイシンがあげられる。抗炎症剤、例えば、コルチコステロイド、NSAIDS及びTNF−α阻害剤との組み合わせ処置も、網膜血管疾患及び黄班浮腫、例えば、糖尿病性網膜症及びDMEの処置に有益であり得る。
組み合わせ治療の計画は、付加的でもよいし、又は、相乗的な結果(例えば、前記2つの薬剤の組み合わせ使用に対する予測よりも網膜症の重症度を低下させる)を生じさせてもよい。一部の実施形態では、本発明は、網膜血管疾患及び黄班浮腫、具体的には、上記AMD及び糖尿病性網膜症、例えば、DME及び/又はPDRの予防及び/又は治療をするための、本発明のタグ付き抗体又は抗原結合フラグメントと、抗血管新生剤(例えば、第2の抗VEGF剤)とを用いた組み合わせ治療剤を提供する。特定の他の実施形態では、本発明は、網膜血管疾患及び黄班浮腫、具体的には、上記血管新生AMD及び糖尿病性網膜症、例えば、DME及び/又はPDRの予防及び/又は治療をするための、本発明のペプチドタグ付き抗体又はペプチドタグ付き抗原結合フラグメントと、眼における他のターゲット、例えば、VEGF、PDGF、EPO、補体経路の成分(例えば、C5、因子D、因子P、C3)、SDF1、アペリン、ベタセルリンを阻害する薬剤又は抗炎症剤(例えば、ステロイド)とを用いた組み合わせ治療剤を提供する。
一態様では、本発明は、硝子体内投与された治療剤の効果の持続期間を延長する方法に関する。効果の持続期間を延長すること(例えば、投与間隔を広げること)は、治療剤の、眼における半減期を増大させ、眼におけるクリアランスを低下させ、又は、眼における平均滞留時間を増大させることにより達成され得る。半減期又は平均滞留時間は、HAと結合するペプチドタグに前記治療剤(例えば、タンパク質又は核酸)を結合させることにより増大され得る(及び、クリアランスが低下し得る)。したがって、一態様では、本発明は、眼における分子の、半減期、平均滞留時間を増大させ、及び/又は、クリアランスを低下させる方法に関する。特に、本発明は、本願明細書に記載されたペプチドタグにタンパク質又は核酸を結合させることにより、眼における前記タンパク質又は核酸の、半減期及び/又は平均滞留時間を増大させ、又は、クリアランスを低下させる方法に関する。
増大した半減期、増大した平均滞留時間、増大した最終濃度、及び/又は、眼からの分子の低下したクリアランス速度の結果として、投与間隔を広げることができる。本発明は、眼における分子の半減期を増大させるための方法であって、対象の眼に、9.0μM以下のKDでHAと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む方法も提供する。特定の具体的な態様では、前記方法は、8.0μM以下のKDで、HAと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。特定の具体的な態様では、前記方法は、7.2μM以下のKDで、HAと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。特定の具体的な態様では、前記方法は、5.5μM以下のKDで、HAと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。本発明は、眼における平均滞留時間を増大させ、最終濃度を増大させ、及び/又は、眼からの分子のクリアランスを低下させるための方法であって、対象の眼に、9.0μM以下のKDで、HAと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む方法を提供する。特定の具体的な態様では、前記方法は、8.0μM以下のKDで、HAと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。特定の具体的な態様では、前記方法は、7.2μM以下のKDで、HAと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。特定の具体的な態様では、前記方法は、5.5μM以下のKDで、HAと結合するペプチドタグに結合した前記分子を含む組成物を投与する工程を含む。特定の態様では、前記ペプチドタグは、配列番号32、33、34、36又は37の配列を含む。前記組成物は、タンパク質又は核酸、例えば、抗体又は抗原結合フラグメント、より具体的には、例えば、抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントに結合した、9.0μM、8.0μM、7.2μM又は5.5μM以下のKDで、HAと結合するペプチドタグを含む。
本願明細書に記載された半減期は、薬剤濃度が1/2低下するために必要とされる時間を意味する(Rowland M and Towzer TN: Clinical Pharmacokinetics. Concepts and Applications. Third edition (1995) and Bonate PL and Howard DR (Eds): Pharmacokinetics in Drug Development, Volume 1 (2004))。詳細は、Kenneth, A et at Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)にも見出され得る。「Pharmacokinetics」, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2 nd Rev. ex edition (1982)も参照され得る。同文献には、薬物動態学的パラメータ、例えば、アルファ半減期及びベータ半減期ならびに曲線下面積(AUC)が記載されている。場合により、本願明細書において引用された全ての薬物動態学的パラメータ及び値は、ヒトにおける値であると読まれるべきである。場合により、本願明細書において引用された全ての薬物動態学的パラメータ及び値は、マウス又はラット又はカニクイザルにおける値であると読まれるべきである。
一態様では、HAに結合することによって、半減期が少なくとも25%増大すること(例えば、5から6.25日)が考えられる。別の態様では、半減期における少なくとも50%の増大(例えば、5から7.5日)が考えられる。別の態様では、半減期における少なくとも75%の増大(例えば、5から8.75日)が考えられる。別の態様では、半減期における少なくとも100%の増大(例えば、5から10日)が考えられる。別の態様では、半減期における100%より大きい増大(例えば、150%、200%)が考えられる。一態様では、本願明細書に記載したように、分子へのペプチドタグの結合は、前記タグを含まない分子の眼における半減期に対して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍及び少なくとも4倍以上、眼における半減期を増大させ得る。タグ付けされていない分子と比較した、HA結合ペプチドタグ付き分子についての眼における半減期の相対的増大は、硝子体内注入により前記分子を投与し、当分野において公知の分析法、例えば、ELISA、質量分光法、ウェスタンブロット、放射線免疫アッセイ又は蛍光標識を使用して、種々の時点において残留する濃度を測定することにより決定され得る。硝子体内に投与された生体分子の硝子体からのクリアランスは、一次指数崩壊関数(方程式1)に適合することが示されている(Krohne et al., 2008;Krohne et al., 2012;Bakri et al., 2007b;Bakri et al., 2007a;Gaudreault et al., 2007;Gaudreault et al., 2005)。
Ct=Ct=0*e−kt (1)
速度定数kは、
である。
ctは、硝子体内投与後の時間tにおける濃度である。
Ct=0は、硝子体内投与後の時間0における濃度である。
T1/2は、硝子体内投与後の眼における半減期である。
Ct=Ct=0*e−kt (1)
速度定数kは、
である。
ctは、硝子体内投与後の時間tにおける濃度である。
Ct=0は、硝子体内投与後の時間0における濃度である。
T1/2は、硝子体内投与後の眼における半減期である。
硝子体内の半減期を増大させる効果は、方程式(1)及び(2)を使用してモデル化され得る。
ペプチドタグ付き分子の平均滞留時間及び/又は半減期の薬物動態学的分析及び決定をするための方法は、当業者にありふれたものであろう。さらに、ペプチドタグ付き分子の平均滞留時間の薬物動態学的分析及び決定をするための方法に関連する詳細は、Shargel, L and Yu, ABC:Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, 4th Edition (1999)、Rowland M and Towzer TN: Clinical Pharmacokinetics. Concepts and Applications. Third edition (1995)及び、Bonate PL and Howard DR (Eds): Pharmacokinetics in Drug Development, Volume 1 (2004)に見出され得る。前記文献には、薬物動態学的パラメータ、例えば、平均滞留時間が記載されている。平均滞留時間及びAUCは、時間に対する、薬剤(例えば、治療用タンパク質、ペプチドタグ付きタンパク質、ペプチドタグ等)のマトリクス又は組織(例えば、血清)濃度の曲線から決定され得る。Phoenix WinNonlinソフトウェア、eg バージョン6.1(Pharsight Corp.,Cary、NC、USAから入手)が、例えば、このようなデータを分析及び/又はモデル化するために使用され得る。前記平均滞留時間は、薬剤が身体に存在する平均時間であり、吸収、分布及び排出のプロセスを包含する。MRTは、用量の63.2%が排出される時間を表す。
一態様では、本発明は、分子(例えば、タンパク質又は核酸)の平均滞留時間を、本願明細書に記載されたペプチドタグに前記分子を結合させることにより増大させる方法に関する。一態様では、本願明細書に記載された分子へのペプチドタグの結合は、眼における前記分子の平均滞留時間を10%以上増大させ得る。更なる態様では、ここに記載された分子へのペプチドタグの結合は、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%以上、眼における前記分子の平均滞留時間を増大させ得る。
更なる態様では、本発明は、分子(例えば、タンパク質又は核酸)の眼におけるクリアランスを、本願明細書に記載されたペプチドタグに前記分子を結合させることにより低下させる方法に関する。一態様では、本願明細書に記載された分子へのペプチドタグの結合は、前記分子の眼におけるクリアランスを10%以上低下させ得る。更なる態様では、本願明細書に記載された分子へのペプチドタグを考慮することは、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%以上、眼における前記分子の眼におけるクリアランスを低下させ得る。
医薬組成物
ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子の送達
本発明は、本発明のペプチドタグ、例えば、9.0μM、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む組成物を提供する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に、又は、別々に配合された、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含んでもよい。本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に、又は、別々に配合された、ペプチドタグ付き分子(例えば、タンパク質又は核酸に結合したペプチドタグ)を含む組成物も提供する。特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、上述したように、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む。本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に、又は、別々に配合された、ペプチドタグ付き抗体もしくはペプチドタグ付き抗原結合フラグメントならびに/又はペプチドタグを含む組成物も提供する。特定の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に配合された、ペプチドタグに結合したVEGF抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物を提供する。より具体的な態様では、本発明は、ペプチドタグ付き分子:NVS1、NVS2、NVS3、NVS36又はNVS37を含む組成物を提供する。さらにより具体的な態様では、本発明は、表1、2、8、8b、9又は9bのいずれかにおける前記ペプチドタグ付き分子を含む組成物を提供する。本願明細書に記載された組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に配合されてもよい。前記組成物は、さらに、例えば、網膜血管疾患に関連する状態又は障害を治療又は予防するのに適した1つ以上の他の治療剤を含み得る。薬学的に許容され得るキャリアは、前記組成物を向上もしくは安定化させ、又は、前記組成物の調製を容易にするために使用され得る。薬学的に許容され得るキャリアとしては、生理学的に適合性である、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤等があげられる。
ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子の送達
本発明は、本発明のペプチドタグ、例えば、9.0μM、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む組成物を提供する。特定の具体的な態様では、前記ペプチドタグは、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に、又は、別々に配合された、配列番号32、33、34、35又は36の配列を含んでもよい。本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に、又は、別々に配合された、ペプチドタグ付き分子(例えば、タンパク質又は核酸に結合したペプチドタグ)を含む組成物も提供する。特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子は、上述したように、眼におけるHAと結合するペプチドタグを含む。本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に、又は、別々に配合された、ペプチドタグ付き抗体もしくはペプチドタグ付き抗原結合フラグメントならびに/又はペプチドタグを含む組成物も提供する。特定の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に配合された、ペプチドタグに結合したVEGF抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物を提供する。より具体的な態様では、本発明は、ペプチドタグ付き分子:NVS1、NVS2、NVS3、NVS36又はNVS37を含む組成物を提供する。さらにより具体的な態様では、本発明は、表1、2、8、8b、9又は9bのいずれかにおける前記ペプチドタグ付き分子を含む組成物を提供する。本願明細書に記載された組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアと共に配合されてもよい。前記組成物は、さらに、例えば、網膜血管疾患に関連する状態又は障害を治療又は予防するのに適した1つ以上の他の治療剤を含み得る。薬学的に許容され得るキャリアは、前記組成物を向上もしくは安定化させ、又は、前記組成物の調製を容易にするために使用され得る。薬学的に許容され得るキャリアとしては、生理学的に適合性である、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤等があげられる。
本発明の医薬組成物は、当分野において公知の各種の方法により投与され得る。前記投与の経路及び/又は方式は、所望の結果に応じて変化する。前記組成物が、眼に対する投与に適しているのが好ましい。より具体的には、前記組成物は、硝子体内投与に適していてもよい。前記薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアは、眼に対する投与(例えば、注入、結膜下又は局所投与)に、より具体的には、硝子体内投与に適しているべきである。前記投与経路に応じて、前記活性な化合物(すなわち、抗体、二重特異性及び多重特異性分子)は、酸の作用及び前記化合物を不活性化する場合がある他の自然条件から、前記化合物を保護する材料でコートされてもよい。本発明は、眼への送達用の組成物を製造する方法であって、9.0μM、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM又は0.5μM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグを、眼におけるターゲット(例えば、VEGF、因子P、因子D、EPO、TNFα、C5、IL−1β等)と結合する、又は、結合可能な分子(例えば、タンパク質又は核酸)に結合させる工程を含む方法も提供する。
前記組成物は、無菌及び流体であるべきである。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散剤の場合には、必要とされる粒径の維持により、及び、界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、前記組成物中に、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール及び塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注入組成物の長期吸収は、前記組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アンモニウム又はゼラチンを含ませることにより、もたらされ得る。
本発明の医薬組成物は、当分野において周知かつ通常に実用化されている方法に基づいて調製され得る。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000;及び、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。医薬組成物は、好ましくは、GMP条件下において製造される。典型的には、治療的に有効な用量又は効果的な用量の分子が、本発明の医薬組成物に使用される。前記ペプチドタグ付き分子は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容され得る剤形に製剤化される。投与計画は、最適な所望の応答(例えば、治療的応答)を提供するために調節される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、複数の分割された用量が、長期間にわたって投与されてもよいし、又は、治療状態の緊急性により指示された場合、用量が比例的に減少又は増加されてもよい。投与の容易性及び用量の均質性のため、非経口組成物を単位剤形に製剤化するのが特に有益である。本願明細書で使用する場合、単位剤形は、処置される対象に対する単位用量として適切な、物理的に分離された単位を意味する。各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共に、所望の治療効果を生じるように算出された所定量の活性化合物を含む。
本発明の医薬組成物中の前記活性成分の実際の用量レベルは、患者に対する毒性なしに、具体的な患者に対する所望の治療応答、組成物及び投与方式を達成するために有効な量の活性成分が得られるように変化し得る。前記選択された用量レベルは、各種の薬物動態学的要因、例えば、使用される本発明の具体的な組成物、又は、そのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与のタイミング、使用される具体的な化合物の排泄速度、処置の持続期間、使用される具体的な組成物との組み合わせで使用される他の薬剤、化合物及び/もしくは材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康及び既往歴等の要因により決まる。用量レベルは、本願明細書に記載された眼/視覚の評価の1つ以上を使用して決定される場合に治療的応答を達成するように選択及び/又は調節されてもよい。
医師又は獣医師は、前記医薬組成物に使用される本発明のペプチドタグ付き分子の用量を、所望の治療的効果を達成するのに必要とされるより低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、前記用量を徐々に増加させることができる。一般的には、本願明細書に記載された網膜血管疾患の処置用の本発明の組成物の有効な用量は、多くの種々の要因、例えば、投与手段、ターゲット部位、患者の生理学的状態、前記患者がヒトもしくは動物であるかどうか、投与される他の薬剤及び、処置が予防的であるか、もしくは、治療的であるかどうかにより変化する。処置用量は、安全性及び効果を最適化するように用量設定される必要がある。ペプチドタグ付き分子による硝子体内投与のための用量は、注入あたりに、0.1mg/眼から6mg/眼の範囲でもよい。眼あたりの単回用量は、眼あたりに、2回の注入で行われてもよい。例えば、12mg/眼の単回用量は、各6mgの2回の注入で送達されて、合計12mgの用量をもたらしてもよい。特定の具体的な態様では、用量は、12mg/眼、11mg/眼、10mg/眼、9mg/眼、8mg/眼、7mg/眼、6mg/眼、5mg/眼、4.5mg/眼、4mg/眼、3.5mg/眼、3mg/眼、2.5mg/眼、2mg/眼、1.5mg/眼、1mg/眼、0.9mg/眼、0.8mg/眼、0.7mg/眼、0.6mg/眼、0.5mg/眼、0.4mg/眼、0.3mg/眼、0.2mg/眼、又は0.1mg/眼以下でもよい。各投与は、眼あたりに、1回以上の注入で行われてもよい。注入あたりの容量は、10マイクロリットル〜50マイクロリットルでもよいが、投与あたりの容量は、10マイクロリットル〜100マイクロリットルでもよい。例えば、用量としては、注入あたりの眼あたりに、0.1mg/50μl、0.2mg/50μl、0.3mg/50μl、0.4mg/50μl、0.5mg/50μl、0.6mg/50μl、0.7mg/50μl、0.8mg/50μl、0.9mg/50μl、1.0mg/50μl、1.1mg/50μl、1.2mg/50μl、1.3mg/50μl、1.4mg/50μl、1.5mg/50μl、1.6mg/50μl、1.7mg/50μl、1.8mg/50μl、1.9mg/50μl、2.0mg/50μl、2.1mg/50μl、2.2mg/50μl、2.3mg/50μl、2.4mg/50μl、2.5mg/50μl、2.6mg/50μl、2.7mg/50μl、2.8mg/50μl、2.9mg/50μl、3.0mg/50μl、3.1mg/50μl、3.2mg/50μl、3.3mg/50μl、3.4mg/50μl、3.5mg/50μl、3.6mg/50μl、3.7mg/50μl、3.8mg/50μl、3.9mg/50μl、4.0mg/50μl、4.1mg/50μl、4.2mg/50μl、4.3mg/50μl、4.4mg/50μl、4.5mg/50μl、4.6mg/50μl、4.7mg/50μl、4.8mg/50μl、4.9mg/50μl、5.0mg/50μl、5.1mg/50μl、5.2mg/50μl、5.3mg/50μl、5.4mg/50μl、5.5mg/50μl、5.6mg/50μl、5.7mg/50μl、5.8mg/50μl、5.9mg/50μl又は6.0mg/50μlがあげられる。例示となる処置計画は、2週間毎に1回又は毎月1回又は2ヶ月毎に1回又は3から6ヶ月毎に1回又は、必要に応じて(PRN)、IVT投与を必要とする。前記ペプチドタグ付き分子は、現在の治療の処置計画を改善し、以下にさらに詳細に記載されている、投与間隔を広げることを可能にする。
ルセンティスと共に使用するのに適したFDA承認用量及び投与計画が考慮される。抗VEGF抗体又は抗原結合フラグメントと共に使用するのに適した他の用量及び投与計画は、米国特許出願公開第20120014958号明細書に記載されている。
ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子の組成物は、複数回投与されてもよい。単回用量間の間隔は、毎週、毎月又は毎年であり得る。例えば、視力又は黄班浮腫に基づいて、患者における再処置の必要性により示された場合、間隔は不規則であってもよい。さらに、別の投与間隔は、医師により決定され、毎月又は効果的であるように必要に応じて投与され得る。効果は、光学干渉断層撮影法(OCT)及び視力により決定される場合、病変の成長、抗VEGF救出速度、網膜の厚みに基づいている。用量及び頻度は、患者におけるペプチドタグ付き分子の半減期及び治療ターゲット(例えば、VEGF、C5、EPO、因子P等)のレベルにより変化してもよい。IVTで投与された治療用分子の効果の持続期間を延長させることは、眼におけるT1/2を増大させること、及び/又は、その眼における平均滞留時間を増大させること、及び/又は、クリアランスを低下させることにより達成され得る。効果の持続期間を延長させることは、例えば、硝子体、網膜及び/又はRPE/脈絡膜からのそのクリアランスを遅延させて、前記ペプチドタグ付き分子の眼における増大した半減期をもたらすために、分子にHA結合ペプチドタグを結合させることにより達成され得る。タグ付けされていない分子と比較して、HAと結合するペプチドタグ付き分子についての眼における半減期の相対的増大は、硝子体内注入により前記分子を投与し、当分野において公知の分析法、例えば、ELISA、質量分光法、ウェスタンブロット、放射線免疫アッセイ又は蛍光標識を使用して、種々の時点において残留する濃度を測定することにより決定され得る。血中濃度は、記載されたように、眼からのクリアランス速度を算出するためにも測定及び使用され得る(Xu L et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 54(3):1616-24 (2013))。
一般的に、本発明のペプチドタグに結合した分子(例えば、抗体又はフラグメント)は、タグ付けされていない分子よりも眼における長い半減期を示す。例えば、眼におけるHAと結合するペプチドタグに結合し分子は、前記タグ付けされていない分子と比較して、半減期における25%の増大(例えば、5から6.25日)、前記タグ付けされていない分子と比較して、半減期における50%の増大(例えば、5から7.5日)、前記タグ付けされていない分子と比較して、半減期における75%の増大(例えば、5から8.75日)、前記タグ付けされていない分子と比較して、半減期における100%の増大(例えば、5から10日)を有し得る。特定の態様では、前記ペプチドタグ付き分子の半減期は、前記タグ付けされていない分子と比較して、100%より高く(例えば、5から、15、20又は30日;1週間から、3週間、4週間以上等)増大し得る。
前記投与の用量及び頻度は、処置が予防的又は治療的であるかどうか、及び、処置が、投与された分子の半減期により直接影響を受けるかどうかにより変化し得る。本願明細書に記載されたペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子の投与は、用量及び投与頻度における臨床的に意義のある改善をもたらす。例えば、前記ペプチドタグ又はペプチドタグ付き分子は、タグ付けされていない分子と比較して、より低い頻度で投与され得る。用量及び投与頻度における臨床的に意義のある改善を達成することは、組成物の初期の開始用量に応じて変化し得る。例えば、毎日、毎週、隔週、毎月又は隔月で投与される分子について、ペプチドタグ付き分子により達成され得る投与頻度における臨床的に意義のある改善は、例えば、投与間隔の、少なくとも25%、30%、50%、75%又は100%の広がりであり得る。特定の態様では、例えば、投与頻度における臨床的に意義のある改善は、それぞれ、毎日から隔日、毎週から2週間毎又は毎月から6週間毎もしくは隔月以上に、投与頻度を低くすることにより生じる。
