CN204439554U - 智能手机宽场荧光成像器 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及智能手机宽场荧光成像器,包括:1.带有摄像头的智能手机,2.出射光可激发荧光的荧光激发光源,3.使得荧光激发光源的出射光垂直转向并且使得被激发的荧光沿荧光的原传播方向穿过的二向色性滤光片,4.光阑,5.发射滤片;摄像头、发射滤片、二向色性滤光片、光阑从上往下依次设置;发射滤片、光阑相互平行,且均与二向色性滤光片成45度角;荧光激发光源的出射光与二向色性滤光片成45度角。本实用新型为无微距镜头设计,具有成本低、结构简单紧凑、体积小巧便携、可应用于便携式设备、检测结果直观可视、充分利用智能手机的优点,属于体外分子诊断技术领域。
Description
技术领域
本实用新型属于体外分子诊断技术领域,特别涉及一种手持式POCT流式基因分析系统中的智能手机宽场荧光成像。
背景技术
POCT(point of care testing)一般称为即时检验,是体外诊断(IVD)的一个细分行业,其凭借便捷、快速的优势,可实现在患者身边快速取得诊断结果,成为近年来快速发展的一个新兴领域。目前正在发展的POCT依据其技术特性主要划分为三代:以快速诊断试纸(如血糖试纸条、早孕试纸条等)为基础的第一代POCT,以卡盒式核酸扩增为基础的第二代POCT,以智能手机的应用为基础的第三代POCT。相比于前两代POCT,第三代POCT由于其具备高灵敏高特异的多参数定量的检测能力和更加集成便携、操作简便、用户友好等诸多潜在优势,已成为体外即时检测领域的最前沿技术。
在第三代POCT基因分析类仪器中,普遍采用基于微流控技术的核酸扩增方法作为核心技术来实现具备上述特征的快速分子诊断。然而,目前发展中的这类POCT基因分析系统包括基于时域聚合酶链式反应(PCR)类的系统和基于等温扩增类的系统,由于其各自技术的固有特点,两类技术均存在着一些制约瓶颈。时域PCR类:其实质相当于传统热循环的微型化,其热循环需要精确重复的升或降温而且热元件(或结构)存在自身热惯性,这些因素通常会导致大量时间和能量的无效消耗、温度控制复杂性、成本的上升、热设计上的笨重。等温扩增类:一方面,其扩增过程无需热循环,其检测的灵敏度、准确性和可定量性极其依赖于扩增过程在时间上的持续,通常只能针对具体样品的反应体系建立与之对应的时间持续标度,缺乏普适性,因而存在实际操作困难;另一方面,扩增产物的可靠检测比较困难,目前其扩增产物主要依赖终点检测(如电泳等),虽然可以通过监测扩增过程中的荧光或溶液浊度等信号的累积来进行定量检测,但却牺牲了其检测的特异性,因为任何非特异性或附生型的产物也能累积上述检测信号,因此这类定量检测存在假阳性风险。作为一种微流控核酸扩增新技术,空域PCR利用“空间交换时间”让样品反应液反复通过两或 三个恒温区来实现PCR所需的热循环,消除了精确反复升降温的需求,避免了热系统自身的热滞,在热循环速度、系统能耗、温度控制和整体尺寸等方面具有显著优势,但目前基于该技术的基因分析装置尚未达到面向POCT应用阶段,主要表现为:(1)集成度不足,仍然依赖笨重的离线设备和资源,如:泵源、温度控制系统、计算机、台式检测器和电源等;(2)功能单一,大多仅具有核酸扩增功能,缺乏关键性的在线分析能力包括实时定量检测和产物鉴别。显然,目前已发展的第三代POCT基因分析类仪器仍存在一些不便和缺陷,亟待加以进一步发展和改进。
