CN111304173A - 一种高效表达猪瘟e2-il1融合蛋白的重组cho细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种高效表达猪瘟e2-il1融合蛋白的重组cho细胞株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效表达猪瘟E2‑IL1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用。该重组CHO细胞株经载有人工合成的E2‑IL1基因序列的载体转染，通过单克隆细胞筛选，获得表达E2‑IL1融合蛋白的重组细胞株；扩大培养至6孔板阶段即可实现无血清悬浮培养，缩短了培养时间，提高了表达量；用该E2‑IL1融合蛋白与佐剂ISA 206 VG制成疫苗免疫仔猪能够同时诱导体液免疫和细胞免疫，血清学检测结果不仅能够产生并检测到针对E2的中和抗体，同时能够在血清中检测到较高的干扰素‑γ以及能够检测到较强的淋巴细胞增殖反应。本发明构建的重组CHO细胞株不仅能够高表达E2‑IL1融合蛋白，而且可以实现抗原蛋白的无血清、大规模、稳定生产，该细胞株可以应用于猪瘟E2亚单位疫苗的研发。

Description

一种高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构 建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
猪瘟病毒(CSFV)传染性强，传播速度快，分布范围广，给养殖业带来很大经济损失。我国从1956年开始提出猪瘟净化，如今猪瘟仍在我国不间断流行。目前市场上在售的猪瘟疫苗均为传统疫苗包括猪瘟灭活疫苗和猪瘟弱毒活疫苗。全病毒疫苗虽然免疫效果好，但是由于其存在灭活不彻底，毒力返强，基因突变造成新的毒株出现等风险，另外也由于全病毒疫苗无法区别免疫与野毒感染，为猪瘟净化带来困难。随着猪瘟净化的日趋紧迫，猪瘟病毒亚单位疫苗成为未来市场的一个焦点。
CSFV为有囊膜单股正链RNA病毒，其中结构蛋白E2分子量为55kDa，是保守性最低、最易变异的分子，也是最主要的免疫保护性蛋白。
白细胞介素-1(IL-1)又称淋巴细胞激活因子，成熟的白介素-1分子可以诱导白介素-2的释放、促进B细胞成熟与增殖、干扰素-γ产生，从而进而影响机体的免疫反应。
CHO细胞为上皮贴壁型细胞，是由仓鼠卵巢分离获得，相较于其他的表达系统，CHO细胞能够对重组基因进行高效表达、并能够对表达蛋白进行翻译后修饰，其表达产物更接近于天然蛋白分子，作为疫苗能够产生更好的免疫攻毒保护。
CHO细胞包括DG44、DXB11、CHO K1等。基于CHO-K1细胞的表达平台多采用GS(谷氨酰胺合成酶)筛选系统和/或抗生素筛选系统。采用GS筛选系统的平台可在转入目的蛋白基因的同时转入GS基因，在筛选阶段采用不含谷氨酰胺的培养基进行筛选。但由于CHO-K1细胞具有内源的GS基因，因此在筛选时往往需要添加MSX甚至和一定量的抗生素同时筛选，以提高筛选效率，而且在工业生产过程中一旦添加MSX作为细胞毒物就很难去除。此外，由于内源GS基因的存在，筛选出的高表达克隆往往稳定性较差，后期培养过程中可能会因为MSX压力的消失外源蛋白产量降低，因此需要进行充分的稳定性评估后，方可用于后期的工艺开发及规模化生产。针对于筛选问题，于2012年已有研究机构对内源性的GS等位基因进行敲除，大大提高了筛选效率，缩短了稳定细胞株的开发周期，同时提升了最终克隆的稳定性，经过筛选CHO-GS-KO细胞株已经在全球应用于多个产品的开发。
目前猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗主要是杆状病毒源和大肠杆菌源，CN 7674883A公布了猪瘟病毒E2基因重组CHO疫苗制备方法。该蛋白只含有E2序列，该E2序列经过了密码子序列优化，其转染的细胞株为CHO-K1，另外其悬浮驯化过程相对较长。同时亚单位疫苗的一个技术瓶颈就是缺乏细胞免疫，造成攻毒保护不完全。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明专利设计了一种能够高效表达猪瘟E2-IL1蛋白的重组CHO细胞株，该细胞株命名为CHOB40-SE2S-IL1·His-131株，分类命名为中国仓鼠卵巢细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.19193，保藏日期为2019年12月6日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
同时本发明设计了上述重组CHO细胞株的构建方法，构建方法包括以下步骤，
