CN113713107B

CN113713107B - miRNA552簇的微小RNA在治疗糖脂代谢病中的应用

Info

Publication number: CN113713107B
Application number: CN202010456825.XA
Authority: CN
Inventors: 任进; 陈静; 范磊; 侯蕾; 邢国振; 戚新明; 许啸鼎; 虞楚薇
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2040-05-26
Also published as: CN113713107A

Abstract

本发明提供了miRNA552簇的微小RNA在治疗糖脂代谢病中的应用。具体地，miRNA552簇的微小RNA能够作为FXR激动剂和LXRα拮抗剂在细胞与动物水平调控糖脂代谢紊乱，体现在抑制高血脂、高血糖、肝脂蓄积和缓解胰岛素抵抗方面。基于此，miRNA552簇的微小RNA可以用于治疗糖脂代谢病。

Description

miRNA552簇的微小RNA在治疗糖脂代谢病中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域。具体地，涉及miRNA552簇的微小RNA在治疗糖脂代谢病中的应用。

背景技术

糖脂代谢病(Glucolipid metabolic diseases,GLMD)是指糖脂代谢紊乱所引起的一类代谢综合征，主要包括肥胖、2型糖尿病、高血压、高血脂、非酒精性脂肪性肝病和动脉粥样硬化等。这类疾病发病机制复杂，影响人群广泛，且造成社会经济负担巨大，因此针对GLMD治疗药物的开发是研究热点。目前糖脂代谢损伤作为引起这类疾病的核心风险因素是受到大家公认的，因此治疗药物的研究方向也多集中于此(Chin J Integr Med.2017；23(6):410-414)。

法尼醇X受体(Farnesoid X receptor，FXR)属于代谢性核受体家族成员之一，受内源性胆汁酸配体激活与维甲酸X受体(Retinoid X receptor，RXR)形成异源二聚体结合在FXR响应元件(FXR response element，FXRE)上启动或抑制下游基因转录，例如：小异二聚体配体(Small Heterodimer Partner，SHP)、载脂蛋白B(apolipoproteinB，ApoB)等从而调控脂类、胆固醇和葡萄糖的代谢[Physiol Rev.2009；89(1):147-91]。目前，在研的FXR激动剂多用于原发性胆汁性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪肝等疾病的治疗[Expert Opin Ther Pat.2018；28(5):351-364]。

肝X受体α(Liver X receptorα，LXRα)属于代谢性核受体家族成员之一，受氧化固醇激活与RXR异源二聚体结合在LXR响应元件(LXR response element，LXRE)上启动下游基因转录，例如：硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(Stearoyl-CoA desaturase 1，SCD-1)、葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)等从而调控脂类、胆固醇和葡萄糖的代谢[CurrOpin Pharmacol.2010；10(6):692-7]。肝特异性的LXRα拮抗剂可用于脂肪肝和改善胰岛素抵抗[Nat Rev Drug Discov.2014；13(6):433-44]。

总结来说，FXR和LXRα作为糖脂代谢调节的潜在靶点已被应用于糖脂代谢病的药物开发研究中。

发明内容

本发明提供了一种能够调控FXR和LXRα对下游糖脂代谢基因转录调节作用的miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA可在体内和体外抑制高血脂、高血糖、肝脂蓄积和缓解胰岛素抵抗，从而治疗糖脂代谢病。

在本发明的第一方面，提供了一种miRNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂的用途，所述的miRNA为miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，用于：

(i)制备FXR激动剂和/或LXRα拮抗剂的药物组合物；和/或

(ii)制备治疗糖脂代谢病的药物组合物；

其中，所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：

(a1)5’-(a)_0-1(N)_1-3(F)_0-1c(g)_0-1(B)_0-1g(a)_0-1(D)_0-1(u)_1-2(N)_3-5(E)_0-1N_2-4(E)_0-1(N)_0-1(F)_0-1(N)_4-5(E)_0-1(N)_0-1-3’；

(a2)5’-(a)_0-1(N)_0-1(H)_0-1(N)_0-2(c)_0-1(I)_0-1(B)_0-1(g)_0-1(a)_0-1(D)_0-1(J)_0-1(N)_8-9(F)_0-1(N)_2-3(K)_0-1(N)_1-3H(N)_0-1-3’；

其中，B为a或c，D为a或g，E为a、g或c，F为a、g或u，H为u、g或c，I为g或c，J为a或u，K为a、u或c，N为a、g、u或c；

并且(a)_0-1表示0或1个a，(N)_1-3表示1、2或3个N，(F)_0-1表示0或1个F，(g)_0-1表示0或1个g，(B)_0-1表示0或1个B，(D)_0-1表示0或1个D，(u)_1-2表示1或2个u，(N)_3-5表示3、4或5个N，(E)_0-1表示0或1个E，(N)_0-1表示0或1个N，(N)_4-5表示4或5个N，(H)_0-1表示0或1个H，(N)_0-2表示0、1或2个N，(c)_0-1表示0或1个c，(I)_0-1表示0或1个I，(J)_0-1表示0或1个J，(N)_8-9表示8或9个I，(N)_2-3表示2或3个N，(K)_0-1表示0或1个K。

在另一优选例中，所述miR-552-3p为hsa-miR-552-3p，其序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述的miR-552-3p衍生序列可用于制备FXR激动剂的药物组合物，具有如SEQ ID NO:3-6、8-10、12、15-20、22-26、30-36、40、46、51、54-70、72-82、84-88、90-119、125、129、135-169中任一所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的miR-552-3p衍生序列可用于制备LXRα拮抗剂的药物组合物，具有如SEQ ID NO:3-6、8-13、15-20、22-24、26、31-37、40-41、46、50-51、54-88、90-119、125、129、132-165、167-169中任一所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的miR-552-3p衍生序列可用于制备FXR激动剂和LXRα拮抗剂的药物组合物，具有如SEQ ID NO:3-6、8-10、12、15-20、22-24、26、31-36、40、46、51、54-70、72-82、84-88、90-119、125、129、135-165、167-169中任一所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的miR-552-3p衍生序列为将miR-552-3p核苷酸序列(如SEQID NO:1)进行单碱基缺失、插入和/或替换形成的衍生序列，且所述miR-552-3p衍生序列作为FXR激动剂不包括选自下组的核苷酸序列：如SEQ ID NO:7、11、13-14、21、27-29、37-39、41-45、47-50、52-53、71、83、89、120-124、126-128、130-134所示的序列；所述miR-552-3p衍生序列作为LXRα拮抗剂不包括选自下组的核苷酸序列：如SEQ ID NO:7、14、21、25、27-30、38-39、42-45、47-49、52-53、89、120-124、126-128、130-131、166所示的序列。

在另一优选例中，所述miRNA552簇的微小RNA来源于哺乳动物，优选地，来源于人或非人哺乳动物(如猴、猩猩)。

在另一优选例中，所述miRNA552簇的微小RNA包括分离的或人工合成的。

在另一优选例中，所述的经修饰的衍生物包括miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列的经修饰的衍生物，其修饰选自下组的一种或多种修饰形式：核苷酸的糖基修饰、核苷酸之间连接方式的修饰、胆固醇修饰、锁核苷酸修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、烃基修饰、和核酸修饰。

在另一优选例中，所述的核苷酸的糖基修饰包括2-O-甲基的糖基修饰、2-O-甲氧乙酯的糖基修饰、2-O-烷基的糖基修饰、2-氟代的糖基修饰、糖环修饰、锁核苷酸修饰；和/或

