CN111197067A - 采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法 - Google Patents

采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111197067A
CN111197067A CN202010035541.3A CN202010035541A CN111197067A CN 111197067 A CN111197067 A CN 111197067A CN 202010035541 A CN202010035541 A CN 202010035541A CN 111197067 A CN111197067 A CN 111197067A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tetrahymena
concentration
medicine
thermophile
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010035541.3A
Other languages
English (en)
Inventor
潘厚军
石存斌
常藕琴
张德锋
任燕
王亚军
谢骏
黄志斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Original Assignee
Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pearl River Fisheries Research Institute CAFS filed Critical Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority to CN202010035541.3A priority Critical patent/CN111197067A/zh
Publication of CN111197067A publication Critical patent/CN111197067A/zh
Priority to AU2020102410A priority patent/AU2020102410A4/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5085—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of invertebrates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，S1、对嗜热四膜虫进行培养；S2、对嗜热四膜虫生长曲线的测定；S3、中草药水煮液或中药单体试液的制备；S4、通过药物对嗜热四膜虫进行培养暴露；S5、药物暴露处理的嗜热四膜虫试液，进行细胞计数，分析药物抑制嗜热四膜虫生长的半数抑制浓度；S6、CCK‑8法测定细胞活力随药物浓度的变化，用SPSS软件计算CC50；S7、评估中草药对嗜热四膜虫的抑制杀灭效果；S8、设计药物浓度，添加入饲料中，评估鱼类对寄生虫的作用效果。采用可人工培养的嗜热四膜虫代替鱼纤毛类寄生虫，进行抗虫药物大通量筛选，受试材料随时可得，不受时间、温度、季节的限制，且具重复性好、经济适用快速。

Description

采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，具体为一种采用嗜热四膜虫筛选抗纤毛类寄生虫中草药物成分的方法。
背景技术
淡水鱼类纤毛类寄生虫包括多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)、车轮虫(Trichodina sp.)、斜管虫(Chilodonella sp.)、小车轮虫等(Trichodinella sp.)等，多子小瓜虫隶属寡膜纤毛纲、膜口目、凹口科、小瓜虫属；车轮虫和小车轮虫分属于寡膜纤毛纲、缘毛亚纲、缘毛目、壶形科、车轮虫属和小车轮虫属；斜管虫属于动基片纲、下口亚纲、管口目、斜管科、斜管虫属；其中多子小瓜虫危害最为严重，以往人们筛选抗寄生虫药物，是直接采用感染寄生虫的鱼进行试验，人们从生产实践中了解到，同一批试验材料鱼，因个体差异，对同一种寄生虫敏感性不同，鱼个体之间感染寄生虫丰度往往差异较大，感染丰度低的鱼体，难以试验出抗虫药物的效果；而感染丰度高的鱼体，又易因虫的危害造成鱼体在药物作用之前急性死亡，因而杀虫药物的筛选因作用对象—寄生虫难以批量稳定获得、鱼体感染程度不均而造成了较大的困难。
前人在小瓜虫、车轮虫等寄生虫药物筛选方面做了很多尝试，然而已有在生产中使用的药物，有的寄生虫已产生了抗药性、有的对环境、水产品安全产生威胁，迫切需要替代药物，来源于植物、动物和矿物的天然药物因为来源多样，成份复杂，如果每一种药物都采用感染寄生虫的鱼进行试验，工作量大、感染寄生虫的鱼没有保障，试验的筛选造成极大的限制，用嗜热四膜虫在抗鱼纤毛类寄生虫药物方面具有广泛的开发与应用前景，为此我们提出一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，包括如下步骤：
S1、嗜热四膜虫的培养
将室温保存培养基中的嗜热四膜虫液1.0mL，转入装有9.0mL嗜热四膜虫培养基的黑盖瓶中，28℃～32℃100rpm条件下培养至对数期，再转接复苏后的嗜热四膜虫至含20mL嗜热四膜虫培养基的锥形瓶中培养至对数初期；
S2、嗜热四膜虫生长曲线的测定
按3000～5000cells/mL的起始密度接种嗜热四膜虫，设置3个平行，于28℃、100rpm的摇床中培养，0～72h间隔6h取一次样进行计数，84～144h间隔12h进行取样计数，144h后每隔24h计数，采用血球计数板或细胞计数仪计数，以时间为横坐标，嗜热四膜虫数为纵坐标，绘制嗜热四膜虫随浓度变化的生长曲线；
S3、中草药水煮液或中药单体试液的制备
(1)中草药水煮液制备
称取30g中草药原药加入300mL蒸馏水浸泡30min～60min，加热至沸腾，文火30min～45min，纱布过滤，滤出药液，煎煮2次，合并2次滤液，浓缩成30mL，得到浓度为1g/mL的原药液，0.22um滤膜过滤除菌后，放置于4℃的冰箱保存，备用；
(2)中药单体试液制备
中药单体称取100mg，加入10mL助溶剂DMSO，即刻加入无菌水90mL，配成含1.0mg/mL(1.0g/L)药液的母液，DMSO含量为0.1mL/mL(约为0.1mg/mL)，放置于4℃的冰箱保存，备用；
S4、药物暴露
室温保存的嗜热四膜虫以5％的接种体积分数接种于100mL已灭菌的嗜热四膜虫培养基中，28℃～30℃、100～150rpm摇床培养，至对数生长期(24h～48h)，并进行细胞计数，再用嗜热四膜虫培养基稀释调整为10mL体系且浓度为1.0×104～6.0×104个/mL四膜虫细胞悬液，加入死亡率0％～100％之间、按等对数间距设置的5～6个浓度的S3所制受试药物，每个浓度组设置3个平行样，并设置空白对照(仅有培养基)及阴性对照(有培养基、嗜热四膜虫，不加药物)，于28℃～32℃、100～150rpm的摇床中培养暴露处理24h；
S5、药物抑制生长浓度的测定
取步骤S4中各浓度药物暴露处理24h的嗜热四膜虫试液，对活细胞数量进行细胞计数，每个样品计数3次，然后以药物浓度为横坐标，活的嗜热四膜虫数为纵坐标，绘制曲线，用SPSS软件分析药物抑制嗜热四膜虫生长的半数抑制浓度(IC50),结果用平均值和标准方差(Mean±SD)表示；
S6、CCK8细胞活力的测定
CCK-8方法利用含有WST-8的试剂测定细胞活力，用酶标仪在450nm波长处测定其OD值，从而测定细胞活力随药物浓度的变化，用SPSS软件计算CC50(对50％的嗜热四膜虫产生细胞毒性时对应的药物浓度)，结果用平均值和标准方差(Mean±SD)表示；
S7、结果判定
综合药物抑制嗜热四膜虫生长的半抑制浓度(S5中IC50)和CCK-8方法(S6中CC50)的浓度进行确定，评估中草药或其有效成分对嗜热四膜虫的抑制杀灭效果；
S8、药物防治鱼感染寄生虫的效果
以嗜热四膜虫细胞增殖的半抑制浓度为基础，参考CCK-8细胞活力测定，设计药物浓度，添加入饲料中，评估鱼类对寄生虫的作用效果。
优选的一种实施案例，步骤S1中，所述嗜热四膜虫培养基原料组成包括：多价蛋白胨1.7～2.5％，酵母提取物1.7～2.5％，D-葡萄糖1.7～5.0％，1mL 0.9g/dL的三氯化铁存储液，在增加蒸馏水至1000mL，于121℃高温灭菌30min，凉后室温保存。
优选的一种实施案例，步骤S3中(1)的中草药原药为马蹄大黄粉末或青蒿粉末；步骤S3中(2)的中药单体为大黄酸(含量98.2％，粉末)、大黄素(含量99.93％，粉末)、芦荟大黄素(99.54％，粉末)，每种中药单体均称取100mg，加入10mL助溶剂DMSO，即刻加入无菌水90mL，配成含1.0mg/mL(1.0g/L)药液的母液，DMSO含量为0.1mL/mL(约为0.1mg/mL)。
优选的一种实施案例，步骤S4和步骤S5中，细胞计数的方法为Count star自动细胞计数仪、Beckman Counter细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数，嗜热四膜虫用乙醇、或碘染液固定细胞后进行计数，数据存入电脑。
优选的一种实施案例，步骤S5中，药物对嗜热四膜虫的抑制生长作用的具体操作为：吸取中药水煮液1mL(相当于1g)，采用嗜热四膜虫培养液稀释，按等对数间距设置，终浓度为2g/L(即2mg/mL)、1.25g/L、0.8g/L、0.5g/L、0.32g/L的试液，中药单体有效成分经预备实验，亦按照等对数间距设置，分别稀释为合适的5个～6个浓度为50mg/L、32mg/L、20mg/L、12.5mg/L、8.0mg/L、5.0mg/L，同时设置相应的DMSO助溶剂作为对照，则其浓度相应为5.0mg/L、3.2mg/L、2.0mg/L、1.25mg/L、0.8mg/L、0.5mg/L，然后接种活跃生长的嗜热四膜虫Cu 428.2株，初始浓度约为1.0×104个/mL，28℃100rpm摇床培养24小时，用IC1000Countstar自动细胞计数仪计数，利用SPSS软件计算中草药水提取对嗜热四膜虫的半抑制浓度IC50。
优选的一种实施案例，步骤S6中，CCK-8法利用含有WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]的试剂测定细胞活力，该试剂在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性、能溶解于组织培养基中的橙黄色甲瓒染料，用酶标仪在450nm波长处测定其OD值，具体操作方法为：取不同浓度的中药水煮液及中药单体试剂暴露24h后的细胞悬液各取100uL于96孔板中(除开96孔板最外一圈的孔)，每个浓度组做3～6个复孔，每孔避光加入10uL的CCK-8溶液，实验中同时设立正常细胞对照(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液和CCK-8)和空白对照(无细胞、加培养基和CCK-8)，将培养板置于28℃培养箱内避光静置孵育4h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度。利用公式计算细胞存活率：Cell viability/％＝(OD样品–OD空白)/(OD对照–OD空白)×100,并利用改良寇式法计算CC50(中位浓度即对50％的细胞产生细胞毒性时对应的药物浓度)。
优选的一种实施案例，步骤S8中，选用金鱼对多子小瓜虫的预防作用进行评估，方法为：根据药物对嗜热四膜虫的作用，设置浓度实验组，在饲料中添加药物，制成药饵，按照2％体重的量添加，喂养金鱼，评估药物预防金鱼感染小瓜虫的效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、采用可人工培养的嗜热四膜虫代替鱼纤毛类寄生虫，进行抗虫药物大通量筛选，受试材料随时可得，不受时间、温度、季节的限制，且具重复性好、经济适用快速的优点；
2、通过完整的嗜热四膜虫增殖的中草药半抑制浓度试验设计和计算方法能够快速得出嗜热四膜虫增殖的中药半抑制浓度，实验结果明确可靠；
3、采用CCK-8法检测中药对嗜热四膜虫的细胞活性，CCK-8试剂被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，可直接进行测定，实验误差也比较小、试验简便、快速；
4、结合活细胞密度的测定和CCK-8法细胞活力测定评估药物对嗜热四膜虫的作用，结果更加精确；
5、针对药物对嗜热四膜虫密度和CCK-8活性的半抑制浓度设计，在对鱼安全的预实验基础上将药物添加入鱼饲料用于预防金鱼感染多子小瓜虫的实验对本发明的方法进行验证，使得通过本发明筛选出的抗鱼感染寄生虫中草药得效果得到有效肯定，方法适用性高，具有推广价值。
附图说明
图1为本发明利用嗜热四膜虫筛选抗鱼感染纤毛类寄生虫中草药的技术路线示意图；
图2为本发明嗜热四膜虫Cu428.2在两种中草药水煮液中24h的活细胞密度和细胞活力；
图3为本发明嗜热四膜虫Cu428.2株在大黄3种单体中24h的活细胞密度和细胞活力。
图中：A为细胞计数法测量结果、B为CCK-8法测量结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，包括如下步骤：
S1、嗜热四膜虫的培养
将室温保存培养基中的嗜热四膜虫液1.0mL，转入装有9.0mL嗜热四膜虫培养基的黑盖瓶中，28℃～32℃100rpm条件下培养至对数期，再转接复苏后的嗜热四膜虫至含20mL嗜热四膜虫培养基的锥形瓶中培养至对数初期；
S2、嗜热四膜虫生长曲线的测定
按3000～5000cells/mL的起始密度接种嗜热四膜虫，设置3个平行，于28℃、100rpm的摇床中培养，0～72h间隔6h取一次样进行计数，84～144h间隔12h进行取样计数，144h后每隔24h计数，采用血球计数板或细胞计数仪计数，以时间为横坐标，嗜热四膜虫数为纵坐标，绘制嗜热四膜虫随浓度变化的生长曲线；
S3、中草药水煮液或中药单体试液的制备
(1)中草药水煮液制备
称取30g马蹄大黄粉末或青蒿粉末加入300mL蒸馏水浸泡30min～60min，加热至沸腾，文火30min～30min，纱布过滤，滤出药液，煎煮2次，合并2次滤液，浓缩成30mL，得到浓度为1g/mL的原药液，0.22um滤膜过滤除菌后，放置于4℃的冰箱保存，备用；
(2)中药单体试液制备
称取大黄酸(含量98.2％，粉末)、大黄素(含量99.93％，粉末)、芦荟大黄素(99.54％，粉末)，每种中药单体均称取100mg，加入10mL助溶剂DMSO，即刻加入无菌水90mL，配成含1.0mg/mL(1.0g/L)药液的母液备用，DMSO含量为0.1mL/mL(约为0.1mg/mL)；
S4、药物暴露
室温保存的嗜热四膜虫以5％的接种体积分数接种于100mL已灭菌的嗜热四膜虫培养基中，28℃～30℃、100～150rpm摇床培养，至对数生长期(24h～48h)，并进行细胞计数，再用嗜热四膜虫培养基稀释调整为10mL体系且浓度为1.0×104～6.0×104个/mL四膜虫细胞悬液，加入死亡率0％～100％之间、按等对数间距设置的5～6个浓度的S3所制受试药物，每个浓度组设置3个平行样，并设置空白对照(仅有培养基)及阴性对照(有培养基、嗜热四膜虫，不加药物)，于28℃～32℃、100～150rpm的摇床中培养暴露处理24h；
S5、药物抑制生长的测定
取步骤S4中各浓度药物暴露处理24h的嗜热四膜虫试液，对活细胞数量进行细胞计数，每个样品计数3次，然后以药物浓度为横坐标，活的嗜热四膜虫数为纵坐标，绘制曲线，用SPSS软件分析药物抑制嗜热四膜虫生长的半数抑制浓度(IC50),结果用平均值和标准方差(Mean±SD)表示；
S6、CCK8细胞活力的测定
利用含有WST-8的试剂测定CCK8细胞活力，用酶标仪在450nm波长处测定其OD值，从而测定细胞活力随药物浓度的变化，用SPSS软件计算CC50(对50％的嗜热四膜虫产生细胞毒性时对应的药物浓度)，结果用平均值和标准方差(Mean±SD)表示；
S7、结果判定
综合药物抑制嗜热四膜虫生长的半抑制浓度(S5中IC50)和CCK8细胞活力的测定方法(S6中CC50)的浓度进行确定，评估中药对嗜热四膜虫的抑制杀灭效果；
S8、对寄生虫的作用
以嗜热四膜虫细胞增殖的半抑制浓度为基础，参考CCK8的细胞活性测定，设计药物浓度，在预实验对鱼体安全的前提下，添加入饲料中，评估鱼类对寄生虫的作用效果。
步骤S1中，嗜热四膜虫培养基原料组成包括：多价蛋白胨1.7～2.5％，酵母提取物1.7～2.5％，D-葡萄糖1.7～5.0％，1mL 0.9g/dL的三氯化铁存储液，在增加蒸馏水至1000mL，于121℃高温灭菌30min，凉后室温保存。
步骤S4和步骤S5中，细胞计数的方法为Count star自动细胞计数仪、BeckmanCounter细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数，嗜热四膜虫用乙醇、或结晶紫染液固定细胞后进行计数，数据存入电脑。
药物对嗜热四膜虫的抑制生长作用的具体操作为：吸取中草药水煮液1mL(相当于1g)，采用嗜热四膜虫培养液稀释，按等对数间距设置，终浓度为2g/L(即2mg/mL)、1.25g/L、0.8g/L、0.5g/L、0.32g/L的试液，中药单体有效成分经预备实验，亦按照等对数间距设置，分别稀释为合适的5个～6个浓度为50mg/L、32mg/L、20mg/L、12.5mg/L、8.0mg/L、5.0mg/L，同时设置相应的DMSO助溶剂作为对照，则其浓度相应为5.0mg/L、3.2mg/L、2.0mg/L、1.25mg/L、0.8mg/L、0.5mg/L，然后接种活跃生长的嗜热四膜虫Cu 428.2株，初始浓度约为1.0×104个/mL，28℃100rpm摇床培养24小时，用IC 1000Countstar自动细胞计数仪计数，利用SPSS软件计算中草药水提取对嗜热四膜虫的半抑制浓度IC 50。
步骤S6中，CCK-8法利用含有WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]的试剂测定细胞活力，该试剂在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性、能溶解于组织培养基中的橙黄色甲瓒染料，用酶标仪在450nm波长处测定其OD值，具体操作方法为：取不同浓度的中草药水煮液及中药单体试剂暴露24h后的细胞悬液各取100uL于96孔板中(除开96孔板最外一圈的孔)，每个浓度组做3～6个复孔，每孔避光加入10uL的CCK-8溶液，实验中同时设立正常细胞对照(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液和CCK-8)和空白对照(无细胞，加培养基和CCK-8)，将培养板置于28℃培养箱内避光静置孵育4h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度。利用公式计算细胞存活率：Cell viability/％＝(OD样品–OD空白)/(OD对照–OD空白)×100,并利用改良寇式法计算CC50(中位浓度即对50％的细胞产生细胞毒性时对应的药物浓度)。
活细胞计数法及CCK-8法分别测得的5种药物对嗜热四膜虫Cu428.2株的半抑制浓度如下表所示：
表1、活细胞计数法及CCK-8法分别测得的5种药物对嗜热四膜虫Cu428.2株的半抑制浓度
Figure BDA0002365858040000121
从图2、图3可以看出，采用细胞计数法与CCK-8法测活细胞密度有对应关系，随着药物(大黄水煮液、青蒿水煮液、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素)浓度的增加，采用计数法测量的嗜热四膜虫的活细胞密度、CCK-8法测量的细胞活力都降低。
针对2种中草药水煮液：采用细胞计数法，测得大黄比青蒿抑制作用较强；CCK-8法测得亦为大黄比青蒿抑制作用强。针对3种中药单体：采用细胞计数法，测得抑制作用由强到弱依次为：芦荟大黄素>大黄素>大黄酸；采用CCK8细胞活力测定法，为大黄素>芦荟大黄素>大黄酸。结果表明：两种方法测得的结果基本一致而有细微差别，结合两种方法评估药物对嗜热四膜虫的作用结果更加精确。
进一步的，检测嗜热四膜虫的细胞活性，常用的有四甲基偶氮唑盐(MTT)法，但与CCK-8法相比，由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而CCK-8试剂被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，可直接进行测定，实验误差也比较小，本发明的方案优越性明显。
步骤S8中，选用金鱼对多子小瓜虫的预防作用进行评估，方法为：根据药物对嗜热四膜虫的作用，设置浓度实验组，在饲料中添加药物，制成药饵，按照2％体重的量添加，喂养金鱼，药物预防金鱼感染小瓜虫的效果如表2，以10倍～20倍IC 50的比例添加在饲料中投喂，以体重计：大黄酸196.6mg/Kg、大黄素37.7mg/Kg、芦荟大黄素33.9mg/Kg，饲喂7天后感染多子小瓜虫，均有较好的预防作用。
表2.大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、预防金鱼感染多子小瓜虫的效果
Figure BDA0002365858040000131
Figure BDA0002365858040000141
综上所述，结合现有技术主要是采用感染寄生虫的鱼直接进行试验，因寄生虫必需借助于鱼体才能繁殖、不能体外培养的特性，试验对象不能随时获得，而且鱼体感染程度不同、药物对鱼体的作用个体差异较大，对寄生虫杀虫药物的筛选具有较大的难度。
本发明专利“采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法”，采用可人工培养的嗜热四膜虫代替鱼纤毛类寄生虫，进行抗虫药物大通量筛选。受试材料随时可得，不受时间、温度、季节的限制，且具重复性好、经济适用快速的优点
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、嗜热四膜虫的培养
将室温保存培养基中的嗜热四膜虫液1.0mL，转入装有9.0mL嗜热四膜虫培养基的黑盖瓶中，28℃～32℃100rpm条件下培养至对数期，再转接复苏后的嗜热四膜虫至含20mL嗜热四膜虫培养基的锥形瓶中培养至对数期；
S2、嗜热四膜虫生长曲线的测定
按3000～5000cells/mL的起始密度接种嗜热四膜虫，设置3个平行，于28℃、100rpm的摇床中培养，0～72h间隔6h取一次样进行计数，84～144h间隔12h进行取样计数，144h后每隔24h计数，采用血球计数板或细胞计数仪计数，以时间为横坐标，嗜热四膜虫数为纵坐标，绘制嗜热四膜虫随浓度变化的生长曲线；
S3、中草药水煮液或中药单体试液的制备
(1)中草药水煮液制备
称取30g中草药原药加入300mL蒸馏水浸泡30min～60min，加热至沸腾，文火30min～45min，纱布过滤，滤出药液，煎煮2次，合并2次滤液，浓缩成30mL，得到浓度为1g/mL的原药液，0.22um滤膜过滤除菌后，放置于4℃的冰箱保存，备用；
(2)中药单体试液制备
中药单体称取100mg，加入10mL助溶剂DMSO，即刻加入无菌水90mL，配成含1.0mg/mL(1.0g/L)药液的母液，DMSO含量为0.1mL/mL(约为0.1mg/mL)。
S4、药物暴露
室温保存的嗜热四膜虫以5％的接种体积分数接种于100mL已灭菌的嗜热四膜虫培养基中，28℃～30℃、100～150rpm摇床培养，至对数生长期(24h～48h)，并进行细胞计数，再用嗜热四膜虫培养基稀释调整为10mL体系且浓度为1.0×104～6.0×104个/mL四膜虫细胞悬液，加入死亡率0％～100％之间、按等对数间距设置的5～6个浓度的S3所制受试药物，每个浓度组设置3个平行样，并设置空白对照(仅有培养基)及阴性对照(有培养基、嗜热四膜虫，不加药物)，于28℃～32℃、100～150rpm的摇床中培养暴露处理24h；
S5、药物抑制生长浓度的测定
取步骤S4中各浓度药物暴露处理24h的嗜热四膜虫试液，对活细胞数量进行细胞计数，每个样品计数3次，然后以药物浓度为横坐标，活的嗜热四膜虫为纵坐标，绘制曲线，用SPSS软件分析药物抑制嗜热四膜虫生长的半数抑制浓度(IC50),结果用平均值和标准方差(Mean±SD)表示；
S6、CCK8细胞活力的测定
利用含有WST-8的试剂测定CCK8细胞活力，用酶标仪在450nm波长处测定其OD值，从而测定细胞活力随药物浓度的变化，用SPSS软件计算CC50(对50％的嗜热四膜虫产生细胞毒性时对应的药物浓度)，结果用平均值和标准方差(Mean±SD)表示；
S7、结果判定
综合药物抑制嗜热四膜虫生长的半抑制浓度(S5中IC50)和CCK8细胞活力(S6中CC50)的浓度进行确定，评估中药对嗜热四膜虫的抑制杀灭效果；
S8、对寄生虫的作用
以嗜热四膜虫细胞增殖的半抑制浓度为基础，参考CCK8细胞活力，设计药物浓度，添加入饲料中，评估鱼类对寄生虫的作用效果。
2.根据权利要求1所述的一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，其特征在于：步骤S1中，所述嗜热四膜虫培养基原料组成包括：多价蛋白胨1.7～2.5％，酵母提取物1.7～2.5％，D-葡萄糖1.7～5.0％，1mL 0.9g/dL的三氯化铁存储液存储液，在增加蒸馏水至1000mL，于121℃高温灭菌30min，凉后室温保存。
3.根据权利要求1所述的一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，其特征在于：步骤S3中(1)的中草药原药为中草药加工成的饮片或粉末，所述中草药为大黄饮片、青蒿饮片、马蹄大黄粉末、青蒿粉末中的一种或者几种；步骤S3中(2)的中药单体为大黄酸(含量98.2％，粉末)、大黄素(含量99.93％，粉末)、芦荟大黄素(99.54％，粉末)中的一种或者几种。
4.根据权利要求1所述的一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，其特征在于：步骤S4和步骤S5中，细胞计数的方法为Count star自动细胞计数仪、Beckman Counter细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数，嗜热四膜虫用乙醇、或碘液固定细胞后进行计数，数据存入电脑。
5.根据权利要求1所述的一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，其特征在于：步骤S5中，药物对嗜热四膜虫的抑制生长作用的具体操作为：吸取中药水煮液1mL(相当于1g)，采用嗜热四膜虫培养液稀释，按等对数间距设置，终浓度为2g/L(即2mg/mL)、1.25g/L、0.8g/L、0.5g/L、0.32g/L的试液，中药单体有效成分经预备实验，亦按照等对数间距设置，分别稀释为合适的5个～6个浓度如为50mg/L、32mg/L、20mg/L、12.5mg/L、8.0mg/L、5.0mg/L，同时设置相应的DMSO助溶剂作为对照，则其浓度相应为5.0mg/L、3.2mg/L、2.0mg/L、1.25mg/L、0.8mg/L、0.5mg/L，然后接种活跃生长的嗜热四膜虫Cu 428.2株，初始浓度约为1.0×104个/mL，28℃100rpm摇床培养24小时，用IC 1000 Countstar自动细胞计数仪计数，利用SPSS软件计算中草药水提取对嗜热四膜虫的半抑制浓度IC50。
6.根据权利要求1所述的一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，其特征在于：步骤S6中，CCK-8法利用含有WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]的试剂测定细胞活力，该试剂在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性、能溶解于组织培养基中的橙黄色甲瓒染料，用酶标仪在450nm波长处测定其OD值，具体操作方法为：取不同浓度的中药水煮液及中药单体试剂暴露24h后的细胞悬液各取100uL于96孔板中(除开96孔板最外一圈的孔)，每个浓度组做3-6个复孔，每孔避光加入10uL的CCK-8溶液，实验中同时设立正常细胞对照(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液和CCK-8)和空白对照(无细胞、加培养基和CCK-8)，将培养板置于28℃培养箱内避光静置孵育4h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度。利用公式计算细胞存活率：Cellviability/％＝(OD样品–OD空白)/(OD对照–OD空白)×100,并利用改良寇式法计算CC50(中位浓度即对50％的细胞产生细胞毒性时对应的药物浓度)。
7.根据权利要求1所述的一种采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法，其特征在于：步骤S8中，选用金鱼对多子小瓜虫的预防作用进行评估，方法为：根据药物对嗜热四膜虫的作用，设置浓度实验组，在饲料中添加药物，制成药饵，按照2％体重的量添加，喂养金鱼，评估药物预防金鱼感染小瓜虫的效果。
CN202010035541.3A 2020-01-14 2020-01-14 采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法 Pending CN111197067A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010035541.3A CN111197067A (zh) 2020-01-14 2020-01-14 采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法
AU2020102410A AU2020102410A4 (en) 2020-01-14 2020-09-24 Method for screening chinese herbal medicine ingredients resistant to ciliated parasites of fishes by using tetrahymena thermophila

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010035541.3A CN111197067A (zh) 2020-01-14 2020-01-14 采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111197067A true CN111197067A (zh) 2020-05-26

Family

ID=70742068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010035541.3A Pending CN111197067A (zh) 2020-01-14 2020-01-14 采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN111197067A (zh)
AU (1) AU2020102410A4 (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080241075A1 (en) * 2006-09-16 2008-10-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Parasite Vaccine
CN102286530A (zh) * 2011-06-16 2011-12-21 中国科学院水生生物研究所 一步法引入外源基因的四膜虫表达载体及构建方法和应用
CN107157968A (zh) * 2017-05-18 2017-09-15 暨南大学 大黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用
CN108619384A (zh) * 2018-07-25 2018-10-09 贵州贵丰农业发展有限公司 一种防治甲鱼寄生虫病的方法
CN108653261A (zh) * 2018-05-04 2018-10-16 浙江省淡水水产研究所 6-正戊氧基大黄酸在防治水霉病和小瓜虫病中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080241075A1 (en) * 2006-09-16 2008-10-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Parasite Vaccine
CN102286530A (zh) * 2011-06-16 2011-12-21 中国科学院水生生物研究所 一步法引入外源基因的四膜虫表达载体及构建方法和应用
CN107157968A (zh) * 2017-05-18 2017-09-15 暨南大学 大黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用
CN108653261A (zh) * 2018-05-04 2018-10-16 浙江省淡水水产研究所 6-正戊氧基大黄酸在防治水霉病和小瓜虫病中的应用
CN108619384A (zh) * 2018-07-25 2018-10-09 贵州贵丰农业发展有限公司 一种防治甲鱼寄生虫病的方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QIAO YE等: "Effects of gelsemine on oxidative stress and DNA damage responses of Tetrahymena thermophila", 《PEERJ.》 *
张国红: "中草药在鱼病防治中的应用", 《中国水产》 *
李一鸣等: "当归补血汤作用于四膜虫抗氧化基因――抗氧化药物筛选新方法初探", 《中国现代中药》 *
潘厚军等: "小瓜虫疫苗研究进展及突破方向――访美小瓜虫研究机构思考", 《广东农业科学》 *
王健华: "青蒿末治疗鱼类斜管虫病养殖试验总结", 《河南水产》 *
王维新等: "水产动物疾病无公害防治技术应用进展", 《安徽农业科学》 *
董姗姗等: "草铵膦对四膜虫毒性作用的研究", 《生物学杂志》 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020102410A4 (en) 2020-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104814984A (zh) 甲病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用
CN105596419A (zh) 一种能提高罗非鱼抗病能力的复方中草药制剂及其应用
CN109266559B (zh) 一种哈茨木霉ltr-2的应用
CN111197067A (zh) 采用嗜热四膜虫筛选抗鱼纤毛类寄生虫中草药成分的方法
CN106177187A (zh) 具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物
CN108785291A (zh) 竹红菌素在制备抗白色念珠菌的产品中的应用
CN102273456B (zh) 一种β-间二羟基苯甲酸大环内酯衍生物在有害螺类防治中的应用
CN102038678A (zh) 二氢青蒿素在制备诱导肿瘤细胞自噬药物中的应用
CN106177035B (zh) 具有降血糖、抗癌的月季花有效提取物的制备方法及应用
CN111544440A (zh) 地奥司明及组合物在制备抗肥胖的产品方面中的应用
CN101461817A (zh) 1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖的用途
CN105381024A (zh) 一种用于治疗鸡球虫病的药物组合物及其制备方法
CN104984334B (zh) 一种狂犬病弱毒苗-吡喹酮复合剂及其制备方法与应用
CN104138396A (zh) 白囊耙齿菌在制备抗疲劳保健品中的用途
CN112891343B (zh) 3-吲哚乙腈在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用
CN105434895A (zh) 一种天麻景天膏及其制备方法
CN108743792A (zh) 有利于提神醒脑的抗疲劳中药合剂及其制备方法
CN115737646B (zh) Mefloquine Hydrochloride在制备抗肠道病毒药物中的应用
CN103638068A (zh) 舌状蜈蚣藻提取物及其制备方法和应用
CN117797147B (zh) 小檗碱类衍生物在制备用于预防或治疗疟疾的药物中的应用
CN113181229B (zh) 甘蓝型油菜-菘蓝G单体附加系在抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2中的应用
CN103397072B (zh) 一种用于粪便标本的念珠菌选择培养基及其制备方法
CN101880705A (zh) 一种用于筛选抗肿瘤药物的微生物筛选模型
CN106039164A (zh) 一种用于治疗鸡球虫病的中药散及其制备方法
CN115006469A (zh) 一种辣椒抗肺癌药物及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination