JP6988015B1 - 耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株、その製造方法、及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
ニューカッスル病ウイルス突然変異株の転写プラスミドの構築及びウイルスレスキュー
突然変異スキームに従って、遺伝子合成方法で4種類の突然変異HN遺伝子配列(HN−P4、HN−PU4、HN−NU4、及びHN−UP4)を得た。HN−P4の突然変異スキームは、62番目のAがR、98番目のNがK、293番目のEがK、494番目のDがGに突然変異することである。HN−PU4の突然変異スキームは、3番目のRがS、197番目のRがI、203番目のHがN、495番目のKがVに突然変異することである。HN−UP4の突然変異スキームは、62番目のAがR、280番目のQがR、353番目のQがR、570番目のGがRに突然変異することである。HN−NU4の突然変異スキームは、147番目のDがG、293番目のEがG、309番目のDがN、494番目のDがGに突然変異することである。それらをそれぞれTS09−C株の転写プラスミドにおけるHN遺伝子に置換し、図1に示すように、4種類の改変された転写プラスミド(pTS−HN−P4、pTS−HN−PU4、pTS−HN−NU4、及びpTS−HN−UP4)を得た。改変された転写プラスミドと補助プラスミドをBHK−21細胞に共トランスフェクションし、それぞれrTS−HN−P4(対照例)、rTS−HN−PU4(本発明)、rTS−HN−NU4(対照例)、及びrTS−HN−UP4(対照例)の4株の耐熱性改変されたニューカッスル病ウイルス突然変異株を得た。上記の4種類の突然変異ウイルスの構築とレスキュースキームでは、会社に送って合成する配列に違いがある以外、残りの操作はほぼ一致している。
突然変異HN遺伝子配列を会社に送って合成し、突然変異HN配列を含むTベクターをテンプレートとして、突然変異HN遺伝子を増幅する上流プライマー配列を配列番号2とし、突然変異HN遺伝子を増幅する下流プライマー配列を配列番号3(1番目から15番目の塩基はInfusionクローニング連結のための相同配列である)とする特異的プライマーを設計した。高忠実度DNAポリメラーゼPrimeSTAR(登録商標)GXL DNA Polymeraseを用いて改変HN遺伝子を増幅した。PCR産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、DNAゲル回収キットを用いて、特異的目的バンドを回収して、突然変異HN遺伝子断片を得た。
TS09−C転写プラスミド中のHN遺伝子以外のすべての配列を増幅するための一対のPCRプライマーを設計して合成し(プライマーの5’末端に相同配列を導入し、改変されたHN遺伝子増幅産物と線形化クローニングベクターとの間に、互いに相同組換え可能な完全に一致する配列を持たせる)、このPCRプライマーは、TS09−C転写プラスミドを増幅する上流プライマー配列を配列番号4、TS09−C転写プラスミドを増幅する下流プライマー配列を配列番号5(1番目から15番目の塩基はInfusionクローニング連結のための相同配列である)とし、これらはすべて人工配列であった。PCR反応系は、5×PrimeSTAR GXL Buffer、dNTP Mixture(各2.5mM)、上下流Primer(0.2〜0.3μM)、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、H2O及びテンプレートからなる。PCR増幅条件は98℃10秒間、60℃15秒間、68℃1分間/kb、35サイクルであった。アガロースゲル電気泳動により目的バンドを検出し、PCR増幅バンドをDNA精製キットで精製して回収し、TS09−C株転写プラスミド(HN遺伝子を除く)の線形化産物を得た。
In−Fusion HD Cloning Kitの取扱書に従って、突然変異したHN遺伝子断片とTS09−C株転写プラスミドの線形化断片をIn−fusion連結し、DH5αコンピテント細胞に形質転換し、LB耐性プレートに塗布し、16時間反転培養後、単コロニーを選んでPCR同定を行い、陽性コロニーに対して拡大培養とプラスミドの抽出を行った。
陽性と同定された転写プラスミドをBam HI制限エンドヌクレアーゼで酵素切断同定を行ったところ、アガロースゲル電気泳動により検出されたバンドはすべて期待通りであった。転写プラスミドを会社に送ってシークエンシング分析を行ったところ、突然変異HN遺伝子を含む転写プラスミドの構築に成功したことを示した。
トランスフェクションの前日に生育状態の良好なBHK−21細胞を6ウェルプレートに移し、トランスフェクションの当日の細胞密度が80%程度に達することを確保し、HBSSで細胞を3回洗浄した後、2%血清を含むDMEM培地を交換し、同時に0.01MOIのポックスウイルスを加え、37℃で1時間インキュベートした。突然変異した転写プラスミドとNP、P、Lタンパク質をそれぞれ発現する3つの補助プラスミドとを、Lipofectamine3000トランスフェクション試薬を用いてBHK−21細胞にそれぞれ1.25μg、0.313μg、0.313μg、0.625μgのプラスミドの量で共トランスフェクションした。6時間のトランスフェクション後、HBSSで細胞を3回洗浄し、0.4μg/mL TPCKパンクレアチン、2%ペニスロマイシンの二重抗体を含むDMEMを交換し、細胞の病変状況を観察し、細胞が明らかな病変を示して脱落したときに、凍結融解を3回繰り返し、0.22μm孔径のフィルターを用いてポックスウイルスを除去し、9〜11日齢のSPFニワトリ胚において3回継代し、HA力価測定とRT−qPCR方法を用いてニューカッスル病ウイルスを同定した。正確であると同定されたニューカッスル病ウイルス突然変異株は、後続の研究に用いることができる。
ニューカッスル病ウイルス突然変異株の熱安定性試験
それぞれ4株のニューカッスル病ウイルス突然変異株に感染した尿膜液を、100μL/本、56℃の水浴で熱処理し、3回繰り返し、それぞれ0、2、5、10、15、30、60、120、180分間でウイルス尿膜液を取り出し、速やかに氷上に置き、ウイルスの血液凝固(HA)力価を測定し、力価の変化を統計して、表1を得た。表1に示すように、母株TS09−C株に比べて、rTS−HN−P4、rTS−HN−NU4及びrTS−HN−UP4株は、いずれもHA熱安定性が著しく低下しており、rTS−HN−PU4のみはHA熱安定性が大幅に向上した。このウイルス株は56℃で180分間熱処理した後、HA力価が3log2だけ低下したが、母株TS09−C株は0に低下した。対照LaSota株は5分間熱処理した後、1log2まで低下した。そのため、4株のニューカッスル病ウイルス突然変異株のうち、rTS−HN−PU4のみはHA熱安定性が著しく向上した。さらに4つの突然変異株の感染力耐熱性を測定し、56℃で対応する時間処理した後、勾配希釈してBHK−21細胞に接種し、そのTCID50力価の変化状況を測定し、感染力−耐熱性曲線をプロットし、感染力が1log10(90%)低下するのに要する時間T90を算出した。その結果、rTS−HN−P4、rTS−HN−NU4、rTS−HN−UP4、及びrTS−HN−PU4のT90は、それぞれ4.3、4.0、4.5、及び25.5分間であり、対照TS09−CとLaSota株のT90は、それぞれ12.7と1.5分間であった。このため、4株の突然変異株のうち、rTS−HN−PU4株のみは、熱安定性が著しく向上し、母株TS09−C株に比べて2.7倍(25.2/12.7))上昇し、一般的なLaSota株より17倍(25.2/1.5)上昇した。
ニューカッスル病ウイルスrTS−HN−PU4株の細胞増殖試験
点突然変異がrTS−HN−PU4株の細胞増殖力価に影響を与えるか否かを解析するために、rTS−HN−PU4株と母株TS09−C株の細胞上での増殖状況を比較した。希釈した2株のウイルスを緻密な単層に成長したBHK−21細胞に接種し、接種してから0、24、48、72、96時間後、細胞上清をそれぞれ採取した。採取した上清を10倍勾配希釈し、希釈度ごとに100μLを単層BHK−21細胞を含む96ウェルプレートに接種し、希釈度ごとに3回繰り返して、細胞病変状況からTCID50を計算して、ウイルスの成長動態曲線をプロットした。その結果、図2に示すように、rTS−HN−PU4株は細胞感染72時間後、基本的にプラットフォーム期に達し、力価が106.86TCID50/mlであり、母株TS09−C株の成長曲線と類似していた。したがって、点突然変異はrTS−HN−PU4株の細胞増殖力価に影響を与えなかった。
ニューカッスル病ウイルスrTS−HN−PU4株の病原性解析
rTS−HN−PU4株の病原性をウイルスのニワトリ胚の最小致死量の平均死亡時間(MDT/MLD)と脳内病原性指数(ICPI)で評価した。MDT/MLDの検出方法:rTS−HN−PU4株のウイルス尿膜液を10倍勾配希釈し、SPFニワトリ胚に100μL/枚で接種し、7日間連続観察し、ニワトリ胚の死亡時間を記録し、MDT/MLD値を算出した。ICPI検出方法:10倍勾配希釈したrTS−HN−PU4株のウイルス尿膜液を1日齢のSPF雛に10羽/群、接種量50μL/羽で接種し、1日1回観察し、ニワトリについて採点し、正常ニワトリは0、発病ニワトリは1、死亡ニワトリは2とした。合計8日間観察し、ICPI値を算出した。その結果、各希釈度のウィルスをニワトリ胚に120時間接種した場合、死亡せず、rTS−HN−PU4株のMDT/MLD値は120時間よりも大きく、ICPI値は0.00であった。母株TS09−C株のMDTも120時間よりも大きく、ICPI値は0.00であった。したがって、rTS−HN−PU4株は母株TS09−C株の弱毒性を保持した。
ニューカッスル病ウイルスrTS−HN−PU4株の免疫原性解析
点突然変異がrTS−HN−PU4株の免疫原性に影響を与えるか否かを解析するために、rTS−HN−PU4株のニワトリ免疫試験を実施した。2週齢のSPF雛を点鼻や点眼により106.0EID50/羽の用量で接種し、同時に、それぞれ母株TS09−C株と未免疫群の2つの対照群を設定した。免疫してから2週間後、翅静脈を介して採血し、血清を分離し、その血液凝固抑制抗体レベルを測定した。その結果、空白対照群を除いて、残りの2群はすべてHI抗体陽性であることを示した。これらのうち、TS09−C株免疫群の平均抗体レベルは23.6、rTS−HN−PU4群の平均抗体レベルは24.8であった。したがって、rTS−HN−PU4株は、母株TS09−C株よりもニワトリに対する免疫原性が高く、ニューカッスル病の耐熱性生ワクチンの候補株とすることができる。
(付記1)
耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株であって、中国典型培養物保蔵センターに保蔵され、保蔵アドレスは中国、武漢、武漢大学、保蔵番号はCCTCC NO:V202041であることを特徴とする耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4。
前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4は、ニューカッスル病ウイルスTS09−C株を母株として、そのHNタンパク質に、3番目のアルギニンからセリンへ、197番目のアルギニンからイソロイシンへ、203番目のヒスチジンからアスパラギンへ、495番目のリジンからバリンへ突然変異する4つのアミノ酸突然変異を導入し、耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4を得ることを特徴とする付記1に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4。
前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4のHNタンパク質の遺伝子配列は配列番号1であることを特徴とする付記1に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4。
ニューカッスル病ウイルスTS09−C株の転写プラスミドを構築するステップaと、
前記TS09−C株の転写プラスミドにおけるHN遺伝子の3番目、197番目、203番目及び495番目のアミノ酸を、それぞれセリン、イソロイシン、アスパラギン酸及びバリンに突然変異するステップbと、
突然変異した転写プラスミドを3つの補助プラスミドとともに宿主細胞にトランスフェクションし、前記耐熱性突然変異株を得るステップcと、
を備えることを特徴とする付記1から3のいずれか1つに記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4の製造方法。
ニューカッスル病の耐熱性生ワクチンの製造におけることを特徴とする付記1から3のいずれか1つに記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4の使用。
Claims (5)
- 耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株であって、中国典型培養物保蔵センターに保蔵され、保蔵アドレスは中国、武漢、武漢大学、保蔵番号はCCTCC NO:V202041であることを特徴とする耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4。
- 前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4は、ニューカッスル病ウイルスTS09−C株を母株として、そのHNタンパク質に、3番目のアルギニンからセリンへ、197番目のアルギニンからイソロイシンへ、203番目のヒスチジンからアスパラギンへ、495番目のリジンからバリンへ突然変異する4つのアミノ酸突然変異を導入し、耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4を得ることを特徴とする請求項1に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4。
- 前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4のHNタンパク質の遺伝子配列は配列番号1であることを特徴とする請求項1に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4。
- ニューカッスル病ウイルスTS09−C株の転写プラスミドを構築するステップaと、
前記TS09−C株の転写プラスミドにおけるHN遺伝子の3番目、197番目、203番目及び495番目のアミノ酸を、それぞれセリン、イソロイシン、アスパラギン酸及びバリンに突然変異するステップbと、
突然変異した転写プラスミドを3つの補助プラスミドとともに宿主細胞にトランスフェクションし、前記耐熱性突然変異株を得るステップcと、
を備えることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4の製造方法。 - ニューカッスル病の耐熱性生ワクチンの製造におけることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株rTS−HN−PU4の使用。
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