CN112111000A - 一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用，所述方法通过基因克隆技术特别设计开发特定CRP编码基因，并以pAO815为模板进行改造构建自诱导分泌表达酵母载体，将所述CRP编码基因克隆至改造后含有GAP启动子及α‑factor分泌信号肽基因的pAO815载体上，并完成四拷贝重组质粒的筛选以及单克隆转化子的筛选，再运用发酵罐技术完成CRP蛋白的分泌表达，最终通过ECH填料纯化，得到纯度高于90％的CRP蛋白。

Description

一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用
技术领域
本申请属于生物技术领域，特别涉及一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP蛋白)是一种典型的急性期血浆蛋白，由于其血浆浓度在响应炎症反应时能够从基线低浓度(＜1μg/mL)迅速增加1000倍以上，因此，长期以来作为临床上炎症反应的非特异性标示物。图1示出天然CRP蛋白的结构示意图，如图1所示，天然CRP蛋白由五个相同的亚单位以非共价键形式结合成对称的五聚体，其相对分子质量为115kD，具体地，五个亚单位聚合形成环状结构，在酸性或碱性环境中，天然的CRP蛋白可分解为五个单体，每个单体即为一个亚单位。天然CRP蛋白的每个亚单位具有206个氨基酸残基，相对分子质量为23kD。天然CRP蛋白中每个亚单位均含有磷酸胆碱结合位点，如图1中第一球系(1)圆球区域所示，进一步地，每个亚单位上临近疏水口袋的位置均有两个钙离子结合位点，如图1中磷酸胆碱旁边的第二球系(2)所示，并且，所有亚单位的磷酸胆碱结合位点均位于天然CRP蛋白环状结构的同侧，将天然CRP蛋白上存在磷酸胆碱结合位点的一面称为识别面，与识别面相对的面称为效应面，所述效应面可与效应因子结合，由于所述效应因子由炎症反应而产生，因此，可据CRP蛋白上是否结合有效应因子来判断供样机体是否存在炎症反应，其中，所述效应因子可以为补体成分C1q或者细胞表面Fcy受体。
目前常采用免疫分析法来检测血浆中CRP蛋白含量，因此，需使用大量高质量的标准品作为对照，作为对照的CRP蛋白质需要活性高、稳定性好，经过长时间贮存而活性几乎无下降。目前市售的CRP蛋白标准品的来源多样，例如，来自大肠杆菌系统表达而得，或者，由患者CRP阳性胸腹水中天然提取。一般地，高品质CRP蛋白来源于天然提取，但是，由于天然提取的CRP蛋白价格昂贵，并且，原料来源并不完全稳定，严重阻碍CRP蛋白标准品等诊断产品的研究开发，因此，科研人员转向利用基因工程研发大量生产CRP的方法。
CRP编码基因，即，用于编码CRP蛋白的基因，属于穿透素家族成员之一，位于人类1号染色体q23区域，其基因序列高度保守。现有技术中存在以色氨酸启动子、CRP编码基因、Kil基因以及来自于大肠杆菌ALP区域的信号肽融合构建重组质粒，再通过在E.coli NM522菌株中成功分泌表达CRP蛋白的方法，该方法通过发酵罐发酵可达到30mg/L的高表达量，进一步地，使用ECH-Sepharose 4B成功纯化CRP蛋白。但是，大肠杆菌系统表达的CRP蛋白结构较为单一，可能出现蛋白折叠不正确或者糖基化不完全的情况，进而会导致CRP蛋白活性不足或者稳定性不足。因此，科研人员期待在真核酵母系统中制备CRP蛋白，从而获得满足使用要求的CRP蛋白。
现有技术中存在将人源CRP编码基因克隆构建到甲醇酵母表达载体pPICZαA上，在甲醇诱导表达菌株X-33中利用甲醇诱导进行分泌表达的方法，并且，利用组氨酸标签进行亲和层析纯化rhCRP。但是，利用甲醇诱导型载体不仅需要在菌体培养过程中进行培养基换液，还需要补加诱导剂甲醇，上述操作容易造成杂菌污染，特别地，如果需要进行发酵罐发酵培养，则上述因素均容易造成经济损失。
发明内容
为解决上述问题中的至少一个，本申请提供了一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，所述方法利用融合有CRP编码基因的重组质粒在毕赤酵母GS115菌株中分泌表达制备CRP蛋白的方法。
本申请的目的在于提供一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，所述方法包括：
步骤1，将CRP蛋白编码基因克隆至pAO815Gα载体中构建单拷贝重组质粒；
步骤2，利用步骤1获得的单拷贝重组质粒获得四拷贝重组质粒；
步骤3，将步骤2所得四拷贝重组质粒进行线性化处理，获得线性化重组质粒；
步骤4，将步骤3获得的线性化重组质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中；
步骤5，从步骤4获得的体系中挑取单克隆转化子，培养所述单克隆转化子进行自诱导表达CRP蛋白。
优选地，所述的CRP蛋白编码基因，包括如下(1’)至(3’)中的至少一种：
(1’)如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(2’)在严格条件下与(1’)所示DNA分子杂交，并且编码CRP蛋白的DNA分子，其中，所述CRP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或者，所述CRP蛋白为将SEQ ID No.1所示的蛋白经过一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且具有相同功能的蛋白；
(3’)与(1’)或者(2’)所述DNA分子具有90％以上同一性，并且编码所述CRP蛋白的DNA分子。
本申请所提供的编码基因为优化的人源CRP编码基因，能够在酵母系统，特别是毕赤酵母系统中表达。
进一步地，所述pAO815Gα载体由pAO815载体与GAP启动子及α-factor分泌信号肽基因构建而成。
本申请人发现，利用pAO815Gα载体与所述CRP编码基因融合，能够使所述CRP编码基因的发酵条件下充分在胞外表达，将CRP蛋白表达于发酵体系的上清液中，便于CRP蛋白的收集和利用。
进一步地，利用所述pAO815Gα载体能够避免甲醇的使用，一方面能够消除甲醇由于易燃易爆等化学性质而带来安全隐患，另一方面还能够避免甲醇由于基本身的毒性而带来的潜在危险。
可选地，在步骤5后，所述方法还可以包括以下步骤：
步骤6，根据步骤5各单克隆转化子的表达活性浓度，筛选目标单克隆转化子，并利用所筛选的目标单克隆转化子制备一级种子液。
可选地，在步骤6之后，所述方法还可以包括以下步骤：
步骤7，利用所述一级种子液制备二级种子液。
可选地，在步骤7之后，所述方法还可以包括以下步骤：
步骤8，利用所述二级种子液发酵制备CRP蛋白。
可选地，在步骤8之后中，所述方法还可以包括以下步骤：
步骤9，将步骤8制备所得的CRP蛋白进行纯化。
在本申请中，特别地，使用ECH填料柱对CRP蛋白进行纯化，本申请人发现，ECH填料中的游离羧基基团与CRP蛋白上的钙离子结合，将CRP蛋白吸附于层析柱上，再使用螯合剂将CRP蛋白从层析柱上洗脱下，所获得的CRP蛋白纯度较高。
第二方面，一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括由上述制备方法所得到的CRP蛋白。
第三方面，利用第一方面所述方法制备所得的CRP蛋白用于制备CRP蛋白标准品的应用。
与现有技术相比，本申请提供的方案利用基因工程大量生产重组CRP蛋白的方法，具体地，通过基因克隆技术特别设计开发了一种CRP编码基因，并以pAO815为模板进行改造构建自诱导分泌表达酵母载体，将所述CRP编码基因克隆至改造后含有GAP启动子及α-factor分泌信号肽基因的pAO815载体上，并完成四拷贝重组质粒的筛选以及单克隆转化子的筛选，再运用发酵罐技术完成CRP蛋白的分泌表达，最终通过ECH填料纯化，得到纯度高于90％的CRP蛋白。
本申请提供的方法避免AOX启动子，因此，有效避免采用甲醇诱导以及培养换液等操作，从而降低杂菌污染CRP蛋白的概率；同时，本申请提供的方案通过添加α-factor信号肽元件实现酵母自诱导分泌表达，并且，CRP蛋白表达后分泌到胞外的功能，减少下游纯化收集CRP蛋白的工作量和操作难度。