より具体的には、本発明のペプチドタグは、現在の眼の治療剤の投与間隔を改善するために使用されてもよい。特定の態様では、ペプチドタグは、前記分子の投与間隔を少なくとも25%広げるのに有用であり得る。例えば、前記投与間隔は、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、100%以上広げられ得る。前記分子の眼における投与間隔は、7.5μM以下、7.0μM以下、6.5μM以下、6.0μM以下、5.5μM以下、5.0μM以下、4.5μM以下、4.0μM以下、3.5μM以下、3.0μM以下、2.5μM以下、2.0μM以下、1.5μM以下、1.0μM以下、0.5μM以下又は100nM以下のKDで、眼におけるHAと結合するペプチドタグに、前記分子を結合させることにより広げられてもよい。例えば、抗VEGF Fabであるラニビズマブ及び抗VEGF IgGであるベバシズマブは、現在、Wet AMD及びDMEの患者に対して、最大の眼に見える利益を達成するために、毎月投与される。HA結合ペプチドタグをラニビズマブ又はベバシズマブに結合させることは、隔月又は四半期の投与に投与頻度を低くすること(すなわち、投与間隔における少なくとも50%の増大)が期待され得る。同様に、抗VEGFアプタマーであるペガプタニブは、現在、Wet AMD患者において、6週間毎の投与が規定されている。ペガプタニブをHA結合ペプチドタグに結合させることは、2ヶ月以上投与間隔を広げること(すなわち、投与間隔における少なくとも30%の増大)が期待される。隔月以上の投与頻度を必要とする他の分子について、臨床的に意義のある改善は、もう1月以上投与間隔を増大させ得る(すなわち、投与間隔における少なくとも50%の増大)。例えば、抗VEGF Fcトラップであるアフリベルセプトは、現在、Wet AMD患者において、隔月の投与が規定されている。アフリベルセプトをHA結合ペプチドタグに結合させることは、3ヶ月毎以上の投与を可能にすることが予測され、投与間隔における少なくとも50%の増大をもたらす。
特定の具体的な態様では、前記組成物は、投与あたりに、12mg、11mg、10mg、9mg、8mg、7mg、6mg、5mg、4.5mg、4mg、3.5mg、3mg、2.5mg、2mg、1.5mg、1mg、0.9mg、0.8mg、0.7mg、0.6mg、0.5mg、0.4mg、0.3mg、0.2mg又は0.1mgの前記ペプチドタグ付き分子を送達するように配合される。特定の具体的な態様では、前記組成物は、注入あたりに、6mg、5mg、4.5mg、4mg、3.5mg、3mg、2.5mg、2mg、1.5mg、1mg、0.9mg、0.8mg、0.7mg、0.6mg、0.5mg、0.4mg、0.3mg、0.2mg、0.1mg又は0.05mgの前記ペプチドタグ付き分子を送達するように配合される。具体的な態様では、前記組成物は、投与あたりに、12mgの前記ペプチドタグ付き分子、及び/又は、注入あたりに、6mgの前記ペプチドタグ付き分子を送達するように配合される。予防的用途では、比較的低い用量が、長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者は、残りの人生の間にわたって処置を受け続ける。治療的用途では、比較的短い間隔で比較的高い用量が、場合により、前記疾患の進行が低下又は終了するまで、及び好ましくは、前記患者が疾患の兆候の部分的又は完全な改善を示すまで必要とされる。その後、前記患者は、予防的投与計画で投与され得る。
本願明細書における実施例では、眼における分子の半減期を延長するヒアルロナン(HA)結合ペプチドタグが記載される。例えば、前記分子は、タンパク質又は核酸でもよい。2つの動物モデル:ウサギVEGF誘導性漏出モデル、網膜浮腫モデル、及び、カニクイザルのレーザ誘導性脈絡膜血管新生(レーザCNV)モデル、血管新生性(wet)AMDモデルを、HA結合タンパク質タグと結合したタンパク質と、そのままの修飾されていない(すなわち、タグ付けされていない)タンパク質又は核酸との間における効果の持続期間における差異を評価するために使用した。
実施例1:VEGF Fab(NVS4)及びペプチドタグ付きVEGF Fab(NVS1)の生成
抗VEGF scFvの抗VEGF Fab(NVS4)への変換
前記抗VEGF Fab(NVS4)を生成するための開始点を、抗VEGF scFv(1008scFv)とした。1008scFvは、米国特許出願公開第20120014958号明細書に先に開示されており、578minimaxT84N_V89L又はタンパク質No:1008として特定された。
抗VEGF scFvの抗VEGF Fab(NVS4)への変換
前記抗VEGF Fab(NVS4)を生成するための開始点を、抗VEGF scFv(1008scFv)とした。1008scFvは、米国特許出願公開第20120014958号明細書に先に開示されており、578minimaxT84N_V89L又はタンパク質No:1008として特定された。
1008scFvをそのFab型(NVS4)に変換するために、1008scFvのアミノ酸配列を、公開されているヒトIgGフレームワーク配列と整列させ、カッパフレームワークと高い相同性を有することを決定した。結果として、1)ヒト免疫グロブリン・カッパ鎖の定常領域配列であるKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号125)を、1008scFvにおける軽鎖のC−末端に付加し、及び、ii)ヒト免疫グロブリンの重鎖の第1の定常Igドメイン(CH1ドメイン)の配列であるASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC(配列番号126)を、1008scFvにおける重鎖のC−末端に付加することにより、1008scFvをNVS4に変換した。さらに、アロタイプとして、重鎖のG1m(f)3及びカッパ軽鎖のKm3と相関する、選択されたアロタイプが、我々の抗体治療に使用される。
タグ付き及びタグ付けされていない組換え抗体及びタンパク質を、HEK293細胞中の哺乳類発現ベクターの一過性導入により発現させ、標準的な親和性樹脂、例えば、Kappaselect(Cat#17−5458−01、GE Healthcare Biosciences)を使用して精製した。
実施例2:修飾されていないVEGF抗体(NVS4)のラニビズマブに対する評価
ウサギの眼における従来のPK決定
ウサギの硝子体における、NVS4及びラニビズマブ(CAS#:347396−82−1)の眼におけるPKプロファイルを、以下に記載され、図1に示された従来の方法を使用して比較した。
ウサギの眼における従来のPK決定
ウサギの硝子体における、NVS4及びラニビズマブ(CAS#:347396−82−1)の眼におけるPKプロファイルを、以下に記載され、図1に示された従来の方法を使用して比較した。
150μg/眼のラニビズマブ又はNVS4を、ウサギの眼の硝子体内に注入した(抗体あたりに、N=6の眼)。ウサギを、注入後1時間ならびに7、14、21、28日で屠殺し、眼を摘出した。前記摘出した眼を解剖し、硝子体を、他の組織から分離し、さらに、TissueLyzer(QIAGEN(登録商標))を使用して機械的にホモジナイズした。前記硝子体における抗体レベルを、ELISAにより測定した。Maxisorp384ウェルプレート(Nunc464718)を、炭酸バッファー(Pierce(登録商標)28382)中のヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Thermo Fisher(登録商標)31119)で、4℃において一晩コートした。インキュベートの合間に、BioTek(登録商標)プレート洗浄器を使用して、プレートをTBST(THERMO SCIENTIFIC(登録商標)28360)で3回洗浄した。翌日、前記プレートを、TBS中のブロッキングバッファー(5% BSA(SIGMA(登録商標)A4503)、0.1% Tween−20(SIGMA(登録商標)P1379)、0.1% Triton X−100(SIGMA(登録商標)P234729)により、室温で2時間(又は、4℃で一晩)ブロッキングした。サンプルを、希釈剤(TBSにおける、2% BSA(SIGMA(登録商標)A4503)、0.1% Tween−20(SIGMA(登録商標)P1379)、0.1% Triton X−100(SIGMA(登録商標)P234729))中に希釈した。サンプルを、穏やかに振とうしながら、前記プレート上で室温において1時間インキュベートした。検出抗体を、HRPにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG[F(ab’)2](Thermo Fisher31414)とした。前記検出抗体を、穏やかに振とうしながら、前記プレートに室温で30分間添加した。Ultra TMBを、15分間添加した(Thermo Fisher(登録商標)34028)。反応を、2N 硫酸(Ricca8310−32)により停止させた。前記サンプルの吸光度を、SpectraMax(登録商標)(450−570nm)上で読み取った。眼の組織からのFab回収レベルを逆算するために、精製した標準を使用した。前記標準について、使用した上限濃度を、2倍希釈による200ng/mLとした。種々の抗体ペアを、ウサギ組織からのFab回収に使用し得る。
NVS4及びラニビズマブは、図1に示されるように、眼における同等のPKプロファイルを示した。ラニビズマブ及びNVS4についての半減期値は、それぞれ、2.5及び2.7日であり、共に関連しない抗VEGF Fabに対するPKの同等性を示す。その後、ペプチドタグ付き抗VEGF Fabが、ラニビズマブ又はNVS4のいずれかと比較されてよい。
ウサギのVEGF負荷モデル
ウサギのVEGF誘導性漏出モデルにおいて、ヒトVEGF(hVEGF)を、硝子体内(IVT)注入によりウサギの眼に投与した。ヒトVEGFは、血管直径、ねじれ及び透過性の増大を含む用量依存性の血管変化を誘導する。血管透過性は、定量的画像処理又はフルオレセイン漏出スコアリングのいずれかと組み合わせたフルオレセイン血管造影(以下に記載される方法)を使用して評価され得る。
ウサギのVEGF誘導性漏出モデルにおいて、ヒトVEGF(hVEGF)を、硝子体内(IVT)注入によりウサギの眼に投与した。ヒトVEGFは、血管直径、ねじれ及び透過性の増大を含む用量依存性の血管変化を誘導する。血管透過性は、定量的画像処理又はフルオレセイン漏出スコアリングのいずれかと組み合わせたフルオレセイン血管造影(以下に記載される方法)を使用して評価され得る。
ウサギにおける硝子体内(IVT)注入
ウサギの眼を、局所の1% シクロペントレート及び2.5又は10% フェニルエフリンにより広げ、角膜を、局所の0.5% プロパラカインにより麻酔した。ついで、前記ウサギを、ケタミン/キシラジン混合物(17.5−35及び2.5−5mg/kg)の筋肉内注射により麻酔した。外科用顕微鏡の直接視覚化下において、50μLの処置液を、硝子体内に注入した。30ゲージのニードルを、角膜輪郭から硝子体の中央に、上側頭に約2mm挿入した。前記ウサギの眼を、前記注入由来の合併症(例えば、出血、網膜剥離又はレンズ傷害)について検査した。ついで、その手順を、もう一方の眼に繰り返した。抗生物質の軟膏(試験の部分集合では、デキサメタゾンをさらに含む抗生物質の軟膏)を、全ての試験について両眼に塗布した。400ngの組換えhVEGFを、約1.6−2kgの体重の、オスのダッチベルテッドウサギの硝子体内に注入した。ヒトVEGF(Peprotech;cat AF100−20、Lot0508AF10)を、無菌の0.9% 生理食塩水に希釈した。VEGF負荷モデルの硝子体内注入48時間後に、ウサギの網膜血管を、以下に記載するように画像化した。
ウサギの眼を、局所の1% シクロペントレート及び2.5又は10% フェニルエフリンにより広げ、角膜を、局所の0.5% プロパラカインにより麻酔した。ついで、前記ウサギを、ケタミン/キシラジン混合物(17.5−35及び2.5−5mg/kg)の筋肉内注射により麻酔した。外科用顕微鏡の直接視覚化下において、50μLの処置液を、硝子体内に注入した。30ゲージのニードルを、角膜輪郭から硝子体の中央に、上側頭に約2mm挿入した。前記ウサギの眼を、前記注入由来の合併症(例えば、出血、網膜剥離又はレンズ傷害)について検査した。ついで、その手順を、もう一方の眼に繰り返した。抗生物質の軟膏(試験の部分集合では、デキサメタゾンをさらに含む抗生物質の軟膏)を、全ての試験について両眼に塗布した。400ngの組換えhVEGFを、約1.6−2kgの体重の、オスのダッチベルテッドウサギの硝子体内に注入した。ヒトVEGF(Peprotech;cat AF100−20、Lot0508AF10)を、無菌の0.9% 生理食塩水に希釈した。VEGF負荷モデルの硝子体内注入48時間後に、ウサギの網膜血管を、以下に記載するように画像化した。
画像取得
ヒトVEGF誘導性網膜血管変化を、静脈内蛍光染料投与後に、網膜血管の画像の取得により定量化した。フルオレセイン
送達後に取得した画像を、全ての効果試験における血管透過性を決定するために使用した。定量的なフルオレセイン漏出を生成する試験も、血管を標識するために選択される蛍光染料(フルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲートデキストラン)の画像化を必要とした。眼の画像を、VEGFの48時間後に取得した。画像は、視神経に隣接する鼻髄腔上の30度のレンズで取得された、40以下の登録された走査レーザ検眼鏡(SLO)画像の平均であった。6−モードSpectralis(登録商標)(Heidelberg Engineering)からのフルオレセインチャネルを、全ての画像取得に使用した。画像化前に、拡張のために、局所的に、1−2滴の1% シクロペントレート及び1−2滴のフェニルエフリン(2.5又は10%)をウサギに投与した。0.5% プロパラカインも、局所麻酔として塗布した。その後、ウサギを、前述のように麻酔した。耳の縁の血管内に、FITCにコンジュゲートした2000kDデキストラン(SIGMA(登録商標))溶液1mLを静脈内注射することにより、画像取得前の約5分間、血管を標識した。使用したFITC−デキストランの濃度(35〜70mg/mL)は、高品質画像を得るために必須のフルオレセインシグナルに基づいて、各ロットについて経験的に選択した。その後、標識された網膜血管の画像を取得した。ついで、網膜血管の透過性を、耳の縁の血管内への0.3mLの10% フルオレセイン溶液を注入することにより評価した。ついで、試験に応じて、一方の眼内のみにフルオレセインを注入した3分後、又は、一方の眼に注入した3分後に、続けて、もう片方の眼にフルオレセインを注入した約4〜6分後のいずれかに取得した。
ヒトVEGF誘導性網膜血管変化を、静脈内蛍光染料投与後に、網膜血管の画像の取得により定量化した。フルオレセイン
送達後に取得した画像を、全ての効果試験における血管透過性を決定するために使用した。定量的なフルオレセイン漏出を生成する試験も、血管を標識するために選択される蛍光染料(フルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲートデキストラン)の画像化を必要とした。眼の画像を、VEGFの48時間後に取得した。画像は、視神経に隣接する鼻髄腔上の30度のレンズで取得された、40以下の登録された走査レーザ検眼鏡(SLO)画像の平均であった。6−モードSpectralis(登録商標)(Heidelberg Engineering)からのフルオレセインチャネルを、全ての画像取得に使用した。画像化前に、拡張のために、局所的に、1−2滴の1% シクロペントレート及び1−2滴のフェニルエフリン(2.5又は10%)をウサギに投与した。0.5% プロパラカインも、局所麻酔として塗布した。その後、ウサギを、前述のように麻酔した。耳の縁の血管内に、FITCにコンジュゲートした2000kDデキストラン(SIGMA(登録商標))溶液1mLを静脈内注射することにより、画像取得前の約5分間、血管を標識した。使用したFITC−デキストランの濃度(35〜70mg/mL)は、高品質画像を得るために必須のフルオレセインシグナルに基づいて、各ロットについて経験的に選択した。その後、標識された網膜血管の画像を取得した。ついで、網膜血管の透過性を、耳の縁の血管内への0.3mLの10% フルオレセイン溶液を注入することにより評価した。ついで、試験に応じて、一方の眼内のみにフルオレセインを注入した3分後、又は、一方の眼に注入した3分後に、続けて、もう片方の眼にフルオレセインを注入した約4〜6分後のいずれかに取得した。
画像分析
血管透過性におけるVEGFの作用を、3〜6分のフルオレセイン画像に適用した2種類の技術を使用して評価した。使用したアプローチにかかわらず、データを作成及び取得するために使用した工程は、先に記載したFITC−デキストラン注入を除いて同じとした。MATLAB(登録商標)(Mathworks(登録商標))を使用してこの目的のために開発された専用のソフトウェアを用いるか、又は、定量的スコアリングシステムを使用して各画像におけるフルオレセイン漏出を評価するかのいずれかにより、定量的に分析を行った。質が不十分な画像の場合、炎症が見られた場合、又は、注入の問題がある場合には、アンマスキング前に排除した。両方のアプローチについて、前記データを、個々の試験のため、又は、複数の試験の組み合わせとして、報告する。両方法を、以下に説明する。
血管透過性におけるVEGFの作用を、3〜6分のフルオレセイン画像に適用した2種類の技術を使用して評価した。使用したアプローチにかかわらず、データを作成及び取得するために使用した工程は、先に記載したFITC−デキストラン注入を除いて同じとした。MATLAB(登録商標)(Mathworks(登録商標))を使用してこの目的のために開発された専用のソフトウェアを用いるか、又は、定量的スコアリングシステムを使用して各画像におけるフルオレセイン漏出を評価するかのいずれかにより、定量的に分析を行った。質が不十分な画像の場合、炎症が見られた場合、又は、注入の問題がある場合には、アンマスキング前に排除した。両方のアプローチについて、前記データを、個々の試験のため、又は、複数の試験の組み合わせとして、報告する。両方法を、以下に説明する。
定量的画像処理分析
一部の試験において、フルオレセイン漏出を、以下に記載された方法を使用する画像処理技術により定量化した。
一部の試験において、フルオレセイン漏出を、以下に記載された方法を使用する画像処理技術により定量化した。
まず、VEGF FITC−デキストラン及びフルオレセイン後の画像を、両画像に共通する血管の特徴を使用して互いに整列させた。ついで:
1.ついで、髄腔の外側領域を、分析用には不十分な画像品質のいずれかの局部に沿って、前記共登録画像からトリミングした。
2.網膜血管における目的の複数の領域を、両画像において表示し、一方の画像の強度を、前記目的の領域におけるシグナルが両画像において等しくなるまで増加させた(正規化)。
3.前記整列させたFITC−デキストラン画像を、浸出フルオレセインを含む画像を生じるフルオレセイン漏出画像から差し引いた。
4.フルオレセイン漏出を、浸出染料画像における目的のトリミング領域に含まれる画素の平均強度として、各眼について報告した。
1.ついで、髄腔の外側領域を、分析用には不十分な画像品質のいずれかの局部に沿って、前記共登録画像からトリミングした。
2.網膜血管における目的の複数の領域を、両画像において表示し、一方の画像の強度を、前記目的の領域におけるシグナルが両画像において等しくなるまで増加させた(正規化)。
3.前記整列させたFITC−デキストラン画像を、浸出フルオレセインを含む画像を生じるフルオレセイン漏出画像から差し引いた。
4.フルオレセイン漏出を、浸出染料画像における目的のトリミング領域に含まれる画素の平均強度として、各眼について報告した。
各群におけるフルオレセイン漏出の阻害を、生理食塩水コントロール群に対して算出した。統計学的分析を、両側スチューデントt検定又はDunnett’s複数比較検定による分散の一方向分析のいずれかにより行った。
定量的フルオレセイン画像漏出スコアリング
一部の試験において、フルオレセイン血管造影画像への適用のために開発された3工程スコアリングシステムを使用して、網膜血管透過性を評価した。リーダにより、各フルオレセイン漏出画像を、3つのカテゴリーの内の1つに割り当てた。スコア0は、網膜血管からの漏出サインがないことを示した。スコア1は、フルオレセイン漏出を示唆するヘイズを示した。認められた漏出が薄い場合、血管のねじれの増加を、スコア1を確認するために使用し得た。スコア2は、網膜血管領域のほとんど又は全てにわたる明確なフルオレセイン漏出を示した。マスクしたランダム化データについて、画像評価を行った。
一部の試験において、フルオレセイン血管造影画像への適用のために開発された3工程スコアリングシステムを使用して、網膜血管透過性を評価した。リーダにより、各フルオレセイン漏出画像を、3つのカテゴリーの内の1つに割り当てた。スコア0は、網膜血管からの漏出サインがないことを示した。スコア1は、フルオレセイン漏出を示唆するヘイズを示した。認められた漏出が薄い場合、血管のねじれの増加を、スコア1を確認するために使用し得た。スコア2は、網膜血管領域のほとんど又は全てにわたる明確なフルオレセイン漏出を示した。マスクしたランダム化データについて、画像評価を行った。
血管透過性を評価するために使用した方法にかかわらず、測定したフルオレセインシグナル又は血管外浸出染料の認められた増加は、血管漏出に比例する。効果は、生理食塩水注入を受けた動物において観察されたシグナルに対する、前記測定したフルオレセインシグナル強度又は認められた血管外浸出染料の低下として定義される。より低い値の平均蛍光シグナル又は画像スコアは、より高い漏出阻害に対応し、及びこのため、より高い効果に対応する。
400ng/眼のヒトVEGFの硝子体内投与は、処置後48時間で、最大漏出をもたらした(図2)。この血管漏出を、抗VEGF分子、例えば、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト又はNVS4の事前IVT投与により、完全に阻害し得る(図3)。抗VEGF分子の作用の持続期間を決定するために、前記抗VEGF分子を、hVEGF負荷前の種々のタイミングで投与した。前記抗VEGF分子の投与と前記hVEGF負荷との間の間隔は、前記抗VEGF分子の作用の持続期間を決定する。前記hVEGF負荷の4から28日前(画像化の6から30日前)に、抗VEGF抗体を、硝子体内に注入した。各ウサギのコホートは、同じ抗体を同時に注入した3〜5匹の動物(6〜10個の眼)からなった。
前記ウサギ漏出モデルにおける効果の持続期間を決定するために、眼あたりに5μgの修飾されていない抗VEGF抗体(例えば、ラニビズマブ又はNVS4)を、hVEGF負荷の4から19日前(画像化の6から21日前、図3)の種々のタイミングで、各眼に対して硝子体内に投与した。ラニビズマブ及びNVS4は両方とも、フルオレセイン漏出スコアにより決定されたように、類似する持続期間の効果プロファイルを有した。5μg/眼のラニビズマブ又はNVS4を、前記hVEGF負荷の4及び7日前に投与した場合、フルオレセイン漏出の完全な阻害が観察された。前記hVEGF負荷の12日前に投与した場合、部分的な効果を示すフルオレセイン漏出の増加が観察された。ラニビズマブをhVEGF負荷の18日前に投与した場合、明らかな有効性が達成されなかった。別の試験において、NVS4は、hVEGF負荷の19日前に投与した場合、明らかな効果が示されなかった。
ウサギの眼における従来のPKデータと共に、これらの結果は、ラニビズマブ及び、修飾されていない/タグ付けされていないVEGF抗原結合フラグメントであるNVS4が、ウサギにおいて、眼における同様の保持時間及び効果の持続期間を有することを示す。下記試験において、ペプチドタグ付き抗体(例えば、HAと結合するペプチドタグに結合したNVS4)を、ラニビズマブと比較した。
実施例3:タグ付き抗体の生成
眼における各種ターゲットに結合する数多くのペプチドタグ、例えば、コラーゲンII、ヒアルロナン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、エラスチン、ビトロネクチンと結合するペプチドタグを生成した。これらのペプチドタグを、眼における抗体の半減期を増大させるその能力について試験した。以下の方法は、単一及び二重のタグ付き抗体の生成及び特徴付けについて述べる。
眼における各種ターゲットに結合する数多くのペプチドタグ、例えば、コラーゲンII、ヒアルロナン、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、エラスチン、ビトロネクチンと結合するペプチドタグを生成した。これらのペプチドタグを、眼における抗体の半減期を増大させるその能力について試験した。以下の方法は、単一及び二重のタグ付き抗体の生成及び特徴付けについて述べる。
単一タグ付き抗体又はFab
上記列記した眼におけるターゲットの1つと結合する単一ペプチドタグを含むNVS4融合タンパク質を調製した。ペプチドタグ配列(例えば、HA結合タグ配列)を、GSGGG(配列番号31)又はGSGG(配列番号124、例えば、NVS5及びNVS11を参照のこと。)のリンカーを使用して、NVS4の重鎖のC−末端に融合させた。対象の産生は、前記タグ配列に融合した軽鎖及び重鎖のFabのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の合成を必要とする。CH1定常ドメインの最後のシステインまでの重鎖可変領域のアミノ酸、続けて、上記GSGGG又はGSGGのリンカー、及び、前記タグ配列のアミノ酸をコードするヌクレオチドを合成した。ただし、前記タグ配列の融合は、重鎖fabのC−末端に限定されない。前記タグを、前記軽鎖のC−末端ならびに前記重鎖もしくは軽鎖又は前記2つの鎖の組み合わせのN−末端に融合するように操作してもよい。
上記列記した眼におけるターゲットの1つと結合する単一ペプチドタグを含むNVS4融合タンパク質を調製した。ペプチドタグ配列(例えば、HA結合タグ配列)を、GSGGG(配列番号31)又はGSGG(配列番号124、例えば、NVS5及びNVS11を参照のこと。)のリンカーを使用して、NVS4の重鎖のC−末端に融合させた。対象の産生は、前記タグ配列に融合した軽鎖及び重鎖のFabのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の合成を必要とする。CH1定常ドメインの最後のシステインまでの重鎖可変領域のアミノ酸、続けて、上記GSGGG又はGSGGのリンカー、及び、前記タグ配列のアミノ酸をコードするヌクレオチドを合成した。ただし、前記タグ配列の融合は、重鎖fabのC−末端に限定されない。前記タグを、前記軽鎖のC−末端ならびに前記重鎖もしくは軽鎖又は前記2つの鎖の組み合わせのN−末端に融合するように操作してもよい。
二重タグ付き抗体又はFab
NVS4の複数のタグ付き型を、2つ以上のペプチドタグをNVS4に融合させることにより調製した。前記ペプチドタグ配列を、以下のいずれかに結合させた:
1)GSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のC−末端、及び、GSGGGリンカーを使用して、NVS4の軽鎖のC−末端(例えば、NVS1d)、
2)GSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のC−末端、及び、GSGGGリンカーを使用して、NVS4の軽鎖のN−末端(例えば、NVS1f)、
3)GSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のN−末端、及び、GSGGGリンカーを使用して、NVS4の軽鎖のN−末端(例えば、NVS1c)、又は、
4)GSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のN−末端、及び、GSGGGリンカーを使用して、NVS4の軽鎖のC−末端、
