DE69033944T2 - Mittel zur direkten chemischen Bindung des D-Dimers aus einer biologischen Probe zwecks Diagnostik und Überwachung von thrombolytischen und hyperkoagulablen Zuständen - Google Patents

Mittel zur direkten chemischen Bindung des D-Dimers aus einer biologischen Probe zwecks Diagnostik und Überwachung von thrombolytischen und hyperkoagulablen Zuständen

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Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Kit zum Nachweis von D-Dimer, ein Fibrinabbauprodukt, das für Erkrankungen des Blutgerinnungssystems indikativ sein kann, das ein Fragment E-Reagenz verwendet, das direkt an D-Dimer in einer biologischen Probe chemisch bindet.
  • Die am meisten verbreitete Erkrankung des menschlichen Blutgerinnungssystems ist die Bildung von Thromben, Blutklumpen, die, wenn in Gefäßen, wie zum Beispiel dem Herzen, gebildet, den Blutfluß behindern können und zu schweren Herzattacken führen können. Zusätzlich kann die Bewegung des Thrombus oder eines Teils davon innerhalb des Kreislaufsystems zu einer Thromboembolie führen, indem der Blutfluß plötzlich unterbrochen wird. Patienten, die eine fibrinolytische Therapie aufgrund von hyperkoagulablen Zuständen erhalten, erfordern eine sorgfältige Überwachung von Gerinnselabbau. Daher ist es wichtig, sensitive und spezifische Mittel zu haben, um die Fibrinolyse nachzuweisen, den Abbau von Blutgerinnseln.
  • Fibrin besteht aus einem Netzwerk von sich verzweigenden Fasern adhäsiver Natur, mit der Fähigkeit, Gesamtblut zu koagulieren, in dem es suspendiert ist. Fibrinolyse ist ein System komplementär zu dem Koagulationsprozeß und normalerweise mit diesem im Gleichgewicht, wobei Ablagerungen von Fibrin beseitigt werden. Der Verdau von Fibrin durch das Enzym Plasmin ergibt Spaltprodukte, einschließlich D-Dimer.
  • Bei pathologer Fibrinolyse sind die Plasmakonzentrationen von Plasminabbauprodukten von Fibrinogen und Fibrin erhöht. Daher sind die Anwesenheit von Fibrinogenabbauprodukten (FDP) in menschlichem Blut oder Urin Anzeiger für thrombotische Erkrankungen. FDP wurden herkömmlicherweise durch Agglutinierungstests gemessen. Zum Beispiel: durch Staphylococcen-Verklumpung; durch Hämagglutinations-Immungssay; oder durch die Verwendung von Latexpartikeln, an die ein Antiserum angebracht wurde.
  • Hawiger et al., "Measurement of Fibrinogen and Fibrin Degradation Products in Serum by Staphylococcal Clumping Test", J. Lab. Clin. Med. 75: 93-108 (1970) beschrieb einen auf der Tatsache basierenden Test, daß ein spezifischer Stamm von Staphylococcus in Anwesenheit von monomerem Fibrin oder FDP höheren Molekulargewichts verklumpen wird. In diesem Verfahren werden serielle Verdünnungen von Serum oder Urinproben mit Suspensionen von Staphylococcus-Zellen gemischt und die Anwesenheit oder Abwesenheit von Verklumpung wird beobachtet.
  • Merskey et al., " A Rapid, Simple, Sensitive Method for Measuring Fibrinolytic Split Products in Human Serum", Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 131: 871-875 (1969) beschrieb einen zwei-Schritt Hämagglutinations-Inhibierungstest. Im ersten Schritt werden Verdünnungen der Testserumprobe mit einer verdünnten Lösung von Antikörpern gegen menschliches Fibrinogen inkubiert. Im zweiten Schritt wird nicht reagierter Antikörper durch Hinzufügen von braunen roten Blutzellen, die mit menschlichen Plasma beschichtet sind, nachgewiesen. Wenn keine Agglutination auftritt, enthielt die Probe ausreichend FDP, um den Antikörper zu neutralisieren.
  • Carney et al., "A Sensitive Latex Slide Assay for Fibrin(ogen) Fragment E", Clinical Chimica Acta 147: 173-177 (1985) beschrieb einen Latex-Agglutinationstest, wobei Latexpartikel mit Antikörpern beschichtet wurden, die direkt mit FDP in Serum reagieren. Die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers DD-3B6/22 gegen D-Dimer führte die benötigte Spezifität ein, um zwischen Fibrin- und Fibrinogenabbauprodukten zu unterscheiden. Dies war eine wichtige Verbesserung, weil der Nachweis von D-Dimer, einem Fibrinabbauprodukt, für die Anwesenheit von Gerinnseln spezifischer ist, was einen Nachweis von Thrombose oder hyperkoagulablen Zuständen mit erhöhter Sensitivität und Spezifität erlaubt, als dies mit anderen Techniken möglich war. Wie in einem Artikel von Elms et al., "Rapid Detection of Cross- Linked Fibrin Degradation Products in Plasma Using Monoclonal Antibody Coated Latex Particles", A.J.C.P. 85(3):360-364 (März 1986) beschrieben, führte der Nachweis der konformationellen und strukturellen Veränderungen bei der Überführung von Fibrinogen in Fibrin und sein kreuz-vernetzen durch Faktor XIIIa im Prozeß der Gerinnselbildung zur Entwicklung von neuen antigenen Determinanten, die eine Unterscheidung zwischen ihren plasminolytischen Abbauprodukten erlaubt. Spezifisch wurde ein monoklonaler Antikörper (DD- 3B6/22), der für kreuzvernetzte Fibrinderivate spezifisch ist, die die D-Dimerkonfiguration enthalten bei der Entwicklung eines Latex-Agglutinationsverfahrens verwendet, das in der Lage ist, Fibrinabbauprodukte in entweder Plasma oder Serum nachzuweisen. Die Sensitivität dieses Tests scheint ungefähr 250 ng/ml an D-Dimer zu sein.
  • Greenberg et al., "Measurement of Plasma Fibrin D-dimer Levels with the Use of a Monoclonal Antibody Coupled to Latex Beads", A.J.C.P. 87(1) 94-100 (Januar 1987) beschrieben einen monoklonalen Antikörper (DD-3B6) gegen Fibrin-D-Dimer, der an Latexperlen gekuppelt war, um einen spezifischen Test (Dimertest) auf Fibrinolyse zur Verfügung zu stellen. Der Dimertestassay wies spezifisch 2 ug/ml von gereinigtem Fibrin D-Dimer oder Fibrin D- Dimer/Fragment E Komplex nach, die zu afibrinogenem Plasma hinzugefügt wurden.
  • US-A-4 090 846 beschreibt einen indirekten Test auf die Anwesenheit von Fibrinogenabbauprodukten in menschlichem Serum oder Urin unter der Verwendung von D- und E- Fragmenten, die an Latexträgerprodukte gekoppelt sind und einem für die D- und E- Fragmente spezifischen Antikörper.
  • EP-A-0 122 478 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers mit Spezifität für kreuzvernetzte Fibrinderivate und ein Assayverfahren unter der Verwendung des Antikörpers.
  • Obwohl die Agglutinationstesttechniken für FDP, einschließlich D-Dimer, verbessert wurden, wurden die Stabilität und Sensitivität dieser Techniken nicht optimiert.
  • Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Kit zur Diagnose und Überwachung von thrombolytischen und hyperkoagulablen Zuständen zur Verfügung zu stellen. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kit, umfassend:
  • Ein Reagenz, das spezifisch das Fibrinabbauprodukt D-Dimer in einer biologischen Probe, wie zum Beispiel Plasma, Urin oder andere Gewebe oder Körperflüssigkeiten, die D-Dimer und andere Fibrinabbauprodukte enthalten können, bindet und nachweist, zur Diagnose und der Überwachung von thrombolytischen und hyperkoagulablen Zuständen, umfassend gereinigtes Fragment E, gebunden an einen festen Träger; und
  • einen markierten für Fragment D-Dimer spezifischen Antikörper.
  • Die folgende Erfindung wird aus der folgenden genaueren Beschreibung ersichtlich werden.
  • Die Matrix eines Blutgerinnsels oder Thrombus wird durch Fibrin gebildet. Fibrin kann durch Faktor XIIIa kreuzvernetzt werden, um ein stabilisiertes Gerinnsel zu bilden. Menschliches kreuzvernetztes Fibrin wird durch das Enzym Plasmin abgebaut. Der D-Dimer/Fragment E- Komplex (DD)E, ist das primäre lösliche Plasminabbauprodukt, das von kreuzvernetztem Fibrin freigesetzt wird. Dieser Komplex kann durch Plasmin weiter abgebaut werden. Der anfängliche (DD)E-Komplex enthält die Fragmente D-Dimer und E&sub1;. Nach weiterem enzymatischem Verdau wird Fragment E&sub1; zu Fragment E&sub2; gespalten, ohne Verlust der Fähigkeit, an das D-Dimer-Fragment zu binden. Der Verdau von Fragment E&sub2; zu E&sub3; führt zur Dissoziation des Komplexes, wobei die letztendlichen Verdauprodukte von Fibrin Fragmente DD und E&sub3; sind. Die Fragmente E&sub1; und E&sub2; weisen die Fähigkeit auf, an Fragment DD von kreuzvernetztem Fibrin zu binden, binden jedoch nicht mit dem DD-E-Komplex, Fibrinogen oder einem der plasmischen Abbauprodukte von Fibrinogen oder von nicht-kreuzvernetztem Fibrin.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Kit zum Nachweis des Plasminabbaus von Fibrin zur Verfügung, unter der Verwendung von gereinigtem Fragment E, angebracht an eine feste Phase, für eine direkte chemische Bindung von D-Dimer aus biologischen Proben.
  • Gereinigtes Fragment E kann gemäß den durch Olexa und Budzynski, in Biochemistry 19, 991 (1979) und in J. Biol. Chem. 254, 4925 (1979) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Der grundsätzliche Prozeß, der in diesen Publikationen beschrieben wird, beginnt mit der Bildung eines Fibringerinnsels von mit Faktor XIII angereichertem Fibrinogen. Das Gerinnsel wird mit Plasmin hydrolysiert und der erhaltene Verdau wird zentrifugiert, um große Gerinnselpartikel zu entfernen. Der Überstand, der lösliche Abbauprodukte, einschließlich dem (DD)E-Komplex enthält, wird dann auf einer Agarosegelperlen-Säule abgetrennt. Der abgetrennte (DD)E-Komplex wird dann in einer konzentrierten Salzlösung inkubiert, um das D- Dimer und E&sub1;- oder E&sub2;-Fragmente zu dissoziieren. Die Fragmente werden dann mittels einer Agarosegelperlen-Säule getrennt und gereinigtes Fragment E&sub1; oder E&sub2; erhalten.
  • Das Kit der Erfindung kann in einer modifizierten ELISA-Technik verwendet werden, um die Konzentration von Fragment E&sub1;/E&sub2; zu quantifizieren, die als das Fangmolekül für D-Dimer verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird Fragment E&sub1;/E&sub2; an einen festen Träger absorbiert. Eine biologische Probe, wie zum Beispiel Plasma, Urin oder andere Körperflüssigkeit, die D-Dimer enthält, wird dann zur Bindung an Fragment E&sub1;/E&sub2; hinzugefügt. Ein für D-Dimer spezifischer monoklonaler oder polyklonaler Antikörper wird dann an ein Enzym, wie zum Beispiel Peroxidase, Urease oder beta-Galactosidase konjugiert. Dem Konjugat (anti-D- Dimer/Enzym) wird dann erlaubt, an das D-Dimer zu binden, das direkt an das Fragment E&sub1;/E&sub2; angebracht ist. Die Zugabe eines für das verwendete Enzym spezifischen Substrats ermöglicht die Quantifizierung von D-Dimer.

Claims (5)

1. Kit, umfassend:
ein Reagenz, das spezifisch das Fibrin-Abbauprodukt D-Dimer bindet und nachweist in einer biologischen Probe, die D-Dimer und andere Fibrin-Abbauprodukte enthalten kann, zur Diagnose und der Überwachung von thrombolytischen und hyperkoagulierbaren Zuständen, umfassend gereinigtes Fragment E, das an einen festen Träger gebunden ist; und
einen für Fragment D-Dimer spezifischen markierten Antikörper.
2. Kit nach Anspruch 1, wobei der feste Träger Latex-Trägerpartikel umfaßt.
3. Kit nach Anspruch 2, wobei die Latex-Trägerpartikel Amidin-modifiziert sind.
4. Kit nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, weiterhin umfassend eine Oberfläche zum Mischen des Reagenz mit der Probe und zur Beobachtung der Agglutination.
5. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fragment E Fragment E&sub1; ist.
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