CN104195236A - 一种巢式pcr数字定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种巢式数字PCR定量方法，其特征是改进的巢式PCR及样本10倍稀释梯度分散至有限单元的数字PCR方法，包括下列步骤：在每个反应单元中预先加入矿物油,在矿物油下方加入1-5μL小体积的第一轮PCR混合液，所述混合液包括等体积的2×反应液和连续10倍稀释梯度的样本液，在第一退火温度下使用外侧引物进行第一轮扩增；随后在第一轮扩增产物中加入10-20倍于第一轮PCR体积的第二轮PCR反应液，在第二退火温度下使用内侧引物进行第二轮扩增；最后检测扩增产物，进行计数定量。本发明还提供了用于本发明的巢式数字PCR定量方法的基因检测试剂盒。

Description

一种巢式PCR数字定量方法
技术领域
本发明属于分子生物学及分子检验领域的核酸扩增技术领域，具体涉及通过改良巢式PCR操作来消除其引物的非特异性扩增而进行样本10倍稀释梯度的数字扩增定量方法领域。
背景技术
所谓数字定量检测或数字化诊断是指确保阳性单个分子或单个以上分子均有检测信号而定为1、阴性绝对无反应信号而定为0的条件下，样本稀释、分散至大量的微型分隔单元使每检测单元含0-1个靶分子，通过检测单元反应信号1计数而对靶分子进行定量的方法，以便于计算机0或1模式的自动化操作，但前提必须是检测方法本身对1个分子或0分子可靠区分。然而传统的化学反应、酶免疫反应等均是检测信号强度与待测分子含量成线性比例且信号简单相加的低灵敏度检测方法，远远区分不了1个靶分子和0个靶分子的差别，所以都无法适用于数字化定量检测方法。
上世纪80年代末诞生的核酸指数扩增的PCR技术，以其2n(n为扩增循环数)放大倍数能检测低至数十乃至数个拷贝的靶分子，然而30个循环扩增的灵敏度仍不足以测出1个靶分子和0个靶分子的区别，超过30个循环扩增又带来严重的非特异性及假阳性；且这种第一代的终末/终点PCR不易定量，需要PCR后凝胶电泳来区分非特异性扩增条带。随后两步扩增的巢式PCR应用(J Med Virol,30-2:85)以超过40个循环扩增的极高灵敏度为单个靶分子检测提供了可能，1992年，Sykes等人(Biotechniques13:444)初步尝试了基于样本稀释和泊松分布计数的定量巢式PCR，并首次提出了数字化定量理念，由于这类PCR系统内引物二聚体扩增和体系外气雾胶交叉污染的严重非特异性的局限而限制了其进一步发展、应用。同年，Higuchi另辟溪径，同时扩增和“闭管”荧光检测的实时荧光PCR方法，减少了PCR后处理的交叉污染，而通过扩增曲线指数期测定来对应初始模板数的相对定量，即进入指数期的扩增循环数与初始模板数呈反对数关系，但一般采用荧光染料的实时荧光PCR仍然于30个扩增循环处产生引物二聚体的非特异性扩增，从而干扰低浓度的靶分子定量。1997年，不与非特异性扩增杂交的系列探针法实时荧光PCR(BioTechniques22:130-138)显著减少了非特异性反应，尤其以水解探针Taqman方法逐步成熟而广泛应用于临床检验，已公认为第二代q-PCR定量PCR技术。但定量需要参考品标准曲线或内标校正，对有限的标本材料如单细胞低丰度基因和野生高背景下的稀少突变基因的准确定量仍存在一定的应用限制。
1999年，Vogelstein & Kinzler报导微升级96孔板的致癌突变基因ras定量PCR及首创数字(digital)PCR概念(PNAS,USA 96:9236)，d-PCR是一种基于单分子PCR方法来进行计数的第三代绝对定量PCR方法，采用分析化学领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至微反应器单元或微滴中，每个反应单元的核酸模板数少于或等于一个。经过PCR热循环反应之后，扩增产物与加入的荧光探针杂交，有一个核酸分子模板的反应单元有扩增而给出荧光信号，没有模板的反应单元没有扩增而无荧光信号。根据稀释比例和反应单元体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度，通过计数及泊松分布统计，就可以实现起始DNA模板的绝对定量。实现数字(digital)PCR的关键：一是荧光探针特异杂交来保证无(0)模板的反应单元无荧光信号；二是dPCR装置的反应单元足够多以保证检测单元不多于一个模板，所以进一步缩微至微流控万级反应单元即纳升体积反应装置，以及近年来微滴化百万级反应单元即皮升级体积装置(Anal. Chem.2011,83:8604)的成熟而开始走向应用。由于样本靶分子含量跨度非常大，浓度低的少于10o=1copy/ml，浓度高的大于101ocopies/ml，浓标本往往需要百万级反应单元即皮升体积微流控或微滴装置才能够分配每个反应单元的核酸模板数少于或等于一个，这种追求反应单元的极致会导致应用普及受限。甚至对某些过浓标本必须进行1至几个数量级预先稀释后才能使用百万级反应单元d-PCR。因此，本领域中仍然需要一种操作简便，成本低廉而又灵敏度极高的PCR检测方法。
发明内容
为了解决d-PCR非特异性局限和微流控或微滴化装置反应单元的极限。本发明提供了一种一种巢式数字PCR定量方法，在传统巢式PCR方法的基础上进行了以下改进：
1. 使用预先矿物油封闭下两步加样和两步扩增的d-PCR方法，彻底杜绝引物二聚体PD非特异性扩增；
2.使用单孔或单管两步引物既进行稀释，并且使用不同的退火温度进行扩增，以保证第一步扩增引物于第二步扩增时绝对失效；