所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、磷酸烷基化修饰；和/或

所述的核酸修饰包括“TT”修饰。

在另一优选例中，所述经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：

(X)_n-(Y)_m 式I，

在式I中，

各X为所述的微小RNA；

各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；

Y连接于X的左侧、右侧或中间；

n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；

m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；

各“-”表示接头、化学键、或共价键。

在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。

在另一优选例中，所述的Y包括(但不限于)胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。

在另一优选例中，所述的前体序列选自下组：

(a)能够在宿主内被加工成所述的微小RNA的前体miRNA；或

(b)能被宿主转录形成所述的前体miRNA，并加工形成所述的微小RNA的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的前体miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式II，

式II中，

Seq_正向为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

在另一优选例中，所述的表达载体用于表达所述的miRNA552簇的微小RNA或其前体miRNA。

在另一优选例中，所述的表达载体含有所述miRNA552簇的微小RNA、或其前体miRNA、或能被宿主转录形成所述前体miRNA的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达载体包括：病毒载体和非病毒载体。

在另一优选例中，所述的表达载体为质粒。

在另一优选例中，所述微小RNA的激动剂选自下组：促进miRNA552簇的微小RNA表达的物质、提高miRNA552簇的微小RNA活性的物质。

在另一优选例中，所述的糖脂代谢病是指糖脂代谢紊乱所引起的一类代谢综合征。

在另一优选例中，所述的糖脂代谢病选自下组：肥胖、2型糖尿病、高血压、高血脂、非酒精性脂肪性肝病、动脉粥样硬化、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括(a)miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂；以及(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有第二活性成分，且所述的第二活性成分选自下组：治疗肥胖、2型糖尿病、高血压、高血脂、非酒精性脂肪性肝病、动脉粥样硬化的药物、或其组合。

在另一优选例中，所述治疗肥胖、2型糖尿病、高血压、高血脂、非酒精性脂肪性肝病、动脉粥样硬化的药物选自下组：胰岛素、双胍类药物、促胰岛素分泌药、胰岛素增敏剂、肠促胰岛素类药、α-葡萄糖苷酶抑制剂、钠–葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂、他汀类药物、贝特类药物、胆碱螯合剂、烟酸及其衍生物、胆固醇吸收抑制剂、胆酸类、PCSK9抑制剂、或其组合。

本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：

(i)第一活性成分，所述第一活性成分为miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂：其中，所述的miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，

其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：

并且(a)_0-1表示0或1个a，(N)_1-3表示1、2或3个N，(F)_0-1表示0或1个F，(g)_0-1表示0或1个g，(B)_0-1表示0或1个B，(D)_0-1表示0或1个D，(u)_1-2表示1或2个u，(N)_3-5表示3、4或5个N，(E)_0-1表示0或1个E，(N)_0-1表示0或1个N，(N)_4-5表示4或5个N，(H)_0-1表示0或1个H，(N)_0-2表示0、1或2个N，(c)_0-1表示0或1个c，(I)_0-1表示0或1个I，(J)_0-1表示0或1个J，(N)_8-9表示8或9个I，(N)_2-3表示2或3个N，(K)_0-1表示0或1个K；

(ii)第二活性成分，所述第二活性成分不同于第一活性成分，且所述的第二活性成分选自下组：治疗肥胖、2型糖尿病、高血压、高血脂、非酒精性脂肪性肝病、动脉粥样硬化的药物、或其组合；和

(iii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液体剂型，优选地为注射剂，更优选为静脉注射剂或腹腔注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方法包括直接注射表达RNA552簇的微小RNA质粒。

在另一优选例中，所述药物组合物用于：

(a)刺激FXR活性和/或抑制LXRα活性；和/或

(b)治疗治疗糖脂代谢病。

在另一优选例中，所述第二活性成分为选自下组的疾病的治疗药物：肥胖、2型糖尿病、高血压、高血脂、非酒精性脂肪性肝病、动脉粥样硬化的药物、或其组合。

在另一优选例中，所述第二活性成分选自下组：胰岛素、双胍类药物、促胰岛素分泌药、胰岛素增敏剂、肠促胰岛素类药、α-葡萄糖苷酶抑制剂、钠–葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂、他汀类药物、贝特类药物、胆碱螯合剂、烟酸及其衍生物、胆固醇吸收抑制剂、胆酸类、PCSK9抑制剂、或其组合。

本发明的第三方面，提供了一种治疗药物组合，所述治疗药物组合包括：

(1)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(i)第一活性成分，所述第一活性成分为miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂：其中，所述的miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，

其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：

和(ii)药学上可接受的载体；以及

(2)第二药物组合物，所述第二药物组合物选自下组：治疗肥胖、2型糖尿病、高血压、高血脂、非酒精性脂肪性肝病、动脉粥样硬化的药物、或其组合。

本发明第四方面，提供了一种(i)激动FXR和/或拮抗LXRα活性；和/或(ii)治疗糖脂代谢病的方法，包括步骤：

向需要的对象施用本发明第一方面所述的活性成分或本发明第二方面所述的药物组合物，从而(i)激动FXR和/或拮抗LXRα活性；和/或(ii)治疗糖脂代谢病。

在另一优选例中，所述对象为哺乳动物，较佳地，为人、小鼠、或大鼠。

本发明第五方面，提供了一种筛选(i)激动FXR和/或拮抗LXRα活性；和/或(ii)治疗糖脂代谢病的候选化合物的方法，包括步骤：

(a)将加入候选化合物的细胞培养体系作为实验组；将不加入候选化合物的细胞培养体系作为对照组；和

(b)测试实验组和对照组中细胞内miRNA552簇的微小RNA的表达活性；

其中，当实验组中细胞内miRNA552簇的微小RNA的表达活性E1显著高于对照组E2，则表明该候选化合物为(i)激动FXR和/或拮抗LXRα活性；和/或(ii)治疗糖脂代谢病的物质。

在另一优选例中，所述的细胞为肝脏细胞，优选地包括HepG2、L02、Huh7等肝实质细胞系。

在另一优选例中，所述的细胞来自人或非人哺乳动物(如啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔和/或猴)。

在另一优选例中，步骤(b)中还包括：

进一步测试所获得化合物对实验组或对照组中FXR和/或LXRα转录活性的影响。

在另一优选例中，所述“显著高于”指E1/E2≥1.5，较佳地，≥2，更佳地，≥3。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1示出了miR-552-3p对FXR/RXR和LXRα/RXR转录活性的影响。A.FXR/RXR转录激活实验显示miR-552-3p可以浓度依赖的增加FXR的转录激活能力。B.LXRα/RXR转录激活实验显示miR-552-3p可以浓度依赖的抑制LXRα的转录激活能力。归一化萤光素酶活性：以阴性对照(NC)为1，对各组的萤光素酶活性进行归一化处理，从而得到归一化萤光素酶活性水平。Student’s t test方法对数据之间的差异性进行计算。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2示出了miR-552-3p对小鼠原代肝细胞脂质蓄积和糖异生的影响。A.miR-552-3p可以抑制FFA刺激的细胞内的TG的蓄积。B.miR-552-3p可以抑制FFA刺激的细胞内的TC的蓄积。C.miR-552-3p可以抑制糖异生底物刺激的葡萄糖生成。Student’s t test方法对数据之间的差异性进行计算。*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。

图3示出了miR-552-3p对高脂高糖饮食诱导小鼠糖脂代谢的影响。A-D.miR-552-3p可以抑制模型小鼠血清中的TG(A)、TC(B)和LDL-C(C)，对HDL-C(D)没有影响。E-F.miR-552-3p可以抑制模型小鼠肝脏内的TG(E)和TC(F)。G.miR-552-3p可以抑制模型小鼠空腹血糖。H.miR-552-3p可以改善模型小鼠OGTT。Student’s t test方法对数据之间的差异性进行计算。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，miRNA552簇的微小RNA能够激动FXR和/或拮抗LXRα活性；和/或(ii)治疗糖脂代谢病。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文使用的，术语“宿主”、“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类，如牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊、长颈鹿、鹿、骆驼、玲羊、大鼠、小鼠、野兔和家兔。

miRNA及其前体

微小RNA(microRNA，简称miRNA)是近年来在线虫，果蝇和植物，哺乳动物等真核生物中发现的一种内源性的长度为22个核苷酸左右的非编码单链小RNA。它在表达上具有组织和时间的特异性，通过与靶mRNA的碱基互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，是调节其他功能基因表达的重要调控分子。越来越多的证据表明miRNA虽然微小，但它通过与靶mRNA形成完全或者不完全互不配对从而对生物体的各种生命过程有着至关重要的作用。

microRNA是一类在机体内发挥着调节基因转录和翻译的内源性非编码单链RNA分子。它的5’种子区序列(第2～8个核苷酸)在进化上高度保守，是该类核酸分子在细胞质中发挥转录后基因表达调控的重要元件(Bioinformatics.2014；30(10):1377-83)。除了种子区经典调控作用，microRNA还有很多其他尚未被解释清楚的调控机制和作用功能。例如：microRNA-552-3p不仅可以对靶基因P450酶CYP2E1在种子序列与mRNA 3’-UTR结合发挥经典的转录后抑制；同时在非种子序列也与其启动子区互补结合，发挥非经典的转录水平抑制(Biochim Biophys Acta.2016；1859(4):650-62)。这表明microRNA对其靶基因的调控有可能不单单只通过其种子区的序列，也有可能依赖于其非种子区的序列。

本发明提供了一类涉及激动FXR和抑制LXRα对下游基因转录作用的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-23nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA是指miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，

其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：

其中，B为a或c，D为a或g，E为a、g或c，F为a、g或u，H为u、g或c，I为g或c，J为a或u，K为a、u或c，N为a、g、u或c；(a)_0-1表示0或1个a，(N)_1-3表示1、2或3个N，(F)_0-1表示0或1个F，(g)_0-1表示0或1个g，(B)_0-1表示0或1个B，(D)_0-1表示0或1个D，(u)_1-2表示1或2个u，(N)_3-5表示3、4或5个N，(E)_0-1表示0或1个E，(N)_0-1表示0或1个N，(N)_4-5表示4或5个N，(H)_0-1表示0或1个H，(N)_0-2表示0、1或2个N，(c)_0-1表示0或1个c，(I)_0-1表示0或1个I，(J)_0-1表示0或1个J，(N)_8-9表示8或9个I，(N)_2-3表示2或3个N，(K)_0-1表示0或1个K；

在另一优选例中，所述的微小RNA来源于人或非人哺乳动物；较佳地所述的非人哺乳动物为猴(如猕猴)、猩猩(如黑猩猩)，黑猩猩和人的miRNA552簇的序列完全一致，猕猴和人的miRNA-552的成熟序列相差一个碱基。所述的“功能与miRNA552簇相同或基本相同”是指保留了miRNA552簇的≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％的激动FXR和拮抗LXRα的功能。

本发明还包括miRNA变体和衍生物。此外，广义上的miRNA衍生物也可包括miRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA552簇进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。

在另一优选例中，所述的miR-552-3p衍生序列具有如SEQ ID NO:3-6、8-10、12、15-20、22-26、30-36、40、46、51、54-70、72-82、84-88、90-119、125、129、135-169中任一所示的核苷酸序列；和/或具有如SEQ ID NO:3-6、8-13、15-20、22-24、26、31-37、40-41、46、50-51、54-88、90-119、125、129、132-165、167-169中任一所示的核苷酸序列。

在一个优选的实施方式中，所述的miR-552-3p衍生序列具有如SEQ ID NO:3-6、8-10、12、15-20、22-24、26、31-36、40、46、51、54-70、72-82、84-88、90-119、125、129、135-165、167-169中任一所示的核苷酸序列。

5’-AACCAUUCAAAUAUACCACAGUUUGUUUAACCUUUUGCCUGUUGGUU GAAGAUGCCUUUCAACAGGUGACUGGUUAGACAAACUGUGGUAUAUACA-3’

(SEQ ID NO:2)

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式II，

式II中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的miRNA552簇的微小RNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式II所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

药物组合物及施用方法

本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：

其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：

(ii)第二活性成分，所述第二活性成分不同于第一活性成分，且所述的第二活性成分选自下组：降血脂药、降糖药、治疗脂肪肝等糖脂代谢病的药物、或其组合；和

(iii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述第二活性成分为选自下组的疾病的治疗药物：肥胖、2型糖尿病、高血压、高血脂、非酒精性脂肪性肝病、动脉粥样硬化、或其组合

如本文所用，术语“第一活性成分”指的是可用于本发明的miRNA552簇、或其前体序列、或含有其的表达载体、或其激动剂。优选地，所述的活性成分选自下组：

(a)miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，所述miR-552-3p衍生序列具有(a1)-(a2)中任一所述的序列；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的微小RNA；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA552簇的微小RNA、(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.00001mg-50mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

在本发明中miRNA552簇可被用于(i)制备FXR激动剂的药物组合物；和/或(ii)制备LXRα拮抗剂的药物组合物；和/或(iii)制备治疗糖脂代谢病的药物组合物。例如，miRNA552簇的衍生物或其激动剂可被用于制备一种药物组合物，所述组合物用于(a)激活FXR和/或拮抗LXRα对下游基因的转录作用；和/或(b)治疗糖脂代谢病。

本发明的优点主要包括：

本发明发现miRNA552簇的微小RNA能够激活FXR和/或拮抗LXRα对下游基因的转录作用，从而能够利用miRNA552簇的微小RNA治疗糖脂代谢病。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

在本发明中，如果没有特殊说明，实施例中所用的材料均为市售产品，本发明中所使用的方法均为本领域中的常规方法。

microRNA衍生物的制备

本发明实施例所采用的hsa-miR-552-3p(序列为5’-aacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:1))；

del-1(序列为5’-acaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:10))；

del-2(序列为5’-aaaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:11))；

del-3(序列为5’-aacggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:12))；

del-4(序列为5’-aacagugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:13))；

del-5(序列为5’-aacagggacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:14))；

del-6(序列为5’-aacagguacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:15))；

del-7(序列为5’-aacaggugcugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:16))；

del-8(序列为5’-aacaggugaugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:17))；

del-9(序列为5’-aacaggugacgguuagacaa-3’(SEQ ID NO:18))；

del-10(序列为5’-aacaggugacuguuagacaa-3’(SEQ ID NO:19))；

del-11(序列为5’-aacaggugacugguagacaa-3’(SEQ ID NO:20))；

del-12(序列为5’-aacaggugacugguugacaa-3’(SEQ ID NO:21))；

del-13(序列为5’-aacaggugacugguuaacaa-3’(SEQ ID NO:22))；

del-14(序列为5’-aacaggugacugguuagcaa-3’(SEQ ID NO:23))；

del-15(序列为5’-aacaggugacugguuagaaa-3’(SEQ ID NO:24))；

del-16(序列为5’-aacaggugacugguuagaca-3’(SEQ ID NO:25))；

ins-1(序列为5’-aaacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:26))；

ins-2(序列为5’-uaacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:27))；

ins-3(序列为5’-gaacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:28))；

ins-4(序列为5’-caacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:29))；

ins-5(序列为5’-aaacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:30))；

ins-6(序列为5’-auacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:31))；

ins-7(序列为5’-agacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:32))；

ins-8(序列为5’-acacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:33))；

ins-9(序列为5’-aaacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:34))；

ins-10(序列为5’-aaucaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:35))；

ins-11(序列为5’-aagcaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:36))；

ins-12(序列为5’-aaccaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:37))；

ins-13(序列为5’-aacaaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:38))；

ins-14(序列为5’-aacuaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:39))；

ins-15(序列为5’-aacgaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:40))；

ins-16(序列为5’-aaccaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:41))；

ins-17(序列为5’-aacaaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:42))；

ins-18(序列为5’-aacauggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:43))；

ins-19(序列为5’-aacagggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:44))；

ins-20(序列为5’-aacacggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:45))；

ins-21(序列为5’-aacagagugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:46))；

ins-22(序列为5’-aacagugugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:47))；

ins-23(序列为5’-aacagggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:48))；

ins-24(序列为5’-aacagcgugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:49))；

ins-25(序列为5’-aacaggaugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:50))；

ins-26(序列为5’-aacagguugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:51))；

ins-27(序列为5’-aacagggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:52))；

ins-28(序列为5’-aacaggcugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:53))；

ins-29(序列为5’-aacagguagacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:54))；

ins-30(序列为5’-aacagguugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:55))；

ins-31(序列为5’-aacagguggacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:56))；

ins-32(序列为5’-aacaggucgacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:57))；

ins-33(序列为5’-aacaggugaacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:58))；

ins-34(序列为5’-aacagguguacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:59))；

ins-35(序列为5’-aacagguggacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:60))；

ins-36(序列为5’-aacaggugcacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:61))；

ins-37(序列为5’-aacaggugaacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:62))；

ins-38(序列为5’-aacaggugaucugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:63))；

ins-39(序列为5’-aacaggugagcugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:64))；

ins-40(序列为5’-aacaggugaccugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:65))；

ins-41(序列为5’-aacaggugacaugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:66))；

ins-42(序列为5’-aacaggugacuugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:67))；

ins-43(序列为5’-aacaggugacgugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:68))；

ins-44(序列为5’-aacaggugaccugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:69))；

ins-45(序列为5’-aacaggugacuagguuagacaa-3’(SEQ ID NO:70))；

ins-46(序列为5’-aacaggugacuugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:71))；

ins-47(序列为5’-aacaggugacuggguuagacaa-3’(SEQ ID NO:72))；

ins-48(序列为5’-aacaggugacucgguuagacaa-3’(SEQ ID NO:73))；

ins-49(序列为5’-aacaggugacugaguuagacaa-3’(SEQ ID NO:74))；

ins-50(序列为5’-aacaggugacuguguuagacaa-3’(SEQ ID NO:75))；

ins-51(序列为5’-aacaggugacuggguuagacaa-3’(SEQ ID NO:76))；

ins-52(序列为5’-aacaggugacugcguuagacaa-3’(SEQ ID NO:77))；

ins-53(序列为5’-aacaggugacuggauuagacaa-3’(SEQ ID NO:78))；

ins-54(序列为5’-aacaggugacugguuuagacaa-3’(SEQ ID NO:79))；

ins-55(序列为5’-aacaggugacuggguuagacaa-3’(SEQ ID NO:80))；

ins-56(序列为5’-aacaggugacuggcuuagacaa-3’(SEQ ID NO:81))；

ins-57(序列为5’-aacaggugacugguauagacaa-3’(SEQ ID NO:82))；

ins-58(序列为5’-aacaggugacugguuuagacaa-3’(SEQ ID NO:83))；

ins-59(序列为5’-aacaggugacugguguagacaa-3’(SEQ ID NO:84))；

ins-60(序列为5’-aacaggugacuggucuagacaa-3’(SEQ ID NO:85))；

ins-61(序列为5’-aacaggugacugguuaagacaa-3’(SEQ ID NO:86))；

ins-62(序列为5’-aacaggugacugguuuagacaa-3’(SEQ ID NO:87))；

ins-63(序列为5’-aacaggugacugguugagacaa-3’(SEQ ID NO:88))；

ins-64(序列为5’-aacaggugacugguucagacaa-3’(SEQ ID NO:89))；

ins-65(序列为5’-aacaggugacugguuaagacaa-3’(SEQ ID NO:90))；

ins-66(序列为5’-aacaggugacugguuaugacaa-3’(SEQ ID NO:91))；

ins-67(序列为5’-aacaggugacugguuaggacaa-3’(SEQ ID NO:92))；

ins-68(序列为5’-aacaggugacugguuacgacaa-3’(SEQ ID NO:93))；

ins-69(序列为5’-aacaggugacugguuagaacaa-3’(SEQ ID NO:94))；

ins-70(序列为5’-aacaggugacugguuaguacaa-3’(SEQ ID NO:95))；

ins-71(序列为5’-aacaggugacugguuaggacaa-3’(SEQ ID NO:96))；

ins-72(序列为5’-aacaggugacugguuagcacaa-3’(SEQ ID NO:97))；

ins-73(序列为5’-aacaggugacugguuagaacaa-3’(SEQ ID NO:98))；

ins-74(序列为5’-aacaggugacugguuagaucaa-3’(SEQ ID NO:99))；

ins-75(序列为5’-aacaggugacugguuagagcaa-3’(SEQ ID NO:100))；

ins-76(序列为5’-aacaggugacugguuagaccaa-3’(SEQ ID NO:101))；

ins-77(序列为5’-aacaggugacugguuagacaaa-3’(SEQ ID NO:102))；

ins-78(序列为5’-aacaggugacugguuagacuaa-3’(SEQ ID NO:103))；

ins-79(序列为5’-aacaggugacugguuagacgaa-3’(SEQ ID NO:104))；

ins-80(序列为5’-aacaggugacugguuagaccaa-3’(SEQ ID NO:105))；

ins-81(序列为5’-aacaggugacugguuagacaaa-3’(SEQ ID NO:106))；

ins-82(序列为5’-aacaggugacugguuagacaua-3’(SEQ ID NO:107))；

ins-83(序列为5’-aacaggugacugguuagacaga-3’(SEQ ID NO:108))；

ins-84(序列为5’-aacaggugacugguuagacaca-3’(SEQ ID NO:109))；

ins-85(序列为5’-aacaggugacugguuagacaaa-3’(SEQ ID NO:110))；

ins-86(序列为5’-aacaggugacugguuagacaau-3’(SEQ ID NO:111))；

ins-87(序列为5’-aacaggugacugguuagacaag-3’(SEQ ID NO:112))；

ins-88(序列为5’-aacaggugacugguuagacaac-3’(SEQ ID NO:113))；

rep-1(序列为5’-uacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:114))；

rep-2(序列为5’-gacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:115))；

rep-3(序列为5’-cacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:116))；

rep-4(序列为5’-aucaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:117))；

rep-5(序列为5’-agcaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:118))；

rep-6(序列为5’-accaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:119))；

rep-7(序列为5’-aaaaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:120))；

rep-8(序列为5’-aauaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:121))；

rep-9(序列为5’-aagaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:122))；

rep-10(序列为5’-aacuggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:123))；

rep-11(序列为5’-aacgggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:124))；

rep-12(序列为5’-aaccggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:125))；

rep-13(序列为5’-aacaagugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:126))；

rep-14(序列为5’-aacaugugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:127))；

rep-15(序列为5’-aacacgugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:128))；

rep-16(序列为5’-aacagaugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:129))；

rep-17(序列为5’-aacaguugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:130))；

rep-18(序列为5’-aacagcugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:131))；

rep-19(序列为5’-aacaggagacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:132))；

rep-20(序列为5’-aacaggggacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:133))；

rep-21(序列为5’-aacaggcgacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:134))；

rep-22(序列为5’-aacagguaacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:135))；

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rep-24(序列为5’-aacaggucacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:137))；

rep-25(序列为5’-aacaggugucugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:138))；

rep-26(序列为5’-aacagguggcugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:139))；

rep-27(序列为5’-aacaggugccugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:140))；

rep-28(序列为5’-aacaggugaaugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:141))；

rep-29(序列为5’-aacaggugauugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:142))；

rep-30(序列为5’-aacaggugagugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:143))；

rep-31(序列为5’-aacaggugacagguuagacaa-3’(SEQ ID NO:144))；

rep-32(序列为5’-aacaggugacggguuagacaa-3’(SEQ ID NO:145))；

rep-33(序列为5’-aacaggugaccgguuagacaa-3’(SEQ ID NO:146))；

rep-34(序列为5’-aacaggugacuaguuagacaa-3’(SEQ ID NO:147))；

rep-35(序列为5’-aacaggugacuuguuagacaa-3’(SEQ ID NO:148))；

rep-36(序列为5’-aacaggugacucguuagacaa-3’(SEQ ID NO:149))；

rep-37(序列为5’-aacaggugacugauuagacaa-3’(SEQ ID NO:150))；

rep-38(序列为5’-aacaggugacuguuuagacaa-3’(SEQ ID NO:151))；

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rep-40(序列为5’-aacaggugacuggauagacaa-3’(SEQ ID NO:153))；

rep-41(序列为5’-aacaggugacuggguagacaa-3’(SEQ ID NO:154))；

rep-42(序列为5’-aacaggugacuggcuagacaa-3’(SEQ ID NO:155))；

rep-43(序列为5’-aacaggugacugguaagacaa-3’(SEQ ID NO:156))；

rep-44(序列为5’-aacaggugacuggugagacaa-3’(SEQ ID NO:157))；

rep-45(序列为5’-aacaggugacuggucagacaa-3’(SEQ ID NO:158))；

rep-46(序列为5’-aacaggugacugguuugacaa-3’(SEQ ID NO:159))；

rep-47(序列为5’-aacaggugacugguuggacaa-3’(SEQ ID NO:160))；

rep-48(序列为5’-aacaggugacugguucgacaa-3’(SEQ ID NO:161))；

rep-49(序列为5’-aacaggugacugguuaaacaa-3’(SEQ ID NO:162))；

rep-50(序列为5’-aacaggugacugguuauacaa-3’(SEQ ID NO:163))；

rep-51(序列为5’-aacaggugacugguuacacaa-3’(SEQ ID NO:164))；

rep-52(序列为5’-aacaggugacugguuagucaa-3’(SEQ ID NO:165))；

rep-53(序列为5’-aacaggugacugguuaggcaa-3’(SEQ ID NO:166))；

rep-54(序列为5’-aacaggugacugguuagccaa-3’(SEQ ID NO:167))；

rep-55(序列为5’-aacaggugacugguuagaaaa-3’(SEQ ID NO:168))；

rep-56(序列为5’-aacaggugacugguuagauaa-3’(SEQ ID NO:169))；

rep-57(序列为5’-aacaggugacugguuagagaa-3’(SEQ ID NO:3))；

rep-58(序列为5’-aacaggugacugguuagacua-3’(SEQ ID NO:4))；

rep-59(序列为5’-aacaggugacugguuagacga-3’(SEQ ID NO:5))；

rep-60(序列为5’-aacaggugacugguuagacca-3’(SEQ ID NO:6))；

rep-61(序列为5’-aacaggugacugguuagacau-3’(SEQ ID NO:7))；

rep-62(序列为5’-aacaggugacugguuagacag-3’(SEQ ID NO:8))；

rep-63(序列为5’-aacaggugacugguuagacac-3’(SEQ ID NO:9))；

均由苏州吉玛基因股份有限公司合成。

实施例1：本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p模拟物对FXR和LXRα的转录活性作用检测。

本实施例中所用细胞模型为HEK293(ATCC细胞库，美国)。其中，HEK293细胞系所用培养基为含10％的胎牛血清的DMEM培养基，培养于含5％二氧化碳的37℃恒温培养箱中。在HEK293细胞中转入20ng的转录因子过表达质粒，20ng转录因子响应元件报告基因质粒，5ngSV40内参质粒以及一定浓度的has-miR-552-3p或NC(阴性对照，购自上海吉玛制药技术有限公司，中国，序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)，转染24小时后，进行双荧光素酶报告基因检测用于表征转录因子的转录活性。

1.1实验材料和方法

1)microRNA模拟物和质粒瞬时转染细胞实验

A、不同浓度的microRNA模拟物(1、10、30nM)、20ng的转录因子过表达质粒(FXR，RXR或LXRα，RXR)，20ng转录因子响应元件报告基因质粒(FXRE或LXRE)，5ngSV40内参质粒加入10μLOpti-MEM培养基，和含有0.15μLLipofectamine 2000的10μLOpti-MEM培养基混合后，静置15分钟，配置成转染工作液。

B、HEK293细胞经胰酶消化后以20000个细胞/孔的密度铺于96孔板内，过夜贴壁。每孔加入50μLOpti-MEM培养基，置于培养箱内待用。将配置的转染工作液加至96孔板内，置于培养箱内培养。6小时后，将孔板内的培养基更换为含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养24小时后检测荧光素酶活性。

2)双荧光素酶报告基因检测

取适量的5×Passive Lysis Buffer，加入4倍体积的去离子水，配置成裂解液。将待收样品孔内的培养基吸去，加入100μLPBS进行洗涤。弃去PBS，每孔加入裂解液25μL(96孔板)，置于恒温混匀仪上，300rpm，振板15分钟，充分裂解细胞。将溶液转移至干净的96孔白板内，避光向每孔内加入10μLLAR，放于酶标仪中测值(萤火虫荧光素酶读值)。避光向每孔内加入10μLStop/Glo，放于酶标仪中测值(海肾荧光素酶读值)。将第一次得到数值除以第二次的数值，即为每孔的实验数据。

1.2实验结果：

结果如图1A所示，在HEK293细胞中共转miR-552-3p和FXR/RXR/FXRE，24小时后检测荧光素酶活性，发现miR-552-3p可以浓度依赖性的增加荧光素酶的活性，这表示miR-552-3p可以促进FXR/RXR对基因的转录能力，是FXR的激动剂。如图1B所示，在HEK293细胞中共转miR-552-3p和LXRα/RXR/LXRE，24小时后检测荧光素酶活性，发现miR-552-3p可以浓度依赖性的抑制荧光素酶的活性，这表示miR-552-3p可以抑制LXRα/RXR对基因的转录能力，是LXRα的拮抗剂。

实施例2：本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p对小鼠原代肝细胞糖脂代谢的作用检测

所用的细胞为从小鼠肝脏内分离的原代肝细胞。其中小鼠原代肝细胞所用的培养基为含10％的胎牛血清的William’s E培养基，培养于含5％二氧化碳的37℃恒温培养箱中。分离肝脏特异性过表达miR-552-3p小鼠和对照小鼠的肝细胞，加入脂肪酸刺激检测细胞内的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)；加入糖异生底物刺激检测细胞分泌到培养基的葡萄糖的含量；从而评价miR-552-3p对小鼠原代肝细胞糖脂代谢的影响。

