CN113484519A - 一种探针、检测玉米赤霉烯酮的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种探针、检测玉米赤霉烯酮的方法及应用，包括信号载体和吸附结合在信号载体上的单克隆抗体，单克隆抗体为玉米赤霉烯酮单克隆抗体，信号载体SAQDsRu的粒径为519～650nm；玉米赤霉烯酮单克隆抗体的浓度为1mg/mL。本发明首次在免疫层析试纸条检测中通过基于金黄色葡萄球菌生物合成量子点并掺杂三联吡啶氯化钌六水合物作为生物载体标记抗体制备新型双模式探针，该探针比色、荧光信号强度高，且可以利用金黄色葡萄球菌蛋白A的识别功能特异性标记抗体，避免了繁琐的修饰程序或恶劣条件，从而显着保留了抗体的生物活性，提供的试纸条对玉米赤霉烯酮的最低检测限分别为0.008ng/mL(比色模式)和0.0058ng/mL(荧光模式)，是传统胶体金试纸条灵敏度的13倍和18倍。

Description

一种探针、检测玉米赤霉烯酮的方法及应用

技术领域

本发明属生物检测领域，涉及一种探针、检测玉米赤霉烯酮的方法及应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一类非甾体类雌激素类真菌毒素，广泛存在于玉米、小麦、大米等谷物、饲料和动物制品中，主要对人体内分泌、生殖功能造成损伤。对动物和人体有生殖毒性，细胞毒性，肝肾毒性和免疫毒性。目前，玉米赤霉烯酮常用的检测方法包括仪器分析法和免疫分析法等。仪器分析法灵敏度高，可准确定量，但样本前处理复杂并且检测仪器昂贵，难以实现现场快速检测技术。免疫分析法主要包括酶联免疫吸附法和免疫层析试纸条，酶联免疫吸附法虽然性能好，但是需要的时间长且需要专业人员的操作。因此，对玉米赤霉烯酮开展有效的检测，并加强相关环节的监管，在食品安全领域中具有重要作用。

由于免疫层析试纸条(ICA)快速、灵敏度高、特异性好，并且成本较低等特点，成为现场快速检测的重要手段。虽然在快速测试方面取得了显著的进展，但大多数定性或半定量检测的比色ICA遵循单模态读出，这可能存在灵敏度和精度不足的缺陷。相比之下，双读或多读出ICA是两种或多个策略的协作关联，通过单模态或多模态标签实现，从而确保提高的性能、整体检测灵活性和结果的优越可靠性。

近年来，人们的热情和关注是开发纳米材料(NMs)，并将其集成到ICA中，以提高生物传感器的分析性能。例如，Ag₄-NTP@AuNPs(比色-拉曼)，Fe₃O₄@PDA@AuNPs(比色-磁性-拉曼)，二氧化锰纳米花/g-C₃N₄/BiFeO₃(比色-荧光)等。然而，这些纳米材料的适宜性往往受到一些不可控的因素的阻碍。功能性NM的制备通常涉及苛刻的条件，例如需要有毒试剂，强化学试剂，高温和高压，这对环境有害并且难以复制；其次，单克隆抗体与NMs之间被动吸附和共价偶联的交联方式不仅容易受到单克隆抗体等电点，温度，离子浓度的影响，而且单克隆抗体也是随机且非特异性的固定在NMs的表面，这可能会损害单克隆抗体的活性。为了规避这些限制，迫切需要开发一种简便且生态友好的策略，以生产具有卓越性能的替代载体来定向固定单克隆抗体，从而保留单克隆抗体的生物识别能力。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种探针、检测玉米赤霉烯酮的方法及应用。用于在小米和玉米样品中进行玉米赤霉烯酮的监测，实现灵敏，精确，快速的目标确定。

为达到上述技术效果，本发明采取的技术方案为：

一种探针，包括信号载体和吸附结合在信号载体上的单克隆抗体，所述的信号载体为信号载体SAQDsRu，所述的信号载体SAQDsRu为基于金黄色葡萄球菌SA合成量子点SAQDs并掺杂三联吡啶氯化钌六水合物制备得到；

所述量子点SAQDs的粒径为513～653nm，所述信号载体SAQDsRu的粒径为519～650nm；

所述的单克隆抗体为玉米赤霉烯酮单克隆抗体。

具体的，所述的信号载体SAQDsRu的制备方法包括：首先将亚硒酸钠固体加入到含金黄色葡萄球菌的液体培养基中，然后加入氯化镉固体得到基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液，最后，将三联吡啶氯化钌六水合物固体添加到所述基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液中混合得到混合溶液，将所述混合溶液离心、重悬于水并灭活所得的金黄色葡萄球菌为信号载体SAQDsRu。

具体的，所述亚硒酸钠的终浓度为4～6mM，所述氯化镉的终浓度为1mM，所述金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值为1.0～2.6。

具体的，所述混合溶液中三联吡啶氯化钌六水合物的浓度为(0.4～1.2)mg/mL，加入三联吡啶氯化钌六水合物后混合的时间为(15～90)min。

具体的，所述探针中的玉米赤霉烯酮单克隆抗体的终浓度为1mg/mL。

具体的，制备该探针的方法包括：

步骤1：将亚硒酸钠固体加入到含金黄色葡萄球菌的液体培养基中，并加入氯化镉固体得到基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液；

所述亚硒酸钠的终浓度为4～6mM，所述氯化镉的终浓度为1mM，所述金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值为1.0～2.6；

步骤2：将三联吡啶氯化钌六水合物固体添加到步骤1中所述基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液中混合得到混合溶液，将所述混合溶液离心、重悬于水并灭活所得的金黄色葡萄球菌为信号载体SAQDsRu；

所述混合溶液中三联吡啶氯化钌六水合物的浓度为(0.4～1.2)mg/mL，加入三联吡啶氯化钌六水合物后混合的时间为(15～90)min；

步骤3：将玉米赤霉烯酮单克隆抗体添加到信号载体SAQDsRu的水溶液中混合，用牛血清白蛋白封闭，离心即得。

进一步的，步骤3中所述的玉米赤霉烯酮单克隆抗体与信号载体SAQDsRu的水溶液混合时的混合比为(3～7)μg:1mL，混合时间为3h，所述信号载体SAQDsRu的水溶液的OD₆₀₀值为2.2～2.6；

牛血清白蛋白封闭时在37℃下封闭30min。

本发明所述的探针用于检测谷物中的玉米赤霉烯酮的应用，所述的谷物包括玉米和小米。

一种检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括本发明所述的探针加入待检测样品中，然后将检测玉米赤霉烯酮的试纸条插入待检测样品中进行检测。

具体的，所述的检测玉米赤霉烯酮的试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线和控制线，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理；

硝酸纤维素膜的制备方法包括：玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物以0.5～0.9μL/cm的划线速率涂覆在检测线上得检测线，羊抗鼠免疫球蛋白以1μL/cm涂覆在控制线上为控制线，然后于37℃条件下干燥30min；

所述的样品垫与结合垫的制备方法包括：将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，于36～37℃条件下干燥8～10h。

与现有技术相比，其优点与积极效果在于：

(1)打破传统复杂的交联过程：该发明只通过基于金黄色葡萄球菌生物合成量子点后掺杂三联吡啶氯化钌六水合物的信号载体与抗体进行简单的吸附作用制备新型双模式探针，免去了复杂的标记过程(如EDC/NHS方法)；

(2)新型双模式探针：首次在免疫层析试纸条检测中通过基于金黄色葡萄球菌生物合成量子点并掺杂三联吡啶氯化钌六水合物材料作为生物载体标记抗体制备新型双模式探针，该探针比色、荧光信号强度高，且可以利用金黄色葡萄球菌蛋白A的识别功能特异性标记抗体，避免了繁琐的修饰程序或恶劣条件，从而显着保留了抗体的生物活性，并增强了检测的灵敏度；

(3)灵敏度高：本发明提供的试纸条对玉米赤霉烯酮的最低检测限分别为0.008ng/mL(比色模式)和0.0058ng/mL(荧光模式)；可作为通用方法快速、便携检测食品中真菌毒素的残留；

(4)特异性强：该发明试纸条对玉米赤霉烯酮具有高度特异性，对其他毒素均无特异性；

(5)良好的实际应用：本发明可以检测小米和玉米中的玉米赤霉烯酮，具有很好的应用前景，可以作为检测各种真菌毒素的通用检测方法。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是本发明基于金黄色葡萄球菌SA合成量子点SAQDs并掺杂三联吡啶氯化钌六水合物得到的信号载体SAQDsRu的制备示意图；

图2为本发明的探针SAQDsRu-mAb与传统胶体金探针AuNPs-mAb的比较示意图；

图3为本发明制备的信号载体SAQDsRu的扫描电镜图(A)、粒径分布图(B)、放大倍数下的扫描电镜图(C)和X射线能量色散光谱图(D)；

图4为本发明制备的量子点SAQDs扫描电镜图(A)、粒径分布图(B)、放大倍数下的扫描电镜图(C)；

图5为本发明制备的基于金黄色葡萄球菌SA合成量子点SAQDs的高分辨率透射电子显微镜(A)及粒径分布图(B)；

图6为本发明制备的量子点SAQDs与信号载体SAQDsRu的X射线衍射图谱；

图7为本发明免疫层析试纸条构型图及免疫层析试纸条检测原理图；

图8为本发明制备的免疫层析试纸条检测灵敏度测试，其中，图8A中，编号1～10表示玉米赤霉烯酮浓度分别为0,0.01,0.02,0.045,0.09,0.18,0.375,0.75,1.5,和3ng/mL的10组试纸条，上排表示试纸条T线的信号强度，下排表示在紫外光下试纸条T线的荧光强度图；图8B、8C和8D分别表示SAQDsRu-CICA(比色)、SAQDsRu-FICA(荧光)和传统胶体金标准曲线；

图9为本发明制备的免疫层析试纸条的特异性，图9A为SAQDsRu-CICA(比色)检测玉米赤霉烯酮的特异性，图9B为SAQDsRu-FICA(荧光)检测玉米赤霉烯酮的特异性；

图10为本发明制备的免疫层析试纸条检测的实际应用，A和C分别为SAQDsRu-CICA(比色)检测玉米和小米中玉米赤霉烯酮的应用，B和D为分别为SAQDsRu-FICA(荧光)检测玉米和小米中玉米赤霉烯酮的应用，玉米赤霉烯酮浓度为0,0.08,0.16,0.36,0.72,1.44,3,6,12和24μg/kg分别对应图10中编号1～10的试纸条。

图11为本发明制备的信号载体SAQDsRu的荧光特性及双模式探针SAQDsRu-mAb的验证结果。

以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。

具体实施方式

以下将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，并非全部实施例，也并未对本发明做任何形式上的限制，凡是利用本实施例的技术方案，包括对本实施例做了简单的变化，均属于本发明保护的范围。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。本发明基于生物合成技术，使用基于金黄色葡萄球菌生物(SA)合成量子点(SAQDs)掺杂三联吡啶氯化钌六水合物作为生物信号载体(SAQDsRu)，通过标记单克隆抗体来制备探针。

在本发明中，单克隆抗体选用玉米赤霉烯酮单克隆抗体(mAb)，最终与生物载体(SAQDsRu)制备新型双模式探针(SAQDsRu-mAb)。双模式是指：既可以基于比色的免疫层析法(CICA)进行检测分析，还可以基于荧光的免疫层析法(FICA)检测分析。

该探针比色、荧光信号强度高，且可以利用金黄色葡萄球菌蛋白A的识别功能特异性标记抗体，避免了繁琐的修饰程序或恶劣条件，从而显着保留了抗体的生物活性，并增强了检测的灵敏度。

本发明的金黄色葡萄球菌(SA)是自然界中容易获得的革兰氏阳性微生物，由于其表面存在大量的蛋白A，可以直接靶向结合单克隆抗体的Fc片段，从而与抗体特异性结合。基于新型双模式探针的免疫层析试纸条检测玉米赤霉烯酮有几个优点：

(1)SA的比表面积大，且含有丰富的官能团，具有易于制造，特定识别和出色的稳定性等不可估量的功能；

(2)利用生物合成的量子点掺杂三联吡啶氯化钌六水合物具有极佳的闭塞强度和荧光特性，易于获得且能组装到完整细胞中；

(3)所制备的量子点避免了繁琐的修饰过程，从而摒弃了传统纳米材料的固有局限性，本发明制备的新型双模式探针(基于比色的免疫层析法和基于荧光的免疫层析法)是一种很有前景的信号载体；

(4)在结合过程中，SA能进行定点捕获且无需对抗体进行任何其他修饰，从而可以最大程度的保持玉米赤霉烯酮单克隆抗体(mAb)的活性并充分暴露与抗原结合片段Fab结构域；

(5)基于金黄色葡萄球菌生物合成量子点掺杂结合三联吡啶氯化钌六水合物的玉米赤霉烯酮分析应用方法来快速量化测试结果，可以更加便携、灵敏、精确、和快速的测定目标。

为了获得最佳的测定性能，发明人优化了SA的浓度，三联吡啶氯化钌六水合物的浓度，加入三联吡啶氯化钌六水合物培养进行染色的时间，玉米赤霉烯酮抗原的划线量，抗体的使用量，新型双模式探针的体积，并确定了最优的系统条件。最终制得的试纸条用于检测食品中的玉米赤霉烯酮毒素，该方法已成功应用于小米和玉米中玉米赤霉烯酮的检测，验证了其实用性，灵敏性和准确性。

该试纸条的工作原理为：基于竞争检测原理，首先，将SAQDsRu-mAb探针添加到实际待检测的样品中以捕获目标玉米赤霉烯酮(ZEN)，结合的SAQDsRu-mAb-ZEN免疫复合物通过毛细作用移向试纸的测试区域。

对于阳性样品，SAQDsRu-mAb探针无法在检测线上出现可见带(当ZEN浓度足够高时)或比空白对照带要亮的条带(当ZEN浓度很低时)。相反，对于阴性样品，SAQDsRu-mAb探针将在检测线中被玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物(ZEN-BSA)拦截，由于SAQD的可见颜色而显示明显的红色(通道1：在环境光下，基于比色的免疫层析法(CICA))。另一方面，由于三联吡啶氯化钌六水合物具有惊人的荧光特性，还可以通过分析SAQDsRu的荧光强度(通道2：在波长365nm紫外光下，基于荧光的免疫层析法(FICA))来检测ZEN。

本发明的探针包括信号载体和吸附结合在信号载体上的单克隆抗体，所述的信号载体为信号载体SAQDsRu，所述的信号载体SAQDsRu为基于金黄色葡萄球菌SA合成量子点SAQDs并掺杂三联吡啶氯化钌六水合物制备得到；信号载体SAQDsRu是含有金黄色葡萄球菌的，在整个制备的过程中，均需要培养基持续提供营养，在制备过程最后步骤是离心达到去除培养基的目的。在信号载体SAQDsRu与玉米赤霉烯酮单克隆抗体吸附时，不加入培养基，经过混合，用牛血清白蛋白封闭，离心后即得本发明所述的探针。

所述量子点SAQDs的粒径为513～653nm，所述信号载体SAQDsRu的粒径为519～650nm，具有典型的金黄色葡萄球菌形态。

本发明的免疫层析试纸条由五部分构成，依次将硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫和吸收垫贴至衬板上，其中硝酸纤维素上划线包被有玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物(ZEN-BSA)和羊抗鼠免疫球蛋白分别做检测线(T线)和控制线(C线)。

本发明中所用的实验试剂包括玉米赤霉烯酮单克隆抗体、氯化镉、三联吡啶氯化钌六水合物均等均为市售所得，并未做进一步处理，本发明所用的氯化镉又名半水氯化镉，又名2.5水合氯化镉。检测仪器设备等均为常用的仪器，检测方法均为常规检测方法。其中，玉米赤霉烯酮单克隆抗体购自西格玛-奥尔德里奇股份有限公司，实施例中培养金黄色葡萄球菌所用的培养基为LB培养基，加水后配成液体培养基进行使用，均购自北京路桥科技股份有限公司。LB培养基的配方为：酵母提取物5g/L，胰蛋白酯10g/L，氯化钠5g/L

终浓度是指该物质在整个溶液中的浓度。

实施例1：

结合图1和2，本实施例给出信号载体SAQDsRu及制备方法，信号载体SAQDsRu是基于金黄色葡萄球菌SA合成量子点SAQDs并掺杂三联吡啶氯化钌六水合物制备得到；量子点SAQDs的粒径为513～653nm，具体为513.26～653.26nm，信号载体SAQDsRu的粒径为519～650nm，具体为519.06～645.94nm。

信号载体SAQDsRu的制备方法包括：首先将亚硒酸钠固体加入到含金黄色葡萄球菌的液体培养基中，然后加入氯化镉固体得到基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液，最后，将三联吡啶氯化钌六水合物固体添加到所述基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液中得到混合溶液，将所述混合溶液离心、重悬于水并灭活所得的金黄色葡萄球菌为信号载体SAQDsRu。

具体的，亚硒酸钠的终浓度为4～6mM，氯化镉的终浓度为1mM，金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值为1.0～2.6；混合溶液中三联吡啶氯化钌六水合物的浓度为(0.4～1.2)mg/mL，加入三联吡啶氯化钌六水合物后混合的时间为(15～90)min。

作为本实施例的优选方案，具体将亚硒酸钠固体(终浓度为5mM)加入到含金黄色葡萄球菌的液体培养基中，金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值为2.2，具体是将液体培养基放入摇床中培养12小时(37℃，160rpm)，金黄色葡萄球菌需要一直生长，不断的提供与亚硒酸钠反应的谷胱甘肽，反应生成硒-半胱氨酸，然后以5000rpm离心4分钟收获，并转移到新鲜的液体培养基中，新鲜的液体培养基持续提供营养，然后加入半水氯化镉固体(终浓度为1mM)进行培养12小时得到基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液，氯化镉与硒-半胱氨酸反应生成硒化镉量子点。

最后，将三联吡啶氯化钌六水合物固体(终浓度为1mg/mL)添加到所述基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液中得到混合溶液并在37℃摇动60min，通过以5000rpm离心4min纯化SAQDsRu，并用超纯水洗涤3次，重悬在去离子水中并在65℃灭活半小时所得的金黄色葡萄球菌即为信号载体SAQDsRu，在4℃下保存备用。

本实施例对量子点SAQDs、信号载体SAQDsRu进行一系列表征，结果分析如下：

从信号载体SAQDsRu的扫描电镜图3A可看出，分散的SAQDsRu具有典型的金黄色葡萄球菌形态，其平均粒径为582.50±63.44nm，并且通过EDS(图3D)观察到SAQDsRu主要是由Cd，S，Se和Ru组成。

在图4中，量子点SAQDs的平均粒径为583.26±69.83nm，结合图3与4可看出，与SAQD相比，SAQDsRu的尺寸没有明显差异，这表明在构建过程中掺入三联吡啶氯化钌六水合物对量子点SAQDs表面没有影响。

高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)见图5：基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点QDs具有球形形态的纳米颗粒，该量子点QDs其平均粒径为2.05±0.73nm，晶格间距约为0.3167nm，与现有的硒化镉量子点CdS_0.75Se_0.25的相邻面(101)的间距一致，证明本实施例基于金黄色葡萄球菌SA成功制备合成了硒化镉量子点CdS_0.75Se_0.25。

X射线能量色散光谱图见图6，SAQDs和SAQDsRu所有特征峰均与标准CdS_0.75Se_0.25(JCPDS No.49-1495)的主峰相匹配，表明掺杂三联吡啶氯化钌六水合物后，SAQDsRu仍保持SAQDs的结构。

实施例2：

遵从上述技术方案，本实施例给出一种探针及制备方法，该探针包括信号载体和吸附结合在信号载体上的单克隆抗体，单克隆抗体为玉米赤霉烯酮单克隆抗体，信号载体为实施例1制备得到的信号载体SAQDsRu；信号载体SAQDsRu的粒径为519～650nm；玉米赤霉烯酮单克隆抗体的浓度为1mg/mL。

制备该探针的方法包括以下步骤：

步骤1：将亚硒酸钠固体加入到含金黄色葡萄球菌的液体培养基中，并加入氯化镉固体得到基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液；

所述亚硒酸钠的终浓度为4～6mM，所述氯化镉的终浓度为1mM，所述金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值为1.0～2.6；

作为本实施例的优选方案，具体将亚硒酸钠固体(终浓度为5mM)加入到含金黄色葡萄球菌的液体培养基中，金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值为2.2，具体是放入摇床中培养12小时(37℃，160rpm)然后通过以5000rpm离心4分钟收获，并转移到新鲜的液体培养基中，新鲜的液体培养基持续提供营养，然后加入半水氯化镉固体(终浓度为1mM)进行培养12小时得到基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液。

步骤2：将三联吡啶氯化钌六水合物固体添加到步骤1中所述基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液中得到混合溶液，将所述混合溶液离心、重悬于水并灭活所得的金黄色葡萄球菌为信号载体SAQDsRu；

所述混合溶液中三联吡啶氯化钌六水合物的浓度为(0.4～1.2)mg/mL，加入三联吡啶氯化钌六水合物后混合的时间为(15～90)min。

具体为将三联吡啶氯化钌六水合物(终浓度为1mg/mL)添加到基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液中得到混合溶液，在37℃摇动1h，通过以5000rpm离心4min纯化SAQDsRu，并用超纯水洗涤3次，最后重悬于水并灭活所得的金黄色葡萄球菌为信号载体SAQDsRu；

步骤3：将玉米赤霉烯酮单克隆抗体添加到信号载体SAQDsRu的水溶液中混合，用牛血清白蛋白封闭，离心即得。

所述的玉米赤霉烯酮单克隆抗体与信号载体SAQDsRu的水溶液混合时的混合比为(3～7)μg:1mL，混合时间为3h，信号载体SAQDsRu的水溶液的OD₆₀₀值为2.2～2.6；牛血清白蛋白封闭时在37℃下封闭30min。

具体的，将4μg玉米赤霉烯酮单克隆抗体(终浓度为1.0mg/mL)添加到1mL信号载体SAQDsRu的水溶液中(OD₆₀₀值为2.2)，混合比为4μg:1mL，放入摇床中摇动3h(37℃，160rpm)，使其充分混合。之后，将混合物用100μL的10％牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封闭30分钟。最后，通过以5000rpm离心4分钟获得探针SAQDsRu-mAb，本实施例制得的探针需要分散在500μL超纯水中，并保存在4℃下以备后续使用。

实施例3：

结合图7，本实施例给出了一种检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括将实施例2所述的探针(SAQDsRu-mAb)加入待检测样品中，然后将检测玉米赤霉烯酮的试纸条插入待检测样品中进行检测。将探针添加到实际待检测的样品中以捕获目标玉米赤霉烯酮(ZEN)，结合的SAQDsRu-mAb-ZEN免疫复合物通过毛细作用移向试纸的测试区域。

在本实施例中，该检测玉米赤霉烯酮的试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线和控制线，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理。

硝酸纤维素膜的制备方法包括：玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物以0.5～0.9μL/cm的划线速率涂覆在检测线上得检测线，羊抗鼠免疫球蛋白以1μL/cm涂覆在控制线上为控制线，然后于37℃条件下干燥30min以备用；具体玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物以0.8μL/cm的划线速率进行涂覆。

样品垫与结合垫的制备方法包括：将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，于36～37℃条件下干燥8～10h。具体为：

样品垫的制备：将玻璃纤维膜剪裁成长15mm宽3mm的规格，放入封闭液(2％BSA)中浸湿，于37℃条件下干燥8h，得样品垫，然后置4℃冰箱中保存。

结合垫的制备：将玻璃纤维膜剪裁成长8mm宽3mm的规格，放入封闭液(2％BSA)中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8h，得样品垫，然后置4℃冰箱中保存。

将吸水纸剪裁成长18mm宽3mm的规格，即得吸水垫。

试纸条的组装：首先将硝酸纤维素膜贴附于衬板上，然后样品垫压结合垫2mm，结合垫压硝酸纤维素膜2mm，吸水垫压硝酸纤维素膜2mm依次贴附于衬板上，即得快速检测四环素的免疫层析试纸条。

实施例4：快速检测玉米赤霉烯酮的灵敏度测定

本实施例具体的检测过程为：将玉米赤霉烯酮标准品溶于超纯水中，连续稀释使浓度为0到3ng/mL范围不同浓度(0.01,0.02,0.045,0.09,0.18,0.375,0.75,1.5和3ng/mL)的测试溶液，超纯水为空白对照。

将2～10μL的SAQDsRu-mAb探针与100μL玉米赤霉烯酮标准溶液混合孵育，再把测试条的样品垫浸入100μL测试溶液中，混合物通过毛细作用向吸收垫迁移。并分别反应20min后，用肉眼分别在环境光和波长365nm紫外光下观察试纸的信号强度和荧光强度。T线与C线的比率(T/C)用于抵消试纸条的差异性，并使影响强度的环境因素最小化。本实施例最终选用加入6μL的SAQDsRu-mAb探针与100μL玉米赤霉烯酮标准溶液混合孵育，后进行检测。

当通过肉眼观察到T线明显比阴性对照条浅时，相应的玉米赤霉烯酮最小浓度定义为视觉检测限(vLOD)，当T线完全消失时，相应的最小浓度作为阈值浓度(临界值)。竞争抑制率IC10(竞争抑制率为10％时的分析物浓度)定义为检测限(LOD)。

检测结果：见图8A，随着玉米赤霉烯酮浓度的增加，试纸条T线的信号强度(图中上排)和荧光强度(图中下排)都越来越浅，T/C值随着玉米赤霉烯酮浓度的增加而不断减弱，两种模式下的vLOD和临界值均为0.02ng/mL和1.5ng/mL。

图8B为SAQDsRu-CICA(基于比色的免疫层析法(CICA))标准曲线检测玉米赤霉烯酮的线性区域，在0.01～3ng/mL范围内的回归方程为Y＝0.1606-0.321X(X＝lg[玉米赤霉烯酮浓度])，具有良好的拟合关系(相关系数(R²)＝0.982)。

图8C为SAQDsRu-FICA(基于荧光的免疫层析法(FICA))标准曲线检测玉米赤霉烯酮的线性区域，在0.01～3ng/mL范围内呈良好的线性关系，R²为0.991，回归方程为Y＝0.1917-0.354X(X＝lg[玉米赤霉烯酮浓度])。

图8D为传统胶体金标准曲线检测玉米赤霉烯酮的线性区域，其vLOD和临界值分别为1.5ng/mL和25ng/mL。

通过计算SAQDsRu-CICA，SAQDsRu-FICA和传统胶体金的检测限LOD分别为0.008ng/mL，0.00058ng/ml和0.1029ng/mL，SAQDsRu-CICA和SAQDsRu-FICA是传统胶体金免疫层析试纸条灵敏度的13倍和18倍。因此，该方法能高灵敏度检测玉米赤霉烯酮，可作为通用方法快速、便捷检测食品中毒素的残留。

实施例4：快速检测玉米赤霉烯酮的特异性测定

本实施例的检测过程为：分别将黄曲霉毒素B₁，黄曲霉毒素B₂，黄曲霉毒素G₁，伏马毒素B₁，呕吐毒素，赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B和展青毒素用超纯水稀释至100ng/mL的浓度，分别取100μL溶液作为检测液，与6μL的SAQDsRu-mAb探针混合孵育，再把测试条的样品垫浸入100μL测试溶液中，同时取100μL超纯水作为空白对照液。20min后，使用现有的条带读取器扫描条检测线(T线)与控制线(C线)的强度，用T/C比值用于特异性分析。

见图9A验证了SAQDsRu-CICA检测玉米赤霉烯酮的特异性。玉米赤霉烯酮的样品浓度为1.5ng/mL时，T线上的颜色被抑制，而对于其他常见的毒素在T线上可以观察到明显的红色。

图9B验证了SAQDsRu-FICA检测玉米赤霉烯酮的特异性。玉米赤霉烯酮的样品浓度为1.5ng/mL时，T线上的颜色被抑制，而对于其他常见的毒素在T线上可以观察到明显的红色荧光。说明该发明能较高度特异性识别玉米赤霉烯酮，具有良好的特异性。

实施例5：

本实施例实际检测了谷物中的玉米赤霉烯酮，谷物包括玉米和小米。检测过程为：将玉米和小米加标预处理玉米赤霉烯酮，在预处理之前，使用液相色谱-质谱法(LC-MS)确认空白的真实样品是否存在玉米赤霉烯酮。将2g样品磨碎，然后加入5mL甲醇-水(90:10，v/v)，充分振荡15min。将得到的提取物在6000rpm下离心10min获得上清液。

将上述处理好的实际样品溶液稀释至不同倍数(玉米赤霉烯酮浓度为0,0.08,0.16,0.36,0.72,1.44,3,6,12和24μg/kg，分别与图10中编号1～10的试纸条一一对应)，各取100μL溶液作为检测液，与6μL的SAQDsRu-mAb探针混合孵育，再把测试条的样品垫浸入100μL测试溶液中，同时取100μL超纯水作为空白对照液。20min后，使用条带读取器扫描条检测线(T线)与控制线(C线)的强度，用T/C比值用于特异性分析。

检测结果见图10A和10C，对于SAQDsRu-CICA，随着玉米赤霉烯酮浓度的增加，T/C的强度逐渐降低。小米和玉米样品的视觉检测限vLOD均为0.16μg/kg(编号3)，临界值均约为12μg/kg(编号9)。

见图10B和10D，对于SAQDsRu-FICA，随着玉米赤霉烯酮浓度的增加，T/C的强度逐渐降低。小米和玉米样品的视觉检测限vLOD均为0.16μg/kg(编号3)，临界值均约为12μg/kg(编号9)。综上所述，小米和玉米样品对SAQDsRu-DICA的灵敏度均与玉米赤霉烯酮加标样品一致，反映了其良好的实际应用价值。

实施例6信号载体SAQDsRu的荧光特性及双模式探针SAQDsRu-mAb的验证

本实施例还验证了信号载体SAQDsRu的荧光特性及双模式探针SAQDsRu-mAb，具体结果见图11。

(1)激发发射矩阵(EEM)光谱和荧光光谱(FL)：图11A，B分别为SAQDsRu的激发发射矩阵(EEM)光谱和荧光光谱(FL)，可以看出SAQDsRu在605nm处的发射峰的强荧光特性，并在460nm处的激发峰具有最佳激发。

(2)荧光强度的条件优化：图11C为SAQDsRu在不同pH下的荧光强度，可以看出当pH值为1.0～6.0时，荧光强度呈明显的上升趋势，当pH值为7.0时，荧光强度最高，此后呈明显的下降趋势，因此选择pH值为7.0作为优化pH值。(1)和(2)的结果验证了信号载体SAQDsRu的荧光特性，以SAQDsRu为信号载体所制备的试纸条具有强荧光性能，可方便快速检测。

(3)激光共聚焦荧光显微镜：通过激光共聚焦荧光显微镜测试了异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)和SAQDsRu之间的相互作用。反应30min后，如图11D，E，F所示，三联吡啶氯化钌六水合物发出红色荧光细胞上显示了FITC的绿色荧光，表明该蛋白与SAQDsRu的成功标记。

(4)zeta电位：图11G为SAQDsRu和SAQDsRu-mAb的电位图，在玉米赤霉烯酮单克隆抗体标记后，测试的zeta电位从-24.9mV变为-23.5mV，这证实了玉米赤霉烯酮单克隆抗体成功地标记在SAQDsRu表面上。

(5)SA，SAQD和SAQDsRu的标记效率测试：如图11H，I所示：SA，SAQD和SAQDsRu的标记效率均高于95％，计算出SA的mAb负载量为3.95×10¹³CFU/mL。证明三联吡啶氯化钌六水合物对SA的耦合效率没有影响。(3)(4)(5)的结果说明制备的信号载体SAQDsRu可以成功的与玉米赤霉烯酮单克隆抗体吸附结合，且能与牛血清白蛋白(BSA)成功偶联，对其应用带来有益的效果。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种探针，其特征在于，包括信号载体和吸附结合在信号载体上的单克隆抗体，所述的信号载体为信号载体SAQDsRu，所述的信号载体SAQDsRu为基于金黄色葡萄球菌SA合成量子点SAQDs并掺杂三联吡啶氯化钌六水合物制备得到；

所述量子点SAQDs的粒径为513～653nm，所述信号载体SAQDsRu的粒径为519～650nm；

所述的单克隆抗体为玉米赤霉烯酮单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的信号载体SAQDsRu的制备方法包括：首先将亚硒酸钠固体加入到含金黄色葡萄球菌的液体培养基中，然后加入氯化镉固体得到基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液，最后，将三联吡啶氯化钌六水合物固体添加到所述基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液中混合得到混合溶液，将所述混合溶液离心、重悬于水并灭活所得的金黄色葡萄球菌为信号载体SAQDsRu。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述亚硒酸钠的终浓度为4～6mM，所述氯化镉的终浓度为1mM，所述金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值为1.0～2.6。

4.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述混合溶液中三联吡啶氯化钌六水合物的浓度为(0.4～1.2)mg/mL，加入三联吡啶氯化钌六水合物后混合的时间为(15～90)min。

5.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针中的玉米赤霉烯酮单克隆抗体的终浓度为1mg/mL。

6.如权利要求5所述的探针，其特征在于，制备该探针的方法包括：

步骤1：将亚硒酸钠固体加入到含金黄色葡萄球菌的液体培养基中，并加入氯化镉固体得到基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液；

所述亚硒酸钠的终浓度为4～6mM，所述氯化镉的终浓度为1mM，所述金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值为1.0～2.6；

步骤2：将三联吡啶氯化钌六水合物固体添加到步骤1中所述基于金黄色葡萄球菌SA合成的量子点SAQDs溶液中混合得到混合溶液，将所述混合溶液离心、重悬于水并灭活所得的金黄色葡萄球菌为信号载体SAQDsRu；

所述混合溶液中三联吡啶氯化钌六水合物的浓度为(0.4～1.2)mg/mL，加入三联吡啶氯化钌六水合物后混合的时间为(15～90)min；

步骤3：将玉米赤霉烯酮单克隆抗体添加到信号载体SAQDsRu的水溶液中混合，用牛血清白蛋白封闭，离心即得。

7.如权利要求6所述的探针，其特征在于，步骤3中所述的玉米赤霉烯酮单克隆抗体与信号载体SAQDsRu的水溶液混合时的混合比为(3～7)μg:1mL，混合时间为3h，所述信号载体SAQDsRu的水溶液的OD₆₀₀值为2.2～2.6；

牛血清白蛋白封闭时在37℃下封闭30min。

8.权利要求1～7任一所述的探针用于检测谷物中的玉米赤霉烯酮的应用，所述的谷物包括玉米和小米。

9.一种检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1～7任一权利要求所述的探针加入待检测样品中，然后将检测玉米赤霉烯酮的试纸条插入待检测样品中进行检测。

10.如权利要求9所述的检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，所述的检测玉米赤霉烯酮的试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线和控制线，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理；

硝酸纤维素膜的制备方法包括：玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物以0.5～0.9μL/cm的划线速率涂覆在检测线上得检测线，羊抗鼠免疫球蛋白以1μL/cm涂覆在控制线上为控制线，然后于37℃条件下干燥30min；

所述的样品垫与结合垫的制备方法包括：将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，于36～37℃条件下干燥8～10h。

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