CN102618439A - 基于封闭反应器的dna片段扩增和定量检测系统 - Google Patents
基于封闭反应器的dna片段扩增和定量检测系统 Download PDFInfo
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Abstract
基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,属于分子生物学检测系统技术领域。它包括扩增单元,扩增单元内配合设置一组封闭反应器,封闭反应器一侧配合设置激发光装置和荧光检测装置,扩增单元底部配合设置给封闭反应器提供动力的传动装置,传动装置与电机连接,扩增单元内配合设置两个或两个以上独立不同温度的定温恒温区域。本发明通过上述技术,实现提高试剂样品的热响应,加快聚合酶链反应过程,大幅缩短实验时间;减少DNA酶的降解,提高样本扩增灵敏度、准确性、再现性,扩展试剂检测线性范围;减少实验中的污染风险;缩短光程,提高光学检测的灵敏度和低背景;实现低成本的多样品多通道检测需要。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域,具体涉及一种广泛应用于医院临床、检验防疫、科研教学、农林生化、刑侦等领域的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统。
背景技术
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),简称PCR技术,是一种体外扩增特异DNA片段的技术,其工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。这一过程的不断重复,可以使得DNA的合成量呈现指数增长,短时间内可达数百万倍。
聚合酶链反应装置(又称PCR仪、基因扩增仪、聚合酶链反应分析仪)是利用聚合酶链反应原理,使反应物在指定的变性温度、复性温度和延伸温度之间自动循环的仪器。 目前主流聚合酶链反应装置包括自上而下依次装配的可插放若干试管的变温金属模块,半导体制冷器,散热器件和风机。采用半导体制冷器控温,是为了使变温金属模块的温度按程序升温和降温,从而使放置于金属模块试管内的反应物按聚合酶链反应所需温度循环变化。
Real-time PCR(又称实时荧光定量PCR检测系统、核酸扩增实时定量检测系统)是在聚合酶链反应基础上增加荧光检测和分析功能的装置。此技术采用对DNA片段进行荧光标记的方法,跟踪显示DNA片段数量及其变化过程,并与已知DNA片段标准品对比,依据荧光信号变化特性可以迅速确定未知样品原始DNA片段的数量。从而为诊断疾病或分子生物学研究提供准确、定量的参考。
Real-time PCR通过使用不同波长的激发光照射试管,当试管中的试剂被激发出荧光时,光学传感器(PMT、PD、CCD等)采集到荧光强度信号并及时传送到计算机进行实时数据显示和分析。
目前主流Real-time PCR的工作模式有:
(a)顶部检测模式 大多数系统都采用此模式,其特征是:变温金属模块底部是封闭的,激发光源都位于模块上方,光学检测器件也位于模块上方,一般通过透镜聚焦或以扫描方式采集数据。此模式下,可以使用通用的半导体制冷器、散热器。但缺点是:由于塑料试管上侧环境温度偏冷,常有蒸发和结露水汽停留和滴落,造成荧光信号突变和检测重复性变差。同时从顶部检测时,距离较远,造成激发光变弱和信号变弱。
(b)底部检测模式 此模式国内有多家企业采用。其特征是:变温金属模块底部是带有小孔,采用LED光源,利用光纤或二向分色镜传递到试管底部,同时将试剂荧光向下经滤光片等光学零件直接或用光纤传导到光学传感器进行检测。此模式下,孔中基本没有积灰问题,试管液体蒸发对检测几乎没有影响,但也会造成荧光信号中含有强烈的激发光背景成份,会造成多波长试剂检测时串扰(cross-talk)无法准确修正。另外,光学元件传导路径较长,中间损耗极大,使得光传感器利用效率较低,并导致背景和噪声较大。
(c)侧面检测模式 个别系统采用此模式,其特征是:变温金属模块底部是封闭的,激发光源从顶部入射或与荧光信号共用光纤,荧光信号通过模块孔侧面引出的光纤导光束来传导。此模式下,塑料试管的影响可以降低,但光纤位于模块侧壁易被残留物污染、磨损、断裂,且难以清洁,使用受限且寿命缩短。此模式下信号相对较弱,系统稳定性差。并且光纤埋设和维修十分困难。
