CN117417902B - 一种重组致弱的猫传染性腹膜炎病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组致弱的猫传染性腹膜炎病毒及其应用，属于生物技术领域。所述重组致弱的猫传染性腹膜炎病毒构建方法包括：利用反向遗传操作平台，将质粒pBAC‑FIPV‑79S的ORF7a区域替换成NanoLuc序列，之后病毒拯救出重组猫传染性腹膜炎病毒。本发明通过对该重组病毒的生长特性测定，证实了ORF7a的缺失不会对病毒生长特性产生显著影响；该重组病毒的致病性结果证实ORF7a缺失显著降低了毒株的致病性。本发明提供的猫传染性腹膜炎病毒对猫具有安全性，对猫传染性腹膜炎病毒强毒株具有保护效果，具有作为弱毒疫苗的潜力。

Description

一种重组致弱的猫传染性腹膜炎病毒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组致弱的猫传染性腹膜炎病毒及其应用。
背景技术
猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)是一种可以引起猫慢性、进行性和致死性疾病的病毒，主要以腹膜炎症、脏器结节、胸腔积液以及致死率接近百分之百为主要特征。FIPV属于冠状病毒的一种，初期一般在口咽组织和肠道上皮细胞定殖；当猫在刺激因素下导致应激或免疫状态改变时会引起病毒复制和突变从而获得突破肠道屏障的能力，此时病毒具有巨噬细胞嗜性，可以在各种内脏器官中复制最终导致病毒性结节或肉芽肿损伤。同时根据产生血清抗体的不同，FIPV被分为两种血清型；I型是在世界范围内主要流行的血清型，Ⅱ型在部分亚洲国家呈零星分步。猫传染性腹膜炎(FIP)按照临床特征可分为非渗出性(干性)和渗出性(湿性)，两种形式都是由FIPV引起的，患病猫的具体表现形式主要取决于病毒以及猫自身的免疫状况。
目前对于猫传染性腹膜炎的治疗方式主要有两种：其一是对症治疗，一般使用免疫刺激因子或免疫调节类药物改善机体免疫状况，但该方式只能延缓死亡，并不能降低FIP的死亡率；其二是抗病毒药物的使用，主要指病毒复制蛋白酶抑制剂以及核酸类似物等，通过影响病毒本身复制的方式来治疗FIP，这种治疗方式可以有效降低死亡率，但受限于药物价格高昂且并未获得生产许可，同样不适合广泛使用。基于以上现状，亟需开发一种具有保护效果的FIP疫苗。
通过对FIPV基因组结构进行分析和研究可发现：FIPV基因组主要包括非结构蛋白编码基因(nsp，non-structural protein)，结构蛋白S、N、M和E编码基因，以及开放阅读框3和7编码基因(open reading frame，ORF3、ORF7)。ORF7基因又可以细分为ORF7a和ORF7b基因，先前未见有相关研究报道ORF7a缺失或替换对其病毒本身复制和毒力的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组致弱的猫传染性腹膜炎病毒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的猫传染性腹膜炎病毒对猫具有安全性，对猫传染性腹膜炎病毒强毒株具有保护效果，具有作为弱毒疫苗的潜力。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种重组猫传染性腹膜炎病毒，构建方法包括：利用反向遗传操作平台，将质粒pBAC-FIPV-79S的ORF7a区域替换成NanoLuc序列，之后病毒拯救出所述重组猫传染性腹膜炎病毒；
所述质粒pBAC-FIPV-79S是将QS病毒的全长基因组序列导入BAC质粒中，再将Spike片段替换为791146S片段；
所述QS病毒的全长基因组序列在GenBank的登录号为MW030108；
所述Spike片段的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述791146S片段的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述NanoLuc序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供所述的重组猫传染性腹膜炎病毒在制备治疗或预防猫传染性腹膜炎病毒的药物中的应用。
进一步地，所述预防猫传染性腹膜炎病毒的药物包括猫传染性腹膜炎病毒疫苗。
进一步地，所述猫传染性腹膜炎病毒疫苗包括全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗或基因工程疫苗。
本发明还提供一种制备猫传染性腹膜炎病毒疫苗的方法，包括将所述的重组猫传染性腹膜炎病毒与医学上常见的免疫佐剂合并，制备成猫传染性腹膜炎病毒疫苗。
进一步地，所述免疫佐剂包括MONTANIDE ISA 206、MONTANIDE ISA 201、MONTANIDE GEL 01ST、氢氧化铝胶佐剂、明矾、弗氏佐剂、脂多糖、胆固醇、植物油或细胞因子中的任意一种或几种。
本发明还提供一种降低猫传染性腹膜炎病毒毒力的方法，包括通过基因编辑技术使猫传染性腹膜炎病毒基因组中的ORF7a区域缺失。
进一步地，所述使猫传染性腹膜炎病毒基因组中的ORF7a区域缺失包括将所述ORF7a区域替换为NanoLuc序列；所述NanoLuc序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述猫传染性腹膜炎病毒包括重组病毒。
进一步地，所述重组病毒包括将QS病毒的Spike片段替换为791146S片段后，获得的重组病毒；
所述QS病毒的全长基因组序列在GenBank的登录号为MW030108；
所述Spike片段的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述791146S片段的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用反向遗传操作平台，将质粒pBAC-FIPV-79S的ORF7a区域替换成NanoLuc序列，之后病毒拯救出重组猫传染性腹膜炎病毒FIPV-79S-Δ7a，通过对该重组病毒的生长特性测定，证实了ORF7a的缺失不会对病毒生长特性产生显著影响；该重组病毒的致病性结果证实ORF7a缺失显著降低了毒株的致病性，说明ORF7a是该毒株比较重要的毒力影响因子之一；免疫后攻毒的结果显示50％的猫在攻毒后一个月仍然存活，这证明了ORF7a缺失毒株具有作为弱毒疫苗的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为重组质粒pBAC-FIPV-79S-Δ7a的构建策略图；
图2为重组毒株FIPV-79S-Δ7a的拯救结果，其中比例尺＝200μm；
图3为重组毒株FIPV-79S-Δ7a与FIPV-79S的体外生长特性对比；
图4为重组毒株FIPV-79S-Δ7a作为弱毒疫苗接种方案的安全性评价；
图5为重组毒株FIPV-79S-Δ7a与FIPV-79S引起的猫脏器病变对比；
图6为重组毒株FIPV-79S-Δ7a对强毒株FIPV-79S的保护效果评价；
图2～图6中，WT代表FIPV-79S对照组；Δ7a代表FIPV-79S-Δ7a实验组。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中质粒pBAC-FIPV-79S来源于华中农业大学彭贵青教授团队，是先将QS基因(GenBank：MW030108)构建到BAC载体上，获得含有QS全基因组的pBAC-FIPV质粒，再利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将Spike片段(SEQ ID NO.1)替换为791146(GenBank：MW030109)的S片段(791146S，SEQ ID NO.2)，最终构建出pBAC-FIPV-79S质粒。相关构建方法公开在文献“Wang G,Hu G,Liang R,Shi J,Qiu X,YangY,Jiao Z,ChenY,ShenZ,Li M,Shi Y,Mao J,Peng G.Establishment ofFull-Length cDNA Clones and anEfficient Oral Infection Model for Feline Coronavirus in Cats.J Virol.2021Oct13；95(21):e0074521.doi:10.1128/JVI.00745-21.Epub 2021Aug 18.PMID:34406859；PMCID:PMC8513462.”中。
HEK-293T细胞和CRFK细胞购买于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，随后在彭贵青教授实验室进行适应性培养(无特殊说明情况下细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中培养)。
实施例1重组质粒pBAC-FIPV-79S-Δ7a的构建策略
重组质粒pBAC-FIPV-79S-Δ7a的构建策略如图1所示：在ORF7a两端设计特异性sgRNA，随后利用CRISPR-Cas9酶将ORF7a区域替换为Nanoluc序列，得到重组质粒。
1)使用http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/网站在线设计ORF7a两端的sgRNA，并将设计好的正反向sgRNA(sgRNA-F和sgRNA-R)融合，使用T7转录酶体外转录，随后CP回收产物，-20℃保存待用。
sgRNA-F:5’-ATTGTCTGTAACTCTTGTAG-3’(SEQ ID NO.4)
sgRNA-R:5’-CTCCTTGTGTGTGTTTTCT-3’(SEQ ID NO.5)
2)配置酶切体系对pBAC-FIPV-79S质粒酶切5h(Buffer 5μL；质粒2μg；sgRNA各1μL；CRISPR-Cas9酶2μL；补水至50μL)，随后CP回收酶切产物。
3)将回收的线性化pBAC-FIPV-79S质粒与PCR扩增后带有同源臂的Nanoluc片段进行同源重组，37℃30min(Buffer 2μL；线性化BAC载体50ng；片段100ng；连接酶1μL；补水至10μL)。
4)将步骤3得到的重组产物加入到DH10BAC感受态中，42℃热激90s，冰浴3min；将感受态涂布到氯霉素抗性的LB固体培养平板中，平板在37℃培养箱中倒置培养16h，挑取单个菌落加入5mL氯霉素抗性的LB液体培养基中扩大培养，12h后提取重组质粒pBAC-FIPV-79S-Δ7a(详细操作流程见Omega质粒提取试剂盒说明书)。
5)重组质粒鉴定：取重组后的pBAC-FIPV-79S-Δ7a质粒当作模板，PCR扩增Nanoluc片段，随后将扩增产物送至生工生物工程股份有限公司测序并与原序列对比，结果一致显示重组质粒构建成功。
Nanoluc核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2重组毒株FIPV-79S-Δ7a的拯救
1)将重组质粒pBAC-FIPV-79S-Δ7a与对照质粒BAC-FIPV-79S分别转染到密度约80％的HEK-293T细胞中(详细转染步骤见jetPRIME说明书)。
2)转染超过48h后，将转染细胞板冻融一次，6000r/min离心10min后，取上清分装待用。
3)待CRFK细胞长到密度约8％，将转染收集的上清接种至CRFK细胞中，24h后逐日观察细胞病变，结果如图2。图2表明，重组质粒与对照质粒都出现了明显膜融合病变，这表明成功拯救出重组病毒。
4)待细胞病变达80％以上，收集病毒悬液反复冻融一到三次，4℃离心机6000r/min离心10min，取上清记为第一代病毒，重组质粒组得到的第一代病毒记为FIPV-79S-Δ7a，对照质粒组得到的第一代病毒记为FIPV-79S，分装存于-80℃待用。
实施例3重组毒株FIPV-79S-Δ7a与FIPV-79S的体外生长特性对比
1)第一代病毒毒价测定：将第一代病毒用无血清DMEM进行10倍的倍比稀释(8个稀释度，每个稀释度8个重复)，将病毒稀释液加入铺好的96孔板CRFK细胞中，24h后观察记录细胞病变并按照Reed-Muench两氏法进行病毒毒价计算。
2)分别用FIPV-79S-Δ7a和FIPV-79S两种病毒以MOI＝0.01感染48孔板中的CRFK细胞，孵育1h后换液，加入含有2％FBS的DMEM细胞维持液，每隔8h收集一次上清，存于-80℃(每个时间点4个重复)，一直持续到48h为止。
3)将上述不同时间点的病毒液冻融一次后用无血清DMEM进行10倍的倍比稀释(8个稀释度，每个稀释度4个重复)，随后将稀释液加入铺好的96孔CRFK细胞中，60h后观察并记录每个孔的细胞病变情况，用Reed-Muench两氏法进行病毒毒价的计算并绘制生长动力学曲线，结果见图3。
为了鉴定ORF7a对FIPV毒株的生长特性影响，本发明分别用FIPV-79S-Δ7a和FIPV-79S两株病毒感染了CRFK细胞，并在特定时间点检测了病毒滴度，绘制了病毒的生长曲线(图3)。结果表明，重组毒株(FIPV-79S-Δ7a)与亲本株(FIPV-79S)在48h内的生长特性无显著性差异，这表明ORF7a的缺失以及Nanoluc片段的插入并不影响重组病毒生长特性。
实施例4重组毒株FIPV-79S-Δ7a免疫接种方案及安全性评价
为了验证重组毒株FIPV-79S-Δ7a是否能够用做弱毒株免疫接种，本发明设计了以下接种方案，并做了安全性评价用于评估重组毒株安全性。
1)将10只成年猫随机分为两组：FIPV-79S-Δ7a实验组和FIPV-79S对照组，各5只猫，分别编号1-5和6-10。
2)攻毒前使用RT-PCR分析每只猫对猫冠状病毒(FCoV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猫疱疹病毒(FHV)以及猫白血病病毒(FeLV)等病原的感染情况，阴性猫可用于后续实验。两组猫放在不同的房间单独的笼子中，实验中专人专组每天饲喂2次猫粮及饮水，同时清理猫砂盆。
3)FIPV-79S-Δ7a实验组口服1mL病毒液体(FIPV-79S-Δ7a毒株1×105.5Tcid50/mL)，FIPV-79S对照组口服1mL强毒株(FIPV-79S毒株1×105.5Tcid50/mL)，连续免疫三次每次间隔21天。
4)每日对猫的精神状态、食欲、体温体重等指标进行记录打分，同时每天记录猫的死亡淘汰情况。
5)第三次免疫结束21天后，从两组猫中选取合适数量的猫进行安乐，并采集心、肝、脾、肺、肾和肠系膜淋巴结等组织以便用于组织含毒量和组织病理学检测，本发明中仅展示器官病变对比作为免疫效果评价。
结果如图4所示，在免疫过程中FIPV-79S-Δ7a实验组1-5只猫存活率为100％，而FIPV-79S对照组的猫存活率为0％，证明了毒株FIPV-79S-Δ7a中ORF7a的缺失对于FIPV毒力具有显著影响，同时也说明毒株FIPV-79S-Δ7a具有作为弱毒苗免疫的潜力。
实施例5重组毒株FIPV-79S-Δ7a引起的猫脏器病变
免疫结束21天后，从FIPV-79S-Δ7a和FIPV-79S两组猫中选取合适数量的猫进行安乐，并采集心、肝、脾、肺、肾等组织以便用于安全性评估，本发明中仅展示器官病变对比作为免疫效果评价，结果如图5，FIPV-79S-Δ7a实验组猫各器官并无明显病变，FIPV-79S对照组在肝脏、脾脏、肾脏等器官均产生明显病变，这证明了重组毒株FIPV-79S-Δ7a的安全性。
实施例6重组毒株FIPV-79S-Δ7a对强毒株FIPV-79S的保护效果评价
为了进一步验证FIPV-79S-Δ7a是否对于FIPV-79S毒株有一定的免疫效果，在完成了安全性实验后继续进行免疫保护效果评价，试验方案如下。
1)将安全性试验后存活的FIPV-79S-Δ7a实验组中剩余的猫1-4号用于后续的免疫保护效果评价，每只猫口服强毒FIPV1 mL(1×105.5Tcid50/mL)。
2)每日对猫的精神状态、食欲、体温体重等指标进行记录打分，同时每天记录猫的死亡淘汰情况。攻毒21天后，从1-4号猫中选取2只猫进行安乐，并采集心、肝、脾、肺、肾和肠系膜淋巴结等组织以便用于组织含毒量和组织病理学检测。
结果如图6所示，口服强毒株FIPV-79S后，FIPV-79S-Δ7a组1-4只猫存活率为50％，证实了重组毒株FIPV-79S-Δ7a作为弱毒疫苗连续接种三次针对FIPV-79S强毒株能够产生一定的保护效果。
Spike片段序列(SEQ ID NO.1)：
ATGATTGTATTACTACTTGCACTCCTTAGCACTGTCAGCTCTGAAGATGCTCCTCATTGTGTTACTCTACCTCAATTTAACACGTCACATGACAATCCGAAGTTTGAACTTAATTTTTACAATTTCCTACAAACTTGGGACATACCACCAAATACCGAGACTATTCTTGGTGGTTATCTACCATATCGTGGTGACGGTGACAATTGTGGTTGGTATAACTTTGTTTATAGTAACTCAGTGGGTTCTAATGGCAAGTACTCATACATAAATACGCGGAACCTTAACATACCTAATGTTCATGGTGTGTACTTTGATGTACGTGAACACAACTCAGATGGAGAATGGGATACACGTGACCGTATTGGTTTGCTGATGTCAGTGCACGGACGTTCGCATTATAGTTTACTTATGTTTTTAGAAGATGATGTGGAAGCCAACGCACCAGATGTTGCTGTTAAGATTTGTAAGTGGCAACACTTGAGTGGTAACATAAGTAACTATCATGCGTGGTCTGCCAATTTAGGTGATGGTGGTCAATGCGTGTTTAACCGTAGGTTTTCGCTTGACACCGTATTGACCACAAATGACTTCTATGGTTTCCAATGGACTGACACCTATGTTGATATCTATCTTAGCGGCACTGTCACTAAAGTGTGGATTGAAAATGACTGGGATATTGTTGAGGCAAGTATCTCTTACAAGTGGAATAAGGTTAATTATGGTTACTACATGCAATTTGTTAACCGCACTACCTATTACACATACAATAGCACTGCTGGTTCAAATTATACGCACTTGCAGTTAAAAGAGTGCAATAGTGAGTATTGTGCTGGTTATGCTAAAAACGTCTTTGTGCCAATTGAAGGTAAAATACCGGAAAGCTTCTCCTTTAGTAACTGGTTTCTGCTATCAGATAAGTCCACTTTAGTGCAAGGACGTGTTCTTAGTAAACAGCCTGTTTTTGTACAATGCCTTAGGTCTGTACCAGCGTGGTCTAACAACACTGCTGTAGTGCATTTTAAAAATGATGTCTTCTGTCCTAACGTCGCGGCAGACGTTTTGAGATTCAATCTAAATTTTAGTGACACTGATGTTTATACAGATTCAATTAAAGATGACCAGTTGTATTTCACATTTGAAGATAATACAACTGCTTCCATAGCCTGTTACAGCAGTGCTAATGTCACTGATTTCCAGCCTGCAAATAATAGCGTTTCTCACATCCCATTTGGCAAAACTGATCATTCCTATTTTTGCTTTGCCAACTTTTCTCATTCTGTTGTGAGCAGACAGTTTTTGGGCATACTTCCACCAACTGTTCGAGAGTTTGCATTCGGTAGGGATGGATCCATTTTTGTTAATGGCTATAAATATTTCAGTTTACCACCTATTAAGAGTGTTAATTTCTCCATCAGTTCAGTTGAGCAGTATGGTTTTTGGACCATAGCTTATACTAACTATACAGATGTAATGGTGGATGTTAATGGCACTTTTATTACTAGGTTATTCTATTGTGATTCACCCCTCAATAGAATCAAGTGCCAACAGTTGAAGCATGAACTACCAGATGGGTTTTATTCAGCTAGCATGCTTGTTAAAAAGGATCTACCCAAAACATTTGTAACTATGCCACAGTTTTATAATTGGATGAATGTCACGCTACATGTCGTATTGAACGACACTGAAAAGAAAGCTGACATCATTTTAGCTAAGGCTGATGAGTTAGCATCACTTGCTGACATACA
CTTTGAAATAGAACAGGCTAATGGAAGTGTTACTAATGTCACTAGCATATGTGTGCAGGC
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GGGACCAGTGCACTGATTACAATATATATGGATTTCAGGGCACAGGCATTATTAGAAATA
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TGAGTTTGTAAATCACACACATTCAAGAAGATCACGTACGTCAACTTTGGAAACAGTAA
CTACCTACACTATGCCACAATTTTATTACATAACAAAGTGGAATAATGACACTTCGACTAA
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TTAATGTCACTAAAGTTGAAATTGTGGATGATAGTATTGGAGTTATTAAACCGGTCTCAA
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GGAACTCGCAACCGTTGAGAAGTTTAACAGCACCACTCTAGGTGGTGAAAAAATGGGT
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GTTGAAGATTTATTGTTCAATAAAGTGGTAACCAGTGGTCTTGGCACTGTGGATGATGAT
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GAAAAACTTCCAGGCTATTAGTGGTTCTATTGCTGAGATCTACAATAGACTGGAAAAAGC
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CTTATGTAAAATGGCCGTGGTATGTGTGGCTACTAATCGGTTTAGTAGTGGTCTTCTGCAT
ACCATTGTTACTATTTTGCTGTCTGAGTACTGGATGTTGTGGGTGCTTTGGTTGCCTTGTA
AGTTGTTGCAATTCTCTTTGTAGTAGAAGACAATTTGAAAGCTACGAACCTATCGAAAAGGTTCACATCCATTAA。
791146S片段序列(SEQ ID NO.2)：
ATGATTGTGCTCGTAACTTGCCTCTTGTTGTTATGTTCATACCACACAGTTTTGAGTACAACAAATAATGAATGCATACAAGTTAACGTAACACAATTGGCTGGCAATGAAAACCTTATCAGAGATTTTCTGTTTAGTAACTTTAAAGAAGAAGGAAGTGTAGTTGTTGGTGGTTATTACCCTACAGAGGTGTGGTACAACTGCTCTAGAACAGCTCGAACTACTGCCTTTCAGTATTTTAATAATATACATGCCTTTTATTTTGTTATGGAAGCCATGGAAAATAGCACTGGTAATGCACGTGGTAAACCATTATTATTTCATGTGCATGGTGAGCCTGTTAGTGTTATTATATCGGCTTATAGGGATGATGTGCAACAAAGGCCCCTTTTAAAACATGGGTTAGTGTGCATAACTAAAAATCGCCATATTAACTATGAACAATTCACCTCCAACCAGTGGAATTCCACATGTACGGGTGCTGACAGAAAAATTCCTTTCTCTGTCATACCCACGGACAATGGAACAAAAATCTATGGTCTTGAGTGGAATGATGACTTTGTTACAGCTTATaTTAGTGGTCGTTCTTATCACTTGAACATCAATACTAATTGGTTTAACAATGTCACACTTTTGTATTCACGCTCAAGCACTGCTACCTGGGAATACAGTGCTGCATATGCTTACCAAGGTGTTTCTAACTTCACTTATTACAAGTTAAATAACACCAATGGTCTAAAAACCTATGAATTATGTGAAGATTATGAACATTGCACTGGCTATGCTACCAATGTATTTGCTCCGACATCAGGTGGTTACATACCTGATGGATTTAGTTTTAACAATTGGTTCTTGCTTACAAATAGTTCCACTTTTGTTAGTGGCAGGTTTGTAACAAATCAACCATTATTGATTAATTGCTTGTGGCCAGTGCCCAGTTTTGGTGTAGCAGCACAAGAATTTT
GTTTTGAAGGTGCACAGTTTAGCCAATGTAATGGTGTGTCTTTAAATAACACAGTGGATG
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CATTTCCTATTGGTTGTATATCTTTTAATTTAACCACTGGTGTTAGTGGAGCTTTTTGGACA
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TTTTCAAGCCATTAGTAGTTCTATTAGTGATATTTATAACAGGCTTGACGAACTGAGTGCT
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CAGACTCTAACCAGACAAGCAGAGGTTAGGGCTAGTAGACAACTTGCCAAAGACAAGG
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TGTTGCAATTCTCTTTGTAGTAGAAGACAATTTGAAAGCTACGAACCTATCGAAAAGGTTCACATCCATTAA。
NanoLuc序列(SEQ ID NO.3)：
ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCG。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种重组猫传染性腹膜炎病毒，其特征在于，构建方法包括：利用反向遗传操作平台，将质粒pBAC-FIPV-79S的ORF7a区域替换成NanoLuc序列，之后病毒拯救出所述重组猫传染性腹膜炎病毒；
所述质粒pBAC-FIPV-79S是将QS病毒的全长基因组序列导入BAC质粒中，再将Spike片段替换为791146S片段；
所述QS病毒的全长基因组序列在GenBank的登录号为MW030108；
所述Spike片段的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述791146S片段的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述NanoLuc序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的重组猫传染性腹膜炎病毒在制备预防猫传染性腹膜炎病毒的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述预防猫传染性腹膜炎病毒的药物包括猫传染性腹膜炎病毒疫苗。
4.一种制备猫传染性腹膜炎病毒疫苗的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的重组猫传染性腹膜炎病毒与医学上常见的免疫佐剂合并，制备成猫传染性腹膜炎病毒疫苗。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫佐剂包括MONTANIDE ISA206、MONTANIDE ISA 201、MONTANIDE GEL 01ST、氢氧化铝胶佐剂、明矾、弗氏佐剂、脂多糖、胆固醇、植物油或细胞因子中的任意一种或几种。
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