进一步地，本申请利用四拷贝重组质粒进行表达，表达量高，借助发酵罐进行自诱导发酵培养，平均表达量达到15mg/L。本申请人发现，四拷贝重组质粒能够满足量产对产量以及产品品质的需求，具体地，拷贝数大能够提高量产的产率，但是，对于本申请提供的重组质粒，当拷贝数大于4时，CRP蛋白不能很好的表达，导致产率反而下降，本申请人分析认为，当拷贝数大于4后，蛋白折叠等可能发生异常，导致难以正常分泌CRP蛋白。
进一步地，在纯化CRP蛋白的工艺上，本申请提供的方案利用ECH填料中的游离羧基基团与CRP蛋白上的钙离子结合，将CRP蛋白吸附于层析柱上，再使用螯合剂将CRP蛋白从层析柱上洗脱下，所获得的CRP蛋白纯度较高。
利用本申请提供方法所制备的CRP蛋白纯度高，活性高，稳定性好，具体地，所述CRP蛋白的有效活性浓度可达60％以上，在无需添加保护剂，并且37℃的条件下加速7天，CRP蛋白无降解现象，因此，可用于体外诊断POCT平台CRP蛋白校准品试剂及质控品的开发。
附图说明
图1示出天然CRP蛋白的结构示意图；
图2示出pAO815Gα载体主要酶切位点及启动子位点；
图3示出pAO815Gα-CRP单拷贝重组质粒构建示意图；
图4示出示出所构建单拷贝重组质粒pAO815Gα双酶切验证结果；
图5示出pAO815Gα-CRP四拷贝重组质粒双酶切验证结果；
图6示出ECH亲和层析主纯化电泳图；
图7示出CRP蛋白加速稳定性电泳图；
图8示出CRP一致性检测结果数据图；
图9-1示出CRP互换性检测标准曲线；
图9-2示出CRP互换性检测标本回算曲线。
附图标记说明
1-第一球系，2-第二球系。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。
下面通过具体的实施例对本申请提供的制备CRP蛋白的方法进行详细阐述。
在本实例中，所使用的实验方法如无特殊说明，则为常规方法。
在本实例中，所使用的主要试剂及仪器如无特别说明，则均可商购，例如：
PCR仪为Bio-Rad T100；恒温震荡摇床为太仓强乐公司；ECH柱为常州天地人和生物科技有限公司；发酵罐为保兴生物10L发酵罐-10JSA-7000；纯化仪为GE公司的AKTAprime plus；所用的限制性内切酶及连接酶均为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒均为生工产品，CRP试剂条的商品名称：C-反应蛋白检测试剂条，供货厂商：基蛋生物科技股份有限公司。
所述CRP蛋白可按照如下步骤1至步骤9制备：
步骤1，将CRP编码基因克隆至pAO815Gα载体中构建单拷贝重组质粒。
在本实例中，所述编码基因包括如下(1’)至(3’)中的至少一种：
(1’)如SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(2’)在严格条件下与(1’)所示DNA分子杂交，并且编码CRP蛋白的DNA分子，其中，所述CRP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或者，所述CRP蛋白为将SEQ ID No.1所示的蛋白经过一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且具有相同功能的蛋白；
(3’)与(1’)或者(2’)所述DNA分子具有90％以上同一性，并且编码所述CRP蛋白的DNA分子。
本申请所提供的编码基因为优化的人源CRP编码基因，能够在酵母系统，特别是毕赤酵母系统中表达。
在本实例中，所述pAO815Gα载体由pAO815载体与GAP启动子及α-factor分泌信号肽基因构建而成，其载体酶切位点及启动子位点如图2所示。
利用EcoR I和Not I将CRP编码基因装入到载体pAO815Gα中，构建pAO815Gα-CRP单拷贝表达重组质粒，其构建示意图如图3所示。
图4示出所构建单拷贝重组质粒pAO815Gα双酶切验证结果，在图4中，1号电泳泳道示出pAO815Gα电泳结果，2号电泳泳道示出pAO815Gα(Bgl II与EcoR I)酶切产物的电泳结果，3号电泳泳道示出DL2000 Marker(由上至下：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)的电泳结果，4号电泳泳道示出DL15000 Marker(由上至下：15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp)的电泳结果，如图4所示，2号电泳泳道显示有三条核酸条带，从上至下分别为pAO815Gα质粒、pAO815Gα去除GAP启动子和α-factor信号肽基因的载体、GAP启动子和α-factor信号肽基因(750bp)，由双酶切验证结果可知pAO815Gα质粒构建正确。
步骤2，利用步骤1获得的单拷贝重组质粒获得四拷贝重组质粒。
在本实例中，以BamH I和Xho I对步骤1获得的pAO815Gα-CRP单拷贝重组质粒进行酶切得到单拷贝克隆载体，再以Bgl II和Xho I对pAO815Gα-CRP单拷贝重组质粒酶切得到含有GAP启动子、α-factor信号肽以及CRP编码基因的基因片段，将二者连接得到pAO815Gα-CRP二拷贝重组质粒，重复上述酶切及连接操作，最终得到pAO815Gα-CRP四拷贝重组质粒。
图5示出pAO815Gα-CRP四拷贝重组质粒双酶切验证结果，在图5中，1号电泳泳道示出DL15000 Marker(由上至下：15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp)电泳结果，2电泳泳道示出pAO815Gα-CRP四拷贝重组质粒电泳结果，3电泳泳道示出pAO815Gα-CRP四拷贝重组质粒(Bgl II与Xho I)酶切产物电泳结果，如图5所示，3号电泳泳道从上至下最上面条带为未能切开的pAO815Gα-CRP四拷贝重组质粒；第二条带为GAP启动子、α-factor信号肽基因和CRP编码基因四拷贝基因(5476bp)；最下面的条带为无GAP启动子、α-factor信号肽基因和CRP编码基因的载体。由图5酶切验证结果可知，pAO815Gα-CRP四拷贝重组质粒构建正确。
步骤3，将步骤2所得四拷贝重组质粒进行线性化处理，获得线性化重组质粒。
在本实例中，以SalI核酸内切酶37℃线性化切1h，回收获得线性化重组质粒。
步骤4，将步骤3获得的线性化重组质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中。
步骤5，从步骤4获得的体系中挑取单克隆转化子，培养所述单克隆转化子进行自诱导表达。
在本实例中，培养所述单克隆转化子进行自诱导表达，具体可以为：
挑取10个单克隆转化子，所述单克隆转化子即步骤4所获得的融合有线性化重组质粒的毕赤酵母GS115感受态细胞，每个融合有线性化重组质粒的毕赤酵母GS115感受态细胞即为一个单克隆转化子。
为各单克隆转化子标注序号1至10，分别培养各单克隆转化子使其表达，培养期间无需添加诱导剂，表达约2天后收集上清液，再使用CRP检测试剂盒分别检测上清液中CRP蛋白表达活性浓度，结果如表1所示，由表1可知，7号单克隆转化子的表达活性浓度最高，检测值为120μg/L，因此，本实例挑取7号克隆进行后期的发酵罐发酵培养验证。
表1单克隆转化子表达活性浓度结果
样品 检测结果(μg/L)
1 82
2 67
3 81
4 102
5 92
6 73
7 120
8 87
9 96
10 91
在本步骤中，所述单克隆转化子的毕赤酵母体系中分泌表达了目标蛋白—CRP蛋白。
基于上述结果，可根据以下步骤进行量产。
步骤6，根据步骤5各单克隆转化子的表达活性浓度，筛选目标单克隆转化子，并利用所筛选的目标单克隆转化子制备一级种子液。
在本实例中，制备一级种子液可以包括：
将选定的目标单克隆转化子接种至YPD培养基，至OD600＝2～5之间，其中，OD600为所述YPD培养基在600nm波长处的吸光值，培养完成后离心收集培养所得菌体(所述菌体为单克隆转化子培养所得产物)，将向菌体中添加甘油至终浓度为15％，再将体系分装，至80OD/mL/管，即，OD600＝80，存于-80℃冰箱备用。
其中，所述YPD培养基按如下就读配制(以1L为例进行说明)：酵母提取物(品牌：OXOID；名称：YEAST EXTRACT)10g；蛋白胨20g；葡萄糖20g，加水定容至1L，500mL/瓶分装至1L三角瓶中，121℃灭菌20min。
步骤7，利用所述一级种子液制备二级种子液。
在本实例中，本步骤可以包括：
取步骤6保存于-80℃条件下的一级种子液接种至500mL的YPD培养基，在30℃以200rpm的恒温振荡器中培养过夜，制备得到二级种子液。
步骤8，利用所述二级种子液发酵制备CRP蛋白。
在本实例中，用于发酵制备CRP蛋白的发酵培养基(以1L培养基为例进行说明)包括以下配比的组分：
Figure BDA0002713579060000061
将装载有发酵罐培养基的发酵罐于120℃下在位灭菌30min，待发酵罐降至室温后使用氨水调节所述发酵罐培养基的pH至5.5，再向所述发酵罐培养基中加入微量元素补料，所述微量元素补料的用量为每升发酵培养基接入6mL所述微量元素补料，所述微量元素补料(以1L为例进行说明)包括以下配比的组分：
Figure BDA0002713579060000071
将所述二级种子液在无菌操作下接种至发酵罐中，以50％甘油作为补料，培养96小时，放罐收菌液。
将所收集的菌液进行离心，收集上清液，例如，以6800rpm对所述菌液离心5min，采用不锈钢滤器(如，滤芯)进行三级过滤(1μm/0.45μm/0.22μm)收集上清液。
步骤9，将步骤8制备所得的CRP蛋白进行纯化。
在本实例中，本步骤具体可以包括：
使用膜包装置对发酵上清进行浓缩换液(20mM Tris，0.14M NaCl，2mM CaCl2，pH＝7.5)，换液比例为1:100；
将浓缩液通过0.45μm滤膜过滤，获得上柱上清液；
以柱平衡缓冲液平衡3-5柱体积，再将所述上柱上清液过ECH柱，再用平衡缓冲液平衡3-5柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱CRP蛋白，再用20％乙醇保存ECH亲和柱。
其中，ECH柱所用缓冲液如下：
平衡缓冲液：20mM Tris,0.14M NaCl，2mM CaCl2，pH7.5；
洗脱缓冲液：20mM Tris,0.14M NaCl，2mM EDTA，pH7.5；
ECH柱保存：20％乙醇。
进一步地，对获得CRP蛋白进行透析，透析所用透析缓冲液可以为：20mM Tris，0.14M NaCl，2mM CaCl2，pH＝7.5；透析比例1:100透析至少4小时，重复一次。
图6示出ECH亲和层析主纯化电泳图，其中，1号电泳泳道示出浓缩换液ECH上柱前样品的电泳结果，2号电泳泳道示出ECH上柱后流穿样品的电泳结果，3号电泳泳道示出纯化样品的电泳结果，4号电泳泳道示出透析后样品的电泳结果，5号电泳泳道示出Marker的电泳结果，蛋白标准分子量；上样量：5μl，由图6可知，经ECH亲和层析主纯化后，CRP蛋白中几乎无杂质。
本实例中，所获得CRP蛋白可于如下保存缓冲液中保存：20mM Tris，0.14M NaCl，2mM CaCl2，pH＝7.5。
本实例所获得CRP蛋白表达量如表2所示：
表2 CRP蛋白表达量结果
名称 浓度 体积 表达量
YL-PCRP 4.81mg/mL 22mL 15.6mg/L
试验例
试验例1 CRP蛋白稳定性
本试验例所用样本为前述步骤9所得CRP蛋白。
实验方法为：
1.在37℃恒温培养箱分别放置1、3、5、7天后取样，蛋白无明显沉淀，对各蛋白进行电泳测试，电泳结果如图7。
图7中，0号电泳泳道示出Marker的电泳结果；1号电泳泳道示出4℃保存样品的电泳结果；2号电泳泳道示出-20℃冻融样品的电泳结果；3号电泳泳道示出-20℃长期冻存样品的电泳结果；4号电泳泳道示出37℃加速1天样品的电泳结果；5号电泳泳道示出37℃加速3天样品的电泳结果；6号电泳泳道示出37℃加速5天样品的电泳结果；7号电泳泳道示出37℃加速7天样品的电泳结果。
由图7可知，37℃加速7天以及-20℃反复冻融的蛋白电泳图与-20℃冻存及4℃保存样品电泳图无差异，说明蛋白的稳定性很好。
2.将CRP蛋白稀释成校准品后做加速稳定性试验，经C-反应蛋白检测试剂盒检测稳定性数据，结果如表3-1至表3-3所示。
表3-1 CRP稀释成校准品加速稳定性数据(1:20稀释倍)
Figure BDA0002713579060000081
表3-2 CRP稀释成校准品加速稳定性数据(1:40稀释倍)
Figure BDA0002713579060000082
表3-3 CRP稀释成校准品加速稳定性数据(1:80稀释倍)
Figure BDA0002713579060000091
试验例2 CRP活性浓度
本试验例所用样本为前述步骤9所得CRP蛋白。
实验方法为：
对CRP蛋白进行梯度稀释，采用C-反应蛋白检测试剂盒检测稀释后的蛋白活性浓度，回算出每个稀释梯度下的母液活性浓度，再将有效母液活性浓度求平均值。经回算获得CRP活性浓度。
结果如表4所示：
表4 CRP蛋白活性检测
稀释点 稀释倍数 电压均值 浓度均值 母液浓度
level1 10 9167 261.68 2616.81
level2 20 6136 138.19 2763.85
level3 40 3920 70.93 2837.33
level4 80 2404 36.14 2891.41
level5 160 1454 19.10 3055.57
level6 320 782 9.26 2962.43
level7 640 423 4.71 3017.36
level8 1280 249 2.70 3456.69
level9 2560 199 2.15 5492.85
level10 5120 125 1.35 6893.01
通过表4可见，前8个稀释倍数的母液浓度差别不大，为有效母液活性浓度，而第九及第十稀释倍数的母液活性浓度相差较大，舍弃。由表4中前八个稀释倍数下的母液有效浓度求平均值计算可得，有效活性浓度：2.95mg/mL，CRP蛋白提供浓度：4.8mg/mL，回算活性率，即，有效活性蛋白浓度的占比为61.4％。
由此可知，CRP的蛋白活性浓度较高，完全满足校准品的使用需求。
试验例3 CRP蛋白线性
本试验例所用样本为前述步骤9所得CRP蛋白。
实验方法为：等倍梯度稀释法检测活性值。
结果如表5所示：
表5 CRP蛋白线性检测结果
Figure BDA0002713579060000101
根据表5绘制标准曲线，其R2＝0.99918。
由此可知，线性优良。
试验例4 CRP一致性
本试验例所用样本为前述步骤9所得CRP蛋白。
本试验例所述一致性是指无本底的血清基质中抗原浓度梯度与标本浓度梯度的一致程度，具体于本试验，用于确认工作校准品在稀释液中的反应与高值标本在阴性血清中的反应是否一致。
其中，所述工作校准品为活性浓度已知且确定的CRP蛋白液。
所述高值标本为CRP活性浓度接近或大于试剂检测上限的患者血清样本，其中，所述试剂为用于测定样本中CRP活性浓度的特异性试剂。
具体试验方法为：
1.准备工作
a)抗原：取出足量的抗原(前述步骤9所得CRP蛋白)，使用前恢复室温；
b)校准品稀释液：准备足量的校准品稀释液(不少于10mL)置于2℃～8℃备用，使用前恢复室温；
c)高值样本：准备足量的接近或大于试剂检测上限的高值样本(不少于800μL)置于-20℃备用，使用前需恢复室温；
d)阴性血清：准备足量的混合阴性血清(不少于10mL)置于2℃～8℃备用，使用前恢复室温。
e)成品试剂：准备一批成品合格试剂备用。
2.操作步骤
1)若高值样本所检测到的标示浓度低于试剂的检测上限，则将所述标示浓度作为曲线的起始点，如果高值样本所检测到的标示浓度有于试剂的检测上限，则将将所述高值样本进行稀释，并将该稀释样本的标示浓度作为曲线的起始点，顺次地，所述曲线的第二个点为吸取500μL高值样本加到500μL阴性血清中所得样本的浓度活性，第三个点使用阴性血清对第二个点进行对倍稀释所得样本的浓度活性，直至达到检测下限，重复测试三次，记录电压值，并计算检测结果的均值(如果高值样本标示浓度高于试剂的上限，则将标本使用阴性血清稀释至试剂的线性范围内，然后再对倍稀释)；
2)按照最大稀释倍数不超过100倍的原则，吸取一定量的抗原加到校准品稀释液中，确认第一个点的稀释倍数后，依次对倍稀释，重复测试两次，记录电压值，并计算检测结果的均值；
3.判定标准
以标本在血清中的反应为标准，计算抗原和校准品稀释液中的理论稀释倍数，并与实际的稀释比例进行相关性分析，若相关系数R2≥0.99，则一致性满足要求。
结果如图8所示，由图8可知，由R2＝0.9995，在0.999以上，即，本申请提供的样本与校准品具有较高的一致性。
试验例5 CRP互换性
本试验例所用样本为前述步骤9所得CRP蛋白。
本申请提供的CRP蛋白用作检测CRP蛋白含量的标准品。
本领域技术人员可知，检测标准品的互换性直接影响量值传递的正确性。具体地，通过两个不同检测程序进行检测，其中，一个检测程序可以为参考检测程序，只有采用具有互换性的标准品校准的值才相同，即，所采用的标准品的互换性强，对取自患者的样本检测的结果才会一致。
检测方法：可参见《WST 256-2011基质效应与互通性评估指南》和《CLSI ep14-A3Evaluation of Matrix Effects》。
结果如图9-1和图9-2所示，其中，
图9-1示出标准曲线，其R2＝0.9996；
图9-2示出标本回算曲线，其R2＝0.9920，由图9-2可知，该批CRP蛋白样本所配制校准品与标本的偏差CV<20％，即，具有较高的互换性，可用作CRP定量检测的标准品。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110> 南京基蛋生物医药有限公司
<120> 一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Gln Thr Asp Met Ser Arg Lys Ala Phe Val Phe Pro Lys Glu Ser Asp
1 5 10 15
Thr Ser Tyr Val Ser Leu Lys Ala Pro Leu Thr Lys Pro Leu Lys Ala
20 25 30
Phe Thr Val Cys Leu His Phe Tyr Thr Glu Leu Ser Ser Thr Arg Gly
35 40 45
Tyr Ser Ile Phe Ser Tyr Ala Thr Lys Arg Gln Asp Asn Glu Ile Leu
50 55 60
Ile Phe Trp Ser Lys Asp Ile Gly Tyr Ser Phe Thr Val Gly Gly Ser
65 70 75 80
Glu Ile Leu Phe Glu Val Pro Glu Val Thr Val Ala Pro Val His Ile
85 90 95
Cys Thr Ser Trp Glu Ser Ala Ser Gly Ile Val Glu Phe Trp Val Asp
100 105 110
Gly Lys Pro Arg Val Arg Lys Ser Leu Lys Lys Gly Tyr Thr Val Gly
115 120 125
Ala Glu Ala Ser Ile Ile Leu Gly Gln Glu Gln Asp Ser Phe Gly Gly
130 135 140
Asn Phe Glu Gly Ser Gln Ser Leu Val Gly Asp Ile Gly Asn Val Asn
145 150 155 160
Met Trp Asp Phe Val Leu Ser Pro Asp Glu Ile Asn Thr Ile Tyr Leu
165 170 175
Gly Gly Pro Phe Ser Pro Asn Val Leu Asn Trp Arg Ala Leu Lys Tyr
180 185 190
Glu Val Gln Gly Glu Val Phe Thr Lys Pro Gln Leu Trp Pro
195 200 205
<210> 2
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
cagaccgata tgtcccgcaa agcgtttgta ttcccgaaag aatctgatac ctcttacgtc 60
tccctgaagg ctccgctgac gaaaccgctg aaagcgttca ccgtctgcct gcacttctac 120
accgagctga gctctacccg cggttactcc atcttctcct acgctaccaa acgccaggat 180
aacgagatcc tgatcttctg gtctaaagac atcggttaca gctttaccgt tggcggctcc 240
gagattctgt tcgaggtgcc ggaagtgacg gttgctccag tgcacatttg cacgagctgg 300
gaatctgcat ctggcatcgt agaattttgg gtggacggca agccacgtgt acgcaaatct 360
ctgaagaaag gctacacggt tggcgcagaa gcatctatca tcctgggtca ggagcaggac 420
tccttcggtg gtaatttcga aggcagccag tctctggtcg gcgacattgg caacgtgaac 480
atgtgggact ttgtcctgtc tccggatgaa atcaacacca tctacctggg tggcccgttc 540
tctccgaacg tgctgaactg gcgcgctctg aagtatgaag ttcagggtga ggtgttcacc 600
aaaccacaac tgtggccg 618

Claims (6)

1.一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述的方法包括：
步骤1，将CRP蛋白编码基因克隆至pAO815Gα载体中构建单拷贝重组质粒；
步骤2，利用步骤1获得的单拷贝重组质粒获得四拷贝重组质粒；
步骤3，将步骤2所得四拷贝重组质粒进行线性化处理，获得线性化重组质粒；
步骤4，将步骤3获得的线性化重组质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中；
步骤5，从步骤4获得的体系中挑取单克隆转化子，培养所述单克隆转化子自诱导表达CRP蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述CPR编码基因包括如下(1’)至(3’)中的至少一种：
(1’)如SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(2’)在严格条件下与(1’)所示DNA分子杂交，并且编码CRP蛋白的DNA分子，其中，所述CRP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或者，所述CRP蛋白为将SEQ ID No.1所示的蛋白经过一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且具有相同功能的蛋白；
(3’)与(1’)或者(2’)所述DNA分子具有90％以上同一性，并且编码所述CRP蛋白的DNA分子。
3.根据权利要求1所述的一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述pAO815Gα载体由pAO815载体与GAP启动子及α-factor分泌信号肽基因构建而成。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤5之后，所述方法还包括：使用ECH填料柱对CRP蛋白进行纯化。
5.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括由权利要求1-4任一权利要求所述的制备方法所得到的CRP蛋白。
6.权利要求1-4任一权利要求所述制备方法得到CRP蛋白用于制备CRP蛋白标准品的应用。
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