5)タンデムにGSGGGリンカーを使用して、NVS4の軽鎖のC−末端(例えば、NVS1e)、
6)タンデムにGSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のC−末端(例えば、NVS1h)、
7)タンデムにGSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のC−末端(例えば、NVS1g)。
NVS4の複数のタグ付き型を、2つ以上のペプチドタグをNVS4に融合させることにより調製した。前記ペプチドタグ配列を、以下のいずれかに結合させた:
1)GSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のC−末端、及び、GSGGGリンカーを使用して、NVS4の軽鎖のC−末端(例えば、NVS1d)、
2)GSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のC−末端、及び、GSGGGリンカーを使用して、NVS4の軽鎖のN−末端(例えば、NVS1f)、
3)GSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のN−末端、及び、GSGGGリンカーを使用して、NVS4の軽鎖のN−末端(例えば、NVS1c)、又は、
4)GSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のN−末端、及び、GSGGGリンカーを使用して、NVS4の軽鎖のC−末端、
5)タンデムにGSGGGリンカーを使用して、NVS4の軽鎖のC−末端(例えば、NVS1e)、
6)タンデムにGSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のC−末端(例えば、NVS1h)、
7)タンデムにGSGGGリンカーを使用して、NVS4の重鎖のC−末端(例えば、NVS1g)。
前記ペプチドタグ配列に融合させた軽鎖及び重鎖のFabのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを合成した。CH1定常ドメインの最後のシステインまでの重鎖可変領域及び軽鎖全体、先行して、又は、続けて、GSGGG又はGSGGのリンカー、及び、記載されたペプチドタグ配列のアミノ酸をコードするヌクレオチドを合成した。
実施例4:ペプチドタグ選択
下記実施例は、抗VEGF抗体(例えば、NVS4)に融合させた場合、その眼におけるターゲットに対する前記ペプチドタグの結合性及び/又は親和性を測定するために使用されて得る方法を説明する。結合親和性を測定するこれら及び他の方法は、当分野において公知である。
下記実施例は、抗VEGF抗体(例えば、NVS4)に融合させた場合、その眼におけるターゲットに対する前記ペプチドタグの結合性及び/又は親和性を測定するために使用されて得る方法を説明する。結合親和性を測定するこれら及び他の方法は、当分野において公知である。
Octet(登録商標)によるHA結合ペプチドタグの結合性及び/又は親和性の決定
ビオチン化HAに対する、ペプチドタグ及び/又はタグ付きVEGF抗体もしくは抗原結合フラグメントの結合評価を、Octet(登録商標)(ForteBio(登録商標))を使用して、製造メーカーの説明により行った。バイオセンサである繊維の先端を、特別な光学層でコートし、ついで、補捉分子を、前記先端に結合させる。前記先端を、前記補捉分子に結合するターゲット分子を含むサンプルに浸漬した。前記2つは、分子層を形成する。白色光を前記繊維に向けると、2つのビームが、後端に反射されるであろう。第1のビームは、参照として、前記先端から来る。第2の光は、前記分子層から来る。前記2つのビームの差異は、スペクトルカラーパターンを生じさせるであろう。位相は、前記分子層の厚みの関数であり、前記先端表面上の分子数に対応する。前記分子が前記センサに結合する際、内部参照における反射は一定のままであろう。前記繊維上の分子層と溶液との間の界面は、結合分子の追加により変化する。前記センサ内の生体層干渉計は、時間経過による波長シフトにおけるこの変化をモニターする。分子が結合する際、シグナルのスペクトルが、前記センサ上で増加した前記層の関数として変化するであろう。このリアルタイムな結合測定は、濃度に対して速度をプロットすることによって、相互作用の反応速度、オンレート及びオフレート、及び最終的な濃度を算出するために使用され得る。
ビオチン化HAに対する、ペプチドタグ及び/又はタグ付きVEGF抗体もしくは抗原結合フラグメントの結合評価を、Octet(登録商標)(ForteBio(登録商標))を使用して、製造メーカーの説明により行った。バイオセンサである繊維の先端を、特別な光学層でコートし、ついで、補捉分子を、前記先端に結合させる。前記先端を、前記補捉分子に結合するターゲット分子を含むサンプルに浸漬した。前記2つは、分子層を形成する。白色光を前記繊維に向けると、2つのビームが、後端に反射されるであろう。第1のビームは、参照として、前記先端から来る。第2の光は、前記分子層から来る。前記2つのビームの差異は、スペクトルカラーパターンを生じさせるであろう。位相は、前記分子層の厚みの関数であり、前記先端表面上の分子数に対応する。前記分子が前記センサに結合する際、内部参照における反射は一定のままであろう。前記繊維上の分子層と溶液との間の界面は、結合分子の追加により変化する。前記センサ内の生体層干渉計は、時間経過による波長シフトにおけるこの変化をモニターする。分子が結合する際、シグナルのスペクトルが、前記センサ上で増加した前記層の関数として変化するであろう。このリアルタイムな結合測定は、濃度に対して速度をプロットすることによって、相互作用の反応速度、オンレート及びオフレート、及び最終的な濃度を算出するために使用され得る。
下記に記載する方法では、ストレプトアビジン・バイオセンサ(ForteBio(登録商標)、Cat.No.18−5019)を、1×Kineticバッファー(FortBio(登録商標)、Cat.No.18−5032)中に10分間予浸して、前記バイオセンサの先端上の保護スクロース層を除去した。ついで、それを、1×Kineticバッファーにより希釈した5μg/mlのビオチン化17kDaヒアルロン酸(HA)200μlを含むウェル内に浸漬し、ビオチン化HAを前記ストレプトアビジン・バイオセンサ上に、900秒間負荷した。ついで、前記補捉されたHAバイオセンサを、200μlの1×Kineticバッファーのウェル内に300秒間浸漬して、ストレプトアビジンにより補捉されなかった残留ビオチン化HAを除去した。その後、前記結合したHAバイオセンサを、一点結合スクリーニング又は反応速度を決定するための連続滴定用に、200nMの濃度の操作された抗体を含むウェル内に浸漬した。前記対象となる修飾された抗体を、前記補捉されたHAと、前記バイオセンサ上で900秒間会合させ、その後、200μlの1×Kineticバッファーを含むウェルに移し、同ウェル中に2100秒間浸漬して、前記抗原であるHAから前記操作された抗体を解離させた。結合の反応速度を、ForteBio’s(登録商標)分析プログラムから決定した。
ELISA結合による、眼におけるターゲットに対するペプチドタグの結合性及び/又は親和性の決定
抗VEGF Fab(NVS4)に融合した種々のペプチドタグの、眼におけるターゲットタンパク質、例えば、コラーゲンII、ラミニン、インテグリン、フィブロネクチン及びエラスチンへの結合を、以下に記載するように、Meso Scale Discovery(登録商標)ELISAを使用して測定した。
抗VEGF Fab(NVS4)に融合した種々のペプチドタグの、眼におけるターゲットタンパク質、例えば、コラーゲンII、ラミニン、インテグリン、フィブロネクチン及びエラスチンへの結合を、以下に記載するように、Meso Scale Discovery(登録商標)ELISAを使用して測定した。
2μg/ml タンパク質25マイクロリットルを、384ウェルのMSDプレート(Cat.# L21XA、Meso Scale Discovery(登録商標))上に、4℃で一晩コートした。前記プレートを、TBS/0.05% Tween−20(Thermo Scientific(登録商標)#28360)中で3回洗浄し、TBS/5% BSA Fraction V(Fisher(登録商標)Cat#ICN16006980)/0.1% Tween−20/0.1% TritonX−100を含むバッファーで、室温で最短2時間又は4℃で一晩ブロッキングした。前記プレートを、1回洗浄した。fabの滴定を、TBS/2% BSA Fraction V/0.1% Tween−20/0.1% TritonX−100を含むバッファー中で希釈し、ウェルあたり25μlを、前記洗浄したプレートに添加し、室温で1時間インキュベートした。その後、前記プレートを3回洗浄した。1:000に希釈した抗ヒトIgGスルホタグ標識化検出抗体(Cat.# R32AJ、Meso Scale Discovery(登録商標))を、ウェルあたり25μl添加した。室温で1時間インキュベートした後、前記プレートを3回洗浄し、1×MSD(登録商標)Readバッファー(Cat.# R92TC)を、ウェルあたり25μl添加する。前記プレートを、SECTOR Imager 6000(登録商標)Meso Scale Discovery(登録商標)機器上で直ちに読み取る。電気化学的発光シグナルデータを、GraphPad Prism(登録商標)を使用して分析する。
結果
全てにおいて、90個のペプチドタグが、抗VEGF Fabに結合し(実施例3を参照のこと。)、Octet又はELISAの眼における各推定上のターゲットへのin vitro結合について評価された。
全てにおいて、90個のペプチドタグが、抗VEGF Fabに結合し(実施例3を参照のこと。)、Octet又はELISAの眼における各推定上のターゲットへのin vitro結合について評価された。
50個の推定のHA結合ペプチドタグ配列が、抗VEGF Fabに結合し、in vitroでのHA結合について評価された。前記50個の推定のHA結合ペプチドタグのうち27個のみが、HAに対する測定可能なin vitro結合を示した。
23個の推定のコラーゲン結合タグが、抗VEGF Fabに結合し、コラーゲンIIに対するin vitro結合について評価された。23個の推定のコラーゲン結合ペプチドタグのうち3つのみが、コラーゲンIIに対するin vitro結合を示した。
7個の推定のインテグリン結合ペプチドタグが、抗VEGF Fabに結合し、インテグリンに対するin vitro結合について評価された。前記7個の推定のインテグリン結合ペプチドタグのうち1つのみが、インテグリンに対するin vitro結合を示した。
他のフィブロネクチン結合性、ラミニン結合性、エラスチン結合性又はビトロネクチン結合性の結合タグは、その各ターゲットへの明らかに測定可能な結合を示さなかった。
その後、陽性のターゲット結合を有するペプチドタグを、ラットのPET/CT系画像化PKモデルにおいて評価した。
実施例5:コラーゲンII、インテグリン又はHAに陽性の結合を有するペプチドタグのPK評価
I−124標識化Fabタンパク質を用いた、IVT注入されたラットのPET/CT画像化
Octet及び/又はELISAにより、HA又はコラーゲンII又はインテグリンに対する測定可能な結合が示された前記タグ付き抗体の眼におけるPKを、本願明細書に記載されたラットのPET/CT画像化法を使用して測定した。
I−124標識化Fabタンパク質を用いた、IVT注入されたラットのPET/CT画像化
Octet及び/又はELISAにより、HA又はコラーゲンII又はインテグリンに対する測定可能な結合が示された前記タグ付き抗体の眼におけるPKを、本願明細書に記載されたラットのPET/CT画像化法を使用して測定した。
ラットの眼に注入された前記タンパク質の放射線標識を、ヨードゲン法(1)を使用して行った。前記方法は、ヨードゲンコートチューブ(THERMO SCIENTIFIC(登録商標)、Rockford、IL)の使用を採用する。典型的には、>85%の放射線標識効率及び約7mCi/mgの比放射能を達成した。硝子体内(IVT)注入用ラットを準備するために、動物を、3% イソフルランガスで麻酔した。ついで、眼を、2滴のシクロペントレート(1%の好ましい濃度)及び2.5〜10% フェニルエフリンにより拡張させた。1滴の局所麻酔剤も塗布した(0.5% プロパラカイン)。解剖顕微鏡下において、30ゲージのニードルで、角膜の輪郭の下約4mmを、眼の中央に向かう角度で切開した。ついで、放射線標識したタンパク質を含む鈍端のハミルトンシリンジ(例えば、33ゲージ)を、この開口から硝子体腔内に挿入し、約3.5μLの放射線標識化タンパク質を注入した。前記眼を、出血又は白内障について試験した。ついで、その手順を、もう一方の眼に繰り返した。ラットの眼内に前記放射線標識化タンパク質を注入した直後に、麻酔した動物を、その腹部を上にして、予熱したPET画像化ベッドに寝かせた。前記ベッドに、ノーズコーンによりガス麻酔を供給した。ついで、固定及び確保された動物を、動物の胸部下に置かれた呼吸センサを使用してモニターされる生体機能(例えば、呼吸)についてのスキャナに移動させた。静的な10分のPETスキャン、続けて、10分のCTスキャンを、GE Triumph LabPET−8三峰性小型動物スキャナ(Gamma Medica、Northridge、CA)において行った。前記CTスキャンの完了後、前記動物を、前記ベッドから取り外し、温かいケージに入れ、正常な生理学的機能を完全に回復するまでモニターした。IVT注入後のPET/CT画像化の典型的な時点を、0、3、6、21、29、46、52、72、94、166、190及び214時間とした。より短い時点での画像化(例えば、0、6、24、48、72及び96時間)でのより短い試験も行った。最後の画像化時点後に、麻酔した動物を、心臓穿刺、失血及び頸椎脱臼により安楽死させた。眼及び他の臓器/組織(血液、肝臓、脾臓、腎臓、胃、肺、心臓、筋肉及び骨)を解剖し、ガンマカウンターにおいて、残存する放射能をカウントした。カウントを、組織/臓器のカウント(% 注入用量/グラム(%ID/g))に変換した。
ついで、全てのPET画像を、MLEL再構築アルゴリズムを使用して再構築し、ついで、前記CT解剖スキャンと共に登録した。分析用に、頭の画像を、左右の半球に分離した。AMIRA(登録商標)(Visualization Sciences Group(登録商標)、Burlington、MA)及びAmide(Sourceforge.net)分析ソフトウェアパッケージを使用して、CTで定義した眼の位置に基づくPET画像における所望の3D領域(ROI)を描いた。前記所望の領域におけるPETシグナルを、減衰補正した注入用量及び動物の眼の重量(死後に測定)を考慮し、前記ROIの体積について正規化して、標準的な取り込み値(SUV)として表した。ついで、前記データをプロットして、前記ラットの眼に注入したタンパク質のクリアランス反応速度(例えば、半減期又は平均滞留時間)を算出した。
修飾されていない(例えば、タグ付けされていない)抗体又は抗原フラグメント及び、タグ付き抗体の眼におけるクリアランスを評価するために、124I−標識抗体を、ラットの眼に注入した。相対的な抗体レベルを、PET/CT系画像化を使用して、長時間にわたって決定した。相対的抗体レベルの測定としてのシグナル強度を、硝子体内(IVT)注入直後、ならびに、注入24、48及び96時間後にも決定した。修飾されていない抗体(例えば、ラニビズマブ)についての前記シグナル強度は、注入48時間後までに初期値の1%に減衰する。注入96時間後に、修飾されていない抗体(例えば、ラニビズマブ)の前記シグナル強度は、検出限界を下回った。このため、前記ラットモデルは、眼において増大した保持時間を有する分子を特定するのに有用な短期のin vivoスクリーニングモデルである。
27個のペプチドタグ付き抗体を、前記ラットモデルにおいて、より長い保持時間について試験した。IVTの96時間後に注入用量の>1%が残存する場合に、保持時間がより長いと定義した。9個のペプチドタグ付き抗体が、96時間後に注入用量の<1%の残留を有していた。対照的に、18/27個のペプチドタグ付き抗体は、IVTの96時間後に注入用量の>1%が残存することによって定義した場合、ラットの眼におけるより長い保持を示した。その後、これらの18個のタグ付き抗体について、前記ウサギ漏出モデルにおける効果を評価した。ウサギは、短期のラットモデルよりも長期のモデルであるため、より臨床的に関連する。
実施例6:ウサギでの効果:1つのHA結合ペプチドタグのみが有効
(実施例2において記載された)前記ウサギ漏出モデルを、コラーゲン又はHAのいずれかと結合するペプチドタグに結合した抗VEGF抗体又はFabが、注入後20日で血管漏出を阻害し得たかどうかを評価するために使用した(図4及び5)。ウサギは、より大きく、ヒトに近い大きさの眼を提供する。前記ウサギにおいて、ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子の長期効果を試験する。コラーゲン結合ペプチドタグ又はHA結合ペプチドタグのいずれかに結合した22個の抗VEGF Fabを、5μg/眼のラニビズマブと等モルの用量で投与した。hVEGF負荷の48時間後、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。コラーゲン結合ペプチドタグの付加は、試験したVEGF Fabのいずれについても、有意なフルオレセイン漏出阻害をもたらさなかった(図5:NVS67、NVS68及びNVS69)。対照的に、HA結合ペプチドタグの付加は、同じ条件下において、フルオレセイン漏出の有意な阻害を示した(NVS1、図5)。前記結果は、コラーゲンと結合するペプチドタグを抗VEGF Fabに結合させることは、タグ付けされていない抗VEGF FabであるNVS4より長く、hVEGFを抑制し、血管漏出を妨げるのに十分でなかったことを示す。対照的に、HA結合ペプチドタグの付加は、有意な効果を示すことができた。このため、半減期を増大させ、in vivoにおける有効な効果を生じさせる前記ペプチドタグの能力は、本願明細書に記載されたように、本発明のHAと結合するペプチドタグに特有のものである。
(実施例2において記載された)前記ウサギ漏出モデルを、コラーゲン又はHAのいずれかと結合するペプチドタグに結合した抗VEGF抗体又はFabが、注入後20日で血管漏出を阻害し得たかどうかを評価するために使用した(図4及び5)。ウサギは、より大きく、ヒトに近い大きさの眼を提供する。前記ウサギにおいて、ペプチドタグ及びペプチドタグ付き分子の長期効果を試験する。コラーゲン結合ペプチドタグ又はHA結合ペプチドタグのいずれかに結合した22個の抗VEGF Fabを、5μg/眼のラニビズマブと等モルの用量で投与した。hVEGF負荷の48時間後、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。コラーゲン結合ペプチドタグの付加は、試験したVEGF Fabのいずれについても、有意なフルオレセイン漏出阻害をもたらさなかった(図5:NVS67、NVS68及びNVS69)。対照的に、HA結合ペプチドタグの付加は、同じ条件下において、フルオレセイン漏出の有意な阻害を示した(NVS1、図5)。前記結果は、コラーゲンと結合するペプチドタグを抗VEGF Fabに結合させることは、タグ付けされていない抗VEGF FabであるNVS4より長く、hVEGFを抑制し、血管漏出を妨げるのに十分でなかったことを示す。対照的に、HA結合ペプチドタグの付加は、有意な効果を示すことができた。このため、半減期を増大させ、in vivoにおける有効な効果を生じさせる前記ペプチドタグの能力は、本願明細書に記載されたように、本発明のHAと結合するペプチドタグに特有のものである。
ELISAによるウサギの最終PK定量化
血管漏出を測定する画像化分析の完了に基づいて、前記動物を、画像化の日又は画像化後の日のいずれかにおいて屠殺し、眼を摘出し、実施例2において上述したように処理して、硝子体中の抗体濃度を定量化した(図4及び図6)。ラニビズマブの最終硝子体濃度は、約5ng/mLであった。対照的に、有効なタグ付き抗体であるNVS1の最終硝子体濃度は、231ng/mLであった。より高い最終薬剤レベルは、20日目での漏出阻害と関連し、より低い最終薬剤レベルは、効果の欠如と関連した。20日目において効果を示さなかった全分子の最終薬剤レベルは、100ng/mL未満であった(図4)。一方、フルオレセイン漏出を阻害した分子(NVS1)の最終薬剤レベルは、100ng/mLより高かった。HAと結合する種々のペプチドタグに結合した3つのタグ付き抗体は、20日目において、ラニビズマブより10−20倍高い薬剤レベルを有したが、効果を示さなかった(例えば、NVS6、NVS7、NVS8)。有効な分子であるNVS1の20日目での薬剤レベルは、タグ付けされていない抗体(例えば、ラニビズマブ)の薬剤レベルより40倍を超えて高かった。このことは、タグ付けされていない抗体と比較して、前記HA結合ペプチドタグ付き抗体の眼におけるクリアランスの顕著に遅い速度を示す。
血管漏出を測定する画像化分析の完了に基づいて、前記動物を、画像化の日又は画像化後の日のいずれかにおいて屠殺し、眼を摘出し、実施例2において上述したように処理して、硝子体中の抗体濃度を定量化した(図4及び図6)。ラニビズマブの最終硝子体濃度は、約5ng/mLであった。対照的に、有効なタグ付き抗体であるNVS1の最終硝子体濃度は、231ng/mLであった。より高い最終薬剤レベルは、20日目での漏出阻害と関連し、より低い最終薬剤レベルは、効果の欠如と関連した。20日目において効果を示さなかった全分子の最終薬剤レベルは、100ng/mL未満であった(図4)。一方、フルオレセイン漏出を阻害した分子(NVS1)の最終薬剤レベルは、100ng/mLより高かった。HAと結合する種々のペプチドタグに結合した3つのタグ付き抗体は、20日目において、ラニビズマブより10−20倍高い薬剤レベルを有したが、効果を示さなかった(例えば、NVS6、NVS7、NVS8)。有効な分子であるNVS1の20日目での薬剤レベルは、タグ付けされていない抗体(例えば、ラニビズマブ)の薬剤レベルより40倍を超えて高かった。このことは、タグ付けされていない抗体と比較して、前記HA結合ペプチドタグ付き抗体の眼におけるクリアランスの顕著に遅い速度を示す。
NVS1のみが、octetによるHAに対する測定可能な結合、PET/CT画像化により測定した場合のラットの眼におけるより長い保持、及び、VEGF負荷の18日前に投与した場合にフルオレセイン漏出の統計学的に有意な阻害により定義される、ウサギ漏出モデルにおける効果のより長い持続期間を示した。コラーゲンII結合ペプチドタグは有効ではなかった。このため、配列番号32の配列を有するHAと結合する前記ペプチドフラグメントを、最適化のために選択した。
前記ウサギ漏出モデルにおいて効果の持続期間の延長を示さなかったペプチドタグの親和性を改善する試みにおいて、8個の推定のHA結合ペプチドを、2種類のFabである、NVS4(抗VEGF Fab)及びNVS00(抗ニワトリライソザイムFabのネガティブコントロール)の重鎖及び軽鎖両方のC−末端上に結合させることにより、16個の更なる二重タグ付きFabを生成した。全てにおいて、8個の二重タグ付きFabを、NVS4について生成した。更なる8個の二重タグ付きFabを、NVS00について生成した。結合における差異は、それらが、NVS4又はNVS00に結合した場合、これらのペプチドタグのいずれについても観察されず、HAに対するこれら16個のペプチドタグ付きFabの結合に明らかな改善は存在しなかった。このため、単量体としてウサギにおける陽性の効果を達成しなかったペプチドタグの多量体化は、複数のタグを抗VEGF FabであるNVS4に結合させた場合、これらのペプチドタグの活性を改善しなかった。
選択したペプチドタグ付き分子(例えば、NVS1、NVS2、NVS36、NVS37、NVS1b及びNVS7)のHA結合親和性を、製造メーカーのプロトコルのとおりに、等温熱量計により決定した(MicroCal(登録商標)、GE Healthcare)。単一のペプチドタグを有するペプチドタグ付き分子、例えば、NVS1、NVS2、NVS36及びNVS37の親和性は、それぞれ、5.5±2μM、8.0±1μM、6.0±1.2μM及び7.2±1.5μMであった。例えば、NVS1d(NVS1d:実施例13に記載)において、複数のペプチドタグを付加することは、結合親和性を改善した。NVS1dは、0.48±0.04μMのKDを有した。対照的に、前記ウサギモデルにおいて有効でなかったNVS7に対する親和性は、44±19μMの親和性でのみHAと結合する。このため、本発明の有効なペプチドタグは、9.0μM以下の結合親和性を示す。
実施例7:グリコシル化及びプロテアーゼ感受性を除去するためのNVS1におけるHA結合ペプチドタグの最適化
in silicoにおける分析は、N−結合グリコシル化部位として、NVS1(配列番号21)のN311位を特定した。この部位におけるグリコシル化を妨げるために、NVS1の6個の単一部位変異体(NVS12、NVS19、NVS20、NVS21、NVS22及びNVS23)ならびに、12個の二重部位変異体(NVS2a、NVS3a、NVS28、NVS31、NVS49、NVS50、NVS51、NVS52、NVS53、NVS54、NVS55及びNVS56)を発現させ、HA結合について特徴付けた。
in silicoにおける分析は、N−結合グリコシル化部位として、NVS1(配列番号21)のN311位を特定した。この部位におけるグリコシル化を妨げるために、NVS1の6個の単一部位変異体(NVS12、NVS19、NVS20、NVS21、NVS22及びNVS23)ならびに、12個の二重部位変異体(NVS2a、NVS3a、NVS28、NVS31、NVS49、NVS50、NVS51、NVS52、NVS53、NVS54、NVS55及びNVS56)を発現させ、HA結合について特徴付けた。
さらに、プロテアーゼ感受性アッセイを、順化培地を使用して行い、プロテアーゼ部位として、NVS1(配列番号21)におけるR236、K241及びR268位を特定した。R236、K241及びR268位におけるプロテアーゼ切断を妨げるために、前記ペプチドタグの複数の単一、二重、三重、四重及び五重変異体を発現させ、HA結合について特徴付けた(表4)。さらに、更なるジスルフィド結合を、前記ペプチドタグ内に操作して、2つのタグ付き変異体であるNVS36及びNVS37を産生した。NVS36又はNVS37におけるペプチドタグ変異体の配列は、それぞれ、配列番号35又は配列番号36である。
Biacore親和性決定
HAに対して最適化されたHA結合ペプチドタグとヒトVECFとの親和性を、Biacoreにより測定した。HA反応速度を決定するために、ビオチン化HAを、BIOCAP Biacoreフォーマットに使用した。前記フォーマットでは、ビオチン化HAが捕捉され、サンプルタンパク質が、種々の濃度で流される。この方法は、以下に詳細に記載する。ターゲット反応速度を決定するために、2種類のフォーマットを使用した。第1のフォーマットは、補捉されるビオチン化ターゲットリガンドを使用し、タンパク質サンプルを種々の濃度で流す、BIOCAP法である。第2のフォーマットは、fabタンパク質サンプルを捕捉し、ターゲットタンパク質を種々の濃度で流す、抗fab補捉法である。
HAに対して最適化されたHA結合ペプチドタグとヒトVECFとの親和性を、Biacoreにより測定した。HA反応速度を決定するために、ビオチン化HAを、BIOCAP Biacoreフォーマットに使用した。前記フォーマットでは、ビオチン化HAが捕捉され、サンプルタンパク質が、種々の濃度で流される。この方法は、以下に詳細に記載する。ターゲット反応速度を決定するために、2種類のフォーマットを使用した。第1のフォーマットは、補捉されるビオチン化ターゲットリガンドを使用し、タンパク質サンプルを種々の濃度で流す、BIOCAP法である。第2のフォーマットは、fabタンパク質サンプルを捕捉し、ターゲットタンパク質を種々の濃度で流す、抗fab補捉法である。
HA結合反応速度及び親和性:
HA反応速度について、接触時間及び解離時間がHA−ビオチン及びヒトVEGFに対する親和性によって異なる、2種類の方法を使用した。両方の方法において、サンプル区画を、15℃に維持するが、分析区画を、25℃又は37℃のいずれかで実行した。この方法では、4つのフローセルを、前記実行に使用した。フローセル1(fc1)は、参照セルとして機能し(リガンドは捕捉されず)、コートされたチップ表面上の修飾されたストレプトアビジン−BIOCAP(登録商標)試薬に対する前記タグ付きタンパク質の非特異的結合について評価した。第2、第3及び第4のフローセルにおいて、BIOCAP(登録商標)試薬と、ビオチン化HAリガンド又は他のビオチン化リガンドのいずれかとが共に捕捉される。ついで、前記タグ付きタンパク質及び親タンパク質を、異なる濃度で流した。
HA反応速度について、接触時間及び解離時間がHA−ビオチン及びヒトVEGFに対する親和性によって異なる、2種類の方法を使用した。両方の方法において、サンプル区画を、15℃に維持するが、分析区画を、25℃又は37℃のいずれかで実行した。この方法では、4つのフローセルを、前記実行に使用した。フローセル1(fc1)は、参照セルとして機能し(リガンドは捕捉されず)、コートされたチップ表面上の修飾されたストレプトアビジン−BIOCAP(登録商標)試薬に対する前記タグ付きタンパク質の非特異的結合について評価した。第2、第3及び第4のフローセルにおいて、BIOCAP(登録商標)試薬と、ビオチン化HAリガンド又は他のビオチン化リガンドのいずれかとが共に捕捉される。ついで、前記タグ付きタンパク質及び親タンパク質を、異なる濃度で流した。
工程1 BIOCAP捕捉工程:
前記BIOCAP(登録商標)試薬を、ビオチン CAPture(登録商標)キット(GE(登録商標)2892034)に提供し、HBS−EP+ランニングバッファー(teknova H8022)中、1:3に希釈した。流速を2μl/分とし、60秒間流した。補捉レベルは、約1500RUであった。
前記BIOCAP(登録商標)試薬を、ビオチン CAPture(登録商標)キット(GE(登録商標)2892034)に提供し、HBS−EP+ランニングバッファー(teknova H8022)中、1:3に希釈した。流速を2μl/分とし、60秒間流した。補捉レベルは、約1500RUであった。
工程2 ビオチン化リガンド捕捉工程:
前記リガンドを全て、10μl/分の速度で、約20秒間、又は、20のRmaxが得られるであろう補捉レベルを達成するために流した。この方法で試験した前記ビオチン化リガンドは、内部で生成されたビオチン化HA及びビオチン化ヒトVEGFを含む。Rmaxを算出する方法の例には、HAについて以下のものが含まれるが、この場合には、我々は、より高い補捉レベルを使用し、約60のRmaxを使用した。下記方程式は、20の相対的Rmaxを達成するための計算を表す。
HA−17kDa:Rmax=RL*(MW検体/MWリガンド)*化学量論 20=RL*(50/17)*1=7RL
前記リガンドを全て、10μl/分の速度で、約20秒間、又は、20のRmaxが得られるであろう補捉レベルを達成するために流した。この方法で試験した前記ビオチン化リガンドは、内部で生成されたビオチン化HA及びビオチン化ヒトVEGFを含む。Rmaxを算出する方法の例には、HAについて以下のものが含まれるが、この場合には、我々は、より高い補捉レベルを使用し、約60のRmaxを使用した。下記方程式は、20の相対的Rmaxを達成するための計算を表す。
HA−17kDa:Rmax=RL*(MW検体/MWリガンド)*化学量論 20=RL*(50/17)*1=7RL
工程3 タンパク質希釈(検体):
より速いオフレートでより高い親和性を有するサンプルのHA反応速度について、タンパク質検体を、60μl/分の流速で、30秒間の接触時間で流した。検体濃度は、25nMで開始し、1:2(1部のバッファーに対して、1部の希釈液)での4回の希釈を含んでいた。速いオフレートのため、85秒の解離時間は、全ての希釈液に対して含まれた。ただし、タンパク質サンプルは、85秒の前にベースラインに達したことに留意されたい。
より速いオフレートでより高い親和性を有するサンプルのHA反応速度について、タンパク質検体を、60μl/分の流速で、30秒間の接触時間で流した。検体濃度は、25nMで開始し、1:2(1部のバッファーに対して、1部の希釈液)での4回の希釈を含んでいた。速いオフレートのため、85秒の解離時間は、全ての希釈液に対して含まれた。ただし、タンパク質サンプルは、85秒の前にベースラインに達したことに留意されたい。
遅いオフレートでより低い親和性を有するサンプルのHA反応速度について、タンパク質検体を、30μl/分の流速で240秒間流した。前記タンパク質検体の濃度は、25nMで開始し、1:2(1部のバッファーに対して、1部の希釈液)での6回の希釈を含んでいた。遅いオフレートのため、1000秒の解離時間は、全ての希釈液に対して含まれた。
工程4 再生:
全てのフローセルにおいて、各サイクルの最後に再生を行った。ビオチンCAPture(登録商標)キットについての再生条件は、下記の通りとした。再生ストック1(8M グアニジン−HCL、GE(登録商標)28−9202−33)3部を、再生ストック2(1M NaOH、GE(登録商標)28−9202−33)1部に混合することにより、再生バッファーを調製した。これを、前記フローセルに、20μl/分で120秒間流した。
全てのフローセルにおいて、各サイクルの最後に再生を行った。ビオチンCAPture(登録商標)キットについての再生条件は、下記の通りとした。再生ストック1(8M グアニジン−HCL、GE(登録商標)28−9202−33)3部を、再生ストック2(1M NaOH、GE(登録商標)28−9202−33)1部に混合することにより、再生バッファーを調製した。これを、前記フローセルに、20μl/分で120秒間流した。
ビオチンCAPture法を使用したターゲットタンパク質の反応速度及び親和性
ターゲット/リガンドの反応速度を決定するために、2つのフローセルを、この方法に使用した。フローセル1は、参照セルとして機能し、BIOCAP(登録商標)試薬のみを含んだ。フローセル2は、結合セルとして機能し、BIOCAP(登録商標)試薬及び前記ビオチン化ターゲット(例えば、ヒトVEGF−ビオチン)の両方を含んだ。前記方法は、4工程からなる。
ターゲット/リガンドの反応速度を決定するために、2つのフローセルを、この方法に使用した。フローセル1は、参照セルとして機能し、BIOCAP(登録商標)試薬のみを含んだ。フローセル2は、結合セルとして機能し、BIOCAP(登録商標)試薬及び前記ビオチン化ターゲット(例えば、ヒトVEGF−ビオチン)の両方を含んだ。前記方法は、4工程からなる。
工程1 ビオチンCAPture試薬:
この試薬を、キットで提供し、ランニングバッファー中、1:3に希釈した。流速を、2μl/分とし、60秒間流した。補捉レベルを、約1500RUとした。
この試薬を、キットで提供し、ランニングバッファー中、1:3に希釈した。流速を、2μl/分とし、60秒間流した。補捉レベルを、約1500RUとした。
工程2 ビオチン化リガンド捕捉工程:
ビオチン化ターゲット/リガンドを、10μl/分の速度で、設定した接触時間流し、20のRmaxのための所望の共鳴単位に到達させた。
下記方程式は、20の相対的Rmaxを達成する計算を表す。
VEGFの例:Rmax=RL*(MW検体/MWリガンド)*化学量論 20=RL*(50/50)*1=20RL
ビオチン化ターゲット/リガンドを、10μl/分の速度で、設定した接触時間流し、20のRmaxのための所望の共鳴単位に到達させた。
下記方程式は、20の相対的Rmaxを達成する計算を表す。
VEGFの例:Rmax=RL*(MW検体/MWリガンド)*化学量論 20=RL*(50/50)*1=20RL
工程3 抗体希釈(検体):
前記タンパク質検体がそのターゲットに対して強力な親和性を有するため、開始濃度を、10nMとし、8回の連続希釈点を含み得る。例えば、一部のタンパク質検体のVEGF反応速度について、前記開始濃度を、1.25nMとし、1:2での7回の希釈を含んだ。短時間での解離及びより長い時間での解離は、前記タンパク質検体により決まる。これらのより低い親和性のタンパク質検体についての全体的なターゲット反応速度については、前記タンパク質検体を、60μl/分で240秒間流し、同検体は、1000秒より長い解離時間を有した。
前記タンパク質検体がそのターゲットに対して強力な親和性を有するため、開始濃度を、10nMとし、8回の連続希釈点を含み得る。例えば、一部のタンパク質検体のVEGF反応速度について、前記開始濃度を、1.25nMとし、1:2での7回の希釈を含んだ。短時間での解離及びより長い時間での解離は、前記タンパク質検体により決まる。これらのより低い親和性のタンパク質検体についての全体的なターゲット反応速度については、前記タンパク質検体を、60μl/分で240秒間流し、同検体は、1000秒より長い解離時間を有した。
工程4 再生:
再生を、全てのフローセルにおいて、各サイクルの最後に行った。ビオチンCAPtureキットについての再生条件は、下記の通りとした。再生ストック1(8M グアニジン−HCL)3部を、再生ストック2(1M NaOH)1部に混合することにより、再生バッファーを調製する。これを、前記フローセルに、20μl/分で120秒間流した。前記検体、リガンド及び再生バッファーを含むサンプル区画を、15℃に維持する。全ての他の実行条件を、1×HBSE+Pバッファー中、25℃又は37℃のいずれかで行った。最終結果は、二重参照、参照フローセルからの両屈折率値の差し引き、及び、検体を含まないブランク結合工程を反映する。データを、10Hzで収集し、Biacore T200評価ソフトウェア(GE Healthcare(登録商標))を使用して分析した。このプログラムは、各相互作用についての速度及び親和性定数を決定するためのグローバル・フィッティング分析法を使用する。
再生を、全てのフローセルにおいて、各サイクルの最後に行った。ビオチンCAPtureキットについての再生条件は、下記の通りとした。再生ストック1(8M グアニジン−HCL)3部を、再生ストック2(1M NaOH)1部に混合することにより、再生バッファーを調製する。これを、前記フローセルに、20μl/分で120秒間流した。前記検体、リガンド及び再生バッファーを含むサンプル区画を、15℃に維持する。全ての他の実行条件を、1×HBSE+Pバッファー中、25℃又は37℃のいずれかで行った。最終結果は、二重参照、参照フローセルからの両屈折率値の差し引き、及び、検体を含まないブランク結合工程を反映する。データを、10Hzで収集し、Biacore T200評価ソフトウェア(GE Healthcare(登録商標))を使用して分析した。このプログラムは、各相互作用についての速度及び親和性定数を決定するためのグローバル・フィッティング分析法を使用する。
プロテアーゼ感受性アッセイ
HA結合ペプチドタグのタンパク質分解的切断について評価するために、ソルターゼ−A媒介反応を使用して、以下の表4に列記したHA結合ペプチドタグの種々の変異体と融合したNVS4の軽鎖のN−末端上を、Invitrogen AlexaFluor488で部位特異的に標識した。前記標識化タンパク質(1mg/ml以上)を、CHO K1PD使用済み培地と混合した(0.05% アジ化ナトリウムを含む使用済み培地と標識化タンパク質との比=1:10)。前記反応混合物を、振とうしながら37℃でインキュベートする。20マイクロリットルを、0日目の開始から種々の日に取り出し、凍結させた。前記サンプルを培養の最終指定日において取得した後、16μl(12μlのサンプル+4μlのSDS負荷染料)を、invitrogenの12〜16% 17ウェルNuPAGE Tris−Bisゲルに負荷した。前記ゲルを、BioRad Gel Doc2000を使用して、AlexaFluor488設定下においてスキャンする。前記タンパク質のタンパク質分解的切断を、より低い分子量へのバンドの質量シフトにより分析する。
HA結合ペプチドタグのタンパク質分解的切断について評価するために、ソルターゼ−A媒介反応を使用して、以下の表4に列記したHA結合ペプチドタグの種々の変異体と融合したNVS4の軽鎖のN−末端上を、Invitrogen AlexaFluor488で部位特異的に標識した。前記標識化タンパク質(1mg/ml以上)を、CHO K1PD使用済み培地と混合した(0.05% アジ化ナトリウムを含む使用済み培地と標識化タンパク質との比=1:10)。前記反応混合物を、振とうしながら37℃でインキュベートする。20マイクロリットルを、0日目の開始から種々の日に取り出し、凍結させた。前記サンプルを培養の最終指定日において取得した後、16μl(12μlのサンプル+4μlのSDS負荷染料)を、invitrogenの12〜16% 17ウェルNuPAGE Tris−Bisゲルに負荷した。前記ゲルを、BioRad Gel Doc2000を使用して、AlexaFluor488設定下においてスキャンする。前記タンパク質のタンパク質分解的切断を、より低い分子量へのバンドの質量シフトにより分析する。
親NVS1に類似する結合性を有する2つの変異体であるNVS2a及びNVS3aを、(表4)、引き続き、前記ウサギ漏出モデルにおいて評価した。NVS2a及びNVS3aのどちらも、ウサギ漏出モデルにおいて何らの効果も示さず、このことは、N311位におけるグリコシル化が、in vivo活性に重要であることを示す。親NVS1に類似する結合性を有する4つの変異体(表4:NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37)を、前記ウサギ漏出モデルにおいて評価した。4つ分子NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37の全ては、前記ウサギモデルにおいて、親NVS1に類似する効果を示した。ただし、NVS1と比較して、前記4つの変異体であるNVS2、NVS3、NVS36及びNVS37は、前記タグ付きタンパク質の開発可能性を改善する重要な要因である、増大したタンパク質安定性、低下又は除去されたタンパク質分解的切断及び増大した融点を示した。
これらの結果は、タンパク質分解的切断を変化させるように修飾された下記配列NVS2、NVS3及びNVS36及びNVS37のみが、より遅い眼におけるクリアランス、及び、延長した効果の持続期間を有する、固有のin vivo特性を保持したことを示した。
生理学的特性、アミノ酸配列及びHA結合性に関して、全体として最も好ましい寄与を有した選択された各プロテアーゼ抵抗性又は非グリコシル化変異体を、前記ウサギモデルにおいて評価した。より具体的には、pIの低下、グリコシル化部位の除去による乏しい安定性を有した変異体、及び/又は、タンパク質分解的切断を示したそれらの変異体を評価しなかった。
配列番号141
GSGGGTCRYAGVYHREAQSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAG WMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNASAPPEEDCT
配列番号141
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実施例8:最適化抗体:NVS1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37の更なる特徴付け
8a:最適化VEGF抗体のBiacore決定
HAに対して最適化されたVEGF抗体とヒトVEGFとの親和性を、上記実施例7に記載したように、Biacoreにより測定した。表5は、複数の実験の対象である各分子についての平均オンレート(ka)、オフレート(kd)及び全体的な親和性(KD)と共に、測定値又は算出値それぞれについての平均の範囲及び標準誤差を列記する。HAに対するNSV1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37の全体的な親和性は、25℃で測定した場合、5.75μMから31nMの範囲であり、37℃で測定した場合、3.07μMから29nMの範囲であった。5個全てのペプチドタグ付き融合分子の親和性は、タグ付けされていないFabであるNVS4と比較して、VEGFに対してより高い(表6)。
8a:最適化VEGF抗体のBiacore決定
HAに対して最適化されたVEGF抗体とヒトVEGFとの親和性を、上記実施例7に記載したように、Biacoreにより測定した。表5は、複数の実験の対象である各分子についての平均オンレート(ka)、オフレート(kd)及び全体的な親和性(KD)と共に、測定値又は算出値それぞれについての平均の範囲及び標準誤差を列記する。HAに対するNSV1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37の全体的な親和性は、25℃で測定した場合、5.75μMから31nMの範囲であり、37℃で測定した場合、3.07μMから29nMの範囲であった。5個全てのペプチドタグ付き融合分子の親和性は、タグ付けされていないFabであるNVS4と比較して、VEGFに対してより高い(表6)。
8b:最適化VEGF抗体のウサギにおける効果
(実施例2に記載した)前記ウサギ漏出モデルを使用して、最適化された抗VEGF抗体が、注入後20日目において血管漏出を阻害するかどうかを評価した(図6)。前記ペプチドタグ付き抗体であるNVS1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37は全て、フルオレセイン漏出を有意に阻害した。一方、等モルのラニビズマブは阻害しなかった(図6)。前記HA結合ペプチドタグ付き抗体は全て、前記タグ付けされていない抗体であるラニビズマブと比較して、20日目における最終薬剤濃度がより高かった(図6)。ラニビズマブの最終硝子体濃度は、5ng/mlであった。一方、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37の最終硝子体濃度は、それぞれ、231、533、343、722及び646ng/mlであった。ラニビズマブについて、これは、注入用量の0.2%を表した。一方、前記最適化された抗VEGF抗体の最終硝子体濃度は、前記注入用量の5.6〜17.4%を表した。このため、前記ペプチドタグ付き抗体のパーセント注入用量は、20日目において、ラニビズマブのパーセント注入用量より、約28〜87倍高かった。前記最終薬剤レベル及び開始用量を、2点PK曲線を算出するために使用した(図7)。前記結果は、ラニビズマブ、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37についての半減期値が、それぞれ、2、4.2、5.6、4.8、5.7及び6.8日であったことを示した。このため、抗体に結合したHA結合ペプチドタグは、タグ付けされていない抗体(例えば、ラニビズマブ)と比較して、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37について、約2〜3.5倍半減期を改善した。
(実施例2に記載した)前記ウサギ漏出モデルを使用して、最適化された抗VEGF抗体が、注入後20日目において血管漏出を阻害するかどうかを評価した(図6)。前記ペプチドタグ付き抗体であるNVS1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37は全て、フルオレセイン漏出を有意に阻害した。一方、等モルのラニビズマブは阻害しなかった(図6)。前記HA結合ペプチドタグ付き抗体は全て、前記タグ付けされていない抗体であるラニビズマブと比較して、20日目における最終薬剤濃度がより高かった(図6)。ラニビズマブの最終硝子体濃度は、5ng/mlであった。一方、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37の最終硝子体濃度は、それぞれ、231、533、343、722及び646ng/mlであった。ラニビズマブについて、これは、注入用量の0.2%を表した。一方、前記最適化された抗VEGF抗体の最終硝子体濃度は、前記注入用量の5.6〜17.4%を表した。このため、前記ペプチドタグ付き抗体のパーセント注入用量は、20日目において、ラニビズマブのパーセント注入用量より、約28〜87倍高かった。前記最終薬剤レベル及び開始用量を、2点PK曲線を算出するために使用した(図7)。前記結果は、ラニビズマブ、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37についての半減期値が、それぞれ、2、4.2、5.6、4.8、5.7及び6.8日であったことを示した。このため、抗体に結合したHA結合ペプチドタグは、タグ付けされていない抗体(例えば、ラニビズマブ)と比較して、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36及びNVS37について、約2〜3.5倍半減期を改善した。
このことは、前記ペプチドタグ付き抗体のクリアランスが、タグ付けされていない抗体より遅いこと、及び、眼からのより遅いクリアランスが、効果の増大と相関するより後の時点でより高い薬剤レベルをもたらすことを示す。タグ付き抗体を、ヒアルロン酸に結合するように操作することにより、眼からの抗体のクリアランスを遅くする。より高い最終薬剤レベル、前記タグ付き抗体の20日目でのより高いパーセント注入用量及びより長い眼における半減期は、作用のこのメカニズムと一致する。HAと結合するペプチドフラグメントによりタグ付けされた抗体がより高いレベルで存在したため、タグ付けされた抗体の投与は、VEGFレベルのより高い抑制をもたらした。より低いVEGFレベルは、血管漏出量の低下及び効果の持続期間の増大に関連する(図6及び7)。ヒトwet AMD患者では、VEGFレベルの抑制は、血管新生活動の再発を予防するために必須である。VEGFレベルの増大は、疾患活動の再発に関連する(Muether et al., 2012)。このため、HAと結合するペプチドフラグメントによりタグ付けされている抗体による、網膜血管疾患(例えば、wet AMD)を有する患者の処置は、タグ付けされていない抗VEGF抗体と比較して、作用のより長い持続期間を有することが期待される。このため、効果を維持するが、投与頻度の低下を提供することにより患者に利益をもたらす。
実施例9:NVS1及びNVS2についての、ウサギにおける20日目から30日目の長期効果及び最終PK
NVS1及びNVS2の効果の持続期間の増大の程度を決定するために、前記ウサギ漏出モデルを、以下に記載するように、NVS1及びNVS2の効果を評価するために修飾した(図8及び図9)。これらの試験では、6.2μg/眼のNVS1及びNVS2(5μg/眼のラニビズマブに等モル)を、前記hVEGF負荷の18、21、24、26又は28日前のいずれかで、ウサギの種々のコホートに硝子体内投与した。hVEGF負荷後48時間で、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。NVS1は、1つの試験における全ての時点において、類似する効果(76〜86%)を達成した(図8)。NVS1及びNVS2は両方とも、20日目(81〜85%)及び30日目(64〜67%)において類似する効果を達成した(図9)。対照的に、hVEGF負荷の20日前における等モル用量のラニビズマブは、血管漏出を阻害しなかった(図3)。
NVS1及びNVS2の効果の持続期間の増大の程度を決定するために、前記ウサギ漏出モデルを、以下に記載するように、NVS1及びNVS2の効果を評価するために修飾した(図8及び図9)。これらの試験では、6.2μg/眼のNVS1及びNVS2(5μg/眼のラニビズマブに等モル)を、前記hVEGF負荷の18、21、24、26又は28日前のいずれかで、ウサギの種々のコホートに硝子体内投与した。hVEGF負荷後48時間で、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。NVS1は、1つの試験における全ての時点において、類似する効果(76〜86%)を達成した(図8)。NVS1及びNVS2は両方とも、20日目(81〜85%)及び30日目(64〜67%)において類似する効果を達成した(図9)。対照的に、hVEGF負荷の20日前における等モル用量のラニビズマブは、血管漏出を阻害しなかった(図3)。
血管漏出を測定する画像化の完了に基づいて、前記動物を屠殺し、眼を摘出し、上述したように、硝子体中の総抗体濃度を定量化するために処理した。IVT投与後20〜21日目において、ラニビズマブの硝子体濃度は、約5ng/mlであった(図6及び7)。対照的に、NVS1の最終硝子体濃度は、20、23、26、28及び30日目において、それぞれ、459、261、202、145及び142であった。このことは、眼における保持の明らかな改善を示す。これらの最終硝子体濃度を、NVS1についての2点及び6点PK曲線を算出するために使用した(図10)。前記結果は、NVS1についての眼における半減期値が、それぞれ、4.2及び5.2日であり、ラニビズマブと比較して、NVS1の約2〜2.5倍の半減期の改善を示す。前記結果は、図7における結果に類似する。
HA結合ペプチドタグにより操作された抗体は、HA結合ペプチドタグを含まない抗体と比較して、眼からの抗体のクリアランスの低下を示した。より高い最終薬剤レベル及びより長い眼における半減期は、作用のこのメカニズムに一致する。より高いNVS1レベルが後の時点で存在するために、ペプチドタグ付き抗体による投与は、タグ付けされていない抗体と比較して、より長い期間、VEGFレベルのより高い抑制をもたらす。ヒトwet AMD患者では、VEGFレベルの抑制は、血管新生活動の再発を予防するために必須である。VEGFレベルの増大は、疾患活動の再発に関連する(Muether et al., 2012)。このため、HA結合ペプチドタグに結合した抗VEGF抗体によるwet AMD患者の処置は、修飾されていない抗VEGF抗体と比較して、作用のより長い持続期間を有することが期待される。これにより、効果を維持する一方で、投与頻度の低下を提供することにより患者に利益をもたらす。
実施例10:カニクイザルにおけるNVS1及びNVS4の認容性、効果及び最終PKの28日の試験
熱レーザ誘導性脈絡管血管新生のカニクイザルモデル
カニクイザルの熱レーザ誘導性脈絡管血管新生モデルにおいて、レーザを、RPEと脈絡膜との間の膜障壁(ブルッフ膜)を破壊するために使用した。前記破壊は、レーザ火傷部位における血管新生をもたらす。病変における病変サイズ及び漏出を、フルオレセイン血管造影を使用して測定し得る。作用の持続期間を決定するために、抗VEGF分子を、熱レーザ法前の種々のタイミングで投与し得る。前記抗VEGF分子投与とレーザ処置との間の間隔は、抗VEGF分子の作用の持続期間を決定する。
熱レーザ誘導性脈絡管血管新生のカニクイザルモデル
カニクイザルの熱レーザ誘導性脈絡管血管新生モデルにおいて、レーザを、RPEと脈絡膜との間の膜障壁(ブルッフ膜)を破壊するために使用した。前記破壊は、レーザ火傷部位における血管新生をもたらす。病変における病変サイズ及び漏出を、フルオレセイン血管造影を使用して測定し得る。作用の持続期間を決定するために、抗VEGF分子を、熱レーザ法前の種々のタイミングで投与し得る。前記抗VEGF分子投与とレーザ処置との間の間隔は、抗VEGF分子の作用の持続期間を決定する。
網膜の黄班周囲に対する焦点熱レーザ除去は、加齢黄班変性(AMD)に対する治療剤を評価するための脈絡膜血管新生(CNV)病変を形成するために一般的な方法である。先の評価試験に基づくと、臨床的に関連するグレードIVのCNV病変の形成においては、657nmのクリプトン赤色レーザの使用がアルゴン緑色レーザ(532nm)より効果的であった(I〜IVのスケールを、病変重症度を評価するために使用した。)。675nmのクリプトンレーザを用いると、レーザ後4週間を超える漏出の延長した持続期間を達成することができたため、数週間から数ヶ月の期間にわたる、抗VEGF剤の作用の持続期間を評価するのに適していると考えられた。
サルにおける硝子体内(IVT)注入
原始的な非ヒト霊長類(Macaca fascicularis)(N=3、2.4−5.8kg)を、ケタミン(5−20mg/kg)、ミダゾラム(0.05−0.5mg/kg)及びグリコピロレート(0.005mg/kg)のIMカクテルにより鎮静させた。必要に応じて、麻酔の深さを、プロポフォール(2〜5mg/kg)の少量の追加IV投与(0.25〜0.5ml)により維持した。前記サルを、手術顕微鏡(Zeiss−Meditec(登録商標))下において、加熱した手術台上に仰向けに寝かせた。瞼及び隣接する組織を、ベタジンスワブスティックで洗浄し、滅菌ドレープを、実験対象の眼上に置いた。1−2滴の0.5% 眼科用ベタインを投与する前に、各眼に0.5% プロパラカイン眼麻酔剤を滴下した。眼を、滅菌BSSで洗浄し、マイクロスポンジを使用して、過剰の流体を除去した。小児科用瞼検鏡を、前記瞼を収容するように配置した。GenTeal(登録商標)ゲル(Navartis(登録商標))を、外科的拡大コンタクトレンズ(Ocular Instruments)の角膜開口部に入れて、手術顕微鏡によって硝子体及びを通る網膜の視覚化を強めた。細い鉗子で結膜を掴み、眼をゆっくり回転させ、角膜輪部の後ろ3mmの注入部位を曝した。ニードルを取り付けた29Gの0.3ccモノジェクトシリンジを、下方斜角で挿入し、網膜に向かって角度を付けた。前記斜角を可視化し、試験物質の硝子体内部送達用に配置した後、プランジャーをゆっくり押し下げて、50μl容量の物質を送達した。前記ニードルをゆっくり引き、前記注入部位を細い鉗子で挟み、試験物質又は硝子体液の逆流を最少化又は防いだ。全ての眼に、感染を予防するために、1−2滴の局所眼科用ビガモックス(Alcon)を投与した。全ての注入観察を記録した。ケージに戻す前に、動物に麻酔回復剤及び予防的鎮痛剤を与えた。
原始的な非ヒト霊長類(Macaca fascicularis)(N=3、2.4−5.8kg)を、ケタミン(5−20mg/kg)、ミダゾラム(0.05−0.5mg/kg)及びグリコピロレート(0.005mg/kg)のIMカクテルにより鎮静させた。必要に応じて、麻酔の深さを、プロポフォール(2〜5mg/kg)の少量の追加IV投与(0.25〜0.5ml)により維持した。前記サルを、手術顕微鏡(Zeiss−Meditec(登録商標))下において、加熱した手術台上に仰向けに寝かせた。瞼及び隣接する組織を、ベタジンスワブスティックで洗浄し、滅菌ドレープを、実験対象の眼上に置いた。1−2滴の0.5% 眼科用ベタインを投与する前に、各眼に0.5% プロパラカイン眼麻酔剤を滴下した。眼を、滅菌BSSで洗浄し、マイクロスポンジを使用して、過剰の流体を除去した。小児科用瞼検鏡を、前記瞼を収容するように配置した。GenTeal(登録商標)ゲル(Navartis(登録商標))を、外科的拡大コンタクトレンズ(Ocular Instruments)の角膜開口部に入れて、手術顕微鏡によって硝子体及びを通る網膜の視覚化を強めた。細い鉗子で結膜を掴み、眼をゆっくり回転させ、角膜輪部の後ろ3mmの注入部位を曝した。ニードルを取り付けた29Gの0.3ccモノジェクトシリンジを、下方斜角で挿入し、網膜に向かって角度を付けた。前記斜角を可視化し、試験物質の硝子体内部送達用に配置した後、プランジャーをゆっくり押し下げて、50μl容量の物質を送達した。前記ニードルをゆっくり引き、前記注入部位を細い鉗子で挟み、試験物質又は硝子体液の逆流を最少化又は防いだ。全ての眼に、感染を予防するために、1−2滴の局所眼科用ビガモックス(Alcon)を投与した。全ての注入観察を記録した。ケージに戻す前に、動物に麻酔回復剤及び予防的鎮痛剤を与えた。
熱レーザ法
前記サルを、ケタミン(5〜20mg/kg)、ミダゾラム(0.05〜0.5mg/kg)及びグリコピロレート(0.005mg/kg)のIMカクテルにより鎮静させた。手術中に、麻酔の深さを、プロポフォール(2〜5mg/kg)の少量の追加IV投与(0.25〜0.5ml)により維持した。ベースラインのカラー眼底写真を、レーザ前に取得し、レーザ火傷の事前配置のために使用して、網膜中心窩から及び互いから等間隔であることを確保し、局所網膜血管出血、CNV病変癒合及び網膜中心窩の機能侵害のような影響を最少化した。前記鎮静させた動物を、その腹部側を上にして、専用の傾斜した携帯式画像化プラットホーム上に置き、各手術について、スリットランプ搭載レーザ又は画像化システムカメラレンズと整列させて頭を位置させた。アルカイン(0.5% プロパラカイン、Alcon)の一滴の眼への局所滴を、各眼に滴下した後、開口部におけるGenTealゲル(Navartis(登録商標))を伴う1×Reichel Mainsterコンタクトレンズ(Ocular Instruments(登録商標))を配置した。600mW、75μmスポットサイズ;0.01−0.1秒の1パルス持続期間に設定されたクリプトン赤色レーザ(Novus Varia Three Mode Laser System、Lumenis(登録商標)を使用して、4か所のレーザ火傷を、両眼の角膜中心窩の外側に形成する。前記サルに、手術後24時間、回復剤及び予防的鎮痛剤を与えた。
前記サルを、ケタミン(5〜20mg/kg)、ミダゾラム(0.05〜0.5mg/kg)及びグリコピロレート(0.005mg/kg)のIMカクテルにより鎮静させた。手術中に、麻酔の深さを、プロポフォール(2〜5mg/kg)の少量の追加IV投与(0.25〜0.5ml)により維持した。ベースラインのカラー眼底写真を、レーザ前に取得し、レーザ火傷の事前配置のために使用して、網膜中心窩から及び互いから等間隔であることを確保し、局所網膜血管出血、CNV病変癒合及び網膜中心窩の機能侵害のような影響を最少化した。前記鎮静させた動物を、その腹部側を上にして、専用の傾斜した携帯式画像化プラットホーム上に置き、各手術について、スリットランプ搭載レーザ又は画像化システムカメラレンズと整列させて頭を位置させた。アルカイン(0.5% プロパラカイン、Alcon)の一滴の眼への局所滴を、各眼に滴下した後、開口部におけるGenTealゲル(Navartis(登録商標))を伴う1×Reichel Mainsterコンタクトレンズ(Ocular Instruments(登録商標))を配置した。600mW、75μmスポットサイズ;0.01−0.1秒の1パルス持続期間に設定されたクリプトン赤色レーザ(Novus Varia Three Mode Laser System、Lumenis(登録商標)を使用して、4か所のレーザ火傷を、両眼の角膜中心窩の外側に形成する。前記サルに、手術後24時間、回復剤及び予防的鎮痛剤を与えた。
画像取得
予想不可能なナトリウムフルオレセイン誘導性嘔吐の発生を最少化するために、前記サルに、IM ゾフラン(0.1mg/kg)及びベナドリル(2.2mg/kg)を、麻酔30分前に与えた。前記サルを、ケタミン(5〜20mg/kg)、ミダゾラム(0.05〜0.5mg/kg)及びグリコピロレート(0.005mg/kg)のIMカクテルにより鎮静させた。手術中に、麻酔の深さを、プロポフォール(2〜5mg/kg)の少量の追加IV投与(0.25〜0.5ml)により維持した。全ての画像モダリティを、ベースライン、レーザ後及びレーザ後2週間に行い、CNV病変の外観、厚み及び漏出を記録した。カラー眼底像撮影(Zeiss ff450+Nカメラ、Carl Zeiss Meditec)を使用して、網膜の中央50度の臨床的外観を記録した。赤外眼底像撮影、フルオレセイン血管造影及びSD−OCT(Spectrials、Heidelberg Engineering)も行った。CNV漏出を、遅延相フルオレセイン血管造影を使用して、0.1〜0.2ml/kgの10% AK−Fluor(登録商標)(Akorn(登録商標))のIVボーラス後5分において評価した。CNV病変厚みも、5°×15° 7−ライン SD−OCTグリッド内の1ラインを使用して測定し、各レーザ火傷に占有されたおおよその面積をカバーした。RPEからILMの距離を、Spectralis(登録商標)HEYEX(登録商標)ソフトウェアにより測定した。平均厚みを、群あたり及び更なる終点で算出して、薬剤処置群とコントロール群との効果を評価した。
予想不可能なナトリウムフルオレセイン誘導性嘔吐の発生を最少化するために、前記サルに、IM ゾフラン(0.1mg/kg)及びベナドリル(2.2mg/kg)を、麻酔30分前に与えた。前記サルを、ケタミン(5〜20mg/kg)、ミダゾラム(0.05〜0.5mg/kg)及びグリコピロレート(0.005mg/kg)のIMカクテルにより鎮静させた。手術中に、麻酔の深さを、プロポフォール(2〜5mg/kg)の少量の追加IV投与(0.25〜0.5ml)により維持した。全ての画像モダリティを、ベースライン、レーザ後及びレーザ後2週間に行い、CNV病変の外観、厚み及び漏出を記録した。カラー眼底像撮影(Zeiss ff450+Nカメラ、Carl Zeiss Meditec)を使用して、網膜の中央50度の臨床的外観を記録した。赤外眼底像撮影、フルオレセイン血管造影及びSD−OCT(Spectrials、Heidelberg Engineering)も行った。CNV漏出を、遅延相フルオレセイン血管造影を使用して、0.1〜0.2ml/kgの10% AK−Fluor(登録商標)(Akorn(登録商標))のIVボーラス後5分において評価した。CNV病変厚みも、5°×15° 7−ライン SD−OCTグリッド内の1ラインを使用して測定し、各レーザ火傷に占有されたおおよその面積をカバーした。RPEからILMの距離を、Spectralis(登録商標)HEYEX(登録商標)ソフトウェアにより測定した。平均厚みを、群あたり及び更なる終点で算出して、薬剤処置群とコントロール群との効果を評価した。
CNV評価スキーム
フルオレセインのIV注入の5分後に取得した遅延相フルオレセイン血管造影画像を、広く受け入れられた4点評価スケール(Covance and Krystolik ME, et al. Arch Ophthalmol 2002; 12:338)を使用して、前記CNV病変を主観的に評価するために使用した。マスクされた熟練の採点者が、下記主観的評価スケールを使用して、各病変をスコアした(表7)。グレードI:過蛍光なし;グレードII:漏出なしに過蛍光を示した;グレードIII:初期又は中期の画像における過蛍光および後期の漏出;グレードIV:中期に鮮やかな過蛍光、後期に処置部位を超える漏出を示す。
フルオレセインのIV注入の5分後に取得した遅延相フルオレセイン血管造影画像を、広く受け入れられた4点評価スケール(Covance and Krystolik ME, et al. Arch Ophthalmol 2002; 12:338)を使用して、前記CNV病変を主観的に評価するために使用した。マスクされた熟練の採点者が、下記主観的評価スケールを使用して、各病変をスコアした(表7)。グレードI:過蛍光なし;グレードII:漏出なしに過蛍光を示した;グレードIII:初期又は中期の画像における過蛍光および後期の漏出;グレードIV:中期に鮮やかな過蛍光、後期に処置部位を超える漏出を示す。
グレードIVの病変を、臨床的に有意と定義した。グレードIV病変の平均数を、処置群あたりに計測し、処置群あたりに形成されたレーザ火傷の総数から、パーセント阻害を算出するために使用した。
予めレーザ照射され、食塩水コントロールとして使用された非天然のカニクイザルを使用して、パイロット試験を、カニクイザルにおいて行った(図11)。最重要の情報は、NVS1の眼における認容性であった。さらに、これらの動物において、フルオレセイン血管造影により測定された持続性の血管漏出が存在した。したがって、薬理学的活性の予備的評価も行った。群あたりに合計2匹の動物(合計4つの眼)について、抗VEGF抗体である、200μg/眼のNVS1又は214μg/眼のNVS2のいずれかを硝子体内に投与した。評価(スリットランプ、フルオレセイン血管造影)を、その日の薬剤投与前、ついで、2、7及び28日目に行った。28日目に、動物を屠殺し、眼を摘出し、記載したように最終薬剤レベルを決定するために硝子体を抽出した。
ELISAによるカニクイザルの最終的な眼におけるPK定量
カニクイザルの硝子体におけるNVS1及びNVS4の眼におけるPKプロファイルを、以下に記載され、図12に示された標準的な方法を使用して比較した。
カニクイザルの硝子体におけるNVS1及びNVS4の眼におけるPKプロファイルを、以下に記載され、図12に示された標準的な方法を使用して比較した。
前記摘出した眼を解剖し、硝子体を他の組織から分離し、さらに、TissueLyzer(QIAGEN(登録商標))を使用して機械的にホモジナイズした。前記硝子体における抗体レベルを、ELISAにより測定した。Maxisorp384ウェルプレート(Nunc464718)を、炭酸バッファー(PIERCE(登録商標)28382)中のVEGF(NOVARTIS(登録商標)05/10/2011)で、4℃で一晩コートした。インキュベートの合間に、BioTek(登録商標)プレート洗浄器を使用して、TBST(THERMO SCIENTIFIC(登録商標)28360)でプレートを3回洗浄した。翌日、前記プレートを、TBS中のブロッキングバッファー(5% BSA(SIGMA(登録商標)A4503)、0.1% Tween−20(SIGMA(登録商標)P1379)、0.1% Triton X−100(SIGMA(登録商標)P234729)により、室温で2時間(又は、4℃で一晩)ブロッキングした。サンプルを、希釈剤(TBS中の2% BSA(SIGMA(登録商標)A4503)、0.1% Tween−20(SIGMA(登録商標)P1379)、0.1% Triton X−100(SIGMA(登録商標)P234729))中に希釈し、穏やかに振とうしながら、前記プレート上で室温において1時間インキュベートした。ついで、ヤギ抗ヒト抗体(bethyl、A80−319A)を、穏やかに振とうしながら、前記プレートに室温で1時間添加した。検出抗体を、HRPにコンジュゲートしたウサギ抗ヤギIgG(H+L)(THERMO FISHER(登録商標)31402)とした。前記検出抗体を、穏やかに振とうしながら、前記プレートに室温で1時間添加した。Ultra TMBを、15分間添加した(THERMO FISHER(登録商標)34028)。反応を、2N 硫酸(Ricca8310−32)により停止させた。前記サンプルの吸光度を、SpectraMax(登録商標)(450〜570nm)上で読み取った。精製した標準を使用して、眼の組織からのFab回収レベルを逆算した。前記標準について、使用した最高濃度を、2倍希釈による200ng/mLとした。
最終薬剤レベルを、硝子体抽出物において測定し、2点PK曲線を作成するために使用した(図12)。タグ付けされていない抗体であるNVS4は、2.09日の眼における半減期を有した。一方、NVS1は、7.03日の眼における半減期を有した。このため、前記HA結合ペプチドタグは、3倍より高く眼のPKを改善した。これらの結果は、1)HA結合ペプチドタグに結合したタンパク質が、非ヒト霊長類に安全に投与され得ること、2)HA結合ペプチドタグに結合したタンパク質が、wet AMDモデルに有効であり得ること、及び、3)HA結合ペプチドタグにタンパク質を結合させることにより、高い薬剤レベルがより長い期間維持され得ることを示す。
実施例11:カニクイザルにおけるNVS1及びラニビズマブの51日目の最終PK
263μg/眼のラニビズマブ又は324μg/眼のNVS1(NVS1:ラニビズマブの用量に等モル)のいずれかを、カニクイザルの群(3匹の動物/群=6個の眼/群)に対して、硝子体内に投与した。投与後21又は51日目に、動物を屠殺し、眼を摘出し、最終薬剤濃度を、Gyrolab ELISAにより測定した(図13)。
263μg/眼のラニビズマブ又は324μg/眼のNVS1(NVS1:ラニビズマブの用量に等モル)のいずれかを、カニクイザルの群(3匹の動物/群=6個の眼/群)に対して、硝子体内に投与した。投与後21又は51日目に、動物を屠殺し、眼を摘出し、最終薬剤濃度を、Gyrolab ELISAにより測定した(図13)。
Gyrolab ELISAによるカニクイザルの最終PK定量
硝子体サンプルを、室温で10分間解凍した。NVS1サンプルを、96ウェルPCRプレート(THRMO SCIENTIFIC(登録商標)AB−800、0.2mL Skirted 96ウェルPCRプレート)において、Rexxip ANバッファー(Gyros(登録商標),Inc、Cat P0004994)中、1:10に希釈した。一方、ラニビズマブ(商標)サンプルを、Rexxip ANバッファー中、1:4に希釈した。サンプルを密封し(GYROS(登録商標),Inc、マイクロプレートフォイル Cat P0003313)、プレートシェイカーにおいて、1分間完全に混合した。前記ウェルの底に泡が見出されないのを確保して、前記サンプルを、Gyrolab(商標)xPワークステーションに入れた。3工程C−A−D法を、Gyrolab(商標)xPワークステーション上で実行する。まず、前記システムに、捕捉抗体、続けて、検体(サンプル)を流す。ついで、検出器のPBS 0.01% Twenn20(Calbiochem,Inc、Cat655206)による洗浄を、各工程間に行った。遊離した(VEGFに結合していない)NVS1の測定についての検量線を、Rexxip ANにおける10% ウサギの硝子体(BioReclamation(登録商標),LLC、Cat Cyno−Vitreous)を含む希釈剤において作成する。前記標準を、6000ng/mLから0.129ng/mLに、1:6の連続希釈をした。
硝子体サンプルを、室温で10分間解凍した。NVS1サンプルを、96ウェルPCRプレート(THRMO SCIENTIFIC(登録商標)AB−800、0.2mL Skirted 96ウェルPCRプレート)において、Rexxip ANバッファー(Gyros(登録商標),Inc、Cat P0004994)中、1:10に希釈した。一方、ラニビズマブ(商標)サンプルを、Rexxip ANバッファー中、1:4に希釈した。サンプルを密封し(GYROS(登録商標),Inc、マイクロプレートフォイル Cat P0003313)、プレートシェイカーにおいて、1分間完全に混合した。前記ウェルの底に泡が見出されないのを確保して、前記サンプルを、Gyrolab(商標)xPワークステーションに入れた。3工程C−A−D法を、Gyrolab(商標)xPワークステーション上で実行する。まず、前記システムに、捕捉抗体、続けて、検体(サンプル)を流す。ついで、検出器のPBS 0.01% Twenn20(Calbiochem,Inc、Cat655206)による洗浄を、各工程間に行った。遊離した(VEGFに結合していない)NVS1の測定についての検量線を、Rexxip ANにおける10% ウサギの硝子体(BioReclamation(登録商標),LLC、Cat Cyno−Vitreous)を含む希釈剤において作成する。前記標準を、6000ng/mLから0.129ng/mLに、1:6の連続希釈をした。
ラニビズマブ(商標)測定のための検量線を、Rexxip ANにおける25% ウサギの硝子体(BioReclamation(登録商標),LLC、Cat Cyno−Vitreous)を含む希釈剤において作成する。前記標準を、1:6で連続希釈して、6000ng/mL〜0.129ng/mLとした。
51日目に、NVS1及びラニビズマブの平均濃度はそれぞれ、2070ng/mL及び<0.1ng/mLであった。前記データは、51日目におけるNVS1の硝子体濃度が、21日目におけるラニビズマブの硝子体濃度より高いことを示す。開始用量ならびに21日目及び51日目の眼における薬剤レベルを、3点PK曲線を算出するために使用した(図13)。これらの曲線は、ラニビズマブ及びNVS1についての眼における半減期値がそれぞれ、2.6及び8.2日であったことを示し、HAと結合するペプチドタグを抗体に結合させることが、サルにおいて、眼におけるPKを約3倍改善し得ることを示す。これらの結果は、前記HA結合ペプチドタグによりタグ付けされた抗体についての眼における半減期における明らかな増大を示す。前記NVS1抗体を、ヒアルロン酸に結合するように操作したことにより、眼からの前記抗体のクリアランスが遅くなった。長期にわたるより高い薬剤レベル及びより長い眼における半減期は、作用のこのメカニズムと一致する。
効果のこの延長した持続期間を、動物モデル、例えば、カニクイザルレーザCNVにおいて試験し得た。前記モデルは、wet AMDのモデルである。動物は、熱レーザ処置前の種々のタイミング(例えば、0〜8週間)で薬剤投与され得る。投与群は、例えば、ビヒクルコントロール群(例えば、生理食塩水)、コントロールのタグ付けされていない抗体(例えば、ラニビズマブ又はNVS4)で処置された群、及び、HA結合ペプチドでタグ付けされた抗体(例えば、NVS2)により処置された群を含み得る。十分な数の動物(例えば、処置群あたりに15〜20匹の動物)の処置により、タグ付けされていない抗体とHA結合ペプチドタグでタグ付けされた抗体との間の効果の持続期間における統計学的区別が可能であり得る。
実施例12:ヒト対象における抗VEGFタンパク質の半減期、最終濃度、効果の持続期間を増大させるための、HA結合ペプチドに結合した抗VEGFタンパク質の使用
12a:ペプチドタグが、より高い最終濃度及び作用の持続期間を増大させる
HAと結合するペプチドタグ(例えば、配列番号32、33、34、35又は36の配列を有するペプチドタグ)に結合した抗VEGFタンパク質(例えば、抗体又は抗原結合フラグメント)による処置は、タグ付けされていないタンパク質と比較して、より遅いタイミングにおいて、より高い薬剤レベルをもたらす。このため、遊離のVEGFレベルのより高い抑制が、より長い期間存在する。より低い遊離VEGFレベルは、病因量の低下及び効果の持続期間の増大に関連する。ヒトwet AMD患者では、VEGFレベルの抑制は、血管新生活動の再発を予防するために必須である。VEGFレベルの増大は、疾患活動の再発に関連する(Muether et al., 2012)。このため、本願明細書に記載されたHA結合ペプチドタグに結合した抗VEGFタンパク質(例えば、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36又はNVS37)によるwet AMD患者の処置は、タグ付けされていない抗VEGFタンパク質と比較して、作用のより長い持続期間を有し得る。これにより、効果を維持する一方、投与頻度の低下を提供することにより患者に利益をもたらす。このような投与スキームの例は、図14A〜Cに示される。現在、500μg/眼のラニビズマブが28日毎にIVT投与されているヒトwet AMDにおいて、最大のVEGF抑制及び最も高い視覚改善を達成している。等モル濃度のペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質(0.62mg)を、IVT投与される硝子体濃度が28日目において前記ラニビズマブ濃度より高くなるようにする。図14Aにおいて、シミュレーションについての灰色のバンドは、1.7μMのKDで、ヒト硝子体HA(250μg/mL)の5〜15%に結合するペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質に対する予測範囲を示す。図14Bにおいて、シミュレーションについての灰色のバンドは、0.48から7.2μMの範囲のKDで、硝子体HAの15%に結合するペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質に対する予測範囲を示す。効果の持続期間を、ヒト硝子体HAの5%又は15%に結合するペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質について、HAについてのKDに対してプロットした(図14C)。効果の持続期間を、28日目におけるラニビズマブの硝子体濃度に達するのにかかる時間として定義した。全てのシミュレーションは、前記ペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質と硝子体HAとの可逆的結合を仮定する。前記ペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質のクリアランスは、前記ペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質が解離して遊離のHA及び遊離のペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質を形成することを除いて仮定しなかった。類似する作用の持続期間の延長及び低下した投与頻度が、HA結合ペプチドタグによりタグ付けされた眼に対する他の治療剤(例えば、他の抗VEGF抗体及び眼における他のターゲットと結合する抗体等)について期待される。
12a:ペプチドタグが、より高い最終濃度及び作用の持続期間を増大させる
HAと結合するペプチドタグ(例えば、配列番号32、33、34、35又は36の配列を有するペプチドタグ)に結合した抗VEGFタンパク質(例えば、抗体又は抗原結合フラグメント)による処置は、タグ付けされていないタンパク質と比較して、より遅いタイミングにおいて、より高い薬剤レベルをもたらす。このため、遊離のVEGFレベルのより高い抑制が、より長い期間存在する。より低い遊離VEGFレベルは、病因量の低下及び効果の持続期間の増大に関連する。ヒトwet AMD患者では、VEGFレベルの抑制は、血管新生活動の再発を予防するために必須である。VEGFレベルの増大は、疾患活動の再発に関連する(Muether et al., 2012)。このため、本願明細書に記載されたHA結合ペプチドタグに結合した抗VEGFタンパク質(例えば、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36又はNVS37)によるwet AMD患者の処置は、タグ付けされていない抗VEGFタンパク質と比較して、作用のより長い持続期間を有し得る。これにより、効果を維持する一方、投与頻度の低下を提供することにより患者に利益をもたらす。このような投与スキームの例は、図14A〜Cに示される。現在、500μg/眼のラニビズマブが28日毎にIVT投与されているヒトwet AMDにおいて、最大のVEGF抑制及び最も高い視覚改善を達成している。等モル濃度のペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質(0.62mg)を、IVT投与される硝子体濃度が28日目において前記ラニビズマブ濃度より高くなるようにする。図14Aにおいて、シミュレーションについての灰色のバンドは、1.7μMのKDで、ヒト硝子体HA(250μg/mL)の5〜15%に結合するペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質に対する予測範囲を示す。図14Bにおいて、シミュレーションについての灰色のバンドは、0.48から7.2μMの範囲のKDで、硝子体HAの15%に結合するペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質に対する予測範囲を示す。効果の持続期間を、ヒト硝子体HAの5%又は15%に結合するペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質について、HAについてのKDに対してプロットした(図14C)。効果の持続期間を、28日目におけるラニビズマブの硝子体濃度に達するのにかかる時間として定義した。全てのシミュレーションは、前記ペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質と硝子体HAとの可逆的結合を仮定する。前記ペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質のクリアランスは、前記ペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質が解離して遊離のHA及び遊離のペプチドタグ付き抗VEGFタンパク質を形成することを除いて仮定しなかった。類似する作用の持続期間の延長及び低下した投与頻度が、HA結合ペプチドタグによりタグ付けされた眼に対する他の治療剤(例えば、他の抗VEGF抗体及び眼における他のターゲットと結合する抗体等)について期待される。