为此,需要发明一种手持式POCT流式基因分析系统,克服现有POCT基因分析仪器在分析速度、多元与定量检测、能源消耗、便携性和操作简便等方面的缺陷与不足,使其秉承POCT理念,具有体积小巧便携,操作简便直观,可现场化使用、成本低等优点且具备高速高灵敏高特异性扩增、实时定量检测、多元核酸鉴别和同时多批次样品分析等能力,使之适用于更广泛的应用场合。该手持式POCT流式基因分析系统主要包括热梯度微反应器、智能手机宽场荧光成像器、微流体驱动器、电子控制系统和充电电池组。本实用新型的智能手机宽场荧光成像器即为其中的一部分。
实用新型内容
针对现有技术中存在的技术问题,本实用新型的目的是:提供一种体积小巧的基于第三代POCT理念的智能手机宽场荧光成像器。
为了达到上述目的,本实用新型采用如下技术方案:
智能手机宽场荧光成像器,包括:1.带有摄像头的智能手机,2.出射光可激发荧光的荧光激发光源,3.使得荧光激发光源的出射光垂直转向并且使得被激发的荧光沿荧光的原传播方向穿过的二向色性滤光片,4.光阑,5.发射滤片;摄像头、发射滤片、二向色性滤光片、光阑从上往下依次设置;发射滤片、光阑相互平行,且均与二向色性滤光片成45度角;荧光激发光源的出射光与二向色性滤光片成45度角。采用这种结构后,结构简单,体积小巧,可应用于手持式便携设备。
进一步,荧光激发光源包括沿着光的传播方向依次设置的LED灯、聚光透镜、激发滤片。采用这种结构后,结构简单,操作方便,可发出能够激发荧 光的特定波长的光线。
进一步,LED灯为LED面光源。采用这种结构后,在特定激发面上形成光强足够强、照射面积足够大、光强分布足够均匀的激发光斑,避免分立多个LED组合激发光源(如环形LED阵列光源)而带来的因LED位置、发光效率以及工作状态等差异造成激发光斑光强分布的不均匀与不可控。
进一步,荧光激发光源包括LED灯散热底座;该LED灯散热底座与LED灯的背面相接,LED灯的正面发光。采用这种结构后,可对LED灯及时散热,保证LED灯的发光效率与使用寿命。
进一步,智能手机宽场荧光成像器,还包括一个安装暗盒;发射滤片、二向色性滤光片、激发滤片、聚光透镜均设置在安装暗盒内,摄像头位于安装暗盒的上方,光阑位于安装暗盒的下方。采用这种结构后,安装暗盒能保证荧光激发光源的出射光和被激发的荧光顺利通过,隔离除荧光激发光源的出射光和被激发的荧光外的干扰光线,提高荧光成像的信噪比,保证检测结果的灵敏性和准确度。
进一步,安装暗盒采用遮光材料制作或安装暗盒的内壁设有遮光涂层。采用这种结构后,结构简单,制作方便。
进一步,摄像头位于智能手机的背面,智能手机的正面设有显示摄像头拍摄的荧光图像的显示屏。采用这种结构后,使得检测结果直观可视,充分利用智能手机。
进一步,控制经反射的荧光激发光源的出射光的横截面形状的光阑上设有若干通孔。采用这种结构后,有效检测区的位置、面积、形状通过安装在其近表面的光阑来调节,以适应不同的检测需求。
进一步,二向色性滤光片从右上方向左下方倾斜,荧光激发光源位于二向色性滤光片的右侧。采用这种结构后,结构简单紧凑。
本实用新型的原理是:
智能手机宽场荧光成像器安装于热梯度微反应器的上表面正上方,用于对上表面微通道荧光图像的实时采集与监测,通过对荧光信号的时域强度和空域强度的分析可产生实时扩增曲线和高分辨融解曲线。
具有高亮度的LED灯发射的激发光通过聚光透镜收集并射向激发滤片滤 波,并通过与激发滤片成45度夹角的二向色性滤光片的反射,形成与初射方向垂直的激发光,该激发光再通过光阑照射微通道内的反应液,反应液中的荧光染料激发荧光,荧光沿着直线依次通过光阑、二向色性滤光镜、发射滤片,收集到智能手机的摄像头的传感器中,从而产生微通道的实时的荧光图像。
采集到的实时荧光图像既可以显示在智能手机的显示屏上进行直接判读和分析,也可以存储在智能手机的内建存储单元中通过USB线缆传输至安装有图像分析软件的服务器电脑上进行分析处理,还可以通过无线信号(WiFi、3G、4G)实时传输到相应的网络服务器上进行远程的在线分析。
