CN103901011A - 一种检测样品中双酚a浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测样品中双酚A浓度的方法，包括：（1）将氧化型石墨烯和能与双酚A特异性结合的DNA片段混合，该DNA片段的5’端有荧光修饰，以期将DNA片段上标记的荧光猝灭；（2）将待测样品与上述混合物混合，在双酚A存在的条件下，DNA片段发生解吸附，DNA片段上标记的荧光恢复；（3）根据步骤（2）中荧光的恢复程度，确定样品中双酚A浓度。该方法可以提出了一种全新的、简单快速的、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测样品中双酚A的浓度。

Description

一种检测样品中双酚A浓度的方法
技术领域
    本发明属于化学领域，涉及一种检测样品中双酚A浓度的方法。
背景技术
纳米材料具有独特的物理和化学性质，在生物传感器中的应用探索已成为国际上的研究前沿和研究热点。纳米材料与生物传感器的结合，涉及到了纳米技术、信息技术、生物技术等多个学科领域，对临床监测、环境监测等领域有重要的影响。碳纳米材料作为最重要的纳米材料之一，其本身具有的潜在优越性，使其在化学、物理学及材料学等领域具有广阔的应用前景。
双酚A（bisphenol A，BPA）是一种类似雌激素的化学物质，可以引发人体荷尔蒙的反应。它是含有两个酚基官能团的有机化合物，是一些重要聚合物的原料和添加剂，如环氧树脂、阻燃剂、聚碳酸酯等，广泛应用于塑料以及造纸工业，有研究证明婴儿可能会通过塑料罐装婴儿食品或婴儿塑料瓶过量摄入这种有雌性激素作用的化学品，而且鱼类或其它野生动物也有可能因为环境中的遗弃双酚A制品受到毒害。此外双酚A与成年人的心脏病、糖尿病、肝功能不正常等也有关联。为确保人们身体健康，发展一种超灵敏快速检测方法确定食品及食品容器中BPA的含量是很重要的。特别是在水溶液中，为确保食品安全，从塑料包装袋或杯子中释放的BPA需要被监测。
在现代检测技术中，各种以仪器为基础的检测BPA的方法已经得到广泛应用，如高效液相色谱法、液相色谱和气相色谱质谱联用，这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，还需要比较繁杂的预处理过程，成本比较高，还需要专业人员操作，利用免疫分析方法探测BPA具有高灵敏度低花费的特点，其也引起研究人员的普遍关注，这种免疫分析方法主要依赖于对应抗体的特异性结合，但BPA类似物的存在会影响检测结果，因此，发展一种新型快速、高灵敏度的检测方法是必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测样品中双酚A浓度的方法，以克服现有的检测双酚A的方法检测不便、且成本昂贵的问题。
本发明通过以下技术方案来实现：一种检测样品中双酚A浓度的方法，包括：
（1）将氧化型石墨烯和能与双酚A特异性结合的DNA片段混合，该DNA片段的5’端有荧光修饰，以期将DNA片段上标记的荧光猝灭；
（2）将待测样品与上述混合物混合，在双酚A存在的条件下，DNA片段发生解吸附，DNA片段上标记的荧光恢复；
（3）根据步骤（2）中荧光的恢复程度，确定样品中双酚A浓度。
氧化型石墨烯（Graphene Oxide，GO）是一种新型的纳米材料，具有特殊的物理化学和光学性质，它能够吸附单链DNA并与之形成GO-DNA复合物，并有效淬灭荧光修饰DNA上标记的荧光，故使其在生物传感器方面的应用十分广泛。本发明的发明人基于氧化型石墨烯能够吸附单链DNA形成GO-DNA复合物，并有效淬灭荧光修饰DNA上标记的荧光，再利用BPA能够与对应的核酸配体的强结合能力使吸附于石墨烯上的核酸配体解吸附，根据核酸荧光强度的恢复程度以确定BPA的浓度，开发一种全新的、简单快速的、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测水中BPA的浓度。根据本发明的实施例，可以利用本发明的方法进行检测的样品的类型并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以为水溶液，例如饮用水、地下水、污水等。
根据本发明的实施例，上述方法还可以具有下列附加技术特征：
进一步的，所述的能与双酚A特异性结合的DNA片段具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并且在5’端进行荧光修饰。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行双酚A浓度检测的效率和灵敏度。
进一步的，所述的氧化型石墨烯的浓度为20-150μg/mL。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行双酚A浓度检测的效率和灵敏度。
进一步的，所述的氧化型石墨烯的浓度为100μg/mL。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行双酚A浓度检测的效率和灵敏度。
进一步的，所述的双酚A的浓度为不大于100 ng/ml。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行双酚A浓度检测的效率和灵敏度。
进一步的，所述的双酚A的浓度为0.02-10 ng/ml。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行双酚A浓度检测的效率和灵敏度。
进一步的，基于下列线性方程，确定所述样品中铅离子的浓度：y=0.0836x+0.6941，y为不同BPA浓度下的(F-F0)/ F0，x为相应BPA的浓度。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行双酚A浓度检测的效率和灵敏度。
根据本发明的实施例，基于体系荧光的恢复程度，确定所述样品中的双酚A浓度是通过将所述体系的荧光与标准曲线进行比较而完成的，其中，所述标准曲线是基于已知双酚A浓度分别为0ng/ml、0.02ng/ml、0.05ng/ml、0.2ng/ml、0.8ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的标准样品进行平行实验而建立的。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行双酚A浓度检测的效率和灵敏度。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是利用不同双酚A浓度标准样品进行检测所得到的荧光曲线，其中双酚A浓度分别取0ng/ml、0.02ng/ml、0.05ng/ml、0.2ng/ml、0.8ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。
图2显示了根据本发明一个实施例的特异性分析图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。
实施例1 相应DNA片段的设计与合成。
设计一段能与BPA分子特异结合的DNA片段，并且在5’端用羧基荧光素FAM进行荧光修饰。DNA序列通过DNA合成仪制备。
荧光修饰DNA：5’-FAM–CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA–3，（SEQ ID NO：1）。
实施例2 实验最适氧化型石墨烯浓度的测定。
取7个离心管，分别依次加入100μM的荧光修饰DNA 2μL（终浓度为100nM），1mg/mL的氧化型石墨烯（终浓度分别为20、40、60、80、100、120、150μg/mL）。然后向每一个离心管中加入0.02M-Tris-HCl 缓冲液（包含0.01％SDS，MgCl2 20mM，KCl 40mM，NaCl 100mM，pH 8.0）到体积为2mL。分别测其荧光强度，然后每一个离心管中分别加入50μg/mL BPA 4μL，BPA最终浓度为100ng/ml。反应20分钟，再测其荧光强度，比较其前后变化，选出氧化型石墨烯最优浓度100μg/mL，即我们实验所用的最适氧化型石墨烯浓度为100μg/mL。
实施例3 BPA标准曲线的建立。
取9个离心管，依次加入100μM的荧光修饰DNA 2μL（终浓度为100nM），1mg/mL的氧化型石墨烯（终浓度为100μg/mL）。然后向每一个离心管中加入0.02M Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）到体积为2mL。依次测其荧光强度，随后向这10个离心管中依次加入不同量的BPA溶液，（终浓度分别为0、0.02、0.05、0.2、0.8、2、10、50、100 ng/ml）反应20分钟后，然后再依次测其荧光强度，前后荧光强度作比较，做出BPA的标准曲线图。该方法的线性范围0.02-10 ng/ml，检测限为0.01 ng/ml。标准曲线的线性方程为y=0.0836x+0.6941，y为不同BPA浓度下的(F-F0)/ F0，x为相应BPA的浓度，线性相关性>0.99。
实施例4 特异性测定。
取6个离心管，依次加入100μM的荧光修饰DNA 2μL（终浓度为100nM），1mg/mL的氧化型石墨烯（终浓度为100μg/mL）。向每一个离心管中加入Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液到体积为2mL。分别测其荧光强度。随后依次加入BPB及其它BPA类似物，使离子最终浓度都为5 ng/ml。反应20分钟，再次测其荧光强度。查看结果显示，该方法有比较好的特异性。
实施例5 实际样品的检测。
向自来水样品中分别添加浓度为0.02，0.05，0.2和 0.8 ng/mL的BPA，采用上述方法确定样品中的双酚A浓度，结果如表1：
表1  BPA水样品的测定
Figure 195065DEST_PATH_IMAGE001
采用基于氧化型石墨烯、DNA相互作用的检测方法测定实际样本中BPA的添加回收率在98.20%-106.00%之间，标准差为3.80%，能够满足现实生活中对BPA的检测需求。
                        序列表
 
<110>  常熟理工学院
 
<120>  一种检测样品中双酚A浓度的方法
 
<130>  xb14042302
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  63
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  能与BPA分子特异结合的DNA片段
 
<400>  1
ccggtgggtg gtcaggtggg atagcgttcc gcgtatggcc cagcgcatca cgggttcgca     60
 
cca                                                                   63
 
 

Claims (7)

1.一种检测样品中双酚A浓度的方法，其特征在于，包括：
（1）将氧化型石墨烯和能与双酚A特异性结合的DNA片段混合，该DNA片段的5’端有荧光修饰，以期将DNA片段上标记的荧光猝灭；
（2）将待测样品与上述混合物混合，在双酚A存在的条件下，DNA片段发生解吸附，DNA片段上标记的荧光恢复；
（3）根据步骤（2）中荧光的恢复程度，确定样品中双酚A浓度。
2.根据权利要求1所述的，其特征在于：所述的能与双酚A特异性结合的DNA片段具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并且在5’端进行荧光修饰。
3.根据权利要求1所述的，其特征在于：所述的氧化型石墨烯的浓度为20-150μg/mL。
4.根据权利要求3所述的，其特征在于：所述的氧化型石墨烯的浓度为100μg/mL。
5.根据权利要求1所述的，其特征在于：所述的双酚A的浓度为不大于100 ng/ml。
6.根据权利要5所述的，其特征在于：所述的双酚A的浓度为0.02-10 ng/ml。
7.根据权利要求1所述的，其特征在于：基于下列线性方程，确定所述样品中铅离子的浓度：
y=0.0836x+0.6941，
y为不同BPA浓度下的(F-F0)/ F0，x为相应BPA的浓度。
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