4ヶ月毎に500μg/眼で投与されるペプチドタグ付き分子(例えば、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36又はNVS37)は、ラニビズマブ又は他のタグ付けされていない抗VEGF分子の毎月又は隔月での投与と比較して、同程度のVEGF抑制及び視覚の付随する改善を達成することが期待される。他の網膜血管疾患を有するヒト患者では、おそらく、遊離VEGFレベルと疾患活動との同様の関係があるため、タグ付き抗VEGF抗体により同様の効果の延長した持続期間が、タグ付き抗VEGF抗体の同様の用量により期待される。
12b:眼における薬剤濃度及び投与間隔における半減期増大の効果
眼内への送達用の分子に本発明のペプチドタグを結合させることは、ペプチドタグを含まない分子に対して、その眼における半減期を増大させ得る。HA結合ペプチドタグを含む分子の眼における半減期を増大させることは、タグ付けされていない分子と比較して、投与後の薬剤レベルを明らかに増大させ得る。HA結合ペプチドタグ付き分子は、タグ付けされていない分子と比較して、もはや治療的に有効でない、硝子体におけるトラフ濃度レベルに達するのにより長い時間がかかるであろう。
眼内への送達用の分子に本発明のペプチドタグを結合させることは、ペプチドタグを含まない分子に対して、その眼における半減期を増大させ得る。HA結合ペプチドタグを含む分子の眼における半減期を増大させることは、タグ付けされていない分子と比較して、投与後の薬剤レベルを明らかに増大させ得る。HA結合ペプチドタグ付き分子は、タグ付けされていない分子と比較して、もはや治療的に有効でない、硝子体におけるトラフ濃度レベルに達するのにより長い時間がかかるであろう。
硝子体内に投与された生体分子の硝子体からのクリアランスは、一次指数崩壊関数(方程式1)に当てはまることが示されている(Krohne et al., 2008;Krohne et al., 2012;Bakri et al., 2007b;Bakri et al., 2007a;Gaudreault et al., 2007;Gaudreault et al., 2005)。
Ct=Ct=0*e−kt
速度定数kは、
である。
ctは、硝子体内投与後の時間tにおける濃度である。
Ct=0は、硝子体内投与後の時間0における濃度である。
T1/2は、硝子体内投与後の眼における半減期である。
Ct=Ct=0*e−kt
速度定数kは、
である。
ctは、硝子体内投与後の時間tにおける濃度である。
Ct=0は、硝子体内投与後の時間0における濃度である。
T1/2は、硝子体内投与後の眼における半減期である。
HA結合ペプチドタグを含む分子の硝子体内半減期を増大させる効果を、上記方程式を使用してモデル化し得る。この実施例の目的のために、タグ付けされていない分子の眼におけるT1/2を5日であると仮定する。図14Dにおいて、曲線は、種々の時間において残留する薬剤の相対量(時間=0において100%の薬剤)ならびに、25%、50%、75%及び100%、眼におけるT1/2を増大させる効果を示す。図14Dは、眼における半減期の増大が、最初の投与後の全てのタイミングにおいて、より高い濃度の硝子体内に投与された分子をもたらすことを示す。表7aは、30日間隔において、(最初の用量の割合としての)残留する分子の量を示す。表7bは、5日の半減期のタグ付けされていないモデルについて、残留する分子の量を示す。例えば、25%半減期を増大させること(例えば、5.0から6.25日)は、30日目での薬剤レベルにおける2.3倍の増大、60日目での薬剤レベルにおける5.28倍の増大、90日目での薬剤レベルにおける12.13倍の増大、120日目での薬剤レベルにおける27.86倍の増大及び150日目での薬剤レベルにおける64倍の増大をもたらす。50%半減期を増大させること(例えば、5.0から7.5日)は、30日目での薬剤レベルにおける4倍の増大、60日目での薬剤レベルにおける16倍の増大、90日目での薬剤レベルにおける64倍の増大、120日目での薬剤レベルにおける>250倍の増大及び150日目での薬剤レベルにおける>1000倍の増大をもたらす。75%半減期を増大させること(例えば、5.0から7.5日)は、30日目での薬剤レベルにおける4倍の増大、60日目での薬剤レベルにおける16倍の増大、90日目での薬剤レベルにおける64倍の増大、120日目での薬剤レベルにおける>250倍の増大及び150日目での薬剤レベルにおける>1000倍の増大をもたらす。100%半減期を増大させること(例えば、5.0から10.0日)は、30日目での薬剤レベルにおける8倍の増大、60日目での薬剤レベルにおける64倍の増大、90日目での薬剤レベルにおける>500倍の増大、120日目での薬剤レベルにおける>4000倍の増大及び150日目での薬剤レベルにおける>32,000倍の増大をもたらす。
したがって、分子の眼における半減期を増大させるペプチドタグ(例えば、HA結合ペプチドタグ)は、眼における薬剤濃度(すなわち、最終薬剤濃度)を明らかに改善することができるため、効果の持続期間の増大及び延長した投与間隔をもたらすことができる。
12c:ペプチドタグは、半減期、効果の持続期間を増大させ、血漿暴露を低下させる
眼に送達される分子(すなわち、ペプチドタグ付き分子又はタグ付けされていない分子)の眼におけるクリアランス又は薬物動態は、標識化分子及び非侵襲的画像化技術、例えば、PET又は蛍光顕微法を使用して眼において直接的に、又は、眼内流体、例えば、硝子体及び眼房水を抽出して、当分野において公知の標準的なELISA、MSDアッセイもしくは質量分光法を使用して濃度を測定することにより測定し得る。眼に送達された分子について、全身性循環における前記分子の出現は、眼からのクリアランス速度により決まる。全身性循環におけるこのような分子の出現速度及び濃度は、眼における前記分子の薬物動態を決定するために使用され得る(Xu L et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 54(3): 1616-24 (2013))。
眼に送達される分子(すなわち、ペプチドタグ付き分子又はタグ付けされていない分子)の眼におけるクリアランス又は薬物動態は、標識化分子及び非侵襲的画像化技術、例えば、PET又は蛍光顕微法を使用して眼において直接的に、又は、眼内流体、例えば、硝子体及び眼房水を抽出して、当分野において公知の標準的なELISA、MSDアッセイもしくは質量分光法を使用して濃度を測定することにより測定し得る。眼に送達された分子について、全身性循環における前記分子の出現は、眼からのクリアランス速度により決まる。全身性循環におけるこのような分子の出現速度及び濃度は、眼における前記分子の薬物動態を決定するために使用され得る(Xu L et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 54(3): 1616-24 (2013))。
ペプチドタグ付き分子の眼における薬物動態を、眼におけるPK結合モデルを使用して、同様に評価及び予測し得る。このモデルにおいて、Fabは、特定のKon及びKoffレートで、少量の硝子体HAに結合する。HAに結合しなかった場合、前記Fabは、ラニビズマブと同じ速度(8.6日の半減期)で眼から出て、血清に入るであろう。カニクイザルのIVT試験からの最終硝子体濃度データに対するHA結合モデルの当てはめに基づいて、サルの硝子体HAの約15%が、前記Fabに結合していたことが推測された。
このモデルは、4.5mLのヒト硝子体におけるペプチドタグ付き分子(例えば、NVS2)の眼及び血清における薬物動態を予測するために使用することができ、前記Fabが、4:1のHAとFabの化学量論で、2×106M−1秒−1のKon及び1.7μMのKDで、ヒト硝子体HA(250μg/mL)の約5〜15%に結合すると仮定する。血清において、前記ペプチドタグ付き分子は、ラニビズマブと同じ全身性の体内動態を有するであろう。この結合モデルを使用して、前記タグ付きペプチド分子についての眼及び血清モデル予測を、他の抗VEGF分子、例えば、ラニビズマブ、アフリベルセプト及びベバシズマブと比較した。
ラニビズマブの眼−血清PKモデルは、Xu L et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 2013に基づくものであった。ベバシズマブの眼−血清PKモデルは、眼における9.82日の半減期(Krohne TU et al., Am J Ophthalmol, 146(4): 508-12 (2008))、生物学的利用能F=0.65〜0.95及びベバシズマブの臨床的薬理学レビュー、STN−12085/0に記載された全身性の体内動態に基づくものであった。アフリベルセプトモデルは、眼における約4日の半減期及び、Thai HT et al., Br J Clin Pharmacol, 72(3): 402-14 (2011)においてモデル化された全身性の体内動態を使用した。
この予測での眼における効果の持続期間は、各分子が、0.5mgのIVT投与後28日目におけるラニビズマブの眼における濃度に到達するのにかかる時間として定義された。前記ペプチドタグ付き分子のシミュレーションのエラーバーは、NVS2ぺプチドタグ付き分子についての予測範囲を示す。ペプチドタグ付き分子(例えば、NVS2)は、0.08mgの低IVT投与で、1ヶ月間の効果を達成すると予測される。前記ペプチドタググ付き分子は、0.5mgのラニビズマブより低い血清暴露も提供すると予測される。アフリベルセプトについての2ヶ月の持続期間を、アフリベルセプトのラベルに使用される投与間隔に基づいてプロットした。アフリベルセプトの血清予測は、前記アフリベルセプトのラベルに記載されているように、3q4w、続けて、q8wの投与後の遊離PKに対応する。
HA結合ペプチドタグを用いて分子(例えば、抗VEGFタンパク質)をタグ付けすることは、眼からのより遅いクリアランスをもたらす。より遅い眼におけるクリアランスは、全身性循環における前記ペプチドタグ付き分子の遅延した出現をもたらす。到達した最大血清濃度は、図14Eに図示されたように、ペプチドタグを含まない分子のそれより低い。ペプチドタグ付き分子(例えば、NVS2)の全身性暴露は、前記タグ付き及びタグ付けされていない分子が等モルの用量で投与された場合、タグ付けされていない分子(例えば、ラニビズマブ)より明らかに少ない。NVS2の血清濃度は、全ての等モル用量において、ラニビズマブの血清濃度より明らかに低い。同様の結果は、アフリベルセプトのタグ付き型(例えば、NVS80T)及びベバシズマブのタグ付き型(例えば、NVS81T)について期待され得る。
実施例13:HA結合ペプチドタグに結合した更なるタンパク質及び核酸の生成
眼におけるタンパク質又は核酸の半減期を延長させるHA結合ペプチドタグの能力を試験するために、本発明のペプチドタグを、各種の眼におけるタンパク質ターゲットと結合する、数多くの抗体、タンパク質及び核酸に結合させた。
眼におけるタンパク質又は核酸の半減期を延長させるHA結合ペプチドタグの能力を試験するために、本発明のペプチドタグを、各種の眼におけるタンパク質ターゲットと結合する、数多くの抗体、タンパク質及び核酸に結合させた。
ペプチドタグ付き抗体及びタンパク質の生成
タグ付き及びタグ付けされていない組換え抗体及びタンパク質を、HEK293細胞中の哺乳類発現ベクターの一過性導入により発現させ、標準的な親和性樹脂、例えば、Kappaselect(Cat#17−5458−01、GE Healthcare Biosciences(登録商標))及びHis Trap(Cat#17−5255−01、GE Healthcare Biosciences(登録商標))を使用して精製した。種々の型の抗体及びタンパク質、例えば、Fab、IgG、Fcトラップ及びタンパク質を試験した。これらの抗体及びタンパク質は、眼における複数のターゲット、例えば、C5、因子P、EPO、EPOR、TNFα、因子D、IL−1β、IL−17A、FGFR2又はIL−10をターゲットにする。
タグ付き及びタグ付けされていない組換え抗体及びタンパク質を、HEK293細胞中の哺乳類発現ベクターの一過性導入により発現させ、標準的な親和性樹脂、例えば、Kappaselect(Cat#17−5458−01、GE Healthcare Biosciences(登録商標))及びHis Trap(Cat#17−5255−01、GE Healthcare Biosciences(登録商標))を使用して精製した。種々の型の抗体及びタンパク質、例えば、Fab、IgG、Fcトラップ及びタンパク質を試験した。これらの抗体及びタンパク質は、眼における複数のターゲット、例えば、C5、因子P、EPO、EPOR、TNFα、因子D、IL−1β、IL−17A、FGFR2又はIL−10をターゲットにする。
上述したように、前記HA結合タグ配列を、GSGGGリンカー(例えば、配列番号31)を使用して、Fabの重鎖のC−末端に結合させることにより、1つのペプチドタグに結合したFabを生成した。ペプチドタグ付きIgG(例えば、HA結合タグ配列を含むIgG融合物)を生成するために、前記HA結合タグ配列を、GSGGGリンカー(例えば、配列番号31)を使用して、IgGの重鎖又は軽鎖のC−末端に融合した。Fc部分を含むペプチドタグ付きタンパク質、例えば、HA結合タグに結合したFcトラップタンパク質を生成するために、前記HA結合タグを、GSGGGリンカー(例えば、配列番号31)を使用して、前記タンパク質のFc部分のC−末端に結合させた。更なるペプチドタグ付きタンパク質を生成するために、前記HA結合タグを、GSGGGリンカー(例えば、配列番号31)を使用して、所望のタンパク質のC−末端に結合させた。上記された全ての場合において、候補の産生は、所望のタンパク質のアミノ酸をコードするヌクレオチドの合成、続けて、上記哺乳類の発現系を使用した発現及び精製を必要とする。
本願明細書に例示されたペプチドタグ付き抗体及びペプチド抗原結合フラグメントも、別の抗体型に変換及び使用され得る。例えば、ペプチドタグ付きIgGを、ペプチドタグ付きFab又はペプチドタグ付きscFvに変換することができ、逆もまた同じである。
ペプチドタグ付き核酸の生成
RNA又はDNAアプタマーを含む核酸は、以下に記載するように、HA結合ペプチドとコンジュゲートし得る。室温でのACN(体積:1.75mL)中のB−3−(2−カルボキシエチル)−1−(1−(2−ヒドラジニル−4−メチルペンタノイル)ピロリジン−2−イル)−6−(1−ヒドロキシエチル)−1,4,7,10−テトラオキソ−2,5,8,11−テトラアザトリデカン−13−オイック酸(198mg、0.280mmol)の溶液中に、DIPEA(0.098mL、0.559mmol)、及び、DMSO(体積:1.75mL)中のA−(3S,6S)−1−((S)−1−((S)−2−アミノ−4−メチルペンタノイル)ピロリジン−2−イル)−3−(2−カルボキシエチル)−6−((R)−1−ヒドロキシエチル)−1,4,7,10−テトラオキソ−2,5,8,11−テトラアザトリデカン−13−オイック酸(32mg、0.056mmol)の溶液を添加する。前記混合物を、室温で1時間攪拌し、ついで、Sunfine Prep C18を使用して、10から90% ACN−水+0.1% TFAにより溶出して精製し、27mgの純粋な所望の生成物である、C−(3S,6S)−3−(2−カルボキシエチル)−1−((S)−1−((S)−34−(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)−2−イソブチル−4,34−ジオキソ−7,10,13,16,19,22,25,28,31−ノナオキサ−3−アザテトラトリアコンタン−1−オイル)ピロリジン−2−イル)−6−((R)−1−ヒドロキシエチル)−1,4,7,10−テトラオキソ−2,5,8,11−テトラアザトリデカン−13−オイック酸を得た。D−ARC126−NH2(NaHCO3 pH8.5バッファー中の25mg/ml)の溶液(18.63mg、230μl、1.807μmol)に、C−(3S,6S)−3−(2−カルボキシエチル)−1−((S)−1−((S)−34−(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)−2−イソブチル−4,34−ジオキソ−7,10,13,16,19,22,25,28,31−ノナオキサ−3−アザテトラトリアコンタン−1−オイル)ピロリジン−2−イル)−6−((R)−1−ヒドロキシエチル)−1,4,7,10−テトラオキソ−2,5,8,11−テトラアザトリデカン−13−オイック酸(DMSO中の100mg/ml)(5.26mg、52.6μl、4.52μmol)を添加した。反応系を、室温で1.5時間攪拌する。粗生成物を、3K MW CO Amiconフィルタカラム(3K MWカットオフ)に通過させ、同時に、ソルターゼバッファー 0.1M Tris pH8.0+CaCl2 0.01M+NaCl 0.15Mにバッファー交換した。Tris 0.25M pH7.4+CaCl2 5mM及びNaCl 150mM(体積:313μL)中の、F−HAペプチドタグの溶液に、E(57.4μL、0.703μmol)を添加し、続けて、ビーズ上にソルターゼA(87μL、0.016μmol)を固定化した。前記混合物を、20℃で2日間振とうした。得られたアプタマー−HA結合ペプチドコンジュゲートを、NVS79Tとした。
RNA又はDNAアプタマーを含む核酸は、以下に記載するように、HA結合ペプチドとコンジュゲートし得る。室温でのACN(体積:1.75mL)中のB−3−(2−カルボキシエチル)−1−(1−(2−ヒドラジニル−4−メチルペンタノイル)ピロリジン−2−イル)−6−(1−ヒドロキシエチル)−1,4,7,10−テトラオキソ−2,5,8,11−テトラアザトリデカン−13−オイック酸(198mg、0.280mmol)の溶液中に、DIPEA(0.098mL、0.559mmol)、及び、DMSO(体積:1.75mL)中のA−(3S,6S)−1−((S)−1−((S)−2−アミノ−4−メチルペンタノイル)ピロリジン−2−イル)−3−(2−カルボキシエチル)−6−((R)−1−ヒドロキシエチル)−1,4,7,10−テトラオキソ−2,5,8,11−テトラアザトリデカン−13−オイック酸(32mg、0.056mmol)の溶液を添加する。前記混合物を、室温で1時間攪拌し、ついで、Sunfine Prep C18を使用して、10から90% ACN−水+0.1% TFAにより溶出して精製し、27mgの純粋な所望の生成物である、C−(3S,6S)−3−(2−カルボキシエチル)−1−((S)−1−((S)−34−(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)−2−イソブチル−4,34−ジオキソ−7,10,13,16,19,22,25,28,31−ノナオキサ−3−アザテトラトリアコンタン−1−オイル)ピロリジン−2−イル)−6−((R)−1−ヒドロキシエチル)−1,4,7,10−テトラオキソ−2,5,8,11−テトラアザトリデカン−13−オイック酸を得た。D−ARC126−NH2(NaHCO3 pH8.5バッファー中の25mg/ml)の溶液(18.63mg、230μl、1.807μmol)に、C−(3S,6S)−3−(2−カルボキシエチル)−1−((S)−1−((S)−34−(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)−2−イソブチル−4,34−ジオキソ−7,10,13,16,19,22,25,28,31−ノナオキサ−3−アザテトラトリアコンタン−1−オイル)ピロリジン−2−イル)−6−((R)−1−ヒドロキシエチル)−1,4,7,10−テトラオキソ−2,5,8,11−テトラアザトリデカン−13−オイック酸(DMSO中の100mg/ml)(5.26mg、52.6μl、4.52μmol)を添加した。反応系を、室温で1.5時間攪拌する。粗生成物を、3K MW CO Amiconフィルタカラム(3K MWカットオフ)に通過させ、同時に、ソルターゼバッファー 0.1M Tris pH8.0+CaCl2 0.01M+NaCl 0.15Mにバッファー交換した。Tris 0.25M pH7.4+CaCl2 5mM及びNaCl 150mM(体積:313μL)中の、F−HAペプチドタグの溶液に、E(57.4μL、0.703μmol)を添加し、続けて、ビーズ上にソルターゼA(87μL、0.016μmol)を固定化した。前記混合物を、20℃で2日間振とうした。得られたアプタマー−HA結合ペプチドコンジュゲートを、NVS79Tとした。
下線の配列は、記載された、クローニングに使用された更なる任意の配列(すなわち、GGGGG、配列番号187)、又は、精製法に使用された更なる任意の配列(例えば、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、HHHHHH、配列番号188)を示す。
実施例14:実施例13のペプチドタグ付きタンパク質及び核酸の更なる特徴付け
HA結合ペプチドタグと融合したタンパク質、Fcトラップ、全長抗体、DARPin及びscFvの結合親和性を、実施例7に記載したように、Biacoreにより測定した。
HA結合ペプチドタグと融合したタンパク質、Fcトラップ、全長抗体、DARPin及びscFvの結合親和性を、実施例7に記載したように、Biacoreにより測定した。
14a:Biacore親和性決定
ペプチドタグ付きタンパク質及びタグ付けされていない親タンパク質の親和性を、実施例7において上述したように、その主なターゲット(例えば、因子P、C5、TNFα、FGFR2、VEGF、因子D、EPO、IL−17、IL−10R)に対する反応速度及びHA結合性を決定するために、Biacoreにおいて分析した。HA反応速度を決定するために、ビオチン化HAを、ビオチン化HAが補捉され、サンプルタンパク質が、種々の濃度で流される、BIOCAP Biacoreフォーマットにおいて使用した。ビオチン化ターゲットリガンド及びビオチン化HAを、実施例7:Biacore親和性決定に記載された親和性測定に使用した。
ペプチドタグ付きタンパク質及びタグ付けされていない親タンパク質の親和性を、実施例7において上述したように、その主なターゲット(例えば、因子P、C5、TNFα、FGFR2、VEGF、因子D、EPO、IL−17、IL−10R)に対する反応速度及びHA結合性を決定するために、Biacoreにおいて分析した。HA反応速度を決定するために、ビオチン化HAを、ビオチン化HAが補捉され、サンプルタンパク質が、種々の濃度で流される、BIOCAP Biacoreフォーマットにおいて使用した。ビオチン化ターゲットリガンド及びビオチン化HAを、実施例7:Biacore親和性決定に記載された親和性測定に使用した。
抗Fab法を使用したターゲットの反応速度及び親和性:
抗Fab補捉法に対して、GE(登録商標)からのヒトFab Capture(登録商標)キットを使用した(GE 28958325)。より詳細な情報は、カタログ番号を参照のこと。この方法について、HBS−EP+ランニングバッファー(teknova H8022)を使用した。CM5チップ(GE(登録商標)、BR−1005−30)を使用して、これに、抗Fabポリクローナルを固定化し、GE(登録商標)のプロトコルに従って、約5,000RUを達成した。より詳細な情報を得るには、GE(登録商標)のウェブサイトにおいて、カタログ番号を参照のこと。2つのフローセルを、この方法に使用した。フローセル1は、固定化された抗Fab試薬のみを含んだ参照セルとして機能した。フローセル2は、抗fab試薬及びタンパク質サンプルの両方を含んだ結合セルとして機能した。この方法において試験された前記タンパク質サンプルは、C5、因子P及びEPOに対して特異的であった。前記タンパク質サンプルを、20のRmaxについてのRUシグナルを達成するために、10μl/分の流速で、特定の接触時間補捉した。タンパク質検体は、そのターゲットに対して強力な親和性を有するため、前記ターゲット検体の開始濃度は、約10nMで開始し、8回の連続希釈点を含み得る。前記ターゲット検体を、60μl/分で、サンプルに応じて、短くて240秒間〜長くて1000秒より長い解離時間で流した。
抗Fab補捉法に対して、GE(登録商標)からのヒトFab Capture(登録商標)キットを使用した(GE 28958325)。より詳細な情報は、カタログ番号を参照のこと。この方法について、HBS−EP+ランニングバッファー(teknova H8022)を使用した。CM5チップ(GE(登録商標)、BR−1005−30)を使用して、これに、抗Fabポリクローナルを固定化し、GE(登録商標)のプロトコルに従って、約5,000RUを達成した。より詳細な情報を得るには、GE(登録商標)のウェブサイトにおいて、カタログ番号を参照のこと。2つのフローセルを、この方法に使用した。フローセル1は、固定化された抗Fab試薬のみを含んだ参照セルとして機能した。フローセル2は、抗fab試薬及びタンパク質サンプルの両方を含んだ結合セルとして機能した。この方法において試験された前記タンパク質サンプルは、C5、因子P及びEPOに対して特異的であった。前記タンパク質サンプルを、20のRmaxについてのRUシグナルを達成するために、10μl/分の流速で、特定の接触時間補捉した。タンパク質検体は、そのターゲットに対して強力な親和性を有するため、前記ターゲット検体の開始濃度は、約10nMで開始し、8回の連続希釈点を含み得る。前記ターゲット検体を、60μl/分で、サンプルに応じて、短くて240秒間〜長くて1000秒より長い解離時間で流した。
HA結合ペプチドタグと結合した全てのFab及びタンパク質は、類似するHA結合親和性を示し、その主なターゲットに対する結合性を保持した(表10)。実際に、前記ペプチドタグの存在は、タグ付けされていない分子と比較して、分子の主なターゲット結合親和性を改善した(実施例15bを参照のこと。)。
HA結合ペプチドタグと結合した全てのFab及びタンパク質は、類似するHA結合親和性を示し、その主なターゲットに対する結合性を保持した(表10)。実際に、前記ペプチドタグの存在は、タグ付けされていない分子と比較して、分子の主なターゲット結合親和性を改善した(実施例15bを参照のこと。)。
14b:ウサギの従来の眼におけるPKの決定
ウサギの硝子体において、HA結合ペプチドタグに結合した抗体、Fcトラップ及びタンパク質の眼における最終濃度を、以下に記載され、図15及び表12に示すように、標準的な方法を使用して、そのタグ付けされていない型と比較した。
ウサギの硝子体において、HA結合ペプチドタグに結合した抗体、Fcトラップ及びタンパク質の眼における最終濃度を、以下に記載され、図15及び表12に示すように、標準的な方法を使用して、そのタグ付けされていない型と比較した。
5μg/眼(約105pモル)のタグ付けされていない抗体及び6.2μg/眼(約105pモル)のタグ付き抗体を、ウサギの眼の硝子体内に注入した(抗体あたりにN=6個の眼)。ウサギを、注入後21日目に屠殺し、眼を摘出した。前記摘出した眼を解剖し、硝子体を、他の組織から分離し、さらに、TissueLyzer(QIAGEN(登録商標))を使用して機械的にホモジナイズした。前記硝子体における抗体レベルを、ELISA又は質量分光法により測定した。
ELISA法
Maxisorp384ウェルプレート(Nunc464718)を、炭酸バッファー(Pierce28382)中のヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Thermo Fisher31119)で、4℃で一晩コートした。インキュベートの合間に、BioTekプレート洗浄器を使用して、TBST(THERMO SCIENTIFIC(登録商標)28360)でプレートを3回洗浄した。翌日、前記プレートを、TBS中のブロッキングバッファー(5% BSA(SIGMA(登録商標)A4503)、0.1% Tween−20(SIGMA(登録商標)P1379)、0.1% Triton X−100(SIGMA(登録商標)P234729)により、室温で2時間ブロッキングした。サンプルを、希釈剤(TBSにおける、2% BSA(SIGMA(登録商標)A4503)、0.1% Tween−20(SIGMA(登録商標)P1379)、0.1% Triton X−100(SIGMA(登録商標)P234729))中に希釈した。サンプルを、穏やかに振とうしながら、前記プレート上で室温において1時間インキュベートした。検出抗体を、HRPにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG[F(ab’)2](Thermo Fisher31414)とした。前記検出抗体を、穏やかに振とうしながら、前記プレートに室温で30分間添加した。Ultra TMBを、15分間添加した(Thermo Fisher34028)。反応を、2N 硫酸(Ricca8310−32)により停止させた。前記サンプルの吸光度を、SpectraMax(450〜570nm)上で読み取った。眼の組織からのFab回収レベルを逆算するために、精製した標準を使用した。前記標準について、使用した上限濃度を、2倍希釈による200ng/mLとした。異なる抗体ペアを、ウサギ組織からのFab回収に使用し得る。