总的说来,本实用新型具有如下优点:结构简单、体积小巧、可应用于便携式设备、检测结果直观可视、充分利用智能手机。
附图说明
图1是智能手机宽场荧光成像器的拆分图。
图2是智能手机宽场荧光成像器的主视图。
图3是手持式POCT流式基因分析系统的立体图。
图4是106拷贝/微升的单增李斯特菌基因组DNA在手持式POCT流式基因分析系统上扩增过程的典型荧光图像。
图5是图4所示荧光图像对应的扩增曲线。
图6是106拷贝/微升的沙门菌基因组DNA、金葡萄球菌基因组DNA和单增李斯特菌基因组DNA在手持式POCT流式基因分析系统上串行扩增的荧光图像。
图7是图6所示荧光图像对应的融解曲线。
其中,其中,1为热梯度微反应器,2为智能手机宽场荧光成像器,3为微流体驱动器,4为电子控制系统,5为充电电池组,6为含绝热底板的避光外壳,2-1为智能手机,2-2为显示屏,2-3为摄像头,2-4为发射滤片,2-5为二向色性滤光片,2-6为激发滤片,2-7为LED灯,2-8为聚光透镜,2-9为光阑,2-10为LED灯散热底座,2-11为安装暗盒。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式来对本实用新型做进一步详细的说明。
智能手机宽场荧光成像器是应如下需求而设计制造的:(1)通过单个高亮 LED灯在特定激发面上形成光强足够强、照射面积足够大、光强分布足够均匀的激发光斑,避免分立多个LED组合激发光源(如环形LED阵列光源)而导致的因LED位置、发光效率以及工作状态等差异造成激发光斑光强分布的不均匀与不可控;(2)采用激发发射同轴光路设计,避免斜射等而引起激发光斑的光场分布不均以及必需的矫正消除处理;(3)利用智能手机内建高度集成的图像传感器、摄像头、显示屏以及其他必要的计算、存储、传输单元,消除了目前普遍采用的荧光宽场成像方案对CCD、显微镜或微距镜头、计算机等分立大型设备的需求。
智能手机宽场荧光成像器主要包括:智能手机、显示屏、摄像头、发射滤片、二向色性滤光片、激发滤片、LED灯、聚光透镜、光阑、LED灯散热底座、安装暗盒。
显示屏和摄像头为智能手机的内建功能单元。本实施例中的智能手机为小米手机(型号Mione,北京小米科技有限责任公司),其摄像头的参数为:8百万像素、光圈数为f/2.4。本实施例中的发射滤片、二向色性滤光片、激发滤片等为商业化荧光滤片组(型号AF002,沈阳汇博光学技术有限公司)。本实施例中的LED灯为高亮蓝光LED面光源(型号XRE-B4,美国科锐),发射中心波长为475nm。本实施中的聚光透镜型号为45℃REE专配透镜,光阑通孔为25mm×42mm。
如图2所示,智能手机的摄像头、发射滤片、二向色性滤光片、光阑从上往下依次设置;其中发射滤片、光阑相互平行,且均与二向色性滤光片成45度角;二向色性滤光片从右上方向左下方倾斜,荧光激发光源位于二向色性滤光片的右侧,即二向色性滤光片的右方依次是:激发滤片、聚光透镜、LED灯,LED灯散热底座。荧光激发光源的出射光与二向色性滤光片成45度角。智能手机的摄像头朝下,显示屏朝上。发射滤片、二向色性滤光片、激发滤片、聚光透镜均设置在安装暗盒内,摄像头位于安装暗盒的上方,光阑位于安装暗盒的下方,LED灯和LED灯散热底座位于安装暗盒的右方。安装暗盒的内壁设有遮光涂层。光阑上设有若干特定形状的通孔,有效检测区的位置、面积、形状通过安装在其近表面的光阑来调节,以适应不同的检测需求。
