CN111925449A - 一种表达鸡vp2和鸡gal-1融合蛋白的重组cho细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种表达鸡vp2和鸡gal-1融合蛋白的重组cho细胞株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种表达鸡VP2和鸡GAL‑1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用。本发明通过电转含有VP2‑GAL1序列的真核表达载体，经过单克隆细胞筛选，获得表达鸡传染性法氏囊病毒VP2‑GAL1融合蛋白的重组细胞株，该细胞株可实现蛋白的无血清、大规模、稳定生产；用VP2‑GAL1蛋白与白油佐剂乳化制成疫苗免疫SPF鸡后能够产生较高的针对VP2的中和抗体，且攻毒保护率提高。本发明可以应用于鸡传染性法氏囊亚单位疫苗的开发。

Description

一种表达鸡VP2和鸡GAL-1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构 建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够高效表达鸡传染性法氏囊VP2和鸡GAL-1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
传染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious BursalDiseaseVirus,IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV是目前危害世界养禽业的三大主要传染病之一，在我国被农业部列为重点防御的二类烈性传染病。IBDV对雏鸡有高度感染性，其特征是通过破坏法氏囊中的B淋巴细胞来摧毁其淋巴器官。
IBDV属于双RNA病毒，主要有5种病毒蛋白，其中VP2占病毒蛋白的51％，是主要的结构蛋白，能够诱导中和抗体产生，是主要的保护性抗原。鸡的β-防御素-1(Gallinacin-1，GAL1)是禽体内发现的一种抗菌肽，主要表达在骨髓、气管、肝脏、肺脏、法氏囊及皮肤，对大肠杆菌、白色念珠菌、沙门氏菌等有抑菌作用。
市场上IBDV疫苗有全病毒弱毒活疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗。目前，弱毒活疫苗和灭活疫苗其安全性和制造工艺仍存在不足，如弱毒疫苗存在毒力返强及不同毒株基因重配的风险；灭活疫苗存在灭活不彻底，抗原制备困难等弊端。基因工程亚单位疫苗虽具有生物安全性高，操作简单，成本低等特点，但是其免疫保护率低是制约其发展的一大因素，因此提高亚单位疫苗免疫保护率成为研发重点。真核表达系统能够进行更准确的转录后修饰，保持抗原的天然结构，提高疫苗免疫原性；免疫佐剂及免疫增强剂的使用也在提高亚单位疫苗保护率方面起到关键作用。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明设计了一种鸡传染性法氏囊病毒VP2和鸡β防御素1的融合蛋白，所述融合蛋白为VP2-GAL1融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，编码该蛋白的基因序列如SEQIDNO.1所示。并设计了能够表达该鸡传染性法氏囊VP2和鸡GAL1融合蛋白的重组CHO细胞株，该细胞株为CHO-B40-VP2-GAL1-80#株，同时本发明细胞株以CHO-B40-VP2-80#命名保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，建议分类命名为中国仓鼠卵细胞，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo.19959。
同时本发明设计了上述重组CHO细胞株的构建方法，构建方法包括以下步骤，
(1)人工合成如SEQIDNO.1所示的基因序列VP2-GAL1，该序列含有临床分离的鸡IBDV流行毒株VP2蛋白的基因序列和鸡β-防御素-1的成熟蛋白基因GAL-1序列，两段序列间用一个短的linker连接，VP2-GAL1序列两端分别设有HindⅢ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点；
(2)使用HindⅢ和EcoRⅠ酶切上述VP2-GAL1序列和p1020载体，回收酶切后的VP2-GAL1序列和p1020载体片段，连接、转化、克隆PCR并进行测序验证，构建p1020-VP2-GAL1表达载体；
(3)使用p1020-VP2-GAL1表达载体转染CHO-GS-KO-B40细胞株，CHO-GS-KO细胞为内源性GS等位基因敲除细胞株，通过细胞培养、单克隆筛选获得高表达VP2-GAL1融合蛋白的细胞株CHO-B40-VP2-GAL1-80#；
(4)将CHO-B40-VP2-GAL1-80#细胞株从96孔板到24孔板再到6孔板进行扩大培养，驯化3代，得到能够完全悬浮无血清培养的细胞株。
同时本发明专利还设计将上述CHO-B40-VP2-GAL1-80#细胞株高效表达的VP2-GAL1融合蛋白用于制备IBDV亚单位疫苗的方法，步骤为，将重组CHO细胞株CHO-B40-VP2-GAL-1-80#经过无血清悬浮放大培养后，离心，收集细胞沉淀，用PBS溶解。测VP2蛋白琼扩效价，并与白油佐剂按1:2比例混合，得到鸡传染性法氏囊VP2-GAL1亚单位疫苗。所述VP2-GAL1融合蛋白琼扩效价为1:8～1:32，优选的，琼扩效价为1:16。
经上述方法制得的IBDVVP2-GAL1亚单位疫苗用来预防鸡传染性法氏囊病毒引起的相关疾病。
相对于现有技术，本发明专利的进步之处在于，选用的CHO细胞株为哺乳动物细胞株CHO-GS-KO，CHO-GS-KO细胞为内源性GS等位基因敲除细胞株，该细胞株在筛选克隆过程中无需添加抗生素或者MSX，提高了筛选效率，缩短了稳定细胞株的开发周期，同时提升了细胞株的稳定性；获得的CHO-B40-VP2-GAL1-80#细胞株能够高效表达鸡VP2-GAL1融合蛋白；利用该融合蛋白制备的疫苗经皮下注射后，疫苗注射SPF鸡产生较高的中和抗体，对IBDV强毒BC6-85攻击具有坚强的抵抗力，免疫保护率提高。
附图说明
图1质粒P1020-VP2-GAL1双酶切鉴定结果，其中M为MarkerBM8000，大小依次为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1-2依次为P1020-VP2-GAL1双酶切，P1020-VP2-GAL1环状质粒。
图2 VP2蛋白和VP2-GAL1融合蛋白WB检测结果，其中M为Marker，大小依次为100KDa，75KDa，63KDa，48KDa，35KDa。泳道1-3为VP2蛋白检测结果，泳道4-6为VP2-GAL1融合蛋白检测结果，一抗为VP2单抗。
图3 VP2-GAL1抗原琼扩效价检测结果。
图4 VP2抗原琼扩效价检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明实施列中所使用的试剂均为市售产品。
本发明试剂、菌株和质粒来源名单如下：
本发明所用CHO-GS-KO-B40细胞及真核表达载体P1020由沈阳药科大学马宁宁实验室提供；
细胞培养基均购自壹生科(深圳)有限公司；
白油佐剂购自于河南通商进出口有限公司；
96孔细胞培养板购自康宁公司；
鸡传染性法氏囊抗体购自山东绿都生物技术有限公司；
EasyPfuDNA聚合酶、dNTP以及核酸电泳Marker购于全式金生物技术公司；
感受态细胞DH5α购自于博迈德生物技术有限公司；
质粒小提试剂盒、质粒大提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和细胞裂解液购自天根生化公司；
T4DNA连接酶和各种限制性内切酶购自NEB公司；
IBDV标准血清和抗原以及IBDV强毒BC6-85株购自中国兽用药品监察所；
VP2-GAL1基因由六合华大基因公司进行合成。
实施例一
构建表达载体p1020-VP2-GAL1
1.VP2-GAL1序列合成
以临床分离的鸡法氏囊流行毒株基因组为模板，扩增VP2序列，两端带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切，进行测序。根据VP2测序结果以及Genbank上报道的鸡β-防御素1的成熟肽序列(登录号：AF033335)合成VP2-GAL1，序列如SEQIDNO.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。其中GAL1核苷酸序列见SEQIDNO.3，其编码蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO.4。
2.P1020-VP2-GAL1重组质粒构建
HindⅢ和EcoRⅠ酶切VP2-GAL1序列以及CHO表达载体p1020，回收酶切片段，然后连接，转化DH5α，克隆挑选，酶切验证构建p1020-VP2-GAL1的载体(图1)，同时构建p1020-VP2载体。PCR、酶切、连接、转化、测序等均为分子生物学常规方法，具体请参考《分子克隆试验操作手册》。
实施例二
重组CHO-B40-VP2-GAL1-80#细胞株筛选及悬浮驯化
1.CHO-GS-KO细胞转染
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；配制120mlCSC03-Cl(含10％透析血清，无谷氨酰胺),置于水浴锅预热至37℃。
(2)从37℃培养箱中取出处于对数生长期的细胞(30ml摇瓶培养)，混匀，在安全柜中取出100ul计数。
(3)根据细胞密度，分别取6x106个细胞至2个15ml离心管内，分别使用电转专用培养基洗2次，每次10ml，最后一次洗完弃去上清，保留细胞沉淀备用。
(4)稀释质粒，分别使用电转培养基稀释线性化实施例一所构建的p1020-VP2-GAL1和p1020-VP2质粒，使其浓度为0.5ug/ul，过滤除菌。
(5)分别取60ug质粒线性化的p1020-VP2-GAL1重组质粒及p1020-VP2重组质粒加入至步骤(3)中的细胞沉淀中；并补加电转专用培养基至总体积为400ul，吹吸混匀，静置1-2min。
(6)将步骤(5)中混合液转分别移至电转杯中(2mm)，电转程序如下所示。
Figure BDA0002644134350000051
(7)将上述电转杯中悬液分别转移至预热好的120ml培养基中，充分混匀后，分别按照100ul每孔铺96孔板。
(8)铺板过程中观察两孔板中细胞情况，铺板结束后，放入培养箱中培养。
2.单克隆筛选与检测
(1)电转后14d左右观察两个96孔板出孔情况，镜下检查并标记单克隆所在位置。
(2)待96孔板中单克隆生长至占1/3-1/2每孔时，弃掉培养基，向标记孔内加入40ul0.25％trypsin-EDTA，室温消化3-5min左右，加入100ul过渡培养基(CSC03-CL与CDCHOKI按照1:1混合，含4％透析血清，该混合培养基无谷氨酰胺)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散，将细胞液分别转移至24孔板。
(3)24孔板培养7d，收细胞悬液，离心，收细胞沉淀，裂解后，检测上清中WB检测是否成功表达目标蛋白并进行产量比较。
(4)经筛选，共收获3株高表达VP2-GAL1融合蛋白的细胞株，其编号分别为10#，80#，122#，最终使用80#进行发酵实验，命名为CHO-B40-VP2-GAL1-80#，其余两株细胞冻存。另外获得3株高表达VP2蛋白的细胞株其编号分别为45#，50#，69#，最终使用69#进行发酵实验，命名为CHO-B40-VP2-69#。
3.筛选细胞株悬浮培养
(1)将分别处于6孔板悬浮培养的CHO-B40-VP2-GAL1-80#和CHO-B40-VP2-69#细胞株，按照1:3进行扩孔培养，此时培养条件已进入到纯悬浮培样阶段(CDCHOK1，无谷氨酰胺，无血清)。
(2)培养3d后观察细胞密度及状态，细胞生长良好，分别将3个孔中的细胞悬液收集至15ml离心管，800rpm，5min，收获细胞。
(3)离心结束后，弃去培养基，分别加入15ml新培养基重悬至125ml摇瓶培养并计数，调整细胞密度至0.5x106/ml，此时记为P0代。
(4)培养72h计数，此时细胞密度在3.5～5.0x106/ml，活率大于96％；按照0.5x106/ml分别转至250ml摇瓶进行扩大培养。
(5)培养72h后，取样计数，并按照0.5x106/ml起始密度分别扩出2瓶500ml摇瓶继续培养，其中1瓶作为种子细胞进行培养并建立细胞库，另外一瓶用于后续的发酵实验。
实施例三
细胞摇瓶发酵及蛋白表达
1.CHO-B40-VP2-GAL1-80#和CHO-B40-VP2-69#细胞摇瓶发酵
(1)将实施例二中500ml摇瓶培养的细胞株CHO-B40-VP2-GAL1-80#和CHO-B40-VP2-69#培养72h后，取出摇瓶，分别进行取样并计数。
(2)每隔48h测定培养基中葡萄糖浓度，当低于2g/L的时候，添加葡萄糖到6-8g/L。补料，按照体积比，补加3％NF604培养基。
(3)持续培养10天(此时细胞活率下降至90％)收细胞悬液，保留细胞沉淀。
(4)分别加入同体积的PBS重悬，冻融3次后，收集上清。表达产物分别进行SDS-PAGE和WB检测(图2)，其中1-3泳道为VP2蛋白大小为48kD,4-6泳道为VP2-GAL1融合蛋白大小为53kD。
2.表达蛋白的琼脂扩散(AGP)效价测定
将表达的VP2蛋白及VP2-GAL1融合蛋白用PBS进行倍比稀释；制备琼脂平板，用梅花打孔器在琼脂平板上打孔；在琼脂平板中间加标准阳性血清，外周孔加用PBS稀释的VP2蛋白和VP2-GAL1融合蛋白，加样后的琼脂平板放入37℃温箱中，48-72h后观察结果。CHO-B40-VP2-GAL1-80#表达的VP2-GAL1融合蛋白琼扩效价检测结果如图3，CHO-B40-VP2-69#细胞株表达的VP2蛋白琼扩效价检测结果如图4，表达蛋白AGP均可以达到1:16。
实施例四
疫苗制备和动物免疫试验
1.疫苗制备
将表达的IBDVVP2蛋白和VP2-GAL1蛋白浓度按AGP进行调整，将调整好的抗原与白油佐剂按水相:油相为1:2进行混合，乳化，制备IBDVVP2亚单位疫苗。乳化、质检合格后置于4℃保存，全程无菌操作。
2.动物免疫和攻毒试验
选取130只3-4周龄SPF鸡，随机分为13组，每组10只进行免疫试验，每只皮下或肌肉注射疫苗0.25ml，另取10只不免疫设为对照。接种后21日，所有试验鸡均采血分离血清，测定抗体效价。饲养环境和用具均提前严格消毒。雏鸡饲养严格按照按标准饲养规程饲养,不免疫组隔离饲养观察。使用标准阳性抗原测定采用琼扩效价测定抗体，即在琼脂平板中间加标准抗原，外周孔加用PBS稀释血清，加样后的琼脂平板放入37℃温箱中，48-72h后观察结果。
同时，接种21日后，1-12组所有试验鸡均点眼攻击IBDV强毒BC6-85株病毒液0.1ml(约含100BID)，逐日观察并记录发病和死亡情况，至96小时，扑杀1-13组所有存活鸡，逐只解剖，观察法氏囊病变。其中G12对照鸡攻毒后应至少8只发病，出现明显的传染性法氏囊病变(如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶胨样分泌物)。免疫分组及攻毒信息见表1。
表1免疫及攻毒信息
Figure BDA0002644134350000071
表2 VP2-GAL1和VP2亚单位疫苗抗体效价及攻毒保护
Figure BDA0002644134350000072
Figure BDA0002644134350000081
试验结果显示：SPF鸡注射VP2-GAL1和VP2亚单位疫苗后,连续观察14日，所有疫苗注射SPF鸡均未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。VP2-GAL1亚单位疫苗和VP2亚单位疫苗攻毒试验结果见表2，可以看出VP2-GAL1亚单位疫苗，在抗原AGP相同的情况上，免疫鸡产生的中和抗体高于VP2亚单位疫苗。当亚单位疫苗抗原琼扩效价AGP为1:8时，VP2-GAL1亚单位疫苗攻毒保护率为100％，10只鸡法氏囊无发病症状，而VP2亚单位疫苗攻毒保护率为80％；抗原AGP为1:16时两种疫苗保护率均100％，商业苗其抗体效价只有1:8.8，保护率80％，对照组攻击BC6-85后，10只鸡全部出现发病症状，法氏囊发黄、肿大有粘液，部分法氏囊萎缩。从表2的结果可以看出VP2-GAL1疫苗可以产生更高的中和抗体，提高了疫苗的攻毒保护率。
本发明专利提供了一种制备鸡传染性法氏囊VP2-GAL1蛋白亚单位疫苗的方法，该方法将VP2-GAL1基因通过转染GS敲除CHO细胞株,获得表达融合蛋白VP2-GAL1的重组细胞株，该细胞株筛选过程简单，安全，细胞株稳定，易于产业化。本发明制备的亚单位疫苗能够产生更高的中和抗体，提高疫苗的攻毒保护率。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。
序列表
<110> 浙江鼎持生物制品有限公司 北京鼎持生物技术有限公司
<120> 一种表达鸡VP2和鸡GAL-1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用
<130> LP20082102
<141> 2020-08-06
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60
ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120
gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180
cctggattcc ctggctcaat tgtaggtgct cactacacac tgcagggcaa tgggaactac 240
aagttcgatc agatgctcct gactgccctg aacctaccgg ccagttacaa ctactgcagg 300
ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacacttc ctggtggcgt ttatgcacta 360
aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420
tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa cgtcctagta 480
ggggaagggg tcaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt 540
ggtgacccca ttcccgcaat agggcttgac ccaaaaatgg tagccacatg tgacagcagt 600
gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660
caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgccat cacaagcctc 720
agcgttgggg gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccacg gccttgtact gggcgccacc 780
atctacctca taggctttga tgggacaacg gtaatcacca gggctgtggc cgcaaacaat 840
gggctgacga ccggcaccga caaccttatg ccattcaatc ttgtgattcc aacaaacgag 900
ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960
gcaggggatc agatgtcatg gtcggcaaga gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc 1020
aactatccag gggccctccg tcccgtcacg ctagtggcct acgaaagagt ggcaacagga 1080
tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140
aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200
atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260
gactttcgtg aatacttcat ggaggtggcc gacctcaatt ctcccctgaa gattgcagga 1320
gcatttggct tcaaagacat aatccgggcc ctaggaggag gaggttccgg aaggaagtca 1380
gattgttttc gaaagagtgg cttctgtgca tttctgaagt gcccttccct cactctcatc 1440
agtgggaaat gctcaagatt ttacctctgc tgcaaaagaa tatggggctg a 1491
<210> 2
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
1 5 10 15
Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr
20 25 30
Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr
35 40 45
Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro
50 55 60
Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Gly Asn Gly Asn Tyr
65 70 75 80
Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Leu Asn Leu Pro Ala Ser Tyr
85 90 95
Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr
100 105 110
Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr
115 120 125
Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu
130 135 140
Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val
145 150 155 160
Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly
165 170 175
Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys
180 185 190
Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile
195 200 205
Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly
210 215 220
Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu
225 230 235 240
Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val His Gly Leu Val
245 250 255
Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Thr Val Ile
260 265 270
Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Thr Gly Thr Asp Asn
275 280 285
Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu Ile Thr Gln Pro
290 295 300
Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln
305 310 315 320
Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu Ala Val Thr
325 330 335
Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val
340 345 350
Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val
355 360 365
Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val
370 375 380
Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu
385 390 395 400
Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr
405 410 415
Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Lys Ser Asp Cys Phe Arg
450 455 460
Lys Ser Gly Phe Cys Ala Phe Leu Lys Cys Pro Ser Leu Thr Leu Ile
465 470 475 480
Ser Gly Lys Cys Ser Arg Phe Tyr Leu Cys Cys Lys Arg Ile Trp Gly
485 490 495
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggaaggaagt cagattgttt tcgaaagagt ggcttctgtg catttctgaa gtgcccttcc 60
ctcactctca tcagtgggaa atgctcaaga ttttacctct gctgcaaaag aatatggggc 120
<210> 4
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Gly Arg Lys Ser Asp Cys Phe Arg Lys Ser Gly Phe Cys Ala Phe Leu
1 5 10 15
Lys Cys Pro Ser Leu Thr Leu Ile Ser Gly Lys Cys Ser Arg Phe Tyr
20 25 30
Leu Cys Cys Lys Arg Ile Trp Gly
35 40

Claims (8)

1.一种鸡VP2和鸡GAL-1融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为VP2-GAL1融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该蛋白的基因序列为VP2-GAL1序列,如SEQ ID NO.1所示。
2.一种表达权利要求1所述的鸡VP2和鸡GAL-1融合蛋白的重组CHO细胞株，其特征在于，所述重组CHO细胞株为CHO-B40-VP2-GAL1-80#株，该细胞株保藏名称为CHO-B40-VP2-80#，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19959。
3.一种如权利要求2所述的重组CHO细胞株的构建方法，其特征在于，构建方法包括以下步骤；
(1)人工合成基因序列VP2-GAL1，该序列含有临床分离的鸡IBDV流行毒株VP2蛋白的基因序列和鸡β-防御素-1的成熟蛋白基因GAL-1序列，两段序列间用一个短的linker连接，VP2-GAL1序列两端分别设有HindⅢ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点；
(2)使用HindⅢ和EcoRⅠ酶切上述VP2-GAL1序列和p1020载体，回收酶切后的VP2-GAL1序列和p1020载体片段，连接、转化、克隆PCR并进行测序验证，构建p1020-VP2-GAL1表达载体；
(3)使用p1020-VP2-GAL1表达载体转染CHO-GS-KO-B40细胞株，通过细胞培养、单克隆筛选获得高表达VP2-GAL1融合蛋白的细胞株CHO-B40-VP2-GAL1-80#；
(4)将CHO-B40-VP2-GAL1-80#细胞株从96孔板到24孔板再到6孔板进行扩大培养，驯化3代，得到能够完全悬浮无血清培养的细胞株。
4.如权利要求2所述的CHO细胞株在制备鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗中的应用。
5.如权利要求2所述的CHO细胞株用于制备鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗的方法，其特征在于，将重组CHO细胞株CHO-B40-VP2-GAL1-80#经过无血清悬浮放大培养后，离心，收集细胞沉淀，用PBS溶解，纯化获得VP2-GAL1融合蛋白，测定VP2-GAL1融合蛋白含量和琼扩效价，并与疫苗佐剂按1:2比例混合，得到鸡传染性法氏囊VP2-GAL1亚单位疫苗。
6.根据权利要求5所述的制备鸡传染性法氏囊亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述VP2-GAL1融合蛋白琼扩效价为1:8～1:32。
7.根据权利要求6所述的制备鸡传染性法氏囊亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述VP2-GAL1融合蛋白琼扩效价为1:16。
8.如权利要求7所述的鸡传染性法氏囊病VP2-GAL1亚单位疫苗在预防鸡传染性法氏囊病毒引起的疾病中的应用。
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