CN104914084A - 量子点阳离子交换信号放大技术检测蛋白类毒素的方法 - Google Patents

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方维焕
章先
李肖梁
王歆
谢珲
时玉菲
孙孟娇
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Abstract

本发明属于生物工程领域,旨在提供一种量子点阳离子交换信号放大技术检测蛋白类毒素的方法。该方法是利用羧基修饰的水溶性硒化镉/硫化锌量子点对蛋白类毒素多克隆抗体进行标记,使量子点上的羧基与抗体氨基在偶联剂的作用下形成稳定的形成量子点-多克隆抗体偶联物;然后以夹心ELISA模式对蛋白类毒素进行检测,采用阳离子交换信号放大技术对结果进行分析,实现蛋白类毒素的定性检测和定量分析。本发明在提高检测灵敏度和稳定性的同时,缩短了检测的时间;对待检的蛋白类毒素的检测灵敏度可以达到皮克水平;本发明中使用的量子点合成方便,成本低。具有高效、快捷、灵敏度高、检测信号稳定等优点。

Description

量子点阳离子交换信号放大技术检测蛋白类毒素的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域,具体涉及一种基于量子点阳离子交换和信号放大技术检测蛋白类毒素的方法。
背景技术
生物毒素又称为天然毒素,是指来源于生物,包括动物、植物、微生物产生的对其它生物物种有毒害作用并不能自身复制的各种化学物质。人类对生物毒素的最早体验源于频发的食物中毒事件,而引起食物中毒的大部分均为生物毒素,并且以微生物毒素最常见。微生物毒素包括蛋白类毒素和真菌毒素,其中蛋白类毒素是相关病原菌致病的主要因素,如金黄色葡萄球菌分泌的A、C型肠毒素、产气荚膜梭菌肠毒素E或蜡样芽孢杆菌分泌的肠毒素FM等均可刺激宿主呕吐中枢,导致出现以呕吐为主要症状的食物中毒。因此建立蛋白类毒素快速准确灵敏的检测方法,日益成为食品安全领域的重要研究内容,受到社会各界的高度重视。
蛋白类毒素的常规检测手段主要包括仪器分析法和酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA),其中仪器分析法因设备昂贵、操作复杂等缺点无法大面积推广使用。基于抗原抗体反应的ELISA检测方法操作流程相对简单,现阶段已成为实验室诊断的常规手段,但其灵敏度和稳定性容易受到众多因素的干扰,尤其是传统基于辣根过氧化物酶(HRP)的酶催化显色法,在定性和定量检测时常受到酶标试剂、显色时间、酶催化底物信号稳定性等诸多因素的制约,影响了结果的均一性和准确性。同时酶标法检测灵敏度有限,无法做到痕量检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,克服现有技术中的不足,提供一种基于量子点阳离子交换和信号放大技术检测蛋白类毒素的方法。
为解决技术问题,本发明的解决方案是:
提供一种基于量子点阳离子交换和信号放大技术检测蛋白类毒素的方法,是利用羧基修饰的水溶性硒化镉/硫化锌量子点(CdSe/ZnS,CdSe为核心,ZnS为壳层,表面由疏水配体包裹,最后包覆一层聚合物达到水溶性状态,经过羧基官能团修饰后,可与特定生物分子进行共价偶联)对蛋白类毒素多克隆抗体进行标记,使量子点上的羧基与抗体氨基在偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下形成稳定的量子点标记的蛋白类毒素多克隆抗体;检测时蛋白类毒素特异性单克隆抗体作为捕获抗体,量子点标记的多克隆抗体作为检测抗体,采用夹心ELISA模式,利用阳离子交换技术对信号进行放大,并通过设置阴性对照,计算样本孔的荧光数值与阴性对照孔荧光数值的比值,若比值≥2.1,则说明该样本中含有目标蛋白毒素,判定为阳性样本,检测过程中可通过设置梯度浓度的蛋白毒素标准品,并根据不同浓度与相其对应的荧光比值绘制标准曲线,实现蛋白类毒素的定性检测和定量分析。
本发明中,所述的阳离子交换信号放大技术是指:通过阳离子交换方法置换出量子点标记的蛋白类毒素多克隆抗体中的Cd2+,利用罗丹明(Rhod-5N)对Cd2+极度敏感并产生荧光强度变化的原理对信号进行放大,通过全波长酶标仪(购自美国MolecularDevices;型号M2)对荧光信号进行检测。
本发明中,所述的偶联剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
本发明中,所述蛋白类毒素是金黄色葡萄球菌A、C型肠毒素、产气荚膜梭菌肠毒素E或蜡样芽孢杆菌肠毒素FM中的任意一种。
本发明的原理描述:
本发明利用量子点成分CdSe在Ag2+存在的条件下可以和Ag2+发生阳离子交换反应,生成更稳定的AgSe纳米晶体和Cd2+,并利用荧光染料Rhod-5N对Cd2+极其敏感的这一特性,设计了基于量子点阳离子交换和信号放大技术的检测蛋白类毒素的方法,其下限可以达到皮克水平。
本发明采用量子点取代常规的辣根过氧化物酶(HRP)对抗体进行标记,并根据量子点的化学成分特性,利用阳离子交换技术对最终的检测信号进行放大,使得检测的灵敏度大大提高,同时避免了常规ELISA检测过程中,上述因素对结果造成的影响,相比酶催化显色,本方法的准确性和稳定性大大提高,并且可以对待检样本中的蛋白类毒素进行定性和定量分析。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明利用新型荧光材料量子点取代常规的辣根过氧化物酶(HRP)对蛋白类毒素多克隆抗体进行标记,开发了蛋白类毒素快速检测新技术,在提高检测灵敏度和稳定性的同时,缩短了检测的时间,夹心法定量检测蛋白类毒素时仅需90min。
(2)本发明对待检的蛋白类毒素的检测灵敏度可以达到皮克水平;本发明中使用的量子点合成方便,成本低。
(3)相对于背景技术,本方法具有高效、快捷、灵敏度高、检测信号稳定等优点。
具体实施方式
发明原理介绍:
通过使用羧基修饰的水溶性硒化镉/硫化锌量子点(CdSe/ZnS)(CdSe为核心,ZnS为壳层,表面由疏水配体包裹,最后包覆一层聚合物达到水溶性状态,量子点表面经过羧基官能团修饰后,可与特定生物分子进行共价偶联),标记纯化后的蛋白类毒素多克隆抗体。
检测蛋白类毒素时采用双抗体夹心ELISA法,即96孔白色不透明酶标板包被特异性蛋白类毒素单克隆抗体作为捕获抗体,加入待检样本孵育后,洗去非特异结合,加入量子点标记的蛋白类毒素多克隆抗体作为检测抗体,作用后洗去非特异结合,加入含有罗丹明(Rhod-5N)、银离子(Ag2+)的显色液,室温放置5min。量子点组成成分CdSe在Ag2+存在的条件下可以与Ag2+发生阳离子交换反应,反应后生成更加稳定的AgSe纳米晶体和Cd2+,荧光染料Rhod-5N对Cd2+的浓度极其敏感,并且在激发与发射波长分别为551/575的条件下,荧光值与Cd2+浓度呈线性关系,通过设置阴性对照,计算样本孔的荧光值与阴性孔荧光值的比值,若比值≥2.1,则说明该样本中含有待检的蛋白类毒素,判定为阳性样本,检测过程中可通过设置梯度浓度的蛋白毒素标准品,并根据不同浓度与相对应的荧光比值绘制标准曲线,对样本中蛋白毒素浓度进行定量检测。
本发明中,羧基修饰的量子点通常使用商品化的产品,具体的反应浓度依据生产商推荐使用浓度来确定,不同生产商推荐数据略有变化。羧基修饰的量子点在偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下与蛋白类毒素多克隆抗体形成共价键,标记时所用的蛋白类毒素多克隆抗体为自制或商品化、纯化后的抗体(经聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色鉴定,抗体重链轻链清晰,且占总蛋白浓度的90%以上)。
本发明中的方法,具体包括以下步骤:
(1)量子点与蛋白类毒素多克隆抗体的偶联
取纯化后的蛋白类毒素多克隆抗体(凝胶电泳鉴定,重链轻链清晰,且占总蛋白浓度的90%以上),溶解于0.01M、pH=7.4的磷酸盐缓冲液中(PBS)中;取50μl浓度为8μM的羧基修饰的量子点置于2ml EP管中,加入300μg待标记的蛋白类毒素多克隆抗体,使反应总体系为400μl;加入抗体后若体积不足,则用10mM的硼酸盐缓冲液补齐;持续混匀反应5min后,加入15μl浓度为10mg/ml的偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC);室温震荡反应2h后,离心去除反应过程中产生的团聚物,上清液经超滤管(购自Millipore,货号UFC503096)浓缩后,用尺寸排阻色谱柱纯化;色谱柱填料为Superdex G200(购自GE公司,货号为17-1043-10),纯化后的量子点标记的蛋白类毒素多克隆抗体保存于4℃冰箱,备用;
(2)最佳检测条件的确定
采取夹心ELISA模式进行检测,即:白色不透明96孔板包被蛋白类毒素特异性单克隆抗体作为捕获抗体,加入待检样本进行作用,洗去非特异性结合后,再加入量子点标记的蛋白类毒素多克隆抗体作为检测抗体进行作用,洗去非特异性结合后,通过阳离子交换信号放大技术,使用全波长酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下对信号进行检测;
夹心ELISA最佳检测条件的确定,主要包括摸索单克隆抗体的最佳包被浓度与量子点标记多克隆抗体的最佳使用浓度。方法是:以pH=9.5的碳酸盐缓冲液稀释单克隆抗体并包被于白色不透明96孔板,洗涤封闭后,加入梯度稀释的待检蛋白类毒素标准品,同时设置阴性对照孔即加入标准品稀释液,37℃恒温培养箱作用45min洗涤后加入稀释的量子点标记的多克隆抗体,37℃恒温培养箱作用45min,洗涤后置于吸水纸上扣干,加入200μl显色液(pH=7.4的0.01M醋酸盐缓冲液配置,含5μM/L Rod-5N和300μM/LAg2+)室温放置5min后,酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取荧光数值。
分别计算在不同蛋白类毒素单克隆抗体包被浓度与不同量子点标记蛋白类毒素多克隆抗体作用浓度(以量子点浓度计算)条件下的检测效果,选取能检测到最低蛋白类毒素浓度(荧光比值≥2.1)所对应的单克隆抗体包被浓度与量子点标记多克隆抗体作用浓度作为检测时的最佳条件;
(3)标准曲线的绘制与实际样本的检测
将蛋白类毒素单克隆抗体用pH=9.5的碳酸盐缓冲液稀释到最佳包被浓度之后,加入到96孔板中,100μl/孔,4℃放置过夜;洗涤封闭后,取体积均为100μl的待检样品和梯度稀释的蛋白类毒素标准品加入反应孔中,并设置阴性对照即加入蛋白毒素标准品稀释液;37℃培养箱作用45min后,洗涤后再加入稀释到最佳使用浓度的量子点标记的蛋白类毒素多克隆抗体,100μl/孔;37℃培养箱避光作用45min,洗涤后并置于吸水纸上扣干,加入200μl显色液(以pH=7.4的0.01M醋酸盐缓冲液配置,含5μM/L Rod-5N和300μM/L Ag2+),室温放置5min后,以全波长酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取荧光数值;将得到的梯度稀释的标准品对应的荧光比值拟合成标准曲线,然后对待检样品中是否含有目标蛋白类毒素进行定性判定:荧光比值≥2.1判定为阳性;荧光比值<2.1判定为阴性;若为阳性,则根据绘制的标准曲线对样本中蛋白类毒素含量进行定量分析。
本发明中,所述蛋白类毒素为金黄色葡萄球菌分泌的A、C型肠毒素、产气荚膜梭菌肠毒素E或蜡样芽孢杆菌分泌的肠毒素FM等。
以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例:采用夹心ELISA法对金黄色葡萄球菌A型肠毒素进行快速检测
以下程序以金黄色葡萄球A型肠毒素单克隆、多克隆抗体和量子点(羧基修饰的水溶性量子点,组成成分为CdSe/ZnS,购自武汉珈源量子点技术开发有限公司,货号Q2625)为例,阐述基于量子点阳离子交换和信号放大技术快速检金黄色葡萄球菌A型肠毒素的方法:
(1)羧基水溶性量子点与金黄色葡萄球菌肠毒素A多克隆抗体的偶联
取纯化后的金黄色葡萄球菌A型肠毒素多克隆抗体(兔源,经鉴定纯度为90%以上,浓度为3mg/ml,溶剂为0.01M磷酸盐缓冲液PBS,pH=7.4),取浓度为8μM的羧基修饰的量子点50μl置于2ml EP管中,然后加入10mM的硼酸盐缓冲液235μl后持续混匀,加入100μl上述金黄色葡萄球菌A型肠毒素多克隆抗体,持续混匀,反应5min后,加入15μl浓度为10mg/ml的偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液,室温震荡反应2h后,12000rpm/min离心去除反应中产生的团聚物,上清液经超滤管(购自Millipore,货号UFC503096)浓缩后,用尺寸排阻色谱柱纯化,色谱柱填料为Superdex G200(购自GE公司,货号为17-1043-10),纯化后的量子点标记的蛋白类毒素多克隆抗体保存于4℃冰箱,备用。
(2)最佳检测条件的确定
检测模式为夹心ELISA,夹心ELISA最佳反应条件,主要包括金黄色葡萄球菌A型肠毒素单克隆抗体的最佳包被浓度与量子点标记金黄色葡萄球菌A型肠毒素多克隆抗体最佳使用浓度。方法是:金黄色葡萄球菌A型肠毒素单克隆抗体(碳酸盐缓冲液稀释,pH=9.5)包被于白色不透明96孔板(购自Corning,货号3922)100μl/孔,4℃包被过夜,用含0.05%(v/v)Tween20的0.01M磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤后,含5%(w/v)脱脂奶粉(PBST配置)37℃封闭2h,洗涤后置于吸水纸扣干,加入用磷酸盐缓冲液(0.01MPBS,pH=7.4)梯度稀释的金黄色葡萄球菌A型肠毒素标准品(浓度从1000ng/ml开始2倍稀释,共11个梯度),同时设置阴性对照孔即加入标准品稀释液PBS,均为100μl/孔,37℃恒温培养箱作用45min洗涤后加入量子点标记的金黄色葡萄球菌A型肠毒素多克隆抗体,100μl/孔,37℃恒温培养箱作用45min,洗涤后置于吸水纸上扣干,加入200μl显色液(pH=7.4的0.01M醋酸盐缓冲液配置,含5μM/L Rod-5N和300μM/L Ag2+)室温放置5min后,酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取荧光数值。
分别计算在不同金黄色葡萄球菌A型肠毒素单克隆抗体包被浓度(5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml)与不同量子点标记金黄色葡萄球菌A型肠毒素多克隆抗体作用浓度(0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μM/L,以量子点浓度计算)条件下的检测效果,选取能检测到最低金黄色葡萄球菌A型肠毒素浓度(荧光比值≥2.1)所对应的单克隆抗体包被浓度与量子点标记多克隆抗体作用浓度作为检测时的最佳条件,本实验中金黄色葡萄球菌A型肠毒素单克隆抗体的最佳包被浓度为1.25μg/ml,量子点标记金黄色葡萄球菌A型肠毒素多克隆抗体的作用浓度为0.05μM/L,此时对应的检测效果最好,灵敏度最高。
(3)实际样本中金黄色葡萄球菌A型肠毒素的定性检测与定量分析
将金黄色葡萄球菌A型肠毒素单克隆抗体用碳酸盐缓冲液(pH=9.5)稀释到1.25μg/ml,加入到96孔板中,100μl/孔,4℃放置过夜。按照上述方法洗涤封闭后,取待检样品和用PBS梯度稀释的金黄色葡萄球菌A型肠毒素标准品100μl加入孔中,37℃恒温培养箱作用45min,PBST洗涤后,加入量子点标记金黄色葡萄球菌A型肠毒素多克隆抗体(0.05μM/L)37℃恒温培养箱避光作用45min,洗涤后置于吸水纸上扣干,加入200μl显色液(pH=7.4的0.01M醋酸盐缓冲液配置,含5μM/L Rod-5N和300μM/L Ag2+)室温放置5min后,全波长酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取荧光数值。以梯度稀释的金黄色葡萄球菌A型肠毒素标准品浓度对数为横坐标,相对应的荧光比值为纵坐标绘制标准曲线,对样本中金黄色葡萄球菌A型肠毒素进行定性检测和定量分析。
我们对市场中25份牛奶样本进行了检测,结果显示其中12份样本呈金黄色葡萄球菌A型肠毒素阳性(含量≥300pg/ml),与商品化试剂盒(购自德国拜发,货号R4101)符合率为100%,且经过定量检测,含量在450-1420pg/ml之间,可用于牛奶中金黄色葡萄球菌A型肠毒素的快速定量检测与定性分析。
特别说明:
虽然本发明的实施例中对量子点阳离子交换信号放大技术运用于蛋白类毒素检测列举一例,并没有列举全部生物分子的具体内容,但是,对于蛋白类毒素及其各自对应的多克隆抗体或单克隆抗体均属于本领域技术人员公知常识。在本发明提供所述的基于量子点阳离子交换信号放大技术检测蛋白类毒素的方法之后,本领域技术人员能够根据其掌握的技能举一反三,实现检测其他蛋白类毒素的目的。
以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明原理的前提下,本发明及其应用还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.量子点阳离子交换信号放大技术检测蛋白类毒素的方法,其特征在于,是利用羧基修饰的水溶性硒化镉/硫化锌量子点对蛋白类毒素多克隆抗体进行标记,使量子点上的羧基与抗体氨基在偶联剂的作用下形成稳定的形成量子点-多克隆抗体偶联物;然后以夹心ELISA模式对蛋白类毒素进行检测,采用阳离子交换信号放大技术对结果进行分析,实现蛋白类毒素的定性检测和定量分析。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的阳离子交换信号放大技术是指:通过阳离子交换方法置换出量子点-抗体偶联物中的Cd2+,利用罗丹明对Cd2+极度敏感产生荧光强度变化的原理进行信号放大,并通过全波长酶标仪对荧光信号进行检测。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的偶联剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述蛋白类毒素是金黄色葡萄球菌A、C型肠毒素、产气荚膜梭菌肠毒素E或蜡样芽孢杆菌肠毒素FM等中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
(1)量子点与蛋白类毒素多克隆抗体的偶联
取纯化后的多克隆抗体,溶解于0.01M、pH=7.4的磷酸盐缓冲液中;取50μl浓度为8μM的羧基修饰的量子点置于2ml EP管中,加入300μg待标记的蛋白类毒素多克隆抗体,使反应总体系为400μl;加入抗体后若体积不足,则用10mM的硼酸盐缓冲液补齐;持续混匀反应5min后,加入15μl浓度为10mg/ml的偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐;室温震荡反应2h后,离心去除反应过程中产生的团聚物,上清液经超滤管浓缩后,用尺寸排阻色谱柱纯化;色谱柱填料为Superdex G200,纯化后的量子点标记的多克隆抗体保存于4℃冰箱,备用;
(2)最佳检测条件的确定
采取夹心ELISA模式进行检测,即:白色不透明96孔板包被蛋白类毒素特异性单克隆抗体作为捕获抗体,加入待检样本进行作用,洗去非特异性结合后,再加入量子点标记的蛋白类毒素多克隆抗体作为检测抗体进行作用,洗去非特异性结合后,通过阳离子交换信号放大技术,使用全波长酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下对信号进行检测;
确定夹心ELISA最佳检测条件,包括对单克隆抗体的最佳包被浓度与量子点标记多克隆抗体的最佳使用浓度的确定;具体方法是:以pH=9.5的碳酸盐缓冲液稀释单克隆抗体并包被于白色不透明96孔板,洗涤封闭后,加入梯度稀释的待检蛋白类毒素标准品,同时设置阴性对照孔即加入标准品稀释液,37℃恒温培养箱作用45min洗涤后加入稀释的量子点标记的多克隆抗体,37℃恒温培养箱作用45min,洗涤后置于吸水纸上扣干,加入200μl显色液室温放置5min后,酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取荧光数值;所述显色液是以pH=7.4的0.01M醋酸盐缓冲液配置,含5μM/LRod-5N和300μM/L Ag2+
分别计算在不同蛋白类毒素单克隆抗体包被浓度与不同量子点标记蛋白类毒素多克隆抗体作用浓度条件下的检测效果,蛋白类毒素多克隆抗体作用浓度以量子点浓度计算;选取荧光比值≥2.1时能检测到最低蛋白类毒素浓度所对应的单克隆抗体包被浓度与量子点标记多克隆抗体作用浓度作为检测时的最佳条件;
(3)标准曲线的绘制与实际样本的检测
将特异性单克隆抗体用PH=9.5的碳酸盐缓冲液稀释到最佳包被浓度之后,加入到96孔板中,100μl/孔,4℃放置过夜;洗涤封闭后,取均为100μl待检样品和梯度稀释的蛋白类毒素标准品加入孔中,并设置阴性对照孔即加入标准品稀释液;37℃培养箱作用45min后,洗涤后再加入稀释到作用浓度的量子点标记的蛋白类毒素多克隆抗体,100μl/孔;37℃培养箱避光作用45min,洗涤并于吸水纸上扣干,加入200μl显色液;显色液以0.01M pH=7.4的醋酸盐缓冲液配置,分别含有5μM/L Rod-5N和300μM/L Ag2+;室温放置5min显色后,以全波长酶标仪在激发波长与发射波长分别为551/575的条件下读取荧光数值;将得到的梯度稀释的标准品对应的荧光比值拟合成标准曲线,然后对待检样品中是否含有目标蛋白类毒素进行定性判定:荧光比值≥2.1判定为阳性;荧光比值<2.1判定为阴性;若为阳性,则根据绘制的标准曲线对样本中蛋白类毒素含量进行定量分析。
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