高亮LED灯发出的光线经过聚光透镜的收集射向激发滤片,滤成能够激 发荧光的特定波长的光线,该光线经过与激发滤片成45度角的二向色性滤光片的反射后形成与从入射方向垂直的反射光线,该反射光线穿过特定形状通孔的光阑后,照射到热梯度微反应器的荧光检测区,以激发该区域内的微通道中荧光染料发射荧光,发射的荧光依次通过光阑、二向色性滤光镜,并经过发射滤片过滤后被摄像头接收,产生对应的荧光图像。摄像头连续拍照记录荧光检测区的荧光图像,并将采集到的图像信息实时显示在显示屏,或通过智能手机内建的无线传输功能模块(如WiFi、3G或4G数据网络、蓝牙等)将图像信息传送到安装有图像分析软件的服务器上进行快速分析处理,或存储在智能手机内部的存储单元中并通过USB数据线传送到上述服务器上处理,上述处理的效果为直接分析判读或生成扩增曲线与融解曲线。
手持式POCT流式基因分析系统,用于现场化的高速核酸扩增、实时定量和产物融解分析等,其主要由热梯度微反应器、智能手机宽场荧光成像器、微流体驱动器、电子控制系统和充电电池组所组成。具体组成方式如下:
热梯度微反应器以散热片和微型涡轮风扇所在的底面为安装面安装于绝热底板上,微型涡轮风扇所在的位置对应的绝热底板上开有通风格栅,散热片的左侧出风口所在的位置对应的避光外壳上开有散热口。在图3所示的视角下,热梯度微反应器的前端安装有微流体驱动器,微流体驱动器的注射器出口与微通道的前端的出口连接。热梯度微反应器的荧光检测区的正上方安装有智能手机宽场荧光成像器,荧光检测区所在的平面与智能手机宽场荧光成像器的底面距离为5cm。与热梯度微反应器的散热片的右侧(即出风口方向反方向)依次安装有电子控制系统和充电电池组,电子控制系统和充电电池组均固定于绝热底板上且与热梯度微反应器和微流体驱动器以印刷电路板进行物理隔离(此处主要是隔热)。热梯度微反应器的荧光检测区与智能手机宽场荧光成像器之间的光路均进行密闭避光处理(即采用遮光卡片挡光)。
在使用手持式POCT流式基因分析系统进行检测时,首先由键盘输入设定的温度值、微流体流速后,电子控制系统中的温度控制单元开启热梯度微反应器中的加热元件和微型涡轮风扇,由温度传感器监控实时温度并反馈给温度控制单元,并由LED显示;待稳定达到设定温度值后,微流体驱动器中的减速步进电机按预先设定程序实现精确取样;同时,开启智能手机宽场荧光成像器, 当微流体流至荧光检测区时,智能手机宽场荧光成像器的摄像头进行荧光图像的实时采集,获得的荧光图像显示在智能手机的显示屏进行直接判读分析,或使用USB数据线或者无线网络传输至计算机,计算机通过图像分析软件对图像上的像素点进行分析,产生相应的扩增曲线与融解曲线。
本实施例中,加热元件的设定温度值为94℃,微型涡轮风扇的工作电压设置为3.5V,微流体的驱动线性流速为4mm/s,摄像头的光圈数为f/2.4,焦距为4mm,使用的采集频率为0.1Hz,使用的感光度ISO为1600。
本实施例中的样品为单增李斯特菌基因组DNA、沙门氏菌基因组DNA和金葡萄球菌基因组DNA,PCR反应体系包括1×PCR缓冲液,200μM dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸),0.04ng/μL BSA(小牛血清蛋白),200nM引物对,1×EvaGreenTM荧光染料,0.2unit//μL Taq聚合酶,反应体积为10μL。其中,单增李斯特菌DNA对应的引物对:上游引物5’-3’CAAGT CCTAA GACGCCAATC,下游引物5’-3’CAAGTCCTAAGACGCCAATC;金葡萄球菌DNA对应的引物对:上游引物5’-3’GGTCCTGAAGCAAGTGCATT,下游引物5’-3’ATACG CTAAG CCACG TCCAT;沙门氏菌DNA对应的引物对:上游引物5’-3’TGCTCAGACATGCCACAGT,下游引物5’-3’TGCTC GTAAT TCACC ACCAT TG。
本实施例中计算机使用的图像分析软件为现有的ImageJ,生成扩增曲线和融解曲线的过程如下。
扩增曲线:(1)将采集到的扩增过程中的原始荧光图像按时间顺序对齐成一幅组合图像,同时使每一幅原始图像上的荧光通道都在组合图像上显示出来,如图4所示;(2)分离组合图像的RGB通道,仅保留荧光信息所在的绿色通道;(3)提取该绿色通道图像上垂直于荧光通道方向的宽度为100像素点的灰度值并绘制其灰度曲线;(4)使用浮动坐标提取每一条荧光通道上的最高灰度值Imax和其两侧相邻荧光通道之间区域的最低灰度值Imin,每一条荧光通道上的Imax减去其对应Imin的平均值得到该荧光通道的灰度值I;(5)以荧光通道数为横坐标,以荧光通道的灰度值为纵坐标,并通过一阶Savitzky-Golay平滑窗口平滑数据点后得到扩增曲线,如图5所示;(6)扩增曲线对应的阈值循环数Ct值通过二阶求导法产生。
融解曲线:(1)选择需要分析的荧光图像,如图6所示,分离其图像的RGB通道,仅保留荧光信息所在的绿色通道;(2)去除图像的背景灰度,提取该绿色通道图像上覆盖荧光通道方向的宽度为10像素点的灰度值并绘制其灰度曲线;(3)以像素点为横坐标,以荧光通道的灰度值为纵坐标,并通过一阶Savitzky-Golay平滑窗口平滑数据点后得到基于像素点的融解曲线;(4)根据空间温度分辨率(℃/pixel)将像素点转换为温度点T’,并根据微型涡轮风扇的工作电压得出对应融解起始点的温度T0(涡轮风扇的工作电压与融解起始点温度的对应关系可以通过预先测得空间温度分布表查得),通过T0+T’得到每一个像素点对应的实际温度点,从而得到基于温度的融解曲线,如图7所示。
上述实施例为实用新型较佳的实施方式,但本实用新型的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本实用新型的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本实用新型的保护范围之内。
Claims (9)
1.智能手机宽场荧光成像器,其特征在于:包括:
-带有摄像头的智能手机,
-出射光可激发荧光的荧光激发光源,
-使得荧光激发光源的出射光垂直转向并且使得被激发的荧光沿荧光的原传播方向穿过的二向色性滤光片,
-光阑,
-发射滤片;
摄像头、发射滤片、二向色性滤光片、光阑从上往下依次设置;发射滤片、光阑相互平行,且均与二向色性滤光片成45度角;荧光激发光源的出射光与二向色性滤光片成45度角。
2.按照权利要求1所述的智能手机宽场荧光成像器,其特征在于:所述荧光激发光源包括沿着光的传播方向依次设置的LED灯、聚光透镜、激发滤片。
3.按照权利要求2所述的智能手机宽场荧光成像器,其特征在于:所述LED灯为LED面光源。
4.按照权利要求2所述的智能手机宽场荧光成像器,其特征在于:所述荧光激发光源包括LED灯散热底座;该LED灯散热底座与LED灯的背面相接,LED灯的正面发光。
5.按照权利要求2所述的智能手机宽场荧光成像器,其特征在于:它还包括一个安装暗盒;发射滤片、二向色性滤光片、激发滤片、聚光透镜均设置在安装暗盒内,摄像头位于安装暗盒的上方,光阑位于安装暗盒的下方。
6.按照权利要求5所述的智能手机宽场荧光成像器,其特征在于:所述安装暗盒采用遮光材料或安装暗盒的内壁设有遮光涂层。
7.按照权利要求1所述的智能手机宽场荧光成像器,其特征在于:所述摄像头位于智能手机的背面,智能手机的正面设有显示摄像头拍摄的荧光图像的显示屏。
8.按照权利要求1所述的智能手机宽场荧光成像器,其特征在于:控制经反射的荧光激发光源的出射光的横截面形状的光阑上设有若干通孔。
9.按照权利要求1所述的智能手机宽场荧光成像器,其特征在于:所述二向色性滤光片从右上方向左下方倾斜,荧光激发光源位于二向色性滤光片的右侧。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |