CN108088992A - 一种氯霉素的化学发光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氯霉素化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：吖啶酯标记物、偶联有抗原或抗体的磁微粒、氯霉素校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B。本发明试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术。本发明试剂盒操作简单方便，反应条件温和，发光值稳定，受外界条件影响少；与现有技术相比，具有灵敏度高、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。

Description

一种氯霉素的化学发光检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域，具体涉及一种氯霉素的化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
氯霉素 ( Chloramphenicol , CAP )，是由Ehrlich于1947年分离出来的一种广谱抗生素，氯霉素可作用于细菌核糖核蛋白体的50S亚基，它可以阻挠蛋白质的合成，对革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌均有抑制作用。由于氯霉素具有价格低廉、抗菌性优良、药性稳定的特点，因而广泛用于各种动物性传染疾病的治疗，对各类家禽、家畜、水产品及蜂蜜制品各种传染性疾病的控制和治疗起重要作用。但氯霉素有严重的毒副作用，能引起再生障碍性贫血症和新生儿灰色综合症等。因此，欧盟、美国、我国以及其他国家严禁氯霉素在动物上使用。目前我国动物源食品中氯霉素残留仍很严重，因此，为保障人民的身体健康，迫切需要建立灵敏度高，特异性强的检验方法。
目前用于检测氯霉素的方法主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法、胶体金免疫分析法、酶联免疫分析法、化学发光酶联免疫法等。其中，高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法需要大型精密仪器，繁琐耗时，检测费用高昂，检测样本有限，不适应大批量样本的检测；胶体金免疫分析法的检测是以肉眼可见的颜色进行表征，存在误差较大，操作繁琐、流程较多、灵敏度低、精度不高等缺点；酶联免疫分析法存在灵敏度低、不易实现全自动化、检测时间长等的缺点；CN104165990 A（2014.11）公开了一种氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法，该试剂盒采用辣根过氧化物酶作为标记物，采用辣根过氧化物酶主要缺点为：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。因此建立一种有效、快速、简单、灵敏、抗干扰性高的检测氯霉素的方法具有十分重要的意义。
本发明以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术进行检测。
吖啶取代物作为化学发光标记物用于免疫分析具有许多优越性，主要有：①化学反应简单、快速、无需催化剂，在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光；②背景发光低，信噪比高，发光反应干扰因素少；③发光类型为闪光型发光，光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；④吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，可提高系统整体灵敏度；⑤易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑥标记物稳定，不受环境氧化剂的影响，在2-8℃下可保存数月之久。因此吖啶取代物是一类非常有效的化学发光标记物。
磁分离免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体而建立的一种新型免疫检测方法，该方法可使抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简便、灵敏度更高、反应快速、稳定、准确地定量测定氯霉素的磁微粒化学发光测定试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
一种氯霉素的化学发光试剂盒及其制备方法，本发明所提供的氯霉素的化学发光试剂盒，包括以下组分：偶联有抗体或抗原的磁微粒、吖啶酯标记的抗原或抗体、氯霉素校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A以及化学发光激发液B。
作为本发明进一步的方案，所述的磁微粒可直接与氯霉素抗体或抗原偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记氯霉素抗体或抗原。
作为本发明进一步的方案，所述的磁微粒偶联缓冲液为pH 5.0-6.0，浓度为20-200 mmol/L 的MES缓冲液。
作为本发明进一步的方案，所述的磁微粒封闭缓冲液为含1%BSA的缓冲液。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯与标记的抗原或抗体的摩尔比为5-100:1。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记缓冲液是pH 8.0-11.0、浓度为0.01-0.20 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
作为本发明进一步的方案，所述的校准品是用含有0.5-5.0% BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加入氯霉素纯品配置而成，校准品形态为液态。
作为本发明进一步的方案，所述的氯霉素校准品浓度梯度为0 ng/mL、0.02 ng/mL、0.08 ng/mL、0.32 ng/mL、1.28 ng/mL、2.00 ng/mL。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成。其中，H2O2的质量分数为0.01-5.0%，HNO3浓度为0.01-1.0 mol/L；化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100的质量分数为0.01-2.0 %，NaOH浓度为0.05-1.0 mol/L。
作为本发明进一步的方案，所述的清洗液是pH 7.0-9.0、浓度为5-50 mmol/L的Tris或HEPES或其它溶液，其中含质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。
本发明检测试剂盒采用的原理是竞争法，具体是通过样本中的氯霉素抗原与系统中的氯霉素抗原竞争结合特异性氯霉素抗体，利用吖啶酯反应产生的光子以检测产物浓度。
本发明的优点在于以磁分离化学发光技术为检测手段，同时采用吖啶酯标记技术进行检测以建立一种检测氯霉素的直接化学发光试剂盒。以磁性微粒为固相分离载体，可使抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，反应快速、彻底；吖啶酯具有背景发光低、信噪比高、发光效率高、标记稳定、可提高系统整体灵敏度的明显优势；本发明操作简单方便，具有发光值稳定、灵敏度高、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。
具体实施方式
本发明提供一种氯霉素的化学发光试剂盒及其组成，为使本发明的目的、技术方案及效果更加明确、清楚，以下对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种氯霉素的化学发光试剂盒，以磁分离化学发光技术作为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术进行检测。该试剂盒包括：偶联有抗原或抗体的磁微粒、吖啶酯标记物、氯霉素校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B。
本发明试剂盒以磁分离化学发光技术作为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术进行检测。
实施例1：试剂盒1的组建及其制备
1. 试剂盒1组建
组建一种氯霉素的化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：
羧基磁珠偶联的氯霉素抗原；
吖啶酯标记的氯霉素抗体；
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
氯霉素系列校准品溶液；
清洗液。
2. 偶联有氯霉素抗原的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入200 μL的0.1 mol/L MES（pH 5.0）缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200 μL的MES缓冲液（pH 5.0），涡旋。
（2）加入20 μg的氯霉素抗原，使羧基与抗体摩尔比为50:1，于旋转反应器上涡旋，室温孵育30 min。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺），于旋转反应器上涡旋，室温孵育2 h。
（4）取200 μL含1% BSA的甘氨酸缓冲液（浓度为50 mmol/L）进行封闭，时间为1 h。
（5）去上清，加入200 μL清洗缓冲液（TBS+0.05% Tween-20），洗涤3次。
（6）将上述制备好的磁微粒混悬液置于500 μL保存液（300 mmol/L甘氨酸、2%甘油、5%蔗糖）中，2-8℃保存。
3. 吖啶酯标记的氯霉素抗体的制备
（1）将100 μg的氯霉素抗体置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液更换5次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH 9.8、浓度为50 mmol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取1.7 mg的吖啶酯，选用化学发光标记物为NSP-DMAE-NHS，溶于447 μL无水二甲基甲酰胺（DMF）中，配成浓度为6.5 mmol/L的吖啶酯溶液。
（3）将经透析后的氯霉素抗体置于500 μL离心管中，加入200 μL标记缓冲液，加入759 μL的6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液（避光反应），使吖啶酯与抗体的摩尔比为7.4:1，震荡混匀，室温下反应1 h。加入100 μL 浓度为10 g/L的赖氨酸，静置15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ab与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液0.1 mol/L的PBS（pH 6.3）平衡并淋洗层析柱。分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280 nm吸光度值。收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA（体积）后分装冰冻保存。
4. 氯霉素校准品的制备
用含有2% BSA的Tris-NaCl缓冲液将氯霉素纯品配制成标示浓度为0 ng/mL、0.02 ng/mL、0.08 ng/mL、0.32 ng/mL、1.28 ng/mL、2.00 ng/mL的一系列校准品。
5. 化学发光激发剂的制备
（1） 化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成。其中，H2O2的质量分数为1.5%，HNO3浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100质量分数为1.0%，NaOH浓度为0.4 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
6. 清洗液的制备
称量3.05 g Tris，8.775 g NaCl至1000 mL的烧杯中，加入1 mL质量分数为0.05%Tween-20，搅拌混匀，定容，将pH调至 7.6后保存备用。
实施例2：试剂盒2的组建及其制备
1. 试剂盒2的组建
组建一种氯霉素的化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：
羧基磁珠偶联氯霉素抗体；
吖啶酯标记的氯霉素抗原；
氯霉素系列校准品溶液；
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
清洗液。
2. 偶联有氯霉素抗体的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入200 μL的0.1 mol/L MES（pH 6.0）缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200 μL的MES（pH 6.0）缓冲液，涡旋。
（2）加入15 μg氯霉素抗体，使羧基与抗体摩尔比为150:1，于旋转反应器上涡旋，室温孵育30 min。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺），于旋转反应器上涡旋，室温孵育2 h。
（4）取200 μL含1% BSA的甘氨酸缓冲液（浓度为50 mmol/L）进行封闭，时间为1 h。
（5）去上清，加入200 μL清洗缓冲液（TBS+0.05% Tween-20），洗涤3次。
（6）将上述制备好的磁微粒混悬液置于500 μL保存液（300 mmol/L甘氨酸、2%甘油、5%蔗糖）中，2-8℃保存。
3. 吖啶酯标记的氯霉素抗原的制备
（1）将100 μg的氯霉素抗原置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液更换5次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH 9.8、浓度为50 mmol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取1.7 mg的吖啶酯，选用化学发光标记物为NSP-DMAE-NHS，溶于447 μL无水二甲基甲酰胺（DMF）中，配成浓度为6.5 mmol/L的吖啶酯溶液。
（3）将经透析后的氯霉素抗原置于500 μL离心管中，加入200 μL标记缓冲液，加入1 mL的6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液（避光反应），使吖啶酯与抗原的摩尔比为20:1，加入200 μL标记缓冲液，室温下反应1 h。加入10 g/L赖氨酸100 μL继续反应15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ag与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液0.1 mol/L的PBS（pH 6.3）平衡并淋洗层析柱。分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280 nm吸光度值。收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA（体积）后分装冰冻保存。
4. 氯霉素校准品的制备
用含有2% BSA的Tris-NaCl缓冲液将氯霉素纯品配制成标示浓度为0 ng/mL、0.02 ng/mL、0.08 ng/mL、0.32 ng/mL、1.28 ng/mL、2.00 ng/mL的一系列校准品。
5. 化学发光激发剂的制备：
（1）化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成。其中，H2O2 的质量分数为1.5%，HNO3浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100质量分数为1.0%，NaOH浓度为0.4 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
实施例3：实际样本中氯霉素的检测
本发明氯霉素定量检测试剂盒的使用操作程序如下：
1. 样本前处理
（1）动物组织（肉类、鱼、虾、肝脏）样本处理
称取均质后的样本 3 g于50 mL离心管中，先加入 3 mL去离子水振荡混匀，再加入6mL乙酸乙酯振荡2 min，室温4000 r/min离心10 min。取上层液体2 mL在50-60℃下氮气吹干。用1 mL正己烷溶解干燥的残渣，再加入0.5 mL浓度为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，混匀，室温 4000 r/min离心5 min。去除上层有机相，取下层水相进行分析。
（2）牛奶样本处理
牛奶检测样本溶液的获得：取150 μL新鲜牛奶于500 μL离心管中，4℃离心10 min（3000 r/min），弃去上层脂肪。移取离心后的牛奶样本25 μL置于干净的玻璃试管中，加入475 μL浓度为0.02 mol/L磷酸盐缓冲液进行稀释。
2.试剂盒的检测
（1）将待测样本50 μL、偶联磁微粒混悬液150 μL、吖啶酯标记物150 μL，依次加入反应管中，振荡混匀，37℃孵育15 min。
（2）分离，清洗5次。
（3）将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（4）加入100 μL化学发光预激发液A，1 s后加入100 μL化学发光激发液B，测量其相对发光强度，样本中氯霉素的含量与其相对发光强度成一定比例关系。
实施例4：性能指标检测结果
（1）试剂盒的灵敏度
对零标准溶液进行20次重复测试，取零标准溶液测定的平均值加上3倍的标准偏差，即为本试剂盒的灵敏度。本试剂盒对氯霉素的灵敏度为0.01 ng/mL。
（2）试剂盒的特异性
与氯霉素结构或功能相似的竞争药物：氟苯尼考、链霉素、红霉素、大观霉素、新霉素。按试剂盒步骤操作，分别加入氯霉素、与氟苯尼考、链霉素、红霉素、大观霉素、新霉素，制作抑制曲线，根据线性方程计算各竞争物的50%抑制浓度。交叉反应率即为抗体对氯霉素的IC50与抗体对氯霉素竞争物的IC50之比的百分数。结果显示：本试剂盒对氯霉素具有较高的特异性，对与氯霉素结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种氯霉素的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于，包括：吖啶酯标记的氯霉素抗体、偶联有氯霉素抗原的磁微粒、氯霉素校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B。
2.根据权利要求1所述的一种氯霉素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
3.根据权利要求1所述的一种氯霉素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的吖啶酯标记的是氯霉素抗体。
4.根据权利要求1所述的一种氯霉素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒可直接与氯霉素抗原偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记氯霉素抗原。
5.根据权利要求1所述的一种氯霉素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的校准品是以含有0.5-5.0% BSA和0.1-0.5% PC300的Tris-HCl缓冲液为基质，加入氯霉素纯品配置而成的系列浓度梯度的校准品溶液。
6.根据权利要求1所述的一种氯霉素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成，化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。
7.一种氯霉素的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于，包括：吖啶酯标记的氯霉素抗原、偶联有氯霉素抗体的磁微粒、氯霉素校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B。
8.根据权利要求7所述的一种氯霉素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
9.根据权利要求7所述的一种氯霉素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的吖啶酯标记的是氯霉素抗原。
10.根据权利要求7所述的一种氯霉素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒可直接与氯霉素抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记氯霉素抗体。
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