目前Real-time PCR反应所用的耗材,其基本特征是一种带锥底和盖的塑料PP试管,标称为0.2ml。由于材料和形状结构的限制,其热传导较差,液体达到所需温度的平衡时间较长;并且其所作为载放的工作介质模块通常为金属材料,温度均匀性和升降温速率的要求成为一对矛盾。Real-time PCR通常选用半导体制冷器件(帕尔贴器件)作为温度控制的主要元件,工作时需要变换目标温度,其升降温变化过程时间约占总实验时间的30-75%。
由于扩增实验总时间需要1-2小时,因反应体系中的DNA聚合酶具有高温下快速降解的特性,使得传统PCR实验对于低浓度DNA片段(10-2拷贝数以下)的实验效果不佳,其Ct值检测变异系数通常为CV=1.5以上,在临床上对于早期疾病诊断存在不利影响。客观上,耗材的因素已影响到PCR技术在临床和科研上的进一步发展。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题,本发明的目的在于提供一种环保、操作方便、检测灵敏度高的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统。
所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于包括扩增单元,所述的扩增单元内配合设置一组封闭反应器,所述的封闭反应器一侧配合设置激发光装置和荧光检测装置,所述的扩增单元底部配合设置给封闭反应器提供动力的传动装置,所述的传动装置与电机连接,所述的扩增单元内配合设置两个或两个以上独立不同温度的定温恒温区域。
所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的封闭反应器为一次性耗材反应器,包括透明导热管及分别配合设置在透明导热管两端的试剂进样口和定量取样按钮,所述的试剂进样口与蠕动气囊连接,试剂进样口、透明导热管、定量取样按钮与蠕动气囊为密封体,构成封闭反应器,试剂进样口内用于吸取放置待测样品,所述的定量取样按钮上配合设有气囊,所述的蠕动气囊上带有防试剂进样口松脱的维持机构。
所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的扩增单元配合设置两个或两个以上不同温度的定温恒温控制区域。以四个区域为例,分别为定温恒温控制区域Ⅰ、定温恒温控制区域Ⅱ、定温恒温控制区域Ⅲ和定温恒温控制区域Ⅳ。
所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的激发光装置包括依次设置的光源、滤光片及透镜。
所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的荧光检测装置包括依次设置的滤光片、透镜或光学收集器、检测传感器及滤波器。
所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的透明导热管为薄壁毛细管状结构,为薄壁透明导热柔性弯管或薄壁透明导热直管。
所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的定温恒温区域内设有工作介质,所述的工作介质为金属、导热流体、液体或空气中的任意一种,每个定温恒温区域的工作介质由加热膜、加热丝或半导体制冷器进行控温。
所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的扩增单元为长方体形结构或圆锥形转台形结构,其外围配合设置用于区域温度隔离的隔热材料。
所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的定温恒温区域内配合设置由电机驱动的往复式蠕动,通过蠕动使透明导热管内的待测样品得到充分混匀和反应。蠕动频率和幅度应保证不引起DNA链的脱落。
所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的激发光装置和荧光检测装置配合设置透明导热管一侧,并紧贴的透明导热管,激发光装置光路和荧光检测装置的光路之间形成30°-150°的夹角。
通过采用上述技术,与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
1)本发明的封闭反应器,是一次性使用的耗材,无需使用昂贵的移液枪和TIP头耗材,而且为封闭式,有效实现了试样的吸取、封闭和受控移动,直至整体封闭废弃,完全避免了移液枪反复使用造成的潜在污染风险,而且使用方便,提高了检测的准确性;
2)本发明的封闭反应器的中部采用光学透明的可弯曲柔性导热塑胶高分子材料管,以便留出荧光检测所需的窗口,通常制作成毛细管状,采用薄壁结构,以增大样品与外部温度环境的热接触面积,缩短热平衡时间,完全无需使用热盖,大大简化了DNA片段扩增装置的设计,消除了反应过程中蒸汽冷凝所造成的荧光信号波动;
3)本发明的封闭反应器的头部是较硬的进样口,其材料可以为金属针头、导热塑胶或导热玻璃材料,当刺破、插入一次性使用的蠕动气囊时,构成一个完整的封闭反应器,蠕动气囊上带有防进样口松脱的维持机构,提高整个反应器的稳定性和密封性;
4)本发明的扩增单元中设立两个或两个以上独立的定温恒温控制区域,当取样器采取紧贴接触措施后,大大增加了有效热接触面积和热传导效率,同时封闭反应器透明管既细又长,热负载小,试剂样品的热滞后效应也大大减小,可满足PCR扩增所需的温度循环反应条件,避免了通常情况下模块变温的升降温过程,能有效加快反应过程,大大节省实验时间,提高了检测分析效率;
5)本发明在定温恒温控制区域采用由电机驱动的往复式蠕动搅拌装置,使得试样在同一温度区域内来回移动,使得试样得到充分混匀,也能进一步克服了温度场不均匀问题。
6)本发明在DNA片段扩增装置基础上可形成定量检测系统,在所需恒温区域设有激发光装置和荧光检测装置,利用封闭反应器的透明窗口进行高效荧光激发和荧光接收,由于光学装置能最大程度接近样品,其过程损耗最小,激发的能量利用率大大提高并且荧光接收的信号强度损失降到最低,实现高灵敏度检测,有利于低浓度检测,激发光装置和荧光检测装置在空间上形成一定法线夹角,通常取30°-150°时可以有效降低信号中的光源背景,从而获得一般系统中无法得到的强信号和低背景;
7)本发明的扩增单元内温度分区恒定控制,只需通过挤压封闭反应器的蠕动气囊,通过推动试样移动实现变温,完全消除了变温金属模块升降温所需的时间,实验过程总时间缩短至少30min以上,有利于保持DNA酶的活性,使得低浓度样品的检测更为准确可靠,检测灵敏度提高;同时大大提高了工作效率和仪器可利用率,由于温度系统恒定,大大提高了实验的可再现性,而且对于常用的PCR试剂所需的常用工作温度是55、72、95℃附近,都在室温以上,无需使用半导体制冷器,从而降低了控制电路的成本,降低了系统电源功率,使得系统应用更为可靠;
8)本发明实现了近距离光学检测,最大程度提高了激发光强度,也使得最大程度获得有效的荧光信号成为可能,由于试样是在毛细管中推进,流过检测器的波形接近梯形,其平稳的信号顶部有利于数据采集和处理;同时样本的体积差异对检测的影响也大大降低。
9)利用本发明的原理和装置平台,可以方便地实现多通道试剂的并行PCR反应和多波长荧光检测,并且稍加变化,可以实现试剂熔解度检测。
附图说明
图1为本发明的结构示意图;
图2为本发明的另一实施例结构示意图;
图3为本发明的封闭反应器的结构示意图;
图4为本发明的封闭反应器另一实施例的结构示意图;
图5为基于本发明封闭反应器的Real-time PCR仪的激发装置与荧光检测装置结构示意图;
图6为本发明图5的俯视图结构示意图。
图中:1-封闭反应器,101-定量取样按钮,102-透明导热管,103-试剂进样口,104-蠕动气囊,2-扩增单元,3-定温恒温控制区域Ⅰ,4-定温恒温控制区域Ⅱ,5-定温恒温控制区域Ⅲ,6-定温恒温控制区域Ⅳ,7-电机,8-传动装置,9-待测样品,10-激发光装置,11-荧光检测装置,12-圆锥形转台。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明,但本发明的保护范围并不仅限于此。
如图1-6所示,基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,包括箱形结构或圆锥形转台形结构的扩增单元2,所述的扩增单元2内配合设置一组封闭反应器1,所述的封闭反应器1一侧配合设置激发光装置10和荧光检测装置11,所述的扩增单元2底部配合设置给封闭反应器1提供动力的传动装置8与电机7连接,所述的扩增单元2内配合设置两个或两个以上独立不同温度的定温恒温区域,本发明的实施例中扩增单元2配合设置四个不同温度的定温恒温控制区域,分别为定温恒温控制区域Ⅰ3、定温恒温控制区域Ⅱ4、定温恒温控制区域Ⅲ5和定温恒温控制区域Ⅳ6,每个区域的温度不同,每个定温恒温区域内设有工作介质,工作介质为金属、导热流体、液体或空气或其他类似的物质,每个定温恒温区域的工作介质由加热膜、加热丝或半导体制冷器进行控温,本发明为了使透明导热管102内的待测样品9得到充分混匀和反应,在定温恒温区域上配合设置由电机驱动的往复式蠕动装置。
图2所示是一种更实用的多样品检测的拓扑形式的截面图,采用了圆锥形转台12结构。封闭反应器1置放于圆锥形转台12的台表面凹槽中,可按放射状排列,形成多样品同时实验,实际系统还带有外圈的保温和夹持机构,区域隔离的保温腔用于保温,上下分层的多个恒温区域及由电机7上下挤压协助试剂样品完成PCR扩增过程,而电机7带动的旋转更方便于光学检测,检测时激发光装置10和荧光检测装置11可以不动,直接通过旋转圆锥形转台12,依次检测每个封闭反应器和不同区域的待测样品9,而且这样的结构可以使待测样品9得到一定程度的可程序控制的离心式抛甩和搅拌作用,充分保证样品中的PCR扩增高效率反应。
如图3和图4所示,封闭反应器1为一次性耗材反应器,包括透明导热管102及分别配合设置在透明导热管102两端的试剂进样口103和定量取样按钮101,所述的试剂进样口103与蠕动气囊104连接,试剂进样口103、透明导热管102、定量取样按钮101与蠕动气囊104为密封体,构成封闭反应器,试剂进样口103内用于放置待测样品9,所述的定量取样按钮101上配合设有气囊,所述的蠕动气囊104上带有防试剂进样口103拔出的维持机构,所述的透明导热管102为薄壁毛细管状结构,为薄壁透明导热柔性弯管(见图4)或薄壁透明导热直管(见图3)。
如图5和图6所示,所述的激发光装置10包括依次设置的光源、滤光片及透镜,荧光检测装置11包括依次设置的滤光片、透镜或光学收集器、检测传感器及滤波器,激发光装置10和荧光检测装置11配合设置在透明导热管102周围,并紧贴的透明导热管102,激发光装置10光路和荧光检测装置11的光路之间形成30°-150°的夹角。
如图1-6所示,本发明的使用过程为:
1)捏带气囊的定量取样按钮101,将待测样品9从试剂进样口103吸入,提取待测样品9后,迅速将试剂进样口103刺穿连通蠕动气囊104组成封闭反应器1,待测,实验完成后,封闭反应1器作为一次性使用的耗材可以整体取出废弃,其一直保持封闭状态,不影响后续实验;
2)扩增单元的使用,将扩增单元2的定温恒温控制区域Ⅰ3、定温恒温控制区域Ⅱ4、定温恒温控制区域Ⅲ5和定温恒温控制区域Ⅳ6加热至设置温度,再将步骤1)中的封闭反应器1置入扩增单元2内,通过适当的夹紧装置与每个恒温区域保持良好的热接触,封闭反应器1的蠕动气囊104与传动装置8触接,根据实际需要,使待测样品9进入指定的定温恒温控制区域,开启电机7,控制传动装置8的力度,挤压蠕动气囊104,使待测样品9上移,当移至指定位置中,关闭电机7,由于定温恒温控制区域的温度是稳定的,所以待测样品9进入该区域后,不需要加热很长时间,即可进行测量,缩短了实验的时间,开启激发光装置10和荧光检测装置11,通过封闭反应器1的透明导热管102的透明窗口进行检测。通过电机7及其传动装置8同步给多个蠕动气囊104施加压力,按所需程序调控,使得所有样本在同等反应环境和过程下完成聚合酶链反应扩增实验,保证实验结果的可对比性和可靠性。
本发明通过温度分区恒定控制,只需通过试样移动实现变温,完全消除了变温金属模块升降温所需的时间,实验总时间缩短至少30min以上,有利于保持DNA酶的活性,使得低浓度样品的检测更为准确可靠,检测灵敏度提高;同时大大提高了工作效率和仪器可利用率。由于温度系统恒定,大大提高了实验的可再现性。对于常用的PCR试剂所需的常用工作温度是55℃、72℃、95℃附近,都在室温以上,无需使用半导体制冷器,从而降低了控制电路的成本,降低了系统电源功率,使得系统应用更为可靠。
如图3的直形的透明导热管102,可以一排间隔放在扩增单元2内,由设置在透明导热管102一侧的激发光装置10和荧光检测装置11进行测量,激发光装置10和荧光检测装置11可以移动,根据需要移至需要测量的待测样品9所在的区域;如图4明导热管102为薄壁透明导热柔性弯管,它可以是单圈或多圈盘旋方式或直通方式布置于定温恒温区域内,通过挤压蠕动气囊104,使得封闭反应器1中的待测样品9因气压差产生移动,在程序控制下完成样品在不同恒温区内的移动和检测。以上装置,可以包含一个或一个以上恒温区域,一个或一个以上封闭反应器1(样本),一个或一个以上光学检测通道,并且可以是组合或拓扑形式,也可以是简化形式。