(1)人工合成E2-IL-6His基因序列；
(2)HindⅢ和EcoRI酶切E2-IL1-6His序列和p1020载体序列，回收酶切后的E2-IL-6His和p1020片段，连接、转化、克隆PCR及测序验证，构建p1020-E2-IL1-6His表达载体；
(3)将p1020-E2-IL1-6His转染CHO-GS-KO-B40细胞株，通过培养、单克隆筛选获得高表达E2-IL1的细胞株CHO-B40-SE2S-IL1·His-131；
(4)CHO-B40-E2-IL1-131细胞株从96孔板到24孔板再到6孔板扩大培养，6孔板阶段能够实现完全悬浮无血清培养。
进一步的，人工合成的E2-IL1-6His基因序列为不含有跨膜区的猪瘟E2序列，该E2序列后面连接了IL1中的一段序列，大小为21bp以及6his序列，该序列如SEQ ID NO.1所示，该序列命名为E2-IL1-6His。本发明的E2-IL1-6His基因序列是将E2和IL-1序列融合表达。
同时本发明专利还设计将上述高效表达猪瘟E2-IL1蛋白的重组CHO细胞株用于制备猪瘟E2-IL1亚单位疫苗的方法，步骤为，将重组CHO细胞株CHOB40-SE2S-IL1·His-131经过无血清悬浮放大培养后，离心，取上清液测E2-IL1融合蛋白的含量，并与佐剂ISA206VG按1:1比例混合，得到重组猪瘟E2-IL1亚单位疫苗。
经上述方法制得的猪瘟病毒E2-IL1亚单位疫苗能够应用于制备猪瘟病毒诊断试剂。
相对于现有技术，本发明专利设计的高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株的进步之处在于，引入了IL1序列，可以更好的诱导细胞免疫；细胞株CHO-B40为敲除GS的CHO细胞株，筛选单克隆重组细胞株无需加压或者加抗生素进行筛选，且筛选的重组细胞株更加稳定；同时本发明在重组细胞株悬浮培养驯化过程中，扩大培养至6孔板阶段即可实现重组CHO细胞株的无血清悬浮培养，缩短筛选时间，降低成本，提高产量，更易产业化。同时本发明的E2-IL1蛋白的分子量在63kD左右，其糖基化更加完善，因此该E2-IL1蛋白可很好的应用于猪瘟病毒亚单位疫苗的研发中。同时用该E2-IL1融合蛋白与佐剂ISA206VG制成疫苗免疫仔猪能够同时诱导体液免疫和细胞免疫，血清学检测结果不仅能够检测到针对E2的中和抗体，同时能够在血清中检测到较高的干扰素-γ以及能够检测到较强的淋巴细胞增殖反应。本发明构建的E2-IL1融合蛋白的重组细胞株(CHOB40-SE2S-IL1·His-131株)不仅能够高表达E2-IL1融合蛋白，而且可以实现抗原蛋白的无血清、大规模、稳定生产。
附图说明
图1 P1020-E2-IL1-his以及P1020-E2-6his双酶切鉴定结果，其中M为MarkerBM8000，大小依次为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1-4依次为P1020-E2-IL1-his双酶切，P1020-E2-IL1-his环状质粒，P1020-E2-his双酶切，P1020-E2-his环状质粒。
图2细胞株CHO-B40-E2-56不同摇瓶发酵时间蛋白表达检测结果，其中M为Marker，大小依次为100KDa，75KDa，63KDa，48KDa，35KDa；5d-12d依次代表其培养天数。
图3细胞株CHO-B40-E2-IL1-131不同摇瓶发酵时间蛋白表达检测结果，其中M为Marker，大小依次为100KDa，75KDa，63KDa，48KDa，35KDa；5d-12d依次代表其培养天数。
图4是动物试验免疫后抗体效价检测结果
图5是2免21天淋巴细胞增殖反应试验结果
图6是2免后血清中IFN-γ检测结果
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明实施列中所使用的试剂均为市售产品。
本发明试剂、菌株和质粒来源名单如下：
本发明所用CHO-B40细胞及真核表达载体P1020由沈阳药科大学马宁宁实验室提供；
细胞培养基均购自壹生科(深圳)有限公司；
ISA 206 VG佐剂以及ISA 201VG佐剂购自于赛彼科(上海)特殊化学品有限公司；
96孔细胞培养板购自康宁公司；
猪瘟E2抗体购自MEDLAN公司；
IFN-γ细胞因子检测试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；
EasyPfu DNA聚合酶、dNTP以及核酸电泳Marker购于全式金生物技术公司；
感受态细胞DH5α购自于博迈德生物技术有限公司；
质粒小提试剂盒、质粒大提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和红细胞裂解液购自天根生化公司；