Maxisorp384ウェルプレート(Nunc464718)を、炭酸バッファー(Pierce28382)中のヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Thermo Fisher31119)で、4℃で一晩コートした。インキュベートの合間に、BioTekプレート洗浄器を使用して、TBST(THERMO SCIENTIFIC(登録商標)28360)でプレートを3回洗浄した。翌日、前記プレートを、TBS中のブロッキングバッファー(5% BSA(SIGMA(登録商標)A4503)、0.1% Tween−20(SIGMA(登録商標)P1379)、0.1% Triton X−100(SIGMA(登録商標)P234729)により、室温で2時間ブロッキングした。サンプルを、希釈剤(TBSにおける、2% BSA(SIGMA(登録商標)A4503)、0.1% Tween−20(SIGMA(登録商標)P1379)、0.1% Triton X−100(SIGMA(登録商標)P234729))中に希釈した。サンプルを、穏やかに振とうしながら、前記プレート上で室温において1時間インキュベートした。検出抗体を、HRPにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG[F(ab’)2](Thermo Fisher31414)とした。前記検出抗体を、穏やかに振とうしながら、前記プレートに室温で30分間添加した。Ultra TMBを、15分間添加した(Thermo Fisher34028)。反応を、2N 硫酸(Ricca8310−32)により停止させた。前記サンプルの吸光度を、SpectraMax(450〜570nm)上で読み取った。眼の組織からのFab回収レベルを逆算するために、精製した標準を使用した。前記標準について、使用した上限濃度を、2倍希釈による200ng/mLとした。異なる抗体ペアを、ウサギ組織からのFab回収に使用し得る。
NVS90及びNVS90Tに対するELISA法
標準的な結合MSDプレート(Meso−Scale Discovery(登録商標)、384ウェル:MSD Cat.# L21XA)を使用し、コーティングバッファー(PBS)及びインキュベートバッファー(2% BSA(Sigma cat #A4503)及び0.1% Tween20及び0.1% Triton−X)を使用して、アッセイを行った。捕捉抗体であるEPO26(Cell Sciences、Cat #26G9C10)を、PBS(25μl)中の1μg/mlでコートし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー(0.05% Tween−20を含むPBS)中で3回洗浄し、25μlのインキュベートバッファーにより、RTで2時間ブロッキングした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。インキュベートバッファー中での硝子体希釈液を、前記プレートに添加し(25μl)、室温で60分間インキュベートした。ヒト組換えダルベポイエチンを、ダルベポイエチンサンプルについての標準(11096−26−7、A000123、5μg/mlで開始)として使用した。NVS90Tを、NVS90Tサンプルについての標準(5μg/mlで開始)として使用した。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。25μlの一次抗体を添加し(インキュベートバッファー中、1μg/ml)、室温で60分間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。25μlの抗種二次Sulfo−TAG抗体(MSD Cat #R32AJ−1)を添加し(インキュベートバッファーにおける1:1000)、RTで60分間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。25μlの1×MSD ReadバッファーTを添加した(界面活性剤を含む、MSD cat #R92TC−1)。プレートを、MSD Spector Imager6000(登録商標)上で読み取った。
標準的な結合MSDプレート(Meso−Scale Discovery(登録商標)、384ウェル:MSD Cat.# L21XA)を使用し、コーティングバッファー(PBS)及びインキュベートバッファー(2% BSA(Sigma cat #A4503)及び0.1% Tween20及び0.1% Triton−X)を使用して、アッセイを行った。捕捉抗体であるEPO26(Cell Sciences、Cat #26G9C10)を、PBS(25μl)中の1μg/mlでコートし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー(0.05% Tween−20を含むPBS)中で3回洗浄し、25μlのインキュベートバッファーにより、RTで2時間ブロッキングした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。インキュベートバッファー中での硝子体希釈液を、前記プレートに添加し(25μl)、室温で60分間インキュベートした。ヒト組換えダルベポイエチンを、ダルベポイエチンサンプルについての標準(11096−26−7、A000123、5μg/mlで開始)として使用した。NVS90Tを、NVS90Tサンプルについての標準(5μg/mlで開始)として使用した。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。25μlの一次抗体を添加し(インキュベートバッファー中、1μg/ml)、室温で60分間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。25μlの抗種二次Sulfo−TAG抗体(MSD Cat #R32AJ−1)を添加し(インキュベートバッファーにおける1:1000)、RTで60分間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。25μlの1×MSD ReadバッファーTを添加した(界面活性剤を含む、MSD cat #R92TC−1)。プレートを、MSD Spector Imager6000(登録商標)上で読み取った。
NVS78及びNVS78Tに対するELISA法
384ウェルのMaxisorp ELISAプレート(Thermo Scientific、464718)を使用し、炭酸−重炭酸コーティングバッファー(BuPHの炭酸−重炭酸バッファーパックを使用して調製、Thermo Scientific(登録商標)、28382)、ブロッキングバッファー(5% BSA(Sigma、A4503)を含むTBST)及び希釈バッファー(2% BSAを含むTBST)を使用して、アッセイを行った。ストレプトアビジン(Rockland(登録商標)、S000−01)を、コーティングバッファー(20μl/ウェル)中の1μg/mlにおいてコートし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー(0.05% Tween−20を含むPBS)中で3回洗浄し、ブロッキングバッファー(50μl/ウェル)により、RTで2時間ブロッキングした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。希釈剤中1μg/mlのhuEpo−ビオチン(Novartis)を、プレートに添加し(20μl/ウェル)、RTで1時間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。希釈剤中の硝子体希釈液を、前記プレートに添加した(20μl/ウェル)。EpoR又はEpoR−HA(Novartis)を、1μg/mlの濃度で開始する標準として使用した。プレートを、RTで1時間インキュベートする。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。20μlの検出抗体(ヤギ抗ヒトFc−HRP、Thermo Scientific(登録商標)、Cat #31413)を、前記プレートに添加し(希釈液中で1:5000)、RTで>30分間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。20μlの1工程 Ultra TMB基質溶液(Pierce(登録商標)、34028)を添加した。陽性のウェルにおいて溶液の色が暗青色に変わった場合、反応を停止させるために、10μlの2N 硫酸停止溶液(RICCA、8310−32)を、各ウェル内に添加する。プレートを、分光計プレートリーダ(Molecular Device(登録商標)、SpectroMax PLUS384)上で、OD450−570nmにおいて直ちに読み取った。
384ウェルのMaxisorp ELISAプレート(Thermo Scientific、464718)を使用し、炭酸−重炭酸コーティングバッファー(BuPHの炭酸−重炭酸バッファーパックを使用して調製、Thermo Scientific(登録商標)、28382)、ブロッキングバッファー(5% BSA(Sigma、A4503)を含むTBST)及び希釈バッファー(2% BSAを含むTBST)を使用して、アッセイを行った。ストレプトアビジン(Rockland(登録商標)、S000−01)を、コーティングバッファー(20μl/ウェル)中の1μg/mlにおいてコートし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー(0.05% Tween−20を含むPBS)中で3回洗浄し、ブロッキングバッファー(50μl/ウェル)により、RTで2時間ブロッキングした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。希釈剤中1μg/mlのhuEpo−ビオチン(Novartis)を、プレートに添加し(20μl/ウェル)、RTで1時間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。希釈剤中の硝子体希釈液を、前記プレートに添加した(20μl/ウェル)。EpoR又はEpoR−HA(Novartis)を、1μg/mlの濃度で開始する標準として使用した。プレートを、RTで1時間インキュベートする。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。20μlの検出抗体(ヤギ抗ヒトFc−HRP、Thermo Scientific(登録商標)、Cat #31413)を、前記プレートに添加し(希釈液中で1:5000)、RTで>30分間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー中で3回洗浄した。20μlの1工程 Ultra TMB基質溶液(Pierce(登録商標)、34028)を添加した。陽性のウェルにおいて溶液の色が暗青色に変わった場合、反応を停止させるために、10μlの2N 硫酸停止溶液(RICCA、8310−32)を、各ウェル内に添加する。プレートを、分光計プレートリーダ(Molecular Device(登録商標)、SpectroMax PLUS384)上で、OD450−570nmにおいて直ちに読み取った。
質量分光法
還元、アルキル化及び消化:
各ウェルにおける60μLの硝子体サンプルを、室温において10分間解凍した。50mM Tris−HCl(Fisher Scientific(登録商標)、BP153−500)中の150μlの8M 尿素(FisherScientific(登録商標)、Cat No.U15−500)を、各サンプルのウェルに添加し、続けて、40mM DTTの最終濃度に、4μLの2M DTT(SigmaAldrich(登録商標)、Cat No.D9779)を添加した。前記プレートを58℃で45分間加熱して、タンパク質を変性させた。その後、前記プレートを室温に冷却し、ついで、40mMの最終濃度にするために、8μLの1M ヨードアセトアミド(SigmaAldrich(登録商標)、Cat.No.I1149)を添加し、室温において暗所で45分間インキュベートする。1.3mLの50mM 重炭酸アンモニウム(Fisher Scientific(登録商標)、Cat.No.BP2413−500)を添加することにより、尿素の最終濃度を2M未満に希釈する。10μLの0.1μg/μL トリプシン(Promega(登録商標)、Cat.No.V5111)を添加し、37℃で一晩インキュベートした。
還元、アルキル化及び消化:
各ウェルにおける60μLの硝子体サンプルを、室温において10分間解凍した。50mM Tris−HCl(Fisher Scientific(登録商標)、BP153−500)中の150μlの8M 尿素(FisherScientific(登録商標)、Cat No.U15−500)を、各サンプルのウェルに添加し、続けて、40mM DTTの最終濃度に、4μLの2M DTT(SigmaAldrich(登録商標)、Cat No.D9779)を添加した。前記プレートを58℃で45分間加熱して、タンパク質を変性させた。その後、前記プレートを室温に冷却し、ついで、40mMの最終濃度にするために、8μLの1M ヨードアセトアミド(SigmaAldrich(登録商標)、Cat.No.I1149)を添加し、室温において暗所で45分間インキュベートする。1.3mLの50mM 重炭酸アンモニウム(Fisher Scientific(登録商標)、Cat.No.BP2413−500)を添加することにより、尿素の最終濃度を2M未満に希釈する。10μLの0.1μg/μL トリプシン(Promega(登録商標)、Cat.No.V5111)を添加し、37℃で一晩インキュベートした。
SPE浄化及びろ過:
消化後、ギ酸(Fluka、Cat.No.56302−50ML−F)を各サンプルに添加して、1%(v/v)の最終濃度とし、トリプシン消化を停止させる。Oasis(登録商標)MCXプレート(Waters、Cat.No.186000259)を使用して、消化サンプルを浄化した。浄化から収集したサンプル溶液を、SpeedVac(ThermoFisher Savant)を使用して、完全に乾燥させた。前記サンプルを一旦乾燥させ、60μLのバッファー(0.1% ギ酸、1% ACN(Sigma Aldrich、Cat.No.34998−4L)及び20pg/μLの重鎖標識内部標準(ThermoFisherにより特注)溶液を、各ウェルに添加した。前記プレートを、20分間振とうした。再構成ペプチド溶液を、10KDa MWCOを有する限外ろ過(Pall Life Scientific、Cat.No.8164)フィルタ用のAcroPrep(商標)advanced 96ウェルフィルタプレートを使用してろ過した。
消化後、ギ酸(Fluka、Cat.No.56302−50ML−F)を各サンプルに添加して、1%(v/v)の最終濃度とし、トリプシン消化を停止させる。Oasis(登録商標)MCXプレート(Waters、Cat.No.186000259)を使用して、消化サンプルを浄化した。浄化から収集したサンプル溶液を、SpeedVac(ThermoFisher Savant)を使用して、完全に乾燥させた。前記サンプルを一旦乾燥させ、60μLのバッファー(0.1% ギ酸、1% ACN(Sigma Aldrich、Cat.No.34998−4L)及び20pg/μLの重鎖標識内部標準(ThermoFisherにより特注)溶液を、各ウェルに添加した。前記プレートを、20分間振とうした。再構成ペプチド溶液を、10KDa MWCOを有する限外ろ過(Pall Life Scientific、Cat.No.8164)フィルタ用のAcroPrep(商標)advanced 96ウェルフィルタプレートを使用してろ過した。
LC−MS/MS分析:
5μLの各ろ過サンプルを、300μm×150mm Symmetry(登録商標)C18カラム(Waters(登録商標)、Cat.No.186003498)に負荷した。5μL/分の流速で、5% B(0.1% ギ酸におけるアセトニトリル)から20% Bの5分の勾配を適用することにより、分離を達成した。2つのペプチド(HC_T3:GPSVFPLAPSSK及びDDA2:TGIIDYGIR)ならびに、各ペプチドについての2つの転移(HC_T3:594.19/699.82及び594.19/847;DDA2:504.58/623.68及び504.58/736.84)を、Waters Xevo TQS質量分光計(Waters)を使用して、各サンプルについてモニターした。アイリーア及び、FNWYVDGVEVHNAK由来の2つの転移(560.28/697.76及び560.28/709.28)である構築物を含むアイリーアを、同じLCカラム及び条件を使用して、同じ質量分光計においてモニターした。これらのペプチドを含む薬剤分子を、これらの転移から生じるMSシグナルを使用して定量した。
5μLの各ろ過サンプルを、300μm×150mm Symmetry(登録商標)C18カラム(Waters(登録商標)、Cat.No.186003498)に負荷した。5μL/分の流速で、5% B(0.1% ギ酸におけるアセトニトリル)から20% Bの5分の勾配を適用することにより、分離を達成した。2つのペプチド(HC_T3:GPSVFPLAPSSK及びDDA2:TGIIDYGIR)ならびに、各ペプチドについての2つの転移(HC_T3:594.19/699.82及び594.19/847;DDA2:504.58/623.68及び504.58/736.84)を、Waters Xevo TQS質量分光計(Waters)を使用して、各サンプルについてモニターした。アイリーア及び、FNWYVDGVEVHNAK由来の2つの転移(560.28/697.76及び560.28/709.28)である構築物を含むアイリーアを、同じLCカラム及び条件を使用して、同じ質量分光計においてモニターした。これらのペプチドを含む薬剤分子を、これらの転移から生じるMSシグナルを使用して定量した。
Gyrolab法
サンプル調製
硝子体サンプルを、室温で10分間解凍した。ついで、5μLの硝子体サンプルを、96ウェルPCRプレート(Thermo Scientific(登録商標)AB−800、0.2mL Skirted 96ウェルPCRプレート)において、Rexxip ANバッファー(Gyros AB(登録商標),Inc、Cat P0004994)中に、1:2に希釈した。サンプルを密封し(Gyros AB(登録商標),Inc、マイクロプレートフォイル Cat P0003313)、プレートシェイカーにおいて、1分間完全に混合した。前記ウェルの底に泡が見出されないのを確保して、前記サンプルを、Gyrolab(商標)xPワークステーションに入れた。3工程C−A−D法を、Gyrolab(商標)xPワークステーション上で実行する。まず、前記システムに、捕捉抗体、続けて、検体(サンプル)、ついで、検出抗体を流す。Gyrolab(商標)xPワークステーションは、PBS 0.01% Tween20(Calbiochem(登録商標),Inc、Cat655206)の洗浄を、各工程間に行う。遊離したFc薬剤測定用の検量線を、Rexxip AN中の50% ウサギ硝子体(BioReclamation(登録商標),LLC、Cat Rabb−Vitreous)を含む希釈剤において作成した。前記標準を、6000ng/mLから0.129ng/mLに、1:6で連続希釈した。Fab薬剤測定用の検量線を、Rexxip AN中の10% ウサギ硝子体(BioReclamation(登録商標),LLC、Cat Rabb−Vitreous)を含む希釈剤において作成した。前記標準を、6000ng/mLから0.129ng/mLに、1:6の連続希釈をした。
サンプル調製
硝子体サンプルを、室温で10分間解凍した。ついで、5μLの硝子体サンプルを、96ウェルPCRプレート(Thermo Scientific(登録商標)AB−800、0.2mL Skirted 96ウェルPCRプレート)において、Rexxip ANバッファー(Gyros AB(登録商標),Inc、Cat P0004994)中に、1:2に希釈した。サンプルを密封し(Gyros AB(登録商標),Inc、マイクロプレートフォイル Cat P0003313)、プレートシェイカーにおいて、1分間完全に混合した。前記ウェルの底に泡が見出されないのを確保して、前記サンプルを、Gyrolab(商標)xPワークステーションに入れた。3工程C−A−D法を、Gyrolab(商標)xPワークステーション上で実行する。まず、前記システムに、捕捉抗体、続けて、検体(サンプル)、ついで、検出抗体を流す。Gyrolab(商標)xPワークステーションは、PBS 0.01% Tween20(Calbiochem(登録商標),Inc、Cat655206)の洗浄を、各工程間に行う。遊離したFc薬剤測定用の検量線を、Rexxip AN中の50% ウサギ硝子体(BioReclamation(登録商標),LLC、Cat Rabb−Vitreous)を含む希釈剤において作成した。前記標準を、6000ng/mLから0.129ng/mLに、1:6で連続希釈した。Fab薬剤測定用の検量線を、Rexxip AN中の10% ウサギ硝子体(BioReclamation(登録商標),LLC、Cat Rabb−Vitreous)を含む希釈剤において作成した。前記標準を、6000ng/mLから0.129ng/mLに、1:6の連続希釈をした。
Fabの検出
合計及び遊離した精製薬剤構築物を、Bioaffy1000 CD(Gyros AB,Inc、Cat P0004253)を使用して、Gyrolab(商標)xPワークステーションにおいて分析した。Gyros AB
合計及び遊離した精製薬剤構築物を、Bioaffy1000 CD(Gyros AB,Inc、Cat P0004253)を使用して、Gyrolab(商標)xPワークステーションにおいて分析した。Gyros AB
遊離した薬剤は、100μg/mLのビオチン−標識化VEGF(Novartis)を、ストレプトアビジンをコートした粒子を含むカラムに負荷することにより測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、25nM alexafluor−647標識化ヤギ抗ヒトIgG−重鎖及び軽鎖抗体(Bethyl Laboratories(登録商標)、Cat A80−319A)による毛管作用により検出した。alexafluor標識を、Life Technologiesの標識キット(Cat A−20186)を使用して行ったことに留意されたい。補捉試薬を、PBS 0.01% Tween20中で調製し、検出試薬を、Rexxip F(Gyros AB(登録商標),Inc、P0004825)中で調製した。
全ての薬剤を、100μg/mLのビオチン−標識化ヤギ抗ヒトIgG−重鎖及び軽鎖抗体(Bethyl Laboratories(登録商標)、Cat A80−319B)を適用することにより測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、10nM alexafluor−647標識化ヤギ抗ヒトIgG−重鎖及び軽鎖抗体(Bethyl Laboratories(登録商標)、Cat A80−319A)による毛管作用により検出した。
Fcタンパク質の検出
全ての遊離した精製薬剤構築物を、Bioaffy1000 CD(Gyros AB,Inc、Cat P0004253)を使用して、Gyrolab(商標)xPワークステーションにおいて分析した。100μg/mLのビオチン−標識化VEGF(Novartis)を、ストレプトアビジンをコートした粒子を含むカラムに負荷することにより、遊離した薬剤を測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、25nM alexafluor−647標識化抗ヒトFc−特異的抗体(R10、Novartis)による毛管作用により検出した。全ての薬剤を、25μg/mLのビオチン−標識化ヤギ抗ヒトIgG−重鎖及び軽鎖抗体(Bethyl Laboratories(登録商標)、Cat A80−319B)を適用することにより測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、12.5nM alexafluor−647標識化ヤギ抗ヒトIgG−重鎖及び軽鎖抗体(Bethyl Laboratories、Cat A80−319A)による毛管作用により検出した。
全ての遊離した精製薬剤構築物を、Bioaffy1000 CD(Gyros AB,Inc、Cat P0004253)を使用して、Gyrolab(商標)xPワークステーションにおいて分析した。100μg/mLのビオチン−標識化VEGF(Novartis)を、ストレプトアビジンをコートした粒子を含むカラムに負荷することにより、遊離した薬剤を測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、25nM alexafluor−647標識化抗ヒトFc−特異的抗体(R10、Novartis)による毛管作用により検出した。全ての薬剤を、25μg/mLのビオチン−標識化ヤギ抗ヒトIgG−重鎖及び軽鎖抗体(Bethyl Laboratories(登録商標)、Cat A80−319B)を適用することにより測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、12.5nM alexafluor−647標識化ヤギ抗ヒトIgG−重鎖及び軽鎖抗体(Bethyl Laboratories、Cat A80−319A)による毛管作用により検出した。
DARPinの検出
遊離した精製薬剤構築物を、Bioaffy1000 CD(Gyros AB,Inc、Cat P0004253)を使用して、Gyrolab(商標)xPワークステーションにおいて分析した。遊離した薬剤を、25μg/mLのビオチン−標識化VEGF(Novartis)を、ストレプトアビジンをコートした粒子を含むカラムに負荷することにより測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、6.25nM alexafluor−647標識化Penta HIS抗体(Qiagen(登録商標)、Cat35370)による毛管作用により検出した。
遊離した精製薬剤構築物を、Bioaffy1000 CD(Gyros AB,Inc、Cat P0004253)を使用して、Gyrolab(商標)xPワークステーションにおいて分析した。遊離した薬剤を、25μg/mLのビオチン−標識化VEGF(Novartis)を、ストレプトアビジンをコートした粒子を含むカラムに負荷することにより測定する。硝子体サンプルを、活性化カラムに負荷し、6.25nM alexafluor−647標識化Penta HIS抗体(Qiagen(登録商標)、Cat35370)による毛管作用により検出した。
HA結合ペプチドタグ(配列番号33)を抗原結合フラグメント(例えば、NVS70、NVS71、NVS72、NVS73、NVS74、NVS75、NVS76及びNVS77等)、Fcトラップタンパク質(NVS78及びNVS80等)、ならびに、タンパク質(NVS84及びNVS90等)に融合させることは、タグ付けされていないFab及びタンパク質と比較して、これらの分子の眼におけるより高い最終濃度をもたらした。これらのデータは、前記HA結合ペプチドタグの融合が、それが融合される分子とは無関係に、眼における半減期(t1/2)の改善を与えることを示す。その結果、HA結合ペプチドタグの融合は、硝子体内に投与された分子の、眼における保持及び眼における半減期を普遍的に増大させると考えられる。
14c:ウサギにおける効果の持続期間
VEGF結合生物製剤をHAと結合するように操作することが、注入後20日目での血管漏出を阻害し得たかどうかを評価するために、ウサギ漏出モデルを使用した(図15)。この試験では、HA結合ペプチドタグによりタグ付けされた種々の抗VEGF分子を、前記hVEGF負荷の18日前に、その各親分子と等モル用量で投与した。hVEGF負荷の48時間後に、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。タグ付けされていないタンパク質であるNVS80、NVS81、NVS82及びNVS84をHA結合ペプチドタグ(例えば、配列番号33)と融合させた、NVS80T、NVS81T、NVS82T及びNVS84Tは、そのタグ付けされていない親分子と比較して、20日目において有意な効果を有した。動物を画像化後のその日に屠殺し、眼を摘出し、処理し、(VEGFに結合しなかった)遊離した薬剤のレベルを、上述したように、Gyrolabにより測定した。NVS80T、NVS81T、NVS82T及びNVS84Tの遊離した最終硝子体濃度は、25ng/mlから2422ng/mlの範囲であり、そのタグ付けされていない親分子であるNVS80、NVS81、NVS82及びNVS84より、31〜220倍高かった(図15)。
VEGF結合生物製剤をHAと結合するように操作することが、注入後20日目での血管漏出を阻害し得たかどうかを評価するために、ウサギ漏出モデルを使用した(図15)。この試験では、HA結合ペプチドタグによりタグ付けされた種々の抗VEGF分子を、前記hVEGF負荷の18日前に、その各親分子と等モル用量で投与した。hVEGF負荷の48時間後に、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。タグ付けされていないタンパク質であるNVS80、NVS81、NVS82及びNVS84をHA結合ペプチドタグ(例えば、配列番号33)と融合させた、NVS80T、NVS81T、NVS82T及びNVS84Tは、そのタグ付けされていない親分子と比較して、20日目において有意な効果を有した。動物を画像化後のその日に屠殺し、眼を摘出し、処理し、(VEGFに結合しなかった)遊離した薬剤のレベルを、上述したように、Gyrolabにより測定した。NVS80T、NVS81T、NVS82T及びNVS84Tの遊離した最終硝子体濃度は、25ng/mlから2422ng/mlの範囲であり、そのタグ付けされていない親分子であるNVS80、NVS81、NVS82及びNVS84より、31〜220倍高かった(図15)。
これらのデータは、前記HA結合タグの融合が、それに融合される分子とは無関係に、眼における保持及び効果の持続期間の改善を付与することを示す。HA結合部分の付加は、全ての各親分子に対して、フルオレセイン阻害を増大させた。このため、硝子体における前記HAタグ付き構築物の量は、hVEGFを抑制し、血管漏出を妨げるのに十分であった。一方、タグ付けされていない分子の量は、そうではなかった。
効果の持続期間の増大は、眼においてヒアルロン酸に結合することが眼からのクリアランスを低下させ、後の時点における、より高いタンパク質レベル、及び、より長い持続期間のためのVEGFの抑制をもたらすことを示す。ヒトwet AMD患者では、VEGFレベルの抑制は、血管新生活動の再発を予防するために必須である。VEGFレベルの増大は、疾患活動の再発に関連する(Muether et al., 2012)。このため、HA結合抗VEGF抗体又はタンパク質によるwet AMD患者の処置は、修飾されていない抗VEGF抗体又はタンパク質と比較して、作用のより長い持続期間を有することが期待される。このため、効果を維持するが、投与頻度の低下を提供することにより患者に利益をもたらす。これらの実験は、本発明のHA結合ペプチドタグが、硝子体における抗VEGFタンパク質薬剤の、半減期を延長させ、最終濃度を増大させ、クリアランスを低下させ、平均滞留時間を増大させるために使用され得ることを示す。
14d:NVS1及びNVS1dについての、ウサギにおける20日目における効果の持続及び最終PK
2つのHA結合部分を有する分子(NVS1d)が、1つのタグ付き構築物(NVS1)に対して効果を増大させ得るかどうかを評価するために、ウサギ漏出モデルを使用した(図16)。VEGF量は、試験の期間を長くする必要なく、増大した半減期を有する分子を試験するために、試験群の半分において、400ng/眼から1200ng/眼に増加させた。等モル量のNVS1及びNVS1d(両方とも、5μg/眼のラニビズマブに等モル)を、前記hVEGF負荷の18日前に硝子体内に投与した。群の半分に、1200ng/眼のhVEGFを投与した。一方、残りに、先に記載した実施例のように、400ng/眼のhVEGFを投与した。hVEGF負荷の48時間後に、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。NVS1及びNVS1dは両方とも、400ng/眼のhVEGF注入による20日目において、同様の効果を達成した(85〜91%の漏出阻害)。1200ng/眼のhVEGFが負荷されたNVS1d群において、フルオレセイン漏出の有意な阻害を達成した(49%)。対照的に、1200ng/眼のhVEGFが負荷されたNVS1群は、有効ではなかった(−2%)。
2つのHA結合部分を有する分子(NVS1d)が、1つのタグ付き構築物(NVS1)に対して効果を増大させ得るかどうかを評価するために、ウサギ漏出モデルを使用した(図16)。VEGF量は、試験の期間を長くする必要なく、増大した半減期を有する分子を試験するために、試験群の半分において、400ng/眼から1200ng/眼に増加させた。等モル量のNVS1及びNVS1d(両方とも、5μg/眼のラニビズマブに等モル)を、前記hVEGF負荷の18日前に硝子体内に投与した。群の半分に、1200ng/眼のhVEGFを投与した。一方、残りに、先に記載した実施例のように、400ng/眼のhVEGFを投与した。hVEGF負荷の48時間後に、フルオレセイン漏出を、上記のように評価した。NVS1及びNVS1dは両方とも、400ng/眼のhVEGF注入による20日目において、同様の効果を達成した(85〜91%の漏出阻害)。1200ng/眼のhVEGFが負荷されたNVS1d群において、フルオレセイン漏出の有意な阻害を達成した(49%)。対照的に、1200ng/眼のhVEGFが負荷されたNVS1群は、有効ではなかった(−2%)。
一般的に、400ng/眼のhVEGFが負荷された、NVS1が注入されたウサギの、投与後18日目での最終硝子体濃度は、598〜953ng/mlの範囲であった。一方、400ng/眼のhVEGFが負荷された、NVS1dが注入されたウサギの、投与後18日目での最終硝子体濃度は、1048〜3054ng/mLの範囲であった。このため、硝子体におけるNVS1d量は、NVS1により達成された量と比較して、硝子体におけるhVEGF量の増加を抑制するのに十分であった。これらのデータは、HAに対して高い親和性を有する2つのHA結合ペプチドタグを含む抗体(NVS1d)は、1つのHA結合ペプチドタグのみを有する抗体(NVS1)と比較して、効果の有意に長い持続期間を有することを示す。
実施例15:HA結合ペプチドタグ付き分子の生物物理学的特性
15a:等電点及び溶解性の改善
前記HA結合タグを種々の種類のタンパク質(例えば、scFv、Fab、IgG及びFcトラップ)に結合させることは、全体的に、前記HA結合タグに結合した親タンパク質の等電点及び溶解性を増大させた。表14に、そのままのタグ付けされていないタンパク質の等電点を、前記HA結合ペプチドタグと結合した同じタンパク質の等電点とあわせて示す。
15a:等電点及び溶解性の改善
前記HA結合タグを種々の種類のタンパク質(例えば、scFv、Fab、IgG及びFcトラップ)に結合させることは、全体的に、前記HA結合タグに結合した親タンパク質の等電点及び溶解性を増大させた。表14に、そのままのタグ付けされていないタンパク質の等電点を、前記HA結合ペプチドタグと結合した同じタンパク質の等電点とあわせて示す。
前記HA結合ペプチドタグは、その主なターゲット/リガンドに対する前記タンパク質の親和性も増大させる。表15は、前記HA結合タグに結合したこれらの同じタンパク質の親和性と比較した、その主なターゲット/リガンドに対する種々のタンパク質の親和性を示す。驚くべきことに、前記HA結合タグに結合したタンパク質は、前記HA結合タグを含まない親タンパク質と比較して、主な眼のタンパク質ターゲット/リガンドに対する親和性において、1.2〜75倍の増大を有した。
15b:眼におけるターゲットとの結合
15b:眼におけるターゲットとの結合
これらの結果は、HAと結合するペプチドタグを抗原結合フラグメント、全長抗体、Fcトラップ、DARPin、scFv及びタンパク質に結合させることが、その主なターゲット、例えば、VEGFに対する、そのタンパク質分子の親和性を増大させることを明らかに示す。これは、これらの抗VEGFタンパク質のターゲット結合領域から空間的に完全に離れている前記HA結合ペプチドタグとしての予期しなかった特性である。
実施例16:I−124標識化ラニビズマブ及びHAタグ付き抗体のラットにおける生体分布
ラニビズマブ及び本発明のHA結合ペプチドによりタグ付けされた抗体(NVS1)の生体分布を、以下に記載するように、I−124標識化タンパク質を使用して測定した。その結果は、前記HA結合ペプチドタグが、眼球外の環境におけるクリアランスへの何らの明らかな影響も及ぼすことなく、眼における治療の作用の持続期間を延長させるのに有用であることを示す。
ラニビズマブ及び本発明のHA結合ペプチドによりタグ付けされた抗体(NVS1)の生体分布を、以下に記載するように、I−124標識化タンパク質を使用して測定した。その結果は、前記HA結合ペプチドタグが、眼球外の環境におけるクリアランスへの何らの明らかな影響も及ぼすことなく、眼における治療の作用の持続期間を延長させるのに有用であることを示す。
ラットの眼に注入された前記タンパク質の放射線標識化を、ヨードゲン法(1)を使用して行った。前記方法は、ヨードゲンコートチューブ(Thermo Scientific、Rockford、IL)を使用する。典型的には、>85%の放射線標識効率及び約7mCi/mgの比放射能を達成した。硝子体内(IVT)注入用ラットを準備するために、動物を、3% イソフルランガスで麻酔した。ついで、眼を、2滴のシクロペントレート(1%の好ましい濃度)及び2.5〜10% フェニルエフリンにより拡張させた。1滴の局所麻酔剤も塗布した(0.5% プロパラカイン)。解剖顕微鏡下において、30ゲージのニードルで、角膜の輪郭の下4mmを、眼の中央に向かう角度で切開した。ついで、放射線標識したタンパク質を含む鈍端のハミルトンシリンジ(例えば、33ゲージ)を、この開口から硝子体腔内に挿入し、約3.5μLの放射線標識化タンパク質を注入した。前記眼を、出血又は白内障について試験した。ついで、その手順を、もう一方の眼に繰り返した。ラットの眼内に前記放射線標識化タンパク質を注入した直後に、麻酔した動物を、その腹部を上にして、予熱したPET画像化ベッドに寝かせた。前記ベッドに、ノーズコーンによりガス麻酔を供給した。ついで、固定及び確保された動物を、動物の胸部下に置かれた呼吸センサを使用してモニターされる生体機能(例えば、呼吸)についてのスキャナに移動させた。I−124標識化ラニビズマブを注入した動物について、動物を、心臓穿刺、失血及び頸椎脱臼により、IVT注入後72時間で安楽死させた。眼及び他の臓器/組織(血液、肝臓、脾臓、腎臓、胃、肺、心臓、筋肉及び骨)を解剖し、ガンマカウンターにおいて、残存する放射能をカウントした。カウントを、カウントした組織/臓器の% 注入用量/グラム(% ID/g)に変換した。I−124標識化HAタグ付き抗体(NVS1)を注入した動物について、動物を、心臓穿刺、失血及び頸椎脱臼により、IVT注入後72時間で安楽死させた。眼及び他の臓器/組織(血液、肝臓、脾臓、腎臓、胃、肺、心臓、筋肉及び骨)を解剖し、ガンマカウンターにおいて、残存する放射能をカウントした。カウントを、カウントした組織/臓器の% 注入用量/グラム(% ID/g)に変換した。
最後のPET/CT画像化時点直後に、ラットを安楽死させ、血液を、心臓穿刺により収集した。臓器及び組織に捕捉された血液関連放射能量を減らすために、血液を、前記動物から取り除いた。個々の臓器及び組織、例えば、左目、右目、血液、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、筋肉、胃、骨及び脳を解剖し、秤量し、I−124についての適切なエネルギーウインドウ(350〜750keV)に設定したガンマカウンターにおいて、残存する放射能をカウントした。ガンマ線カウントについての2つの標準を、各眼及び両眼における注入用量の1/100希釈液を調製することにより調製した。標準は、1分あたりのカウント数(cpm)及び各眼に注入されたcpmに関して、前記動物に注入された合計活性を算出するために使用した。2つの生理食塩水充填チューブを、ガンマカウンターにおいて計測して、バックグラウンド活性を取得した。バックグラウンドcpmを、前記組織のcpmから差し引いた。ついで、バックグラウンドを差し引いたcpmを、注入のタイミングに対して減衰補正し、合計注入cpmで割り、100を掛けて、%注入用量(% ID)を算出した。前記減衰補正された各眼におけるcpmを、その眼に注入されたcpmで割り、100を掛けて、その眼における% IDを算出した。% ID/グラムを算出するために、各算出% IDを、対応する組織/臓器の重量で割った。以下の参照には、% ID/gの算出がより詳細に記載されている:Yazaki PJ, et al. 2001。
結果及びまとめ:
放射線標識化され、IVT投与されたラニビズマブ及びNVS1の生体分布を、ガンマカウンターを使用して評価した(図17)。I−124標識化ラニビズマブのIVT後72時間において、前記注入用量の約1.4%が、眼において測定された。対照的に、I−124標識化HAタグ付き抗体のIVT後166時間において、前記注入用量の約11%が、眼において測定された。このことは、ラニビズマブと比較して、HA結合ペプチドタグ付き抗体の10倍以上高い眼における保持を示す。分析した残りの眼以外の組織において、類似する量のラニビズマブ及び前記HA結合ペプチドタグ付き抗体の両方が、眼の外部において測定された。このことは、ラニビズマブと比較して、前記HA結合ペプチドタグ付き抗体の眼球外保持において、明らかな差がないことを示す。これらのデータは、I−124標識化ペプチドタグ付き分子が、タグ付けされていない分子と比較して、明らかにより高い眼における保持、より低い眼におけるクリアランス及び増大した最終的な眼における濃度を有するという、驚くべき発見を示す。ただし、前記HA結合ペプチドタグの半減期延長効果は、眼の外部では見られなかった。
参考文献
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放射線標識化され、IVT投与されたラニビズマブ及びNVS1の生体分布を、ガンマカウンターを使用して評価した(図17)。I−124標識化ラニビズマブのIVT後72時間において、前記注入用量の約1.4%が、眼において測定された。対照的に、I−124標識化HAタグ付き抗体のIVT後166時間において、前記注入用量の約11%が、眼において測定された。このことは、ラニビズマブと比較して、HA結合ペプチドタグ付き抗体の10倍以上高い眼における保持を示す。分析した残りの眼以外の組織において、類似する量のラニビズマブ及び前記HA結合ペプチドタグ付き抗体の両方が、眼の外部において測定された。このことは、ラニビズマブと比較して、前記HA結合ペプチドタグ付き抗体の眼球外保持において、明らかな差がないことを示す。これらのデータは、I−124標識化ペプチドタグ付き分子が、タグ付けされていない分子と比較して、明らかにより高い眼における保持、より低い眼におけるクリアランス及び増大した最終的な眼における濃度を有するという、驚くべき発見を示す。ただし、前記HA結合ペプチドタグの半減期延長効果は、眼の外部では見られなかった。
参考文献
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Claims (42)
- ヒアルロナン(HA)と結合するペプチドタグであって、前記ペプチドタグが、
a)配列番号33、配列番号34、配列番号35及び配列番号36;又は、
b)配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36の配列の95個の連続するアミノ酸、
からなる群から選択される配列を含む、ペプチドタグ。 - タンパク質又は核酸に結合している請求項1記載のペプチドタグを含むペプチドタグ付き分子。
- 前記ペプチドタグが、N末端及び/又はC末端で前記タンパク質に結合しているか、あるいは、前記核酸の5’及び/又は3’末端に結合している、請求項2記載のペプチドタグ付き分子。
- 前記ペプチドタグが、前記タンパク質又は核酸に直接結合している、請求項2又は3記載のペプチドタグ付き分子。
- 前記ペプチドタグが、前記タンパク質又は核酸に、リンカーを介して間接的に結合している、請求項2又は3記載のペプチドタグ付き分子。
- 前記タンパク質が、
a)単離された抗体もしくはその抗原結合フラグメント;
b)治療用タンパク質、
c)タンパク質受容体、又は、
d)設計アンキリン反復タンパク質(darpin)
である、請求項2から5のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。 - 前記核酸が、アプタマーである、請求項2又は3記載のペプチドタグ付き分子。
- 前記分子が、VEGF、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL−1β、IL−17A、Il−10、TNFα又はFGFR2と結合するタンパク質である、請求項2から5のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
- 前記分子が、PDGF−BBと結合する核酸である、請求項2、3、4、5又は7のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
- 前記分子が、
a)VEGFと結合し、それぞれ配列番号1、2及び3の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号11、12及び13の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含むか;又は、
b)C5と結合し、それぞれ配列番号37、38及び39の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号46、47及び48の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含むか;又は、
c)因子Pと結合し、それぞれ配列番号53、54及び55の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号65、66及び67の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含むか;又は、
d)EPOと結合し、それぞれ配列番号75、76及び77の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号86、87及び88の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含むか、又は、
e)TNFαと結合し、それぞれ配列番号108、109及び110の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号117、118及び119の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含むか、又は、
f)IL−1βと結合し、それぞれ配列番号189、190及び191の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号198、199及び200の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含む、
単離された抗体又は抗原結合フラグメントである、請求項6記載のペプチドタグ付き分子。 - 前記分子が、
a)それぞれ配列番号7及び配列番号17;又は、
b)それぞれ配列番号40及び配列番号49;又は、
c)それぞれ配列番号59及び配列番号71;又は、
d)それぞれ配列番号81及び配列番号92;又は、
e)それぞれ配列番号111及び配列番号120;又は、
f)それぞれ配列番号193及び配列番号201
の配列を有する可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを含む、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項10記載のペプチドタグ付き分子。 - 前記分子が、
a)それぞれ配列番号9及び配列番号19;又は、
b)それぞれ配列番号42及び配列番号51;又は、
c)それぞれ配列番号61及び配列番号73;又は、
d)それぞれ配列番号83及び配列番号95;又は、
e)それぞれ配列番号113及び配列番号122;又は、
f)それぞれ配列番号194及び配列番号202
の、重鎖及び軽鎖の配列を含む、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項10又は11記載のペプチドタグ付き分子。 - a)配列番号21及び19;又は、
b)配列番号23及び19;又は、
c)配列番号25及び19;又は、
d)配列番号27及び19;又は、
e)配列番号29及び19;又は、
f)配列番号44及び51;又は、
g)配列番号63及び73;又は、
h)配列番号85及び95;又は、
i)配列番号115及び122;又は、
j)配列番号196及び202
の配列を含む、請求項10記載のペプチドタグ付き分子。 - 請求項2から13のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子と、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又はキャリアとを含む、組成物。
- 眼内送達用に配合された、請求項14記載の組成物。
- 12mg/眼の前記ペプチドタグ付き分子を含む、請求項14又は15記載の組成物。
- 請求項1記載のペプチドタグをコードする核酸。
- 請求項2から13のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子をコードする核酸。
- 請求項17又は18記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項19記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、哺乳類の細胞株である、請求項20記載の宿主細胞。
- 請求項20又は21記載の宿主細胞を、前記ペプチドタグ又は前記ペプチドタグ付き分子を産生するのに適切な条件下において培養することと、前記ペプチドタグ又は前記ペプチドタグ付き分子を単離することとを含む、
請求項1記載のペプチドタグ又は請求項2から13のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子を製造するための方法。 - 医薬として使用するための、請求項2から13のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
- 眼用の医薬として使用するための、請求項2から13のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
- 対象における網膜血管疾患に関連する状態又は障害の処置において使用するための、請求項2から13のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
- 血管新生性加齢黄斑変性(wet AMD)、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症からなる群から選択される状態又は障害の処置において使用するための、請求項25記載のペプチドタグ付き分子。
- 医薬として使用するための、請求項14から16のいずれか一項に記載の組成物。
- 眼用の医薬として使用するための、請求項27記載の組成物。
- 対象における網膜血管疾患に関連する状態又は障害の処置において使用するための、請求項27又は28記載の組成物。
- 対象において、眼の状態又は障害を処置する方法であって、
前記対象に、請求項14から16のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、
方法。 - 対象において、網膜血管疾患に関連する状態又は障害を処置する方法であって、
前記対象に、請求項14から16のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。 - 前記網膜血管疾患に関連する状態又は障害が、血管新生性加齢黄斑変性(wet AMD)、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症である、請求項29記載の組成物又は請求項30もしくは31記載の方法。
- 対象における黄斑浮腫に関連する状態又は障害の処置において使用するための、請求項2から13のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子。
- 対象における黄斑浮腫に関連する状態又は障害の処置において使用するための、請求項14から16のいずれか一項に記載の組成物。
- 対象において、黄斑浮腫に関連する状態又は障害を処置する方法であって、
前記対象に、請求項2から13のいずれか一項に記載のペプチドタグ付き分子を投与することを含む、方法。 - 対象において、黄斑浮腫に関連する状態又は障害を処置する方法であって、
前記対象に、請求項14から16のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。 - 前記黄斑浮腫に関連する状態又は障害が、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、血管新生性加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症、多病巣性脈絡膜炎、近視の脈絡膜血管新生又は未熟児網膜症である、請求項33もしくは34記載の組成物又は請求項35もしくは36記載の方法。
- 対象におけるVEGF媒介性障害の処置において使用するための、抗VEGF抗体又はその抗原結合フラグメントに結合している請求項1記載のペプチドタグを含む組成物。
- 対象において、VEGF媒介性障害を処置する方法であって、
前記対象に、抗VEGF抗体又はその抗原結合フラグメントに結合している請求項1記載のペプチドタグを含む組成物を投与することを含む、方法。 - 前記抗VEGF抗体又はその抗原結合フラグメントが、それぞれ配列番号1、2及び3の重鎖CDR1、2及び3の配列、ならびに、それぞれ配列番号11、12及び13の軽鎖CDR1、2及び3の配列を含む、請求項38記載の組成物又は請求項39記載の方法。
- 前記対象におけるVEGF媒介性障害が、加齢黄斑変性、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、後水晶体線維形成、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫(例えば、脳腫瘍に関連するもの)、メーグス症候群、関節リウマチ、乾癬及びアテローム硬化症である、請求項38から40のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
- ペプチドタグ付き分子を製造する方法であって、該方法は、請求項1記載のペプチドタグを、タンパク質又は核酸に結合させることを含む、方法。
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