CN204490890U - 热梯度微反应器 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及热梯度微反应器,包括发热基底、微通道、加热元件、温度传感器和供发热基底散热的散热装置;发热基底包括实心柱体段和空心柱体段;空心柱体段的横截面为开口朝向实心柱体段的U形,实心柱体段与U形开口的一端相接且与U形开口的另一端断开;微通道呈螺线管式缠绕在发热基底外,螺线管的轴线与发热基底的长度方向一致;加热元件和温度传感器安装在实心柱体段内。具有如下优点:结构紧凑、温度控制简单;解链温度区间、退火/延伸温度区间和延伸-解链线性热梯度区间的长度、位置均可灵活调整;能快速对微通道内的样品进行扩增,为荧光分析提供高密度的通道单元和大面积的成像视野。属于体外分子诊断技术领域。
Description
技术领域
本实用新型属于体外分子诊断技术领域,特别涉及一种手持式POCT流式基因分析系统中的热梯度微反应器。
背景技术
POCT(point of care testing)一般称为即时检验,是体外诊断(IVD)的一个细分行业,其凭借便捷、快速的优势,可实现在患者身边快速取得诊断结果,成为近年来快速发展的一个新兴领域。目前正在发展的POCT依据其技术特性主要划分为三代:以快速诊断试纸(如血糖试纸条、早孕试纸条等)为基础的第一代POCT,以卡盒式核酸扩增为基础的第二代POCT,以智能手机的应用为基础的第三代POCT。相比于前两代POCT,第三代POCT由于其具备高灵敏高特异的多参数定量的检测能力和更加集成便携、操作简便、用户友好等诸多潜在优势,已成为体外即时检测领域的最前沿技术。
在第三代POCT基因分析类仪器中,普遍采用基于微流控技术的核酸扩增方法作为核心技术来实现具备上述特征的快速分子诊断。然而,目前发展中的这类POCT基因分析系统包括基于时域聚合酶链式反应(PCR)类的系统和基于等温扩增类的系统,由于其各自技术的固有特点,两类技术均存在着一些制约瓶颈。时域PCR类:其实质相当于传统热循环仪的微型化,其热循环需要精确重复的升或降温而且热元件(或结构)存在自身热惯性,这些因素通常会导致大量时间和能量的消耗、温度控制的复杂、成本的上升、热设计上的笨重。等温扩增类:一方面,其扩增过程无需热循环,其检测的灵敏度、准确性和可定量性极其依赖于扩增过程在时间上的持续,通常只能针对具体样品的反应体系建立与之对应的时间持续标度,缺乏普适性,因而存在实际操作上的困难;另一方面,扩增产物的可靠检测比较困难,目前其扩增产物主要依赖终点检测(如电泳等),虽然可以通过监测扩增过程中的荧光或溶液浊度等信号的累积来进行定量检测,但却牺牲了其检测的特异性,因为任何非特异性或附生型的产物也能累积上述检测信号,因此这类定量检测存在假阳性风险。作为一种微流控核酸扩增新技术,空域PCR利用“空间交换时间”让样品反应液反复通过两或三个恒温区来实现PCR所需的热循环,消除了精确反复升降温的需求,避免了热系统自身的热滞,在热循环速度、系统能耗、温度控制和整体尺寸等方面具有显著优势,但目前基于该技术的基因分析装置尚未达到面向POCT应用阶段,主要表现为:(1)集成度不足,仍然依赖笨重的离线设备和资源,如:泵源、温度控制系统、计算机、台式检测器和电源等;(2)功能单一,大多仅具有核酸扩增功能,缺乏关键性的在线分析能力包括实时定量检测和产物鉴别。显然,目前已发展的第三代POCT基因分析类仪器仍存在一些不便和缺陷,亟待加以进一步发展和改进。
为此,需要发明一种手持式POCT流式基因分析系统,克服现有POCT基因分析仪器在分析速度、多元与定量检测、能源消耗、便携性和操作简便等方面的缺陷与不足,使其秉承POCT理念,具有体积小巧便携,操作简便直观,可现场化使用、成本低等优点,并且具备高速高灵敏高特异性扩增、实时定量检测、多元核酸鉴别和同时多批次样品分析等能力,使之适用于更广泛的应用场合。该手持式POCT流式基因分析系统主要包括热梯度微反应器、智能手机宽场荧光成像器、微流体驱动器、电子控制系统和充电电池组。本实用新型的热梯度微反应器即为其中的一部分。
实用新型内容
针对现有技术中存在的技术问题,本实用新型的目的是:提供一种通过单个加热元件即可在发热基底的外表面形成解链温度区间、退火/延伸温度区间和延伸-解链线性热梯度区间,以获得不同样品的退火/延伸的最佳反应温度和合适的融解分析温度区间,供微通道中通过的样品反应液进行高效PCR扩增和高分辨融解分析。
为了达到上述目的,本实用新型采用如下技术方案:
热梯度微反应器,包括发热基底、微通道、加热元件、温度传感器和供发热基底散热的散热装置;发热基底包括实心柱体段和空心柱体段;空心柱体段的横截面为开口朝向实心柱体段的U形,实心柱体段与U形开口的一端相接且与U形开口的另一端断开;微通道呈螺线管式缠绕在发热基底外,螺线管的轴线与发热基底的长度方向一致;加热元件和温度传感器安装在实心柱体段内。此处所说的螺线管类似螺纹形状,区别在于其缠绕的母体形状并非螺纹的圆柱形或圆锥形,而为发热基底的柱体形。发热基底为导热系数适中的金属材质或其它具有线性热导率的复合导热材质。采用这种结构后,通过单个加热元件配合温度传感器、散热装置有效控制发热基底的温度,从而在发热基底表面形成解链温度区间、退火/延伸温度区间和延伸-解链线性热梯度区间,且区间的大小、位置均可灵活调整,能快速对微通道内的反应液样品进行扩增,为后续荧光成像分析做准备提供高密度的通道单元和大面积的成像视野。
进一步,实心柱体段与空心柱体段相连接的部位位于发热基底的上端,实心柱体段与空心柱体段相断开的部位位于发热基底的下端,实心柱体段位于发热基底的左端,空心柱体段位于发热基底的右端;实心柱体段的左端表面为半圆柱面,空心柱体段的右端表面也为半圆柱面,两半圆柱面的半径相同。采用这种结构后,即发热基底采用特殊的形状,一方面便于微通道缠绕,另一方面能有效控制各区间的大小和位置。
进一步,发热基底的外表面设有呈螺线管式分布的U形沟槽,微通道嵌入U形沟槽中。采用这种结构后,U形沟槽将微通道环绕,加速热量的传递,热量传递均匀;同时微通道依预先加工好的U形沟槽布置,缠绕方便。
进一步,空心柱体段的下端具有一个凸出块;发热基底通过凸出块安装在散热装置上。采用这种结构后,结构简单,安装方便。
进一步,散热装置包括散热片和朝向散热片吹风的微型涡轮风扇;凸出块安装在散热片的上端。采用这种结构后,散热片配合微型涡轮风扇散热,操作简单,散热可靠;调节风扇的功率即可调整温度区间的温度跨度和有效长度。
进一步,凸出块为立方体形;凸出块与发热基底一体成型,发热基底在凸出块所在区域继续由上述U型沟槽贯穿,凸出块的下端平面紧贴散热片的上端。采用这种结构后,凸出块的上端直接覆盖在发热基底的下端,一体制作成型,两者之间留有U形沟槽,安装微通道时只需穿过U形沟槽即可。
进一步,实心柱体段的长度大于空心柱体段的长度;实心柱体段的前端与空心柱体段的前端对齐,实心柱体段的后端凸出于空心柱体段的后端。采用这种结构后,实心柱体段凸出于空心柱体段的一段形成圆柱区,其余的发热基底形成扁平区,即可将PCR预变性区控制在圆柱区处。
进一步,实心柱体段内开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的圆形通孔,实心柱体段内还开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的插孔;加热元件为电加热棒,安装在圆形通孔内;温度传感器为K型热电偶,安装在插孔内。优选的,电加热棒位于实心柱体段的半圆柱面的中心轴线上。采用这种结构后,结构简单、安装方便,加热元件可对发热基底进行均匀加热,温度易于控制。
进一步,微通道为透明聚四氟乙烯毛细管。采用这种结构后,便于微通道内的反应液进行荧光的激发与成像。
进一步,微通道呈螺线管式缠绕至实心柱体段的后端,微通道位于后端的一端为进样口。采用这种结构后,可将PCR预变性区控制在圆柱区处。
本发明的原理是:
微通道紧密包埋于发热基底的U型沟槽中;通过温度传感器反馈控制加热元件工作,保持单个加热元件维持恒定温度即可在发热基底外表面形成解链温度区间、退火/延伸温度区间和延伸-解链线性热梯度区间,且通过调节散热装置的输出功率可以灵活改变上述温度区间的温度及区间长度,以适应最佳扩增效果和检测效果;微通道中的反应液通过微流体驱动器以油相为载流体驱动其沿微通道流动,依次经历解链温度区间、退火/延伸温度区间和延伸-解链线性热梯度区间。在延伸-解链温度区之间形成空间融解分析所需的线性热梯度区。通过调节散热装置的输出功率,可实现对退火/延伸区间温度跨度的改变以获得不同引物退火/延伸的最佳反应温度和合适的融解分析温度区间。优选的,发热基底的上表面作为荧光检测区,其有效检测区的位置、面积、形状通过安装在其近表面的智能手机宽场荧光成像器的光阑来来调节,以适应不同的检测需求。
总的说来,本实用新型具有如下优点:结构紧凑、温度控制简单;解链温度区间、退火/延伸温度区间和延伸-解链线性热梯度区间的温度跨度、位置均可灵活调整;能快速对微通道内的反应液进行扩增,为后续荧光成像分析做准备。
附图说明
图1是热梯度微反应器的拆分图。
图2是发热基底的立体图。
图3是发热基底的功能分区图。
图4是手持式POCT流式基因分析系统的立体图。
图5是106拷贝/微升的单增李斯特菌基因组DNA在手持式POCT流式基因分析系统上扩增过程的典型荧光图像。
图6是图5所示荧光图像对应的扩增曲线
图7是106拷贝/微升的沙门菌基因组DNA、金葡萄球菌基因组DNA和单增李斯特菌基因组DNA在手持式POCT流式基因分析系统上串行扩增的荧光图像。
图8是图7所示荧光图像对应的融解曲线。
其中,1为热梯度微反应器,2为智能手机宽场荧光成像器,3为微流体驱动器、4为电子控制系统,5为充电电池组,6为含绝热底板的避光外壳。
1-1为发热基底,1-2为微通道,1-3为加热元件,1-4为温度传感器,1-5为散热片,1-6为微型涡轮风扇,1-1-1为插孔,1-1-2为圆形通孔,1-1-3为断开部,1-1-4为凸出块,1-1-5为U形沟槽,1-1-6为圆柱区,1-1-7为扁平区,1-1-8为荧光检测区,1-2-1为进样口,1-2-2为出口。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式来对本实用新型做进一步详细的说明。
热梯度微反应器,是应如下需求而设计制造的:(1)通过维持单个加热元件保持一定温度来产生PCR热循环所需的必要各个温度区并同时形成用于空间融解曲线分析的线性温度梯度区间,实现功能的高效集成;(2)消除以往采用独立恒温区设计中各温区之间热绝缘的需求,实现整体热结构的紧凑化和微型化;(3)减少PCR热循环过程中的能源消耗,简化温度控制,以及降低仪器成本。
热梯度微反应器主要包括:发热基底、微通道、加热元件、温度传感器、凸出块、散热片和微型涡轮风扇组成。
发热基底是由导热系数适中并易于加工成型的黄铜材料制作,外部基本尺寸为35mm×10mm×45mm。发热基底包括图1所示的位于左侧的实心柱体段和位于右侧的空心柱体段;空心柱体段的横截面为卧倒的、开口朝向实心柱体段的U形,实心柱体段与U形开口的一端相接且与U形开口的另一端断开;实心柱体段与空心柱体段相连接的部位位于发热基底的上端,实心柱体段与空心柱体段相断开的部位位于发热基底的下端,实心柱体段的左端表面为半圆柱面,空心柱体段的右端表面也为半圆柱面,两半圆柱面的半径相同。实心柱体段的长度大于空心柱体段的长度;实心柱体段的前端与空心柱体段的前端对齐,实心柱体段的后端凸出于空心柱体段的后端。实心柱体段内开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的圆形通孔,直径为4mm,该圆形通孔与半圆柱面同轴。圆形通孔旁的实心柱体段内还开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的插孔,直径为0.5mm,深度为6mm。发热基底的外表面设有呈螺线管式分布的U形沟槽,螺线管的轴线沿着前后方向设置,U形沟槽的尺寸为0.6mm(宽)×0.6mm(深),沿发热基底的圆柱区后端按顺时针方向螺线型延伸发热基底前端。发热基底的断开部分的间距为6mm。
发热基底的空心柱体段的下端固定一凸出块,该凸出块为立方体形,凸出块的上端紧贴空心柱体段,下端紧贴并安装在散热片上。凸出块的尺寸为12mm×42mm,高度为3mm。
微通道为透明聚四氟乙烯(PTFE)毛细管,微通道呈螺线管式缠绕包埋于上述U型沟槽内,其尺寸为内径0.3mm,外径0.5mm,总长为3.5m,其中在圆柱区的圈数为3圈,用作PCR预变性区,在扁平区的圈数为42圈用作PCR扩增区。微通道位于后端的一端为进样口。
加热元件为电加热棒,安装在圆形通孔内;温度传感器为K型热电偶,安装在插孔内。
散热片和微型涡轮风扇共同组成散热装置,微型涡轮风扇的出风口朝向散热片,控制微型涡轮风扇的输出功率,即可控制散热片对发热基底的散热量,进而控制散热基底的温度。
手持式POCT流式基因分析系统,用于现场化的高速核酸扩增、实时定量和产物融解分析等,其主要由热梯度微反应器、智能手机宽场荧光成像器、微流体驱动器、电子控制系统和充电电池组所组成。具体组成方式如下:
热梯度微反应器以散热片和微型涡轮风扇所在的底面为安装面安装于绝热底板上,微型涡轮风扇所在的位置对应的绝热底板上开有通风格栅,散热片的左侧出风口所在的位置对应的避光外壳上开有散热口。在图4所示的视角下,热梯度微反应器的前端安装有微流体驱动器,微流体驱动器的注射器出口与微通道的前端的出口连接。热梯度微反应器的荧光检测区的正上方安装有智能手机宽场荧光成像器,荧光检测区所在的平面与智能手机宽场荧光成像器的底面距离为5cm。与热梯度微反应器的散热片的右侧(即出风口方向反方向)依次安装有电子控制系统和充电电池组,电子控制系统和充电电池组均固定于绝热底板上且与热梯度微反应器和微流体驱动器以印刷电路板进行物理隔离(此处主要是隔热)。热梯度微反应器的荧光检测区与智能手机宽场荧光成像器之间的光路均进行密闭避光处理(即采用遮光卡片挡光)。
在使用手持式POCT流式基因分析系统进行检测时,首先由键盘输入设定的温度值、微流体流速后,电子控制系统中的温度控制单元开启热梯度微反应器中的加热元件和微型涡轮风扇,由温度传感器监控实时温度并反馈给温度控制单元,并由LED显示;待稳定达到设定温度值后,微流体驱动器中的减速步进电机按预先设定程序实现精确取样;同时,开启智能手机宽场荧光成像器,当微流体流至荧光检测区时,智能手机宽场荧光成像器的摄像头进行荧光图像的实时采集,获得的荧光图像显示在智能手机的显示屏进行直接判读分析,或使用USB数据线或者无线网络传输至计算机,计算机通过图像分析软件对图像上的像素点进行分析,产生相应的扩增曲线与融解曲线。
本实施例中,加热元件的设定温度值为94℃,微型涡轮风扇的工作电压设置为3.5V,微流体的驱动线性流速为4mm/s,摄像头的光圈数为f/2.4,焦距为4mm,使用的采集频率为0.1Hz,使用的感光度ISO为1600。
本实施例中的样品为单增李斯特菌基因组DNA、沙门氏菌基因组DNA和金葡萄球菌基因组DNA,PCR反应体系包括1×PCR缓冲液,200μM dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸),0.04ng/μL BSA(小牛血清蛋白),200nM引物对,1×EvaGreenTM荧光染料,0.2unit//μL Taq聚合酶,反应体积为10μL。其中,
单增李斯特菌DNA对应的引物对:上游引物5’-3’CAAGT CCTAAGACGC CAATC,下游引物5’-3’CAAGTCCTAAGACGCCAATC;金葡萄球菌DNA对应的引物对:上游引物5’-3’GGTCCTGAAGCAAGTGCATT,下游引物5’-3’ATACG CTAAG CCACG TCCAT;沙门氏菌DNA对应的引物对:上游引物5’-3’TGCTCAGACATGCCACAGT,下游引物5’-3’TGCTC GTAATTCACC ACCAT TG。
本实施例中计算机使用的图像分析软件为现有的ImageJ,生成扩增曲线和融解曲线的过程如下。