图5和图6所示的激发光装置10和荧光检测装置11,紧贴封闭反应器1的透明导热直管或透明导热柔性弯管,两者的光路在空间上形成一定法线夹角,通常取30°-150°时可以有效降低信号中的光源背景,从而获得一般系统中无法得到的强信号和低背景,光学装置中集成必要的特定光源选择、特定滤光片选择、特定透镜选择,并具有传导、聚焦、准直、消反等功能,并能根据需要配置成可移动扫描或摄像的工作模式,实现了近距离光学检测,最大程度提高了激发光强度,也使得最大程度获得有效的荧光信号成为可能。由于试样是在毛细管中推进,流过检测器的波形接近梯形,其平稳的信号顶部有利于数据采集和处理;同时样本的体积差异对检测的影响也大大降低。
本发明通过上述技术,实现提高试剂样品的热响应,加快聚合酶链反应过程,大幅缩短实验时间;减少DNA酶的降解,提高样本扩增灵敏度、准确性、再现性,扩展试剂检测线性范围;减少实验中的污染风险;缩短光程,提高光学检测的灵敏度和低背景;实现低成本的多样品多通道检测需要。因此,利用本发明的原理和装置平台,可以方便地实现多通道试剂的并行PCR反应和多波长荧光检测,并且稍加变化,可以实现试剂熔解度检测。
Claims (10)
1.基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于包括扩增单元(2),所述的扩增单元(2)内配合设置一组封闭反应器(1),所述的封闭反应器(1)一侧配合设置激发光装置(10)和荧光检测装置(11),所述的扩增单元(2)底部配合设置给封闭反应器(1)提供动力的传动装置(8)与电机(7)连接,所述的扩增单元(2)内配合设置两个或两个以上独立不同温度的定温恒温区域。
2.根据权利要求1所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的封闭反应器(1)为一次性耗材反应器,包括透明导热管(102)及分别配合设置在透明导热管(102)两端的试剂进样口(103)和定量取样按钮(101),所述的试剂进样口(103)与蠕动气囊(104)连接,试剂进样口(103)、透明导热管(102)、定量取样按钮(101)与蠕动气囊(104)为密封体,构成封闭反应器,试剂进样口(103)内用于吸取放置待测样品(9),所述的定量取样按钮(101)上配合设有气囊,所述的蠕动气囊(104)上带有防试剂进样口(103)拔出的维持机构。
3.根据权利要求1所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的扩增单元(2)配合设置两个或两个以上不同温度的定温恒温控制区域。
4.根据权利要求1所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的激发光装置(10)包括依次设置的光源、滤光片及透镜。
5.根据权利要求1所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的荧光检测装置(11)包括依次设置的滤光片、透镜或光学收集器、检测传感器及滤波器。
6.根据权利要求1所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的透明导热管(102)为薄壁毛细管状结构,为薄壁透明导热柔性弯管或薄壁透明导热直管。
7.根据权利要求1所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的定温恒温区域内设有工作介质,所述的保温介质为金属、导热流体、液体或空气中的任意一种,每个定温恒温区域的工作介质由加热膜、加热丝或半导体制冷器进行控温,每个定温恒温区域之间采用隔热材料隔离或通过空气间隙实现隔离。
8.根据权利要求1所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的扩增单元(2)为长方体形结构或圆锥形转台形结构,其外围配合设置恒温腔。
9.根据权利要求1所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的定温恒温区域配合设置由电机驱动的往复式蠕动装置,通过震动使透明导热管(102)内的待测样品(9)得到充分混匀和反应。
10.根据权利要求2所述的基于封闭反应器的DNA片段扩增和定量检测系统,其特征在于所述的激发光装置(10)和荧光检测装置(11)配合设置透明导热管(102)一侧,并紧贴的透明导热管(102),激发光装置(10)光路和荧光检测装置(11)的光路之间形成30°-150°的夹角。
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