2.1实验材料和方法

1)构建肝脏特异性过表达miR-552-3p小鼠模型

A、腺相关病毒制备：miR-552-3p过表达质粒(GPAAV-CMV-Mcherry-miR-552-3p)和对照质粒(GPAAV-CMV-Mcherry)购于吉满生物科技(上海)有限公司。过表达的病毒制备分三大步。(A)病毒包被：293T细胞培养在含10％的胎牛血清的DMEM培养基中(15cm皿)，细胞密度达到70-80％后将细胞培养基更换为无血清的DMEM培养基。取1支15mL离心管加入3mL0.3M CaCl₂溶液，分别取30μg miR-552-3p过表达质粒或对照质粒，30μg pHelper(辅助质粒)，30μg pAAV2/8(包装质粒)加入到CaCl₂溶液中，混匀。另取一支15mL离心管加入3mL2×HBS溶液，与质粒/CaCl₂混合液混合。接下来将质粒/CaCl₂/HBS悬液加入293T细胞后，把细胞放回到37℃培养箱继续培养，6小时后更换为含10％的胎牛血清的DMEM培养基，继续培养66-72小时。(B)病毒纯化：用培养基将细胞吹打悬浮并收集到50mL离心管中，3000g离心10分钟，将上清移至50mL离心管待用。向上清中加入10％PEG800与1M的NaCl，混匀后4℃过夜。随后，12000g离心15分钟。沉淀用适量Lysis buffer进行重悬。加入Benzonase(1μL/20mL)，37℃孵育30分钟。加入等体积氯仿，置于摇床剧烈摇晃1小时，12000g离心15分钟。上清转移至超滤管(100KD)内，5000g离心10分钟。弃去套管内废液，向超滤管内加入适量Lysisbuffer，继续离心。重复此操作3-4次。之后5000g进行离心，每隔一段时间取出观察，使终体积为500μL左右。将纯化后的病毒置于-80℃冰箱内保存。

B、肝脏特异性过表达miR-552-3p小鼠的构建：通过尾静脉注射给C57/BL6雄性小鼠予过表达miR-552-3p或对照的腺相关病毒，28周后取其新鲜肝脏。

2)小鼠原代肝细胞分离

将C57/BL6雄性小鼠饥饿过夜16小时，用10％水合氯醛麻醉小鼠。待小鼠充分麻醉后，用75％乙醇对小鼠腹部进行消毒，打开小鼠腹腔，向肝门静脉插入针头，把预热的前灌流液与DMEM培养基通过75％乙醇消毒后的灌流泵，以3mL/min流速通过肝门静脉进入肝脏。将肝脏内的血液完全排出后，将前灌流液换为含胶原酶(0.2mg/10mL)的DMEM培养基，灌流15-20mL。将肝脏取下，放入细胞皿中，用含10％的胎牛血清的DMEM培养基润洗肝脏，终止消化。用镊子轻轻撕扯肝脏，将释放出来的细胞悬液通过70μm的细胞筛网进行过滤并离心3分钟(50g)。将细胞沉淀用20mL梯度液(10mL DMEM养基，9mL Percoll，1mL10xPBS)进行重悬，并1500rpm离心8分钟。下层细胞沉淀用含10％的胎牛血清的William’s E培养基重悬并计数，按实验要求细胞密度进行铺板，置于培养箱内培养。

3)TG和TC测定：小鼠原代肝细胞以3×10⁵/mL的密度铺板(24孔板)，0.9mM脂肪酸FFA(PA:OA＝1:2)刺激24小时后，弃去培养基，用500μLPBS润洗一次。加入50μL1％tritonX-100，将细胞充分裂解，转移至EP管内。室温孵育30分钟后，12000g离心5分钟。取上清进行检测。对于TG(检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司)，2.5μL细胞裂解样本加入到96孔板内，与250μL反应液37℃孵育10分钟，用酶标仪测定510nm处的吸光度。并与标准品吸光度进行比较，确定甘油三酯的含量。对于TC(检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司)，取2.5μL细胞裂解样本加入到96孔板内，加入250μL反应液37℃孵育10分钟，用酶标仪测定510nm处的吸光度。并且根据标准品吸光度，计算样本中总胆固醇的含量。对于校准，采用细胞蛋白含量来进行校准。蛋白浓度测定方法如下：5μL样品转移至预先加入15μL去离子水的96孔板中，加入180μL配置好的BCA工作液(A液:B液＝50：1)，37℃孵育30分钟，用酶标仪测定450nm处的吸光度，并根据标曲计算蛋白浓度。

4)细胞分泌的葡萄糖含量测定：小鼠原代肝细胞以3×10⁵/mL的密度铺板(96孔板)，5小时细胞贴壁后将培养基换为无血清的DMEM培养基，饥饿处理18小时。之后将培养基换为含糖异生底物的培养基(无糖无酚红DMEM培养基，20mM乳酸钠，2mM丙酮酸钠)，置于培养箱内继续培养。6小时后，吸取50μL培养基转移至新的96孔板内，加入100μL配置好的葡萄糖检测液(R1:R2溶液＝1:1)，置于37℃孵育30min，检测505nm处的吸光度。同时，将原96孔板内培养基吸去，加入100μL预先配置的CCK-8工作液(CCK-8:培养基＝1:10)，置于培养箱内培养1小时，测定450nm处吸光度。用CCK-8的值对细胞产生的葡萄糖含量进行校准。

2.2实验结果：

结果如图2A所示，0.9mMFFA可以刺激对照细胞中TG的蓄积，而在过表达miR-552-3p中的TG响应FFA刺激升高的能力显著下降；同样如图2B所示，0.9mMFFA可以刺激对照细胞中TC的蓄积，而在过表达miR-552-3p中的TC响应FFA刺激升高的能力显著下降。结果如图2C所示，培养基中加入糖异生底物可以显著增加对照细胞分泌到培养基中的葡萄糖，而过表达miR-552-3p中相应刺激后的葡萄糖的产生能力显著下降。

实施例3：本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p对饮食诱导模型小鼠糖脂代谢的作用检测

采用高糖高脂饮食诱导C57/BJ6雄性小鼠产生糖脂代谢紊乱，利用腺相关病毒过表达系统在小鼠肝脏中特异性过表达miR-552-3p，通过检测小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C，肝脏组织中的TG、TC，空腹血糖和口服糖耐量(OGTT)来评价miR-552-3p对血脂、肝脂、血糖和胰岛素抵抗的作用。

3.1实验材料和方法

1)诱导糖脂代谢紊乱的小鼠模型：A、动物来源：8周龄C57/BJ6雄性小鼠，购于上海吉辉实验动物饲养有限公司。B、动物培养条件：SPF级动物房饲养；温度：22-24℃；湿度：45-80％；光照：150-300Lx，12小时昼夜交替。其饲养，给药和处死均严格按照动物实验和福利的指导(参照上海市实验动物管理条例)。C、动物诱导条件：C57BL/6J小鼠饲养于SPF级动物房中，适应性驯养一周后，即9周龄时给予饮食诱导(高脂饲料为60kcal％Fat，高糖以饮水的方式给予，糖水配方：5％葡萄糖，17％果糖)，诱导28周后开始给病毒。

2)注射病毒及分组：诱导28周后，统一测量体重，然后根据体重进行分组，每组10只小鼠。按照每只动物4×10^11个病毒对小鼠进行尾静脉注射，给予对照病毒以及miR-552-3p过表达病毒。分为mcherry组(对照)与mcherry-miR-552-3p组。每周对动物体重进行检测。给病毒13周后，对动物进行处死。

3)观察指标：A、所有动物的血清样本指标LDL-C、HDL-C、TC、TG均由生化分析仪(罗氏，Cobas C501)进行检测。B、所有动物的肝脏内TG、TC采用检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所有限公司。C、所有动物的空腹血糖(饥饿6小时)由罗氏的便携式血糖仪检测。D、所有动物的OGTT检测方法：将小鼠饥饿过夜，以灌胃的方式给予小鼠1.5g/kg葡萄糖，分别在0、15、30、45、60、90及120分钟检测鼠尾静脉的血糖浓度。

3.2实验结果：

结果如图3A-D所示，肝脏内特异性过表达miR-552-3p可以显著性降低模型小鼠血清中的TG、LDL-C和TC，对HDL-C没有作用。同时还可以降低模型小鼠肝脏组织中的TG(图3E)和TC(图3F)，降血糖(图3G)和改善胰岛素抵抗(图3H)。

实施例4：本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p单碱基缺失衍生物对人肝癌细胞(HepG2)中FXR和LXRα下游基因的作用检测

所用细胞模型为人肝癌细胞HepG2(ATCC细胞库，美国)。其中，HepG2细胞系所用培养基为含10％的胎牛血清的MEM培养基，培养于含5％二氧化碳的37℃恒温培养箱中。在HepG2细胞中分别转染浓度为10nM的hsa-miR-552-3p单碱基缺失模拟物或NC(阴性对照，购自上海吉玛制药技术有限公司，中国，序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)，基于RT-qPCR技术检测细胞中的ApoB(FXR下游基因)和SCD(LXR下游基因)mRNA含量。

4.1实验材料和方法

1)hsa-miR-552-3p单碱基缺失模拟物序列见表4。

2)microRNA模拟物转染细胞实验：

A、将100μL无血清培养基Opti-MEM(购自Thermo Fisher Scientific公司，美国)，1μL RNAimax(购自Invitrogen公司，美国)和10nM的microRNA模拟物混合20分钟作为反式转染的转染液加到24孔板的1个空孔内。

B、胰酶消化HepG2细胞，计数，按照每孔75000个细胞铺板，和之前的转染液共培育72小时后检测。

3)提取RNA实验：总RNA抽提采用异丙醇沉淀法，具体步骤如下(以24孔板为例)。

A、每孔用500μLPBS清洗后，加入500μL RNAiso plus，吹打几次。将溶液转移至1.5mLEP管内。

B、向1.5mLEP管内加入200μL氯仿，上下颠倒混匀30s，室温静置10分钟，放于4℃离心机内，12000rpm离心15分钟。

C、将上清转移至新的1.5mLEP管内，加入等体积的异丙醇，用以沉淀RNA。上下颠倒混匀10次，室温静置10分钟后，放于4℃离心机内，12000rpm离心15分钟。

D、弃去上清，可观测到管底有白色沉淀。加入1mL75％乙醇重悬沉淀，4℃离心机内，12000rpm离心15分钟。弃去上清，将EP管盖打开，室温挥发残余液体。15-20分钟后，加入适量DEPC水，溶解沉淀后，进行下一步实验。

4)实时定量荧光PCR实验：

A、利用酶标仪检测抽提的RNA浓度。

B、将RNA反转录为cDNA，反转录体系(20μL)，见下表。反转录过程：①37℃，15min；②85℃，5s；③保持10℃。

表1反转录体系

C、定量PCR：反应体系(每孔)见下表。

表2定量PCR反应体系

定量PCR过程：①50℃，2min；②95℃，20s；③95℃，3s；④60℃，30s；③-④循环40次。

表3引物序列表

基因	引物序列(5’-3’)	SEQ ID NO:
			hApoB正向引物	TGCTCCACTCACTTTACCGTC	170
hApoB反向引物	TAGCGTCCAGTGTGTACTGAC	171
			hSCD正向引物	TCTAGCTCCTATACCACCACCA	172
hSCD反向引物	TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC	173
			hGAPDH正向引物	GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT	174
hGAPDH反向引物	GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG	175

D、数据处理：采用2^-△△Ct法。①△Ct＝Ct(目的基因)-Ct(内参基因)；②-△△Ct＝-(△Ct(处理组)-△Ct(对照组))；③对-△△Ct进行2的幂运算，即2^-△△Ct就得出经microRNA模拟物转染组与对照组之间的倍数关系。数据以均值±标准差(mean±sd)表示，采用t检验对数据进行统计学分析。

4.2实验结果：

每个测试孔内ApoB或SCD的mRNA相对含量用以下公式计算：

测试孔ApoB或SCD mRNA相对含量＝测试孔ApoB或SCD mRNA含量/NC孔ApoB或SCDmRNA含量。

经过hsa-miR-552-3p处理后，与NC孔相比，ApoB的mRNA是NC孔的0.41倍，SCD的mRNA是NC孔的0.47倍。hsa-miR-552-3p单碱基缺失模拟物处理后ApoB和SCD的mRNA与NC相比的值见表4，对于ApoB，5’端的第3、5-7位碱基和第16位碱基发生单碱基缺失后，会使该类microRNA对ApoB没有抑制作用；对于SCD，5’端的第7、16、20-21位碱基发生单碱基缺失后，会使该类microRNA对SCD没有抑制作用。

表4单碱基缺失衍生物及其活性

实施例5：本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p单碱基插入衍生物对人肝癌细胞(HepG2)中FXR和LXRα下游基因的作用检测

所用细胞模型为人肝癌细胞HepG2(ATCC细胞库，美国)。其中，HepG2细胞系所用培养基为含10％的胎牛血清的MEM培养基，培养于含5％二氧化碳的37℃恒温培养箱中。在HepG2细胞中分别转染浓度为10nM的hsa-miR-552-3p单碱基插入模拟物或NC(阴性对照，购自上海吉玛制药技术有限公司，中国，序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)，基于RT-qPCR技术检测细胞中的ApoB(FXR下游基因)和SCD(LXR下游基因)mRNA含量。

5.1实验材料和方法

1)hsa-miR-552-3p单碱基插入模拟物序列见表5。

2)其他材料与方法同实施例4

同实施例4。

5.2实验结果：

数据分析方法同实施例4，具体实验结果如表5所示，对于ApoB，5’端的第1位碱基前插入u或g或c、或第2位和第3位碱基间插入c、或第3位和第4位碱基间插入u或a或c、或第4位和第5位碱基间插入任何碱基、或第5位和第6位碱基间插入u或g或c、或第6位和第7位碱基间插入a或g或c、或第11位和第12位碱基间插入u、或第14位和第15位碱基间插入u、或第15位和第16位碱基间插入c后，会使该类microRNA对ApoB没有抑制作用；对于SCD，5’端的第1位碱基前插入u或g或c、或第1位和第2位碱基间插入a、或第3位和第4位碱基间插入u或a、或第4位和第5位碱基间插入任何碱基、或第5位和第6位碱基间插入u或g或c、或第6位和第7位碱基间插入g或c、或第15位和第16位碱基间插入c后，会使该类microRNA对SCD没有抑制作用。

表5单碱基插入衍生物及其活性

实施例6：本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p单碱基替换衍生物对人肝癌细胞(HepG2)中FXR和LXRα下游基因的作用检测

所用细胞模型为人肝癌细胞HepG2(ATCC细胞库，美国)。其中，HepG2细胞系所用培养基为含10％的胎牛血清的MEM培养基，培养于含5％二氧化碳的37℃恒温培养箱中。在HepG2细胞中分别转染浓度为10nM的hsa-miR-552-3p单碱基替换模拟物或NC(阴性对照，购自上海吉玛制药技术有限公司，中国，序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)，基于RT-qPCR技术检测细胞中的ApoB(FXR下游基因)和SCD(LXR下游基因)mRNA含量。

6.1实验材料和方法

1)hsa-miR-552-3p单碱基替换模拟物序列见表6。

2)其他材料与方法同实施例4

同实施例4。

6.2实验结果：

数据分析方法同实施例4，具体实验结果如表6所示，对于ApoB，5’端的第3位碱基替换为除本身c以外的任何碱基、第4位碱基替换为u或g、第5位碱基替换为除本身g以外的任何碱基、第6位碱基替换为u或c、第7位碱基替换为除本身u以外的任何碱基、第21位碱基替换为u后，会使该类microRNA对ApoB没有抑制作用；对于SCD，5’端的第3位碱基替换为除本身c以外的任何碱基、第4位碱基替换为u或g、第5位碱基替换为除本身g以外的任何碱基、第6位碱基替换为u或c、第18位碱基替换为g、第21位碱基替换为u后，会使该类microRNA对SCD没有抑制作用。

表6单碱基替换衍生物及其活性

通过单碱基缺失、插入和替换实验，证实对于作为FXR激动剂调控FXR下游基因(以ApoB为例)，核苷酸序列通式为5’-(a)_0-1(N)_1-3(F)_0-1c(g)_0-1(B)_0-1g(a)_0-1(D)_0-1(u)_1-2(N)_3-5(E)_0-1N_2-4(E)_0-1(N)_0-1(F)_0-1(N)_4-5(E)_0-1(N)_0-1-3’；作为LXR拮抗剂调控LXR下游基因(以SCD为例)，核苷酸序列通式为5’-(a)_0-1(N)_0-1(H)_0-1(N)_0-2(c)_0-1(I)_0-1(B)_0-1(g)_0-1(a)_0-1(D)_0-1(J)_0-1(N)_8-9(F)_0-1(N)_2-3(K)_0-1(N)_1-3H(N)_0-1-3’。其中，B为a或c，D为a或g，E为a、g或c，F为a、g或u，H为u、g或c，I为g或c，J为a或u，K为a、u或c，N为a、g、u或c；(a)_0-1表示0或1个a，(N)_1-3表示1、2或3个N，(F)_0-1表示0或1个F，(g)_0-1表示0或1个g，(B)_0-1表示0或1个B，(D)_0-1表示0或1个D，(u)_1-2表示1或2个u，(N)_3-5表示3、4或5个N，(E)_0-1表示0或1个E，(N)_0-1表示0或1个N，(N)_4-5表示4或5个N，(H)_0-1表示0或1个H，(N)_0-2表示0、1或2个N，(c)_0-1表示0或1个c，(I)_0-1表示0或1个I，(J)_0-1表示0或1个J，(N)_8-9表示8或9个I，(N)_2-3表示2或3个N，(K)_0-1表示0或1个K。

同时，基于以上实施例，根据本发明的hsa-microRNA-552-3p及其衍生序列能够有效激动FXR和拮抗LXR调控下游糖脂代谢基因的转录能力，因此进而抑制高血脂，高血糖，肝脂蓄积和缓解胰岛素抵抗从而治疗糖脂代谢病。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海药物研究所

<120> miRNA552簇的微小RNA在治疗糖脂代谢病中的应用

<130> P2020-0688

<160> 175

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

aacaggugac ugguuagaca a 21

<210> 2

<211> 96

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

aaccauucaa auauaccaca guuuguuuaa ccuuuugccu guugguugaa gaugccuuuc 60

aacaggugac ugguuagaca aacuguggua uauaca 96

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

aacaggugac ugguuagaga a 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

aacaggugac ugguuagacu a 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

aacaggugac ugguuagacg a 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

aacaggugac ugguuagacc a 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

aacaggugac ugguuagaca u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

aacaggugac ugguuagaca g 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

aacaggugac ugguuagaca c 21

<210> 10

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

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aacggugacu gguuagacaa 20

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aacagugacu gguuagacaa 20

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aacagguacu gguuagacaa 20

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caacagguga cugguuagac aa 22

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auacagguga cugguuagac aa 22

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<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 129

aacagaugac ugguuagaca a 21

<210> 130

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 130

aacaguugac ugguuagaca a 21

<210> 131

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 131

aacagcugac ugguuagaca a 21

<210> 132

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 132

aacaggagac ugguuagaca a 21

<210> 133

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 133

aacaggggac ugguuagaca a 21

<210> 134

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 134

aacaggcgac ugguuagaca a 21

<210> 135

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 135

aacagguaac ugguuagaca a 21

<210> 136

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 136

aacagguuac ugguuagaca a 21

<210> 137

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 137

aacaggucac ugguuagaca a 21

<210> 138

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 138

aacagguguc ugguuagaca a 21

<210> 139

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 139

aacagguggc ugguuagaca a 21

<210> 140

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 140

aacaggugcc ugguuagaca a 21

<210> 141

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 141

aacaggugaa ugguuagaca a 21

<210> 142

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 142

aacaggugau ugguuagaca a 21

<210> 143

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 143

aacaggugag ugguuagaca a 21

<210> 144

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 144

aacaggugac agguuagaca a 21

<210> 145

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 145

aacaggugac ggguuagaca a 21

<210> 146

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 146

aacaggugac cgguuagaca a 21

<210> 147

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 147

aacaggugac uaguuagaca a 21

<210> 148

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 148

aacaggugac uuguuagaca a 21

<210> 149

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 149

aacaggugac ucguuagaca a 21

<210> 150

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 150

aacaggugac ugauuagaca a 21

<210> 151

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 151

aacaggugac uguuuagaca a 21

<210> 152

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 152

aacaggugac ugcuuagaca a 21

<210> 153

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 153

aacaggugac uggauagaca a 21

<210> 154

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 154

aacaggugac uggguagaca a 21

<210> 155

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 155

aacaggugac uggcuagaca a 21

<210> 156

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 156

aacaggugac ugguaagaca a 21

<210> 157

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 157

aacaggugac uggugagaca a 21

<210> 158

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 158

aacaggugac uggucagaca a 21

<210> 159

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 159

aacaggugac ugguuugaca a 21

<210> 160

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 160

aacaggugac ugguuggaca a 21

<210> 161

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 161

aacaggugac ugguucgaca a 21

<210> 162

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 162

aacaggugac ugguuaaaca a 21

<210> 163

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 163

aacaggugac ugguuauaca a 21

<210> 164

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 164

aacaggugac ugguuacaca a 21

<210> 165

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 165

aacaggugac ugguuaguca a 21

<210> 166

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 166

aacaggugac ugguuaggca a 21

<210> 167

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 167

aacaggugac ugguuagcca a 21

<210> 168

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 168

aacaggugac ugguuagaaa a 21

<210> 169

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 169

aacaggugac ugguuagaua a 21

<210> 170

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 170

tgctccactc actttaccgt c 21

<210> 171

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 171

tagcgtccag tgtgtactga c 21

<210> 172

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 172

tctagctcct ataccaccac ca 22

<210> 173

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 173

tcgtctccaa cttatctcct cc 22

<210> 174

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 174

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 175

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 175

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims

1.一种miRNA的用途，所述的miRNA为miR-552-3p衍生序列，其特征在于，用于制备FXR激动剂和/或LXRα拮抗剂的药物组合物；

其中，所述miR-552-3p衍生序列可用于制备FXR激动剂的药物组合物，并且所述衍生序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-6、8-10、12、15-20、22-26、30-36、40、46、51、54-70、72-82、84-88、90-119、125、129、135-169中任一所示；

或所述的miR-552-3p衍生序列可用于制备LXRα拮抗剂的药物组合物，并且所述衍生序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-6、8-13、15-20、22-24、26、31-37、40-41、46、50-51、54-88、90-119、125、129、132-165、167-169中任一所示。

2.一种miRNA的用途，所述的miRNA为miR-552-3p，其特征在于，用于：

(i)制备FXR激动剂和/或LXRα拮抗剂的药物组合物；和/或

(ii)制备治疗2型糖尿病的药物组合物。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物还含有第二活性成分，且所述的第二活性成分选自下组：降血脂药、降糖药、治疗脂肪肝等糖脂代谢病的药物、或其组合。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述治疗糖脂代谢病的药物选自下组：胰岛素、双胍类药物、促胰岛素分泌药、胰岛素增敏剂、肠促胰岛素类药、α-葡萄糖苷酶抑制剂、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂、他汀类药物、贝特类药物、胆碱螯合剂、烟酸及其衍生物、胆固醇吸收抑制剂、胆酸类、PCSK9抑制剂、或其组合。