3. 对样本先进行9个及以上数量级的10倍稀释，以及在此基础之上任选地增加一两级的100倍稀释，再将每个数量级的稀释标本分配到有限个反应孔/反应单元，这样总共96孔板、384孔板或聚二甲基硅氧烷微孔芯片就能取得百万级反应单元微滴化及微流控芯片装置的功效。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种巢式数字PCR定量方法，其特征是改进的巢式PCR及样本10倍稀释梯度分散至有限单元的数字PCR方法，包括下列步骤：在每个反应单元中预先加入矿物油，在矿物油下方加入1-5μL小体积的第一轮PCR混合液，所述混合液包括等体积的2×反应液和连续10倍稀释梯度的样本液，在第一退火温度下使用外侧引物进行第一轮扩增；随后在第一轮扩增产物中加入10-20倍于第一轮PCR体积的第二轮PCR反应液，在第二退火温度下使用内侧引物进行第二轮扩增；最后检测扩增产物，进行计数定量。
在本发明的一个具体实施方案中，所述第一退火温度为44oC-48oC，所述第二退火温度为56oC -60oC。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述外侧引物短于内侧引物。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述第一轮扩增为在矿物油下方加入1-2.5μL样本和等体积的2×外侧引物PCR反应液，使用14-18个碱基的外侧引物在44oC-48oC的退火温度下进行的15-25个热循环的PCR扩增。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述第二轮扩增为在第一轮同一孔中加18-45μL的1×内侧引物PCR反应液，用同样吸头插入矿物油层下面加入，使用18-24个碱基的内侧引物在56oC-60oC的退火温度下进行的20-30个热循环的PCR扩增。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述第二轮扩增产物的检测通过如下步骤进行：在反应液中加入SYBR Green I荧光染料进行实时检测；或在第二轮PCR反应后每孔加入2-5μL的EB (0.5μg/mL)于矿物油层下面，置96孔板于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测。
在本发明的另一个具体实施方案中，将待测样本进行连续梯次的10倍稀释后每个梯次的稀释梯度又等量分配到10个反应孔/单元，进行梯次×10单元两轮巢式PCR，当一组10个PCR有7个或多于7个扩增荧光反应定为1个靶分子/孔样本，一组10个PCR有3个及少于3个扩增荧光反应定为0个靶分子/孔样本，一组10个PCR有4个-6个扩增荧光反应定为0.5个靶分子/孔样本，以1个靶分子组或0.5个靶分子组乘以样本稀释倍数推算出初始靶模板分子绝对数量。
在本发明的另一个具体实施方案中，按照根据权利要求7的方法推算出的初始靶模板分子绝对数量，将样本一次稀释至大约0.5个靶分子/孔，加等量2×第一轮PCR反应液后分散至整个96孔板，同样两轮改良巢式d-PCR，数据进行泊松分布计数，得到高一个数量级精确度的初始靶模板分子绝对数量。
在本发明的另一个具体实施方案中，将待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至含有100-10000个反应单元的聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行两轮巢式数字PCR定量。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于本发明的巢式数字PCR定量方法的基因检测试剂盒，其成份包括：核酸提取试剂，dNTPs及dTTP，UDG酶，Taq酶及其缓冲液，外侧引物F1/R1，内侧引物F2/R2，染料EB及SYBR Green I，纯化水dH2O，矿物油。 
本发明的的巢式数字PCR定量方法操作简便，成本低廉而又灵敏度极高，可作为重要的临检样本、核酸参考品和科研样本的手动/手工d-PCR方法，同时也为更快捷、高效超级单元微滴化的微流控芯片装置的研制提供了前期研究工具和创新指导思路。 
附图说明：
图1.改良巢式PCR示意图，第一轮PCR采用短引物小体积扩增，第二轮PCR加入长引物于封闭的第一轮PCR反应管大10倍体积扩增，示意图中，长细线条代表靶模板，透明粗线条代表外侧引物和第一轮扩增产物；黑体粗线条代表内侧引物和第二轮扩增产物。
图2.无模板的CaMV引物PD验证PCR，其外侧引物经15,……,24个循环普通PCR扩增后稀释进行内引物高Tm退火实时荧光PCR，相应本底Ct值均为35-36，所以第一轮少于24个循环和第二轮少于35个循环巢式PCR不会产生PD非特异扩增；如第一轮30个循环后第二轮荧光PCR则其本底Ct值18。
图3. 实施例转基因大豆油的d-PCR 96孔板定量结果。
具体实施方式
本发明的巢式数字PCR定量方法其特征不同于传统的巢式PCR，传统的巢式PCR方法是从第一轮PCR产物取出一小部分来加入第二轮PCR以及加PCR反应液后再加矿物油或热盖代替油密闭，所以容易交叉污染。而本发明的数字定量巢式PCR为反传统巢式PCR顺序操作的两步数字PCR，其技术特征是预先加矿物油，第一轮PCR小体积加入矿物油下进行低退火温度扩增，且样本10倍梯度稀释后分梯度组PCR，第二轮PCR大体积加入第一轮反应进行高退火温度扩增以使第一轮外侧引物在第二轮失去作用，避免外侧引物两轮PCR持续产生引物二聚体PD扩增，配合预加矿物油隔绝PCR系统外气雾胶污染，保证所述的巢式数字PCR“0”模板没有非特异性反应，而巢式PCR两轮大于40个循环反应能实现“1”个模板扩增检出。本发明的一个具体实施方案的示意图显示于图1中。
在本发明方法的一个具体实施方案中，在反应孔预先加入30-50μL矿物油确保密闭情况下，加1-2.5μL样本和等体积的2×外侧引物PCR反应液于矿物油层下面，进行12-20个碱基的外侧引物44oC-48oC退火的15-25个热循环第一轮PCR扩增；于第一轮同一孔中加18-45μL的1×内侧引物PCR反应液，用同样吸头插入矿物油层下面加入，进行16-26个碱基的内侧引物56oC-60oC退火的20-30个热循环第二轮PCR扩增。
在本发明方法的另一个具体实施方案中，将待测样本进行9个或以上梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度又等量分配到有限个反应孔/反应单元，进行共96孔板、384孔板两轮巢式PCR，采用样本预先10倍稀释的9组梯度重复PCR，总有一组10个PCR其靶分子理论数位于0-1之间，能取得相当于万级甚至百万级反应单元微流控或微滴化装置的功效，以及在此基础之上加一两级的100倍稀释或取舍；如在第二轮1×PCR反应液中加入1×SYBR Green I荧光染料可在第二轮进行实时荧光PCR检测，否则于第二轮PCR反应后每孔加入2-5μL的EB (0.5μg/mL)于矿物油层下面，置96孔板于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测。
在本发明方法的另一个具体实施方案中，将待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至100-10000个反应单元聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行两轮巢式数字PCR定量。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于本发明的巢式数字PCR定量方法的基因检测试剂盒，所述试剂盒成份包括：核酸提取试剂，dNTPs及dTTP，UDG酶，Taq酶及其缓冲液，外侧引物F1/R1，内侧引物F2/R2，染料EB及SYBR Green I，纯化水dH2O，矿物油。
为了克服现有d-PCR “0”反应有非特异性的障碍和微流控或微滴化装置反应单元数目的限制。本发明的巢式数字PCR定量方法利用巢式PCR能够检出单个分子的高灵敏度，改进传统巢式PCR操作方式以消除引物二聚体非特异性扩增所掩盖的“0”模板反应。
常规的巢式PCR(nest PCR)是一种由外侧和内侧两套引物进行两轮扩增的高特异性和灵敏度的PCR模式，首先由外侧引物进行第一轮15-30个热循环扩增，然后从第一轮反应产物中取出少部分作为模板进行第二轮内侧引物15-30个热循环扩增，内侧引物与第一轮产物序列互补，第二轮扩增在第一轮较长片段扩增基础上继续放大、扩增较短一些的目的片段产物。两套引物特异杂交增强了靶序列选择的特异性，多于30个循环以上的扩增提高了灵敏度，近40个循环的扩增可以检出单个分子。为了避免第一轮PCR后开盖操作所带来的气雾胶交叉污染，衍生了不开盖的单管巢式PCR，即采用较长外侧引物和较短的内侧引物同时加入单管PCR，外侧引物的退火温度比内侧引物的退火温度高10摄氏度以上，这样单管反应第一轮PCR时采用较高的引物退火温度使外侧引物先行扩增而内侧引物不会扩增，第二轮PCR通过降低退火温度使内侧引物扩增。但是由于在第二轮扩增中外侧引物仍能部分杂交、延伸，因此在超过30个循环后就一定会产生引物二聚体PD非特异性扩增，仍需要PCR后凝胶电泳来区分非特异性扩增条带。但是这种扩增方法由于“0”模板的PD非特异性扩增而使其完全无法适用于数字(digital)PCR。
本发明的发明人改进了常规的巢式PCR操作方式，反过来设计外侧和内侧两套引物，使用较短的14-18个碱基的外侧引物和较长的18-24个碱基的内侧引物，内侧引物的退火温度比外侧引物的退火温度高10oC以上。本发明的方法采用96孔板两轮PCR反应，在每孔预先加入30-50μL矿物油确保密闭情况下，第一轮PCR加1-2.5μL样本和等体积的2×外侧引物PCR反应液，用加样枪吸头轻轻插入矿物油层下面缓缓加入，进行44oC-48oC退火的15-25个热循环扩增；第二轮PCR于上一轮同一孔中加18-45μL的1×内侧引物PCR反应液，用同样吸头插入矿物油层下面加入，进行56oC-60oC退火的20-30个热循环扩增。第一轮PCR较短外侧引物的低温退火扩增会增多一些单引物与非靶模板线性扩增，但不会聚焦产生足够被荧光检测检出的指数非特异性扩增；随后第二轮PCR较长内侧引物的高温退火扩增会进一步排除这些非靶扩增的少量DNA，特异性仍强于普通PCR。
本发明的改进巢式PCR操作方式最根本优点是消除了引物二聚体非特异性扩增，引物对往往必须大于4μM浓度和超过30个热循环扩增才会产生可检测的引物二聚体扩增。外侧引物在第一轮15-25个热循环中不够产生可检测的引物二聚体，进入第二轮PCR后外侧引物被稀释10-20倍仅0.5μM浓度和外侧引物Tm值明显低于第二轮PCR退火温度10oC以上，其引物浓度和Tm值双重作用限制下外侧引物对于两轮PCR始终不会产生可检测的引物二聚体扩增；而4μM浓度内侧引物对仅参与第二轮PCR的20-30个热循环也不够产生可测的引物二聚体。本发明的方法中还配合预加矿物油隔绝PCR系统外的气雾胶交叉污染(后加矿物油会无意溅起少量PCR液于油表面及管壁上继续扩增而导致气雾胶泄露)。
在本发明的巢式数字PCR定量方法的一个实施方案中，按如下步骤进行PCR操作：（1） 首先将未知浓度的待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释：取9个1.5mL塑料EP管，每管均先加入某μL纯化水，取1/10体积待测样本原液加入第1管水中、并用吸头轻轻混匀、此为原液×10-1倍，从第1管中取1/10体积的10倍稀液加入第2管水中、并轻混为原液×10-2倍，每管换一吸头，以此类推地稀释至原液×10-9的浓度；(2) 用2×PCR反应液稀释样本：每个EP管稀释样本均加入等量体积含外侧引物的2×PCR反应液，生成第一轮PCR混合液；(3) 将第一轮PCR混合液分别加入反应孔预加的矿物油层下面：取一个尖底的96孔PCR反应板(8×12孔)，每孔先加入30-50μL矿物油，A1-10组加2-5μL/孔原液×10-9倍浓度的第一轮PCR混合液于矿物油下管底，B1-10组加2-5μL/孔原液×10-8倍浓度的第一轮PCR混合液，C……H类推，剩余的A-E11-12孔加2-5μL/孔原液×10-1倍浓度的第一轮PCR混合液，最后加两孔阳性对照、两孔阴性对照和两孔系统本底对照；(4) 用所述96孔PCR板进行15-25个热循环（94oC变性20秒、44oC-48oC退火45秒、72oC延伸30秒）的第一轮PCR扩增；(5) 在所述96孔板的各孔中再加入18-45μL/孔的含内侧引物1×PCR反应液，用同样吸头插入矿物油层下面加入，进行20-30个热循环（94oC变性20秒、56oC-60oC退火25秒、72oC延伸30秒）的第二轮PCR扩增。
两轮加起来超过40个循环的扩增提供了能够检测出单个分子的灵敏度；而每轮少于25个循环、30个循环的引物扩增又不会产生可检测到的引物二聚体PD非特异性干扰；再采用样本预先10倍稀释的9组重复PCR，总有一组的10个PCR的靶分子理论数位于0-1之间。改良巢式PCR如在第二轮1×PCR反应液中加入1×SYBR Green I荧光染料可在第二轮进行实时荧光PCR检测；或者，可于第二轮PCR反应后每孔加入2-5μL的EB (0.5μg/mL)于矿物油层下面，置96孔板于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测；或者，可于第二轮PCR反应后每孔加入针对野生与突变基因不同波长的红绿两种分子信标探针，可进行高野生背景下突变定量。结果判读：一组10个PCR有7个或多于7个扩增荧光反应定为1个靶分子/孔样本，一组10个PCR有3个及少于3个扩增荧光反应定为0个靶分子/孔样本，一组10个PCR有4个-6个扩增荧光反应定为0.5个靶分子/孔样本，以1个靶分子组或0.5个靶分子组乘以样本稀释倍数就推算出初始靶模板分子绝对数量，正负误差为5-10个分子。
如果需要进一步更精确定量检测，可在上述d-PCR基础上，将样本一次稀释至大约0.5个靶分子/孔，加等量2×第一轮PCR反应液后分散至整个96孔板，同样按本发明方法进行两轮巢式d-PCR，结果数据进行泊松分布计数，可以得到初始靶模板分子绝对数量，正负误差为1-2个分子。
在一个更具体的实施方案中，本发明的巢式数字PCR定量方法包括以下操作步骤：
(1)   改良巢式d-PCR引物选择尤其外侧引物设计及验证：
进行PCR成功与否的关键是引物选择的优劣，尤其常规的巢式PCR外侧引物需要经过两轮40个以上热循环，因此通常会产生引物二聚体PD非特异性扩增，从而掩盖无模板的本底PCR反应。根据Hands(Brownie.J.,1997,Nucleic Acids Res.,25-16:3215)技术，70%以上同序引物对不会产生引物二聚体；我们将天然同序6-8个碱基的序列放置离引物3'末端2-5个碱基的中部，如此一对部分同序引物一般推后5-10个热循环才产生PD扩增，以减少外侧引物第一轮PCR产生PD的几率，再加上外侧引物10倍稀释和Tm值低10度于第二轮PCR，在上述条件下不会产生PD扩增。第二轮内侧引物的选择则在外侧引物限定的片段范围内根据一般引物设计原则来设计。
   设计选择的外侧引物和内侧引物是否导致PD扩增或什么条件下导致PD扩增？其最终选择必须通过试验来确定。采用不加样本的无模板空白系统PCR来验证PD扩增，配置10个改良巢式PCR反应，第一轮PCR使用普通PCR仪1-10管分别扩增15-24个热循环或更宽范围循环，第二轮全部采用SYBR Green I实时荧光PCR扩增45个热循环，挑选没有PD或最晚有PD扩增的试验管作为第一轮PCR最佳循环条件，同时通过实时荧光PCR可以确切知道第二轮PCR最多进行多少个循环不产生PD扩增。
第一轮无模板外侧引物普通PCR：按以下配方配制10次试验，每次5μL的外侧引物PCR混合液，
外侧引物F1 (5μM)                    0.5μl
外侧引物R1 (5μM)                    0.5μl
6 mM dNTP                              0.5μl
10×Taq buffer                           5.0μl
Taq                                         1.0μl
dH 2 O                                       43μl
                                              50μl
   取1-10支0.2mLPCR管，先加入50μl/管的矿物油，再依次吸取5μL的PCR混合液，分别小心加入1-10号PCR管矿物油层下面，进行94oC变性2分钟后，进行24个热循环（94oC变性20秒、44o-48oC退火45秒、72oC延伸30秒）的第一轮PCR扩增，在完成15-24个热循环72oC延伸后依次手工/手动取出1-10号PCR管。
第二轮SYBR Green I实时荧光PCR：按以下配方配制10次试验，每次50μL的内侧引物PCR混合液，
  内侧引物F2(5μM)                     5μl
内侧引物R2(5μM)                      5μl
6mM dNTP                                 5μl
10×Taq buffer                            50μl
Taq                                          10μl
SYBR Green I(25×)                     10μl
dH 2 O                                       415μl
500μl
吸取45μL/管的含内侧引物荧光PCR反应液，用同样吸头插入1-10号管矿物油层下面小心加入，进行94oC变性2分钟后，进行45个热循环（94oC变性20秒、56o-60oC退火25秒、72oC延伸30秒）的第二轮实时荧光PCR扩增。
内外侧引物对一经完成验证第一轮和第二轮最佳循环数，每次进行应用d-PCR检测时就无需再次/或每次进行验证，固定使用确定的第一轮和第二轮最佳循环数。
 
(2)样本DNA/RNA提取及纯化：
动物DNA微磁球法提取：采用0.2-1 M异硫氰酸胍与0.2-1% SDS裂解，核酸在0.2-2.0 M的盐条件下结合至含0.1 M的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（pH6.5）的聚苯乙烯微磁球(0.1-0.4 mg/mL)的硅烷化表面羟基(Melzak et al,1996)，用pH小于6.0的盐液和70%乙醇液各洗涤1次，微磁球干燥10分钟后用pH大于8.5的TE缓冲液洗脱。
植物CTAB法DNA提取：将植物样本于灭菌研钵中加液氮捣碎，再加入500μL十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）研磨，然后转入1.5mL塑料EP管中65oC水浴1小时，加等体积的氯仿-异戊醇（24:1混合）抽提一次，微磁球结合或2倍酒精盐液沉淀，加40μL的TE洗脱或溶解DNA。
RNA快速提取：标本0.1 ml加裂解液(/Trizol)1 ml(0.5ml的4M GTC液+0.5ml水饱和酚)，漩涡振荡，再加0.1 ml氯仿混匀，台式高速离心10分钟，裂解上清加等量异丙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤，加50μl经DEPC处理的dH2O溶解RNA。或裂解上清液中加微磁球交联固相化一端引物纯化(GTC液：65℃溶解的4M异硫氰酸胍+0.1 mM DTT+0.2%SDS) 。 
(3)样本核酸10倍稀释梯度第一轮PCR：待测样本按下表作9个梯次10倍稀释，
取9个1.5mL塑料EP管，每管先加入27μL纯化水，取3μL待测样本原液加入第1管水中、并用吸头轻轻混匀、此为原液×10-1倍，从第1管中取3μL的10倍稀液加入第2管水中、并轻混为原液×10-2倍，每管换一吸头，原液×10-3…依次类推…原液×10-9；稀释梯度每个EP管加入等量27μL以下含外侧引物的2×PCR反应液，生成第一轮PCR混合液。
第一轮2×PCR反应液：
外侧引物F1 (5μM)                      6μl
外侧引物R1 (5μM)                      6μl
6 mM dNTP                                6μl
10×Taq buffer                            60μl
Taq                                          12μl
UDG                                        0.5μl
dH 2 O                                       210μl
                                              300μl
取一个尖底的96孔PCR反应板(8×12孔)，每孔先加入50μL矿物油，A1-10组加4μL/孔原液×10-9倍的第一轮PCR混合液于矿物油下管底，B1-10组加4μL/孔原液×10-8倍的第一轮PCR混合液，C……H类推，剩余的A-E11-12孔加4μL/孔原液×10-1倍的第一轮PCR混合液，最后加两孔阳性对照、两孔阴性对照和两孔系统本底dH2O对照。按照之前验证过的实验条件进行95oC变性2分钟后的15-25个热循环（94oC变性20秒、44o-48oC退火45秒、72oC延伸30秒）的第一轮PCR扩增。
 
(4)第一轮产物稀释后第二轮内引物PCR：按以下配方配制第二轮1×PCR反应液，
内侧引物F2(5μM)                    40μl
内侧引物R2(5μM)                    40μl
6mM dNTP                              40μl
10×Taq buffer                         400μl
Taq                                         80μl
UDG                                      4.0μl
SYBR Green I(25×)                   80μl
dH 2 O                                    3320μl
4.0 ml
  在96孔板各孔中再加入36μL/孔的含内侧引物的1×PCR反应液，用同样吸头插入矿物油层下面加入，按照之前验证过的实验条件进行94oC变性2分钟后的20-30个热循环（94oC变性20秒、56o-60oC退火25秒、72oC延伸30秒）的第二轮PCR扩增。
(5)d-PCR终产物荧光显色及计数定量：
第二轮PCR反应后每孔直接加入4μL的溴化乙锭EB(0.5μg/mL)于矿物油层下面，置96孔板于254nm波长紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测；或者，可于PCR反应后每孔加入针对野生与突变基因不同波长的红绿两种分子信标探针，可进行高野生背景下突变定量检测。结果判读：一组10个PCR有7个或多于7个扩增荧光反应定为1个靶分子/2.0μL样本，一组10个PCR有3个及少于3个扩增荧光反应定为0个靶分子/2.0μL样本，一组10个PCR有4个-6个扩增荧光反应定为0.5个靶分子/2.0μL样本，以1个靶分子组或0.5个靶分子组乘以样本稀释倍数就可以推算出初始靶模板分子绝对数量，正负误差5-10个分子。对于0-1结果判断不清楚的临界组PCR产物可进一步进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴别检测。
实施例
以下实施例进一步说明本专利的内容，但不应理解为对本专利的限制。在不背离本专利精神和实质的情况下，对本专利方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
食品转基因启动子dPCR定量检测：
转基因技术突破自然资源的限制，大幅度提高了农产品产量、品质和效益，同时亦带来了转基因食品生物安全问题，并日益受到世界各国政府和社会公众的广泛关注。随之，食品转基因成份定量检测及dPCR绝对定量检测的需求也快速上升。转基因作物已从大豆、玉米、棉花等主要农作物发展至数十种转基因作物种类；转基因类型大多为各种抗除草剂型、抗虫型、或抗除草和抗虫复合型，且也已拓展至改变亚麻酸含量、高赖氨酸型、延迟熟软及抗病毒等一系列新型转基因种类。选择某一转基因靶分子作为转基因qPCR或dPCR定量检测已不太容易作为广泛检测使用，然而多数转基因型均采用花叶病毒CaMV 35S启动子表达、调控，采用共同的启动子序列可以优先作为转基因qPCR或dPCR检测的初筛工具。本发明以转基因豆油为应用实施例来进行CaMV 35S启动子dPCR检测。
 
（1）CaMV 35S启动子序列外侧引物和内侧引物设计及验证：
遵循Hands技术70%以上同序引物对不会产生引物二聚体原则和离引物3'末端2-5个碱基的中部天然同序6-8个碱基的序列的引物对一般推后PD约5-10个循环的策略。从CaMV 35S启动子序列选择一对中部7个碱基的同序引物作为外侧引物F1/R1如下：
CaMV F1：5'-tgg aaa agg aag g  tg-3'
CaMV R1：5'-t ata tag  agg aag g  gt-3'
以及其扩增片段范围内根据引物设计软件Primer5挑选一对内侧引物F2/R2如下：
CaMV F2：5'-cat tgc gat aaa gga aag g-3'
CaMV R2：5'-gaa gga tag tgg gat tgt g -3'
并通过不加样本的无模板空白系统PCR来验证PD扩增，配置10个改良巢式PCR反应，第一轮PCR使用普通PCR仪1-10管分别扩增15-24个热循环或更宽范围循环，第二轮采用SYBR Green I实时荧光PCR全部扩增45个热循环，挑选没有PD或最晚有PD扩增的试验管第一轮PCR最佳循环条件，同时通过实时荧光PCR可以确切知道第二轮PCR最多进行多少个循环不产生PD扩增。
第一轮无模板外侧引物普通PCR：按以下配方配制10次试验，每次×5μL的外侧引物PCR混合液，
CaMV F1 (5μM)                        0.5μl
CaMV R1 (5μM)                        0.5μl
6 mM dNTP                              0.5μl
10×Taq buffer                          5.0μl
Taq                                         1.0μl
dH 2 O                                       43μl
                                              50μl
   取1-10支0.2mLPCR管，先加入50μl/管的矿物油，再依次吸取5μL的PCR混合液，分别小心加入1-10号PCR管矿物油层下面，进行94oC变性2分钟后，24个热循环（94oC变性20秒、44oC退火45秒、72oC延伸30秒）的第一轮PCR扩增，在完成15-24个热循环72oC延伸后依次手工/手动取出1-10号PCR管。
第二轮SYBR Green I实时荧光PCR：按以下配方配制10次试验，每次×50μL的内侧引物PCR混合液，
 CaMV F2(5μM)                          5μl
CaMV R2(5μM)                           5μl
6mM dNTP                                  5μl
10×Taq buffer                            50μl
Taq                                             10μl
SYBR Green I(25×)                     10μl
dH 2 O                                         415μl
500μl
   吸取45μL/管的含内侧引物 荧光PCR反应液，用同样吸头插入1-10号管矿物油层下面小心加入，进行94oC变性2分钟后，45个热循环（94oC变性20秒、56oC退火25秒、72oC延伸30秒）的第二轮实时荧光PCR扩增。
内外侧引物对一经完成验证第一轮和第二轮最佳循环数，每次进行应用d-PCR检测时就无需再次/或每次进行验证，固定使用确定的第一轮和第二轮最佳循环数。
验证结果见图2，图2为无模板的CaMV引物PD验证PCR结果，其外侧引物经15,……,24个循环普通PCR扩增后稀释进行内引物高Tm退火实时荧光PCR，相应本底Ct值均为35-36。因此可以看出，第一轮少于24个循环和第二轮少于35个循环巢式PCR不会产生PD非特异扩增。
⑵豆油样本DNA提取及柱纯化：
根据（中国农业科学2007,40(5):1069）提取DNA方法：取金龙鱼牌食用转基因大豆油10mL加10mL正己烷于烧杯中磁力搅拌2hr，加20mL的PBS继续搅拌3hr，转入50mL塑料管离心12000g×20mins，小心取出下层水相，转入一新50mL管加等体积的异丙醇并混匀，置-20oC×20mins再离心12000g×20mins，弃上清，沉淀加dH2O 100μL溶解，加500μL结合缓冲液过离心柱，洗液洗柱两次，柱瞬离干燥后加50μL的TE洗脱DNA。
⑶样本核酸10倍稀释梯度第一轮PCR：待测样本按下表作9个梯次10倍稀释，
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
浓度 原液×10-1 原液×10-2 原液×10-3 原液×10-4 原液×10-5 原液×10-6 原液×10-7 原液×10-8 原液×10-9
取9个1.5mL塑料EP管，每管先加入27μL纯化水，取3μL待测样本原液加入第1管水中、并用吸头轻轻混匀、此浓度为原液×10-1倍，从第1管中取3μL的10倍稀液加入第2管水中、并轻混为原液×10-2倍，每管换一吸头，原液×10-3…依次类推…原液×10-9；稀释梯度每个EP管加入等量27μL以下含外侧引物的2×PCR反应液，生成第一轮PCR混合液。
第一轮2×PCR反应液：
CaMV F1 (5μM)                         6μl
CaMV R1 (5μM)                         6μl
6 mM dNTP                                6μl
10×Taq buffer                           60μl
Taq                                           12μl
dH 2 O                                       210μl
                                               300μl
加样：取一个尖底的96孔PCR反应板(8×12孔)，每孔先加入50μL矿物油，A1-10组加5μL/孔原液×10-9倍的第一轮PCR混合液于矿物油下管底，B1-10组加5μL/孔原液×10-8倍的第一轮PCR混合液，C……H类推，剩余的A-E行第11-12孔加5μL/孔原液×10-1倍的第一轮PCR混合液，F行第11-12孔加两孔阳性对照，G行第11-12孔加两孔阴性对照，H行第11-12孔加两孔系统本底dH2O对照。进行95oC变性2分钟后，进行15-25个热循环（94oC变性20秒、44oC退火45秒、72oC延伸30秒）的第一轮PCR扩增。
⑷第一轮产物稀释后第二轮内引物PCR：按以下配方配制第二轮1×PCR反应液，
CaMV F2(5μM)                         50μl
CaMV R2(5μM)                         50μl
6mM dNTP                                50μl
10×Taq buffer                          500μl
Taq                                          100μl
SYBR Green I(25×)                 100μl
dH 2 O                                      4150μl
5.0 ml
  将96孔板再加45μL/孔的含内侧引物1×PCR反应液，用同样吸头插入矿物油层下面加入，进行94oC变性2分钟后，进行20-30个热循环（94oC变性20秒、56oC退火25秒、72oC延伸30秒）的第二轮PCR扩增。
⑸d-PCR终产物荧光显色及计数定量：
第二轮PCR反应后每孔直接加入5μL的溴化乙锭EB(0.5μg/mL)于矿物油层下面，置96孔板于254nm波长紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测。结果判读：一组10个PCR有7个或多于7个扩增荧光反应定为1个靶分子/2.5μL样本，一组10个PCR有3个及少于3个扩增荧光反应定为0个靶分子/2.5μL样本，一组10个PCR有4个-6个扩增荧光反应定为0.5个靶分子/2.5μL样本，以1个靶分子组或0.5个靶分子组乘以样本稀释倍数就可以推算出初始靶模板分子绝对数量，正负误差5-10个分子。
（6）金龙鱼牌豆油d-PCR结果数据（荧光照片见图3）：
由上表可见，A-F行（稀释度为原液×10-9 – 10-4）的检测结果均为0拷贝数。G行（稀释度为原液×10-3）检测结果为1拷贝分子/2.5μL样本。
结果计算：由G行（稀释度为原液×10-3）检测结果为1拷贝数/2.5μL样本，可以计算得出原液拷贝数为1000拷贝分子/2.5μL样本；由10mL豆油提取50μl的DNA分子原液可以算出每1mL豆油样本提取5μL原液，最后换算结果为2000拷贝/5μL原液/mL豆油样本。即测量结果为2000个拷贝分子/mL豆油样本。
 
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Claims (10)

1.一种巢式数字PCR定量方法，其特征是改进的巢式PCR及样本10倍稀释梯度分散至有限单元的数字PCR方法，包括下列步骤：在每个反应单元中预先加入矿物油,在矿物油下方加入1-5μL小体积的第一轮PCR混合液，所述混合液包括等体积的2×反应液和连续10倍稀释梯度的样本液，在第一退火温度下使用外侧引物进行第一轮扩增；随后在第一轮扩增产物中加入10-20倍于第一轮PCR体积的第二轮PCR反应液，在第二退火温度下使用内侧引物进行第二轮扩增；最后检测扩增产物，进行计数定量。
2.根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法， 其中所述第一退火温度为44oC-480C，所述第二退火温度为56oC-60oC。
3.根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法，其中所述外侧引物短于内侧引物。
4.根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法， 其特征在于所述第一轮扩增为在矿物油下方加入1-2.5μL样本和等体积的2×外侧引物PCR反应液，使用14-18个碱基的外侧引物在44oC-48oC的退火温度下进行的15-25个热循环的PCR扩增。
5.根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法， 其特征在于所述第二轮扩增为在第一轮同一孔中加18-45μL的1×内侧引物PCR反应液,用同样吸头插入矿物油层下面加入,使用18-24个碱基的内侧引物在56oC-60oC的退火温度下进行的20-30个热循环的PCR扩增。
6.根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法，其中所述第二轮扩增产物的检测通过如下步骤进行：在反应液中加入SYBR Green I荧光染料进行实时检测；或在第二轮PCR反应后每孔加入2-5μL的EB (0.5μg/mL)于矿物油层下面,置96孔板于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测。
7.根椐权利要求3所述的巢式数字PCR定量方法，其特征是将待测样本进行连续梯次的10倍稀释后每个梯次的稀释梯度又等量分配到10个反应孔/单元，进行梯次×10单元两轮巢式PCR，当一组10个PCR有7个或多于7个扩增荧光反应定为1个靶分子/孔样本,一组10个PCR有3个及少于3个扩增荧光反应定为0个靶分子/孔样本,一组10个PCR有4个-6个扩增荧光反应定为0.5个靶分子/孔样本,以1个靶分子组或0.5个靶分子组乘以样本稀释倍数推算出初始靶模板分子绝对数量。
8.根椐权利要求4所述的一种巢式数字PCR定量方法，其特征是按照根据权利要求7的方法推算出的初始靶模板分子绝对数量，将样本一次稀释至大约0.5个靶分子/孔,加等量2×第一轮PCR反应液后分散至整个96孔板,同样两轮改良巢式d-PCR，数据进行泊松分布计数,得到高一个数量级精确度的初始靶模板分子绝对数量。
9.根椐权利要求1所述的一种巢式数字PCR定量方法，其特征是将待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至含有100-10000个反应单元的聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行两轮巢式数字PCR定量。
10.用于权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法的基因检测试剂盒, 其成份包括：核酸提取试剂，dNTPs及dTTP，UDG酶，Taq酶及其缓冲液，外侧引物F1/R1，内侧引物F2/R2，染料EB及SYBR Green I，纯化水dH2O，矿物油。
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