CN102605065A

CN102605065A - 一种连续流动巢式pcr微流控方法

Info

Publication number: CN102605065A
Application number: CN2012100666704A
Authority: CN
Inventors: 章春笋; 邢达; 舒博文
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2012-03-14
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明公开了一种连续流动巢式PCR微流控方法，该方法针对目标检测物的DNA序列设计由两对引物构成的巢式引物，将待测样品DNA加入含外引物的PCR反应体系混匀后注入连续流动式巢式PCR微流控装置中，使PCR反应液沿螺旋缠绕在三个独立控温的恒温铜柱片上的毛细管完成20~35个PCR扩增循环，并由毛细管末端的荧光检测与分析系统对扩增产物进行荧光图像采集与分析。将扩增产物加入包含内引物的PCR反应体系中，如上所述完成巢式PCR第二步扩增与产物检测。通过对两轮扩增产物荧光图像强度的分析，可确定待测样品中目标检测物的存在与否及其相对量。本发明可实现对低丰度DNA样品的低成本高灵敏快速检测，检出限可达1个拷贝数/总体积，所用时间仅为35~45min。

Description

一种连续流动巢式PCR微流控方法

技术领域

本发明属于微流控PCR分析与检测技术领域，特别涉及一种连续流动巢式PCR微流控方法。

背景技术

自从20世纪90年代初 Manz 和 Widmer 首次提出微型全分析系统概念以来，作为其核心技术的微流控技术已发展为当前世界上最前沿的科技领域之一。当前微型全分析系统的热点和重点应用领域主要集中在生命科学领域，微流控技术在促进分析仪器微型化、集成化、自动化和便携化方面的优势为其在生物医学、高通量药物合成筛选、环境监测与保护、卫生检疫、医疗保健诊断、法医鉴定以及生化战剂的侦测等众多领域提供广阔的应用前景。聚合酶链式反应（PCR）是一种选择性体外扩增DNA片段的方法，因其优异的灵敏度和特异性在生命科学以及诸多相关领域已经得到非常广泛的应用。因此，在微流控技术日益朝生命科学领域发展的过程中，微流控技术与PCR相结合以实现快速灵敏的分析检测是一种必然的发展趋势。

目前微流控PCR主要分为静态和动态两大类。前者实质为传统PCR热循环仪的微型化，由于微结构本身仍具有较大的热容而额外增加了变温过程中的热弛豫时间，因此PCR的快速性受到限制。后者利用“空间交换时间”让PCR反应液沿微通道连续通过两或三个恒温区来实现PCR所需的热循环，因此可快速变温而大大缩短循环总时间。微通道结构尺寸的缩小导致比面积大大增加，在提高导热和传质速率从而加快分析和处理的同时，也使得通道内壁与反应液中的生物分子的相互作用加剧，降低PCR的扩增效率，而动态微流控PCR由于反应液与通道接触面积的增加而表现得更加明显。为克服这些不足，一些新兴技术和方法近年来得到发展，比如降低反应通道与生物分子的相互作用而采用的通道内表面钝化处理、油包裹技术，但工艺流程复杂耗时，增加检测成本，或样品PCR后处理繁琐，操作不便，难以满足实际分析检测中低成本高效率的需求。

在针对实际生物样品核酸的检测与分析中，采用现有技术方法的微流控PCR的成功运用仍依赖于较高的初始核酸模板浓度，对于低丰度的核酸样品则面临检测特异性和灵敏度不足的瓶颈。

巢式PCR作为一种利用两套引物对进行两轮扩增的改良的聚合酶链式反应，其第一轮扩增采用的外引物对与普通PCR相似，第二轮扩增采用的内引物可结合在第一轮扩增DNA片段的内部并且第一轮扩增产物作为模板，因而降低了扩增多靶点的可能性，有效增加低丰度核酸样品的检测特异性和灵敏度。另一方面，由于巢式PCR包含两轮PCR扩增，相比于常规PCR其耗时量倍增，特别是在传统热循环仪上巢式PCR通常需要2.5~4 h才能完成，导致检测的时效性受到极大限制。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的不足，实现对低丰度核酸快速超灵敏检测与分析，本发明的目的在于提供一种连续流动巢式PCR微流控方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种连续流动巢式PCR微流控方法，包括如下步骤：

1）提取待测样本的基因组DNA；

2）引物设计：针对目标检测物的特异性基因DNA序列设计由一对外引物和一对内引物构成的巢式引物；

3）配制PCR反应体系：第一轮PCR反应体系含有外引物；第二轮PCR反应体系含有内引物；

4）第一轮PCR反应：将待测物的DNA样品加入第一轮PCR反应体系中，得到第一轮PCR反应液，将第一轮PCR反应液注入连续流动巢式PCR微流控装置中，完成20~35个PCR热循环；

5）第二轮PCR反应：取部分第一轮PCR扩增产物加入第二轮PCR反应体系中，充分混匀后，得到第二轮PCR反应液，将第二轮PCR反应液注入连续流动巢式PCR微流控装置中，完成20~35个PCR热循环。

优选的，第一轮PCR反应体系包括：

组分终浓度

Taq 聚合酶 0.05~0.1U/μL

Tris-HCl（pH=8.3） 10 mM

KCl 50 mM

MgCl₂ 1.5 mM

4×dNTP Mixture 0.2 mM

外引物1 200~300 nM

外引物2 200~300 nM

第二轮PCR反应体系包括：

组分终浓度

Taq 聚合酶 0.05~0.1 U/μL

Tris-HCl（pH=8.3） 10 mM

KCl 50 mM

MgCl₂ 1.5 mM

4×dNTP Mixture 0.2 mM

内引物1 300~400 nM

内引物2 300~400 nM

优选的，第一轮PCR反应的条件为：20 ~ 35个PCR扩增循环，每个PCR扩增循环中，PCR反应液在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的流通时间分别为4~10 s、4~10 s和4~22 s。

优选的，第二轮PCR反应的条件为：20 ~ 35个PCR扩增循环，每个PCR扩增循环中，PCR反应液在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的流通时间分别为4 ~ 10 s、4 ~15 s和10 ~ 22 s。

以上所述的巢式PCR微流控过程是在连续流动的单一液相体系中完成的。

以上所述的巢式PCR的变性、退火和延伸是以PCR反应混合液反复依次流过解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的形式实现。

以上所述的巢式PCR在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的停留时间的长短是通过控制PCR反应混合液在反应通道中线性流速的快慢实现。

以上所述的巢式PCR在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的停留时间之比是由反应通道在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的长度之比决定。

优选的，以上所述巢式PCR反应体积可根据待测样品的量在5~50 μL之间灵活可调。

优选的，本发明的巢式PCR反应是在开放通道中单向流动过程中实现。

用于实现本发明巢式PCR微流控方法的连续流动巢式PCR微流控装置：

参见附图1~3，本发明的连续流动巢式PCR微流控装置，包括流体控制系统、PCR热循环系统、荧光检测与分析系统14。其中流体控制系统由注射泵1、注射器2、毛细管3和收集管12组成，PCR热循环系统主要由铜柱4、热电偶6、加热器6、循环水冷却装置7、温度采集与控制系统8组成，荧光检测与分析系统14主要由冷却式CCD相机10、荧光显微镜11和通孔固定台13组成，本发明中还包括计算机9，计算机9可控制PCR热循环系统以及对荧光检测与分析系统14收集的数据进行分析。

在流体控制系统中，注射器2安装在注射泵1上，毛细管3通过硅胶管连接在注射器2针头上，启动注射泵后，注射泵推动注射器推杆，注射器内压缩空气驱动PCR反应液在毛细管3内前进，毛细管3螺旋缠绕在PCR热循环系统的螺旋柱面上，穿过通孔固定台13，最终连接于收集管12。为了增加铜柱4与毛细管3接触加热面积从而加快铜柱4与毛细管3的热交换速率，各铜柱片外壁刻有螺旋凹槽，毛细管包埋在铜柱面螺旋槽内。为使双链DNA充分完成初始解链从而充分利用模板以及最后一步延伸反应中引物延伸完全并使单链产物退火成双链，在本装置解链区铜柱41与延伸区铜柱43相互毗邻的侧壁竖直方向均刻有凹槽，毛细管3从解链区铜柱41底端开始沿竖直向上的侧壁凹槽到达顶端的第一个循环解链区的外壁凹槽，此段毛细管作为预解链段，然后按解链-退火-延伸顺序沿各铜柱外壁凹槽自上而下缠绕20~35圈，此段毛细管为PCR热循环段，毛细管每缠绕1圈即形成一个循环，毛细管到达铜柱外壁凹槽的最后一个循环的延伸区后继续沿延伸铜柱侧壁竖直向上的凹槽从螺旋铜柱顶端穿出，此段毛细管作为附加延伸段。为了防止毛细管过度弯折导致管内该处流体流速突变，解链区铜柱片41和延伸区铜柱片43的侧壁凹槽与外壁凹槽衔接过渡区均圆角处理。本发明中的侧壁凹槽为U型凹槽（长65 mm，深和宽均为1.1 mm）。本发明中铜柱外壁的螺旋凹槽为U型凹槽（宽和深均为1.1 mm）。注射泵1为精确持续微量注射泵，注射器2为精密注射器，毛细管3为PTFE毛细管，收集管12为薄壁聚丙烯PCR管。

在PCR热循环系统中，铜柱4按1：1：2的比例分割成解链铜柱片41、退火铜柱片42和延伸铜柱片43，各铜柱片中央轴向包埋的加热器5用于加热铜柱片获得PCR循环所需的温度。为获得稳定的退火温度，在退火区铜柱片42的加热器5两侧分别包埋一冷却水管72，水管72两端连接到循环水冷却装置7上，循环水冷却装置7中的微型水泵71驱动冷却水分别沿水管72依次自下而上和自上而下穿过退火铜柱，冷却水带走退火区铜柱片42上的热量，使其保持恒定的退火温度。水管72为硅胶管。各铜柱片侧壁边缘包埋的热电偶6用于反馈铜柱片的温度信号。解链铜柱片41、退火铜柱片42和延伸铜柱片43分别构成PCR反应的三个恒温区（解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区），毛细管3按解链-退火-延伸顺序螺旋缠绕在各铜柱片外壁上，毛细管3每缠绕1圈即形成一个循环。温度采集与控制系统8将热电偶6采集的温度模拟信号转化位数字信号并传输给计算机9，计算机利用模糊PID算法程序通过温度采集与控制系统8控制加热器5上电流的通断，从而实现对各恒温区的独立精确控温。在本发明中，铜柱4的外径为35 mm，内径为18 mm，高为70 mm；加热器5为电阻式加热棒（外径6 mm，长度70 mm，220 V，100 W）；热电偶6为微型K型热电偶（感温金属丝外径0.05 mm，绝缘皮层直径0.7 mm）。

在荧光检测与分析系统14中，冷却式CCD相机10固定在荧光显微镜顶部，并通过USB缆线与计算机连接，用于荧光图像实时采集。通孔固定台13安装在荧光显微镜11的可调载物台上，通孔固定台13为一矩形厚铝板（尺寸为100 mm×100 mm×3.6 mm），侧面沿x轴方向钻有一矩形通孔（尺寸为1.1 mm×1.1 mm×100 mm）用于固定毛细管，正面中央开有矩形窗口（尺寸为30 mm×30 mm×3.6 mm）作为光学检测区，通孔固定台安装在可调的荧光显微镜载物台上。当毛细管内扩增产物运动至光学检测区落在显微成像视野内，冷却式CCD相机对扩增产物的荧光图像进行连续采集，并将图像数字信号传输给计算机9，计算机显示荧光图像并利用图像分析软件获取图像荧光强度值。本发明中冷却式CCD相机10为广州市明美科技有限公司产品，型号MC15。荧光显微镜11为美国Bio-rad公司产品，型号M17。

本发明装置所用的温度采集与控制模块所采用的软件为基于LabView2009（National Instruments 公司开发）软件开发的模糊PID算法的控制程序。

本发明装置中荧光成像系统所采用的图像分析软件MS 1.5.0为广州明美科技有限公司开发。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明的连续流动巢式PCR微流控方法可实现对低丰度的待测核酸样品的快速、高灵敏检测，检出限可达到1个拷贝数；

（2）采用连续流动巢式PCR微流控方法可有效克服常规微流控PCR中循环数增加导致的非特异性和假阳性现象对检测结果的干扰；

（3）与传统仪器上巢式PCR以及微池静态巢式PCR相比，本发明的巢式PCR过程在连续流动的单一液相体系中进行，有利于和上游样品处理、下游产物分析等功能模块集成，从而能以连续流动形式快速、自动地完成检测分析；

（4）与常规巢式PCR相比，本发明的巢式PCR基于连续流动微流控技术，具备样品试剂消耗少，扩增时间大大缩短等优势。

（5）与常规巢式PCR相比，本发明的巢式PCR采用连续流动方式的进行，热迟滞大大降低，升/降温快速准确，可在更宽范围内选择退火温度的同时确保扩增的特异性，便于高效扩增巢式PCR引物的设计。

附图说明

图1：连续流动巢式PCR微流控装置结构示意图；

图2：连续流动巢式PCR微流控装置俯视图；

图3：连续流动巢式PCR微流控装置工作原理图；

图4：实施例1连续流动巢式PCR扩增反应结果；

图5：实施例2连续流动巢式PCR扩增反应结果；

图6：实施例3连续流动巢式PCR扩增反应结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

本发明的连续流动巢式PCR微流控方法，具体步骤如下：

（1）提取待测样本的基因组DNA。

（2）引物设计：针对目标检测物的特异性基因DNA序列设计由两对引物构成的巢式引物。

（3）PCR混合液配制：分别配制包含1×SybrGreen I荧光染料的外引物与内引物PCR的25 μL预混体系，其中包含外引物的浓度为通用PCR体系引物浓度的50% ~75%。包含内引物的PCR预混体系中内引物浓度为通用PCR体系引物浓度的75%~100%。

（4）将待测物的DNA样品加入包含外引物的PCR预混体系中，通过一次性注射器将PCR反应液由毛细管3入口端引入连续流动巢式PCR微流控装置上的毛细管微通道中，然后将毛细管3入口端连接到连续流动巢式PCR微流控装置上的注射器2的针头上。

（5）启动连续流动巢式PCR微流控装置上的注射泵1，注射泵1推动注射器2推杆，注射器2内压缩空气驱动PCR反应液在毛细管3内前进，使PCR反应液持续沿螺旋缠绕在三个独立控温的恒温铜柱片（解链区铜柱片41、退火区铜柱片42、延伸区铜柱片43）上的毛细管3完成20~35个PCR扩增循环，由毛细管3末端的荧光检测与分析系统14对扩增产物进行荧光图像的采集与分析。

（6）取部分的第一步扩增产物加入包含内引物的PCR预混体系中，充分混匀后，重复步骤4，启动注射泵1，使PCR反应液沿螺旋缠绕在三个独立控温的恒温铜柱（解链区铜柱片41、退火区铜柱片42、延伸区铜柱片43）上的毛细管3完成25~40个PCR扩增循环，由毛细管3末端的荧光检测与分析系统14对扩增产物进行荧光图像的采集与分析。

（7）通过计算机对对两轮扩增产物荧光图像强度值的分析，可确定待测样品中目标检测物的存在与否及其相对量。

下面以单增李斯特菌的检测为例，进一步说明本发明的连续流动巢式PCR微流控方法。

1、引物设计：采用引物设计软件（如Primer Premier 6.0）对单增李斯特菌hlyA基因(基因库编号ATCC 9525)的DNA序列进行分析，根据反应体系要求最终选择的巢式PCR的外引物对和内引物对如下表所示。

2、PCR反应体系的配制：由于本发明主要针对低丰度DNA模板的检测，为减小PCR过程中未完全反应的引物形成引物二聚体对荧光检测信号的干扰，在参照PCR试剂生产商的使用说明的基础上，本发明对PCR反应体系中外引物浓度作了适当的优化，实际外引物浓度为推荐浓度的75%。本发明中所采用的PCR体系如下表所示。

3、PCR扩增反应

DNA样品的制备：利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取单增李斯特菌基因组DNA，依次稀释为1、1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵拷贝/μL，作为待测DNA样品，阴性对照采用灭菌水替代模板，分别进行以下PCR反应：

（1）将待测DNA样品加入包含外引物的第一步扩增预混体系，通过一次性注射器将PCR反应液由PEFE毛细管3入口端引入连续流动巢式PCR微流控装置上的毛细管微通道中，然后将PTFE毛细管3连接到连续流动巢式PCR微流控装置上的注射器2的针头上。

（2）启动注射泵1，注射泵1推动注射器2推杆，注射器2内压缩空气驱动PCR反应液在PTFE毛细管3内前进，使PCR反应液持续沿螺旋缠绕在三个独立控温的恒温铜柱片的毛细管3完成30个PCR扩增循环。循环参数如下：解链区95℃，退火区55℃，延伸区72 ℃，设置注射体积流速为23.56 μL/min，对应PCR反应液在毛细管通道中的线流速2 mm/s，每个PCR扩增循环中，PCR反应液在上述三个恒温区的流通时间分别为10 s、10 s和22 s，总循环25min。

（3）使扩增产物混合液沿PTFE毛细管3流至荧光显微载物台成像视野区，通过CCD数码成像装置采集扩增产物荧光图像并图像数字信号传输给计算机，计算机利用图像分析软件MS 1.5.0分析扩增产物荧光强度值（见图4）。

（4）取毛细管出口处收集的第一轮扩增产物2 μL加入第二轮PCR反应预混体系中，充分混匀后通过一次性注射器引入PTFE毛细管3中。

（5）重复步骤（2），其中循环参数如下：解链区95 ℃，退火区47.5 ℃，延伸区72℃，设置注射体积流速为41.23μL/min，对应PCR反应液在毛细管通道中的线流速3.5 mm/s，每个PCR扩增循环中，PCR反应液在上述三个恒温区的流通时间分别为6 s、6 s和14 s，总循环时间约17min。

（6）重复步骤（3），分析结果见图4。

（7）对于从荧光检测判断有扩增的样本，可取5 μL在毛细管3出口处收集的扩增产物，加入1 μL 6×Loading buffer ，使用2.25 % 琼脂糖凝胶进行电泳作进一步分析确认。

实验结果表明，本发明的连续流动式巢式PCR微流控方法可实现对低丰度待测核酸样品的快速、灵敏检测，检出限可达10个拷贝数，所用时间仅为42 min。

实施例2

连续流动巢式PCR微流控方法扩增循环数测试

1、PCR反应体系：同样是以单增李斯特菌的检测为例，待测DNA样品的浓度为5×10⁶拷贝/μL，PCR反应引物、反应体系和实施例1相同，阴性对照采用灭菌水替代模板。

2、PCR扩增反应：将第一轮PCR扩增反应的循环数分别设置为20个、25个、30个、35个，其他反应条件、反应步骤和实施例1相同，测试不同的循环数对PCR反应结果的影响，实验结果见图5。

由图5 可见，在一定范围内，增加PCR反应的循环数，PCR产物的荧光强度也随之增强。因此，为了获得理想的PCR扩增产物的量，在可实现的范围内适当增减本发明PCR装置上的毛细管圈数，均属于本发明的一部分，落在本发明的保护范围内。

实施例3

连续流动巢式PCR微流控方法扩增时间测试

2、PCR扩增反应：将第一轮PCR扩增反应的线性流速分别设置为：

2 mm/s（在解链区、退火区、延伸区三个恒温区的流通时间分别约为10 s、10 s和22 s）；

3.5 mm/s（在三个恒温区的流通时间分别约为6 s、6 s和14 s）；

5 mm/s（在三个恒温区的流通时间分别约为4 s、4 s和10 s）；

7.5 mm/s（在三个恒温区的流通时间分别约为3 s、3 s和7 s）；

10 mm/s（在三个恒温区的流通时间分别约为2 s、2 s和4 s）。

第二轮PCR扩增反应的线性流速与第一轮的相同，将第一轮PCR反应的产物稀释1000倍后，取2 μL作为第二轮PCR反应的DNA模板，其他反应条件、反应步骤和实施例1相同，测试不同的线性流速对PCR反应结果的影响，实验结果见图6。

实验结果表明，当第一轮反应PCR反应液在解链区、退火区、延伸区三个恒温区的流通时间分别不少于3 s、3 s、7 s，第二轮反应PCR反应液在解链区、退火区、延伸区三个恒温区的流通时间分别不少于3 s、3 s、7 s时，即可实现本发明的目的；当第一轮反应PCR反应液在解链区、退火区、延伸区三个恒温区的流通时间分别不少于4 s、4 s、10s，第二轮反应PCR反应液在解链区、退火区、延伸区三个恒温区的流通时间分别不少于4 s、4 s、10 s时，即可获得理想的扩增结果。

当然，PCR反应的时间通常主要取决于目的扩增序列的长度与理化性质如CG含量。时间过短，因反应不充分而得不到足量扩增产物；时间过长，可能导致聚合酶活性下降且会产生非特异性扩增，均不利于提高反应效率。因此，在本领域技术人员的理解范围内，根据目的序列的性质适当调整反应时间的长短，都应被视为本发明的一部分，落入本发明的保护范围。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出的若干的变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

<110> 华南师范大学

<120> 一种连续流动巢式PCR微流控方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

aacatatcca ggtgctctcg taa 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

ggaaggtctt gtaggttcat taaca 25

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

aatcaaccag atgttctc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

gattcactgt aagccatt 18

Claims

1.一种连续流动巢式PCR微流控方法，包括如下步骤：

1）提取待测样本的基因组DNA；

2.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：第一轮PCR反应体系包括：

组分终浓度

Taq 聚合酶 0.05~0.1U/μL

Tris-HCl（pH=8.3） 10 mM

KCl 50 mM

MgCl₂ 1.5 mM

4×dNTP Mixture 0.2 mM

外引物1 200~300 nM

外引物2 200~300 nM

第二轮PCR反应体系包括：

组分终浓度

Taq 聚合酶 0.05~0.1 U/μL

Tris-HCl（pH=8.3） 10 mM

KCl 50 mM

MgCl₂ 1.5 mM

4×dNTP Mixture 0.2 mM

内引物1 300~400 nM

内引物2 300~400 nM。

3.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：第一轮PCR反应的条件为：20 ~ 35个PCR扩增循环，每个PCR扩增循环中，PCR反应液在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的流通时间分别为4~10 s、4~10 s和4~22 s。

4.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：第二轮PCR反应的条件为：20 ~ 35个PCR扩增循环，每个PCR扩增循环中，PCR反应液在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的流通时间分别为4 ~ 10 s、4 ~15 s和10 ~ 22 s。

5.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR过程是在连续流动的单一液相体系中完成的。

6.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR的变性、退火和延伸是以PCR反应混合液反复依次流过解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的形式实现。

7.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的停留时间是通过调节PCR反应混合液在反应通道中线性流速来控制的。

8.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的停留时间之比是由反应通道在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的长度之比决定。

9.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR反应体积可根据待测样品的量在5~50 μL之间灵活可调。

10.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR反应是在开放通道中单向流动过程中实现。