T4DNA连接酶和各种限制性内切酶购自NEB公司。
实施例1
E2-6His和E2-IL1-6His序列合成
参考猪瘟CSFV国内流行毒株E2序列，合成E2-6His和E2-IL1-6His
E2序列去除跨膜区，大小为1011个碱基；IL1序列大小为27个碱基，编码9个氨基酸；6his序列，大小为18个碱基，编码6个组氨酸。合成后的E2-6His和E2-IL1-6His，序列的两端分别含有HindⅢ和EcoRI酶切位点。E2-IL1-6His的序列如SEQ ID NO.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
P1020-E2-IL1-6his以及P1020-E2-6his重组质粒构建
HindⅢ和EcoRI酶切合成后的E2-6His和E2-IL1-6His序列以及真核表达载体p1020，回收酶切片段，然后连接，转化DH5α，克隆挑选，验证，测序，构建p1020-E2-6His及p1020-E2-IL1-6His真核表达载体。PCR、酶切、连接、转化、测序等均为分子生物学常规方法，具体请参考《分子克隆试验操作手册》。
实施例3
P1020-E2-IL1-6his及P1020-E2-6his重组质粒转染CHO-GS-KO细胞与单克隆筛选的建立
CHO-GS-KO细胞转染
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；配制300ml CSC03-Cl(含10％透析血清，无谷氨酰胺)；分装成2瓶，每瓶150ml，置于水浴锅预热至37℃。
(2)从37℃培养箱中取出处于对数生长期的细胞(30ml摇瓶培养)，混匀，在安全柜中取出100ul计数。
(3)根据细胞密度，取5x106个细胞至15ml离心管内，使用电转专用培养基洗2次，每次10ml，最后一次洗完弃去上清，保留细胞沉淀备用。
(4)稀释质粒，使用电转培养基稀释线性化质粒，使其浓度为0.5ug/ul，过滤除菌。
(5)分别取60ug质粒P1020-E2-IL1-6his和P1020-E2-6his加入至(3)中的细胞沉淀中；并分别补加电转专用培养基至总体积为400ul，吹吸混匀，静置1-2min。
(6)将(5)中混合液转移至电转杯中(2mm)，电转程序如下所示。
Figure BDA0002424186630000051
(7)将上述电转杯中悬液分别转移至预热好的150ml培养基中，充分混匀后，按照100ul每孔铺96孔板。
(8)铺板过程中观察孔板中细胞情况，铺板结束后，放入培养箱中培养。
单克隆筛选与检测
(1)电转后14d左右观察96孔板出孔情况，镜下检查并标记单克隆所在位置。
(2)待96孔板中单克隆生长至占1/3-1/2每孔时，弃掉培养基，向标记孔内加入40ul 0.25％trypsin-EDTA，室温消化3-5min左右，加入100ul过渡培养基(CSC03-CL与CDCHOKI按照1:1混合，含2％透析血清，该混合培养基无谷氨酰胺)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散，将细胞液转移至24孔板。
(3)待24孔板长满时，取上清，WB检测是否成功表达目标蛋白并比较产量。
(4)经筛选，共收获3株高表达猪瘟E2-IL1蛋白的细胞株，其编号分别为131#，195#，240#，最终使用131#进行发酵实验，命名为CHOB40-SE2S-IL1·His-131株其余两株细胞冻存。
同样的方法获得共收获3株高表达猪瘟E2蛋白的单克隆细胞株，其编号分别为56#，105#，203#，最终使用56#进行发酵实验，命名为CHO-E2-56，其余两株冻存备用。
实施例4
CHOB40-SE2S-IL1·His-131和CHO-E2-56细胞株悬浮培养
(1)将处于24孔板悬浮培养的CHOB40-SE2S-IL1·His-131以及CHO-E2-56细胞扩大6孔板培养，此时培养条件已进入到纯悬浮培样阶段(CDCHOK1，无谷氨酰胺，无血清)。
(2)培养3d后将处在6孔板培养阶段的2株细胞按照1:3进行扩孔培养。
(3)培养3d后观察细胞密度及状态，细胞生长良好，将3个孔中的细胞悬液收集至15ml离心管，800rpm，5min，收获细胞。
(4)离心结束后，弃去培养基，加入15ml新培养基重悬至125ml摇瓶培养并计数，调整细胞密度至0.5x106/ml，此时记为P0代。
(5)培养72h计数，此时细胞密度在3.5～5.0x106/ml，活率大于96％；按照0.5x106/ml转至250ml摇瓶进行扩大培养。
(6)培养72h后，取样计数，并按照0.5x106/ml起始密度扩出2瓶500ml摇瓶继续培养，其中1瓶作为种子细胞进行培养并建立细胞库，另外一瓶用于后续的发酵实验。
实施例5
细胞摇瓶发酵实验
(1)细胞株CHOB40-SE2S-IL1·His-131以及CHO-B40-E2-56培养72h后，取出500ml摇瓶，进行取样并计数。
(2)每隔24h测定培养基中葡萄糖浓度，当低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L。
(3)补料，按照体积比，补加3％NF604培养基。
(4)培养期间每天收获1ml培养上清，用于检测蛋白表达情况，持续至第12天。
(5)SDS-PAGE检测不同培养时间的蛋白表达量，用以确认生产工艺中的最佳生产条件，CHO-B40-E2-56株检测结果如图2所示，CHOB40-SE2S-IL1·His-131株检测结果如图3所示。
(6)采用Bradford法测定蛋白浓度，经检测CHO-B40-E2-56细胞株产量可达500mg/L；CHOB40-SE2S-IL1·His-131细胞株产量可达800mg/L(细胞株培养9天检测结果)。
实施例6
疫苗制备
取所需猪瘟E2和E2-IL1融合蛋白分别加入到ISA 201 VG佐剂以及ISA 206 VG佐剂中(体积比为1:1)，使蛋白终浓度为25ug/ml，乳化、质检合格后置于4℃保存，全程无菌操作。
实施例7
免疫试验
筛选3-5周龄长白猪(猪瘟抗体抗原均阴性、圆环抗原阴性、蓝耳抗原阴性，42头)进行免疫试验，初免后3周(21天)加强免疫一次。采用颈部肌肉注射。实验共分7组(市场亚单位疫苗组，市场全病毒疫苗组；E2-201组；E2-IL1-201组；E2-206组；E2-IL1-206；阴性对照组。使用JNT试剂盒测定抗体效价。市场亚单位疫苗和市场全病毒疫苗购自市场，用量按照说明书进行。PHA植物血凝素，购自广州医药研究所。淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技发展公司。MTT四甲基偶氮唑盐，购自SIGMA公司。IFN-γ检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。
(1)分别于1免后21天及2免后21天采集全血后分离血清，使用猪瘟病毒(CSFV)ELISA抗体检测试剂盒检测抗体水平。
(2)图4结果显示：ISA-206佐剂组阻断率高于其它免疫组，最终使用ISA-206佐剂用于后续试验；同一种佐剂中，使用猪瘟E2与IL1融合蛋白作为抗原的阻断率高于使用猪瘟E2作为抗原的免疫组。
(3)淋巴细胞增殖反应试验：无菌条件下用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，离心收集细胞，离心，洗涤2次后，用完全RPMI-1640培养液悬浮细胞，细胞计数后，调节细胞浓度至1×106个/mL，将制备好的淋巴细胞加到96孔细胞培养板中，每孔加100ul(4×105个/mL)向各孔中加入PHA至终浓度为10ug/ml，37℃，5％C02孵育24h。每孔加入10ul MTT(5mg/ml，溶于灭菌生理盐水)，继续培养1h，加入100ul酸化的SDS，充分混合，以溶解甲瓒颗粒。在酶标仪上于570m处测定A值，减去培养液对照的A值，即为待测样品的A值。以刺激指数(SI)作为判断淋巴细胞转化成都的参数。
细胞增殖率(SI)＝(A实验一A对照)/A对照×100％。
图5淋巴细胞转化试验结果显示：E2-IL1-206-DC组显著优于E2-206-DC组。
(4)干扰素-γ测定
采用ELISA测定猪血清中干扰素-γ的含量。
图6结果显示：E2-IL1-206-DC组血清中IFN-γ水平高于E2-206-DC组。
本发明专利提供了一种制备猪瘟E2-IL1融合蛋白亚单位疫苗的方法，该方法将E2-IL1融合基因通过转染GS敲除细胞株获得表达E2-IL1的重组细胞株，该细胞株的筛选无需添加MSX或者抗生素，另外本发明所用细胞株在6孔扩大培养阶段即可实现重组细胞株的无血清悬浮培养，更利于工业化生产，本发明的E2-IL-1亚单位疫苗在引起高水平的体液免疫的同时，可协同增强疫苗诱导的细胞免疫应答，从而提供有效的免疫攻毒保护。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。
序列表
<110> 浙江鼎持生物制品有限公司 北京鼎持生物技术有限公司
<120> 一种高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用
<130> LP19111645-2
<141> 2020-03-24
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atggtgttaa gaggacaggt tgtgcaaggt gtaatatggc tgctgttggt gaccggggca 60
caagggcggt tgtcctgcaa ggaagactac aggtatgcca tatcatcaac caatgagata 120
gggccactag gggctgaagg tctcaccacc acctggaaag aatacaacca cggcctgcag 180
ctggacgacg ggactgtcag ggccatctgc accgcagggt ctttcaaagt tacagcactt 240
aatgtggtta gtaggaggta tctagcatca ttacataaga gggctttgcc cacctcagtt 300
acatttgaac tcctatttga tgggaccacc ccagtaattg aggaaatggt agatgacttt 360
gggtttgggc tatgcccttt tgacacaatc cctgtggtca aagggaagta caacactact 420
ttattaaacg gcagtgcttt ctatctagtc tgcccaatag ggtggacggg cgtcatagag 480
tgcacggcag tgagccccac taccttgaga agagaagtgg taaaaacctt taagagagag 540
aagcccttcc cgcacagagt ggattgcgtg accactatag tagaaagaga ggacctgttc 600
tactgcaagt tggggggcaa ttggacatgc gtgaaaggca acccggtgac ctacacgggg 660
gggcaagtaa agcaatgcag gtggtacggg ttcgacttca aagaacccga tgggctccca 720
cactacccca taggcaaatg catcctagca aatgagacgg gttacagggt agtggattcc 780
acagactgca acagagatgg tgttgttatc agtactgaag gagaacatga gtgtttgatc 840
ggcaacacca ccgtaaaagt acacgcgttg gatggaagac tggcccctat gccgtgtaga 900
cccaaagaaa tcgtctctag tgcgggacct gtaagaaaaa cttcttgcac tttcaactat 960
acaaagagtc taagaaacaa gtactatgag cctagggaca gctacttcca gcagtatatg 1020
cttaagggag agtaccaata ctggtttgat gtgcaaggtg acgactccaa caacaagcac 1080
caccatcacc accactaa 1098
<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Met Val Leu Arg Gly Gln Val Val Gln Gly Val Ile Trp Leu Leu Leu
1 5 10 15
Val Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly Leu
35 40 45
Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Asn His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly
50 55 60
Thr Val Arg Ala Ile Cys Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu
65 70 75 80
Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu
85 90 95
Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Thr Pro Val
100 105 110
Ile Glu Glu Met Val Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp
115 120 125
Thr Ile Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly
130 135 140
Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu
145 150 155 160
Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Arg Glu Val Val Lys Thr
165 170 175
Phe Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Val Asp Cys Val Thr Thr
180 185 190
Ile Val Glu Arg Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp
195 200 205
Thr Cys Val Lys Gly Asn Pro Val Thr Tyr Thr Gly Gly Gln Val Lys
210 215 220
Gln Cys Arg Trp Tyr Gly Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp Gly Leu Pro
225 230 235 240
His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg
245 250 255
Val Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr
260 265 270
Glu Gly Glu His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His
275 280 285
Ala Leu Asp Gly Arg Leu Ala Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile
290 295 300
Val Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe
325 330 335
Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Val Gln
340 345 350
Gly Asp Asp Ser Asn Asn Lys His His His His His His
355 360 365

Claims (5)

1.一种高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株，其特征在于，所述重组CHO细胞株名称为CHOB40-SE2S-IL1·His-131株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.19193。
2.一种高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株的构建方法，其特征在于，构建方法包括以下步骤，
(1)人工合成E2-IL1-6His基因序列；
(2)HindⅢ和EcoRI酶切E2-IL1-6His序列和p1020载体序列，回收酶切后的E2-IL-6His和p1020片段，连接、转化、克隆PCR及测序验证，构建p1020-E2-IL1-6His表达载体；
(3)将p1020-E2-IL1-6His转染CHO-GS-KO-B40细胞株，通过培养、单克隆筛选获得高表达E2-IL1的细胞株CHOB40-SE2S-IL1·His-131；
(4)将CHOB40-SE2S-IL1·His-131细胞株从96孔板到24孔板再到6孔板扩大培养，驯化3代，能够完全悬浮无血清培养。
3.根据权利要求2所述的高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株的构建方法，其特征在于，人工合成的E2-IL1-6His基因序列为不含有跨膜区的猪瘟E2序列，该E2序列后面连接了IL1中的一段肽序列，大小为27bp，编码9个氨基酸以及编码6个组氨酸的6his序列，该序列如SEQ ID NO.1所示，该序列命名为E2-IL1-6His。
4.根据权利要求1所述的高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株用于制备猪瘟E2-IL1亚单位疫苗的方法，其特征在于，将重组CHO细胞株CHOB40-SE2S-IL1·His-131经过无血清悬浮放大培养后，离心，取上清液，测E2-IL1融合蛋白的含量，并与佐剂ISA206 VG按1:1比例混合，得到重组猪瘟E2-IL1亚单位疫苗。
5.根据权利要求4所述的方法制得的猪瘟病毒E2-IL1亚单位疫苗在制备猪瘟病毒诊断试剂中的应用。
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