扩增曲线:(1)将采集到的扩增过程中的原始荧光图像按时间顺序对齐成一幅组合图像,同时使每一幅原始图像上的荧光通道都在组合图像上显示出来,如图5所示;(2)分离组合图像的RGB通道,仅保留荧光信息所在的绿色通道;(3)提取该绿色通道图像上垂直于荧光通道方向的宽度为100像素点的灰度值并绘制其灰度曲线;(4)使用浮动坐标提取每一条荧光通道上的最高灰度值Imax和其两侧相邻荧光通道之间区域的最低灰度值Imin,每一条荧光通道上的Imax减去其对应Imin的平均值得到该荧光通道的灰度值I;(5)以荧光通道数为横坐标,以荧光通道的灰度值为纵坐标,并通过一阶Savitzky-Golay平滑窗口平滑数据点后得到扩增曲线,如图6所示;(6)扩增曲线对应的阈值循环数Ct值通过二阶求导法产生。
融解曲线:(1)选择需要分析的荧光图像,如图7所示,分离其图像的RGB通道,仅保留荧光信息所在的绿色通道;(2)去除图像的背景灰度,提取该绿色通道图像上覆盖荧光通道方向的宽度为10像素点的灰度值并绘制其灰度曲线;(3)以像素点为横坐标,以荧光通道的灰度值为纵坐标,并通过一阶Savitzky-Golay平滑窗口平滑数据点后得到基于像素点的融解曲线;(4)根据空间温度分辨率(℃/pixel)将像素点转换为温度点T’,并根据微型涡轮风扇的工作电压得出对应融解起始点的温度T0(涡轮风扇的工作电压与融解起始点温度的对应关系可以通过预先测得空间温度分布表查得),通过T0+T’得到每一个像素点对应的实际温度点,从而得到基于温度的融解曲线,如图8所示。
上述实施例为实用新型较佳的实施方式,但本实用新型的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本实用新型的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本实用新型的保护范围之内。
Claims (10)
1.热梯度微反应器,其特征在于:包括发热基底、微通道、加热元件、温度传感器和供发热基底散热的散热装置;
发热基底包括实心柱体段和空心柱体段;空心柱体段的横截面为开口朝向实心柱体段的U形,实心柱体段与U形开口的一端相接且与U形开口的另一端断开;
微通道呈螺线管式缠绕在发热基底外,螺线管的轴线与发热基底的长度方向一致;
加热元件和温度传感器安装在实心柱体段内。
2.按照权利要求1所述的热梯度微反应器,其特征在于:所述实心柱体段与空心柱体段相连接的部位位于发热基底的上端,实心柱体段与空心柱体段相断开的部位位于发热基底的下端,实心柱体段位于发热基底的左端,空心柱体段位于发热基底的右端;实心柱体段的左端表面为半圆柱面,空心柱体段的右端表面也为半圆柱面,两半圆柱面的半径相同。
3.按照权利要求2所述的热梯度微反应器,其特征在于:所述发热基底的外表面设有呈螺线管式分布的U形沟槽,微通道嵌入U形沟槽中。
4.按照权利要求3所述的热梯度微反应器,其特征在于:所述空心柱体段的下端具有一个凸出块;发热基底通过凸出块安装在散热装置上。
5.按照权利要求4所述的热梯度微反应器,其特征在于:所述散热装置包括散热片和朝向散热片吹风的微型涡轮风扇;凸出块安装在散热片的上端。
6.按照权利要求5所述的热梯度微反应器,其特征在于:所述凸出块为立方体形;凸出块的与发热基底一体成型,凸出块的下端平面紧贴散热片的上端。
7.按照权利要求2所述的热梯度微反应器,其特征在于:所述实心柱体段的长度大于空心柱体段的长度;实心柱体段的前端与空心柱体段的前端对齐,实心柱体段的后端凸出于空心柱体段的后端。
8.按照权利要求1所述的热梯度微反应器,其特征在于:所述实心柱体段内开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的圆形通孔,实心柱体段内还开设沿着实心柱体段的长度方向延伸的插孔;加热元件为电加热棒,安装在圆形通孔内;温度传感器安装在插孔内。
9.按照权利要求1所述的热梯度微反应器,其特征在于:所述微通道为透明毛细管。
10.按照权利要求7所述的热梯度微反应器,其特征在于:所述微通道呈螺线管式缠绕至实心柱体段的后端,微通道位于后端的一端为进样口。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |