TWI638049B - 兩階段操作核酸反應檢測管 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種兩階段操作之核酸反應檢測管，檢測管包含可容納液體之容置空間以及擺放試紙之檢測空間，可免於進行試劑或液體移轉，直接進行核酸放大反應，反應結果則可透過觀察置放於檢測空間之試紙得知。

Description

兩階段操作核酸反應檢測管

本發明與生物學領域有關，特別是關於一種免移轉液體之先後進行核酸聚合酶連鎖反應及檢測核酸反應結果之二階段操作檢測管。

聚合酶鎖鏈反應(Polymerase Chain Reaction, 以下簡稱PCR)為一種快速放大DNA訊號的技術，其原理及主要操作步驟為(a)變性(denature): 利用高溫（90~95℃）將雙股DNA解離成單股DNA，再以單股DNA 作為複製的模板；(b)引子黏合(primer annealing): 溫度降低到適當溫度時，引子會黏附到正確的目標基因位置；(c)引子延長(primer extension): 反應溫度調整到72℃，並利用鎂離子作為酵素輔因子，使得DNA聚合酶依照模板上的核苷酸組合將脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate, 以下簡稱dNTPs）逐次黏附於引子之後，進而合成另一股新DNA 片段。透過此三個步驟不斷重複之升降溫變化進行目的核酸訊號放大，每重複一次三個步驟的操作，目的核酸的數目就可擴增一倍，若設定三個步驟操作共進行40次循環，目的核酸的數量就可以放大近109倍，目的核酸的訊號也隨之放大，因此PCR技術為目前臨床診斷大量使用來作為分子診斷的技術，可應用於包含遺傳疾病診斷、病原菌診斷、腫瘤癌症之診斷預後評估等。由PCR技術衍生而來的RT-PCR也具有相類似之應用原理，因此同樣作為目前被臨床診斷大量運用之技術。

目前常被使用來進行PCR或RT-PCR反應的裝置多以耐熱塑料作為置放反應試劑之試管，透過溫控金屬對試管進行反覆升溫降溫之操作，以達到三個步驟之反應溫度，來達成目的核酸訊號放大的效果。以現行系統而言，因為利用溫控金屬作為反應系統，其反應體積較大，使得整個溫控系統必須具有較大的體積及熱容比；又依目前實務上之操作，一般試驗所需的循環次數約為30-35次左右，所需反應時間約介於二至三個小時間，其中多數時間用於等待溫控金屬之升降溫，因此反應時間較難縮減。

再者，前述PCR或RT-PCR通常利用膠體電泳(gel electrophoresis)方式來確認目標基因的訊號是否有被成功放大，因此在完成PCR或RT-PCR後，尚須將含目標基因放大訊號的產物(以下簡稱PCR或RT-PCR產物)從反應試管中取出一特定體積，注入預先製備完成的膠體井(well)中，藉由核酸分子在中性或鹼性溶液中帶負電的特性，使得核酸分子在電場作用下會往正極方向移動，且移動的速度與其分子量大小成反比。透過此方法之操作，即可檢測出目標基因核酸是否有成功放大，利用膠體電泳進行檢測之正確率雖高，但從進行PCR或RT-PCR至完成膠體電泳，需要數個小時的反應時間，對於一些需要即時或在短時間內得知檢測結果的測試項目來說，由於進行PCR或RT-PCR再加上電泳確認測試結果的時間太長，因此通常無法利用PCR或RT-PCR的方式來進行輔助診斷或檢驗。此外，利用膠體電泳的方式來進行結果判讀時，因需將PCR或RT-PCR產物從反應管中移轉至膠體井中，此過程容易被外部物質汙染PCR或RT-PCR產物，從而造成誤判。

為了能夠縮短反應時間，一種利用熱對流反應原理進行PCR之技術問世(以下簡稱熱對流式PCR)。此技術最早是由Krishnan等人設計了Rayleigh-Benard cell的圓柱形管，配合上下兩個不同加熱源作為溫度控制，一般而言，液面頂端溫度約維持在60˚C左右，而底部溫度則約為95˚C左右，透過該圓柱形腔體上下端溫度不同產生之溫差，驅動腔體內液體之流動，PCR反應亦隨之進行，此方式同樣可進行RT-PCR。其後陸續有應用相同原理之衍生技術開發並做為商業使用，如利用單點加熱方式之隔絕式恆溫反應（insulated isothermal polymerase chain reaction, iiPCR），其係為一種在封閉毛細管內進行的聚合酶連鎖反應，或利用三點加熱源形式之封閉迴路式流道之設計；抑或利用非接觸式輻射之方式，其加熱點位於圓柱管中央之封閉迴路設計，來達到進行PCR或RT-PCR之效果等諸多不同設計。透過此種利用熱對流反應原理進行PCR或RT-PCR之方法，將不再需要透過溫控金屬對試管進行反覆升溫降溫之操作以達到三個步驟之反應溫度，可節省許多反覆升降溫的時間，亦可以減少溫控金屬之使用量。

同時，為減少因外界物質汙染PCR或RT-PCR產物，而造成檢測結果之誤判，近年亦陸續有可取代傳統膠體電泳之判讀技術開發，例如利用具有單一性螢光物質與目標基因序列結合，當檢測儀器給予適當波長之光束激發該螢光物質，該螢光物質就會發出螢光，並被檢測儀器偵測，該螢光亮度與PCR或RT-PCR產物數量成正比，因此可達到即時定性甚至定量的效果，節省反應時間。

又如透過對目標基因序列具有專一性標記之試紙來檢測PCR或RT-PCR產物，亦是近年來常使用的檢測方式之一。試紙法的檢測原理係在PCR或RT-PCR試劑中加入至少二種不同專一性抗體之抗原，第一種抗原可為DIG或TexasR，第二類抗原可為Avidin或FITC，亦可用其他具有專一性的抗原取代前述抗原。當反應完成後，產物即帶有兩種不同抗原。同時，在試紙之一端噴塗膠體金、乳膠球或其他呈色物質，該呈色物質與前述第二種抗原之專一性抗體結合，此種抗體可為Biotin、anti-FITC或其他可對應之專一性抗體，而試紙之另一端則有黏附的吸水棉；此外，在試紙特定部位噴塗固著於另一對應前述第一類抗原之專一性抗體，如anti-DIG、anti-TexasR或其他可對應之專一性抗體；當反應結束後，將PCR或RT-PCR產物取出並滴放適當體積之試劑於試紙有噴塗呈色物質之一端，此時產物中第一種抗原將會與第一種抗體專一性結合，並形成第一種抗原-第一種抗體-呈色物質的複合物，這個複合物會因試劑之毛細現象從呈色端往吸水棉端移動，當移動到第二種抗體噴塗的位置時，第二種抗原將會與第二種抗體專一性結合後，會固定於該處並呈色，使用者得以藉由呈色與否判讀結果。利用試紙檢測法所需時間約為數分鐘不等，較傳統膠體電泳檢測法節省不少實驗時間，因應不同之需求，前述專一性抗體亦可用核酸探針取代。

呈上所述，以熱對流式PCR輔以試紙檢測法進行和檢測，比起傳統PCR或RT-PCR及膠體電泳之檢測方法節省許多反應時間，雖已廣泛為研究及商業使用，但目前坊間並未成功開發出可直接進行熱對流式PCR或RT-PCR反應及產品檢測兩種不同操作訴求之檢測試管，因此在執行上仍需先在試管中完成熱對流式PCR後，在將產物從試管中取出適當體積滴到試紙上，才能完成核酸檢測，由於產物取出不易，使得操作相當不便，且仍無法確實避免外部物質造成之汙染。

有鑑於此，本發明提供一種不需要進行試劑或液體移轉，而可以在PCR或RT-PCR反應完成後，在同一裝置中利用試紙進行核酸反應結果檢測之二階段操作檢測管。

鑒於上述問題，本發明係涉及一種二階段操作檢測管。此種檢測管使用上不需要進行試劑或液體移轉，僅需在熱對流式PCR或RT-PCR反應完成後，與裝有試紙之連接管、檢測管連接，就可以直接在同一裝置中利用試紙進行核酸反應結果檢測。

為了達成前述目的，依據本發明提供之一較佳實施例，本裝置包含一具有一第一連接部及一檢測空間之第一管體，此檢測空間可以容納一端具有吸水棉之試紙；一具有第二連接部及一容置空間之第二管體，此容置空間可以容納目標基因待測物及相關試劑；一具有一第一部位及一第二部位之連接體，可分別連接於第一管體的第一連接部及前述第二管體的第二連接部；此連接體的第一部位具有一導流單元及一集液空間，導流單元可將容置空間的液體引導至集液空間，此連接體的第二部位則具有一試紙置放空間供試紙置放，且前述試紙置放空間與前述集液空間連接。

熱對流式PCR或RT-PCR反應完成後，組裝第一管體、第二管體以及連接體，以形成一封閉式檢測管，檢測試紙則已先行置入第一管體與連接體中。待組裝完成後，將檢測管進行180度翻轉，使試劑透過連接體之導流單元進入集液空間，於試紙置放空間與試紙接觸。透過試紙一端附有吸水棉產生之毛細現象將PCR或RT-PCR產物從試紙噴塗有呈色物質之一端拉往吸水棉端，在此過程中，產物所攜帶之專一性抗原將會與預先噴塗於試紙上之專一性抗體結合而呈色，使用者可透過第一管體之觀測部觀察檢測結果。藉由本發明的上揭技術手段，可達到在同一裝置中進行熱對流式PCR或RT-PCR以及檢測產物之目的。

以下即配合附圖詳細說明本發明之一較佳實施例的結構及功效。另外，本說明書中對於機構或其部位在其位置描述上冠以「前」、「後」、「左」、「右」、「上」、「下」等，對應於使用者在操作本較佳實施例時的空間關係。

請參考第1圖，本發明一較佳實施例的檢測管(1)主要包含一第一管體(10)、一第二管體(30)、及一連接於第一管體及第二管體之間的一連接體(20)。

請參考第1圖、第2a圖及第2b圖、及第3圖，在本實施例中，前述第一管體(10)為一由PC塑膠製成的透明管體，具有一第一連接部(101)、一手持部(103)、一位於第一連接部(101)及手持部(103)之間的觀測部(102)、及一檢測空間(104)。在本實施例中，第一管體(10)的觀測部(102)外周概呈一圓形周面，表面光滑；此外，第一管體(10)的一端為前述手持部(103)，在管體外周具有相對二平面，可供使用者以手指夾持，以利判讀；位於前述手持部(103)相對一端的第一連接部(101)在管體內側具有一第一嵌合結構(105)，在本實施例中，第一嵌合結構(105)具有至少一環狀凸出單元(1051)，用於連接前述連接體(20)；第一管體(10)的內部為前述檢測空間(104)，用於容納一尾端附有吸水棉之試紙，為一橫剖面呈長圓形的空間，亦即此空間具有二平行的壁面，以及處於相對位置的二曲面。因此，當使用者由觀測部(102)觀看第一管體(10)時，圓形外周面與內部平坦的壁面就構成一平凸透鏡的結構，當前述試紙置於檢測空間(104)時，即可放大試紙上的資訊，以利判讀。此外，該尾端附有吸水棉之試紙，於檢測空間(104)之置放方向為附有吸水棉之一端位於第一嵌合結構(105)之另一端。

參考第1圖及第4圖，本實施例的第二管體(30)為一由PC塑膠製成的透明中空管體，一端內徑較寬用以連接前述連接體(20)，相對一端則為內徑較窄的毛細管部(302)，前述第二管體(30)具有一第二連接部(301)及一容置空間(303)。在本實施例中，第二連接部(301)與第一管體(10)的第一連接部(101)相似，管體內側具有一第二嵌合機構(304)，且第二嵌合機構具有至少一環狀凸出單元(3041)，用於連接前述連接體(20)；第二管體(30)內部的容置空間(303)用於容納待檢測液體，例如反應試劑。

參考第1圖及第5圖，本實施例的連接體(20)為一由矽膠製成、具有一硬度較第一、第二管體(10)(30)低的彈性體，前述連接體(20)具有一第一部位(201)及一第二部位(202)，可分別連接於第一管體(10)的第一連接部(101)及第二管體(30)的第二連接部(301)，具體而言，第一部位(201)及第二部位(202)分別具有一第三嵌合機構(203)，在本實施例中，即為外周面具有複數環狀凸出單元(2031)，當連接體與第一管體(10)、第二管體(30)連接時，第一管體(10)或第二管體(30)內管壁環狀凸出單元(1051)(3041)可迫使連接體(20)的相應部位略微變形，而使得第一、第二部位(201)(202)的環狀凸出單元與相應的第一、第二管體(10)(30)的連接部環狀凸出單元(1051)(3041)相互嵌合，而形成緊密連結、密封的狀態。

參考第5圖，第一部位(201)具有一導流單元(204)及一集液空間(205)，第二部位(202)則具有一試紙置放空間(206)，為一具有一致管徑的長形通道。試紙置放空間(206)具有一開口(207)，試紙置放空間用於將前述試紙推入前述試紙置放空間(206)，開口則位於鄰近前述導流單元的入口及一鄰近前述試紙置放空間的出口，該開口(207)之長度寬度約略等同於檢測試紙之寬度及厚度，且前述出口的開孔面積較前述入口大，其目的在於防止反應試劑在未與試紙接觸並透過毛細現象往試紙另一端移動而逐步與試紙上噴塗之專一性抗體進行反應下，直接透過縫隙直接流到第一管體(10)之檢測空間(104)，造成檢測結果之誤判。

在本實施例中，導流單元(204)為一朝向前述集液空間(205)的導流坡面(2041)，當使用者將檢測管(1)為180度倒置時，亦即將第1圖上下翻轉，前述導流坡面(2041)可引導位於第二管體(202)內部的液體流向前述集液空間(205)，而集液空間(205)為一中空腔體，可容納液體，且集液空間(205)與試紙置放空間(206)連通，當液體流入集液空間(205)時，就會與置放於試紙置放空間(206)的待測試紙接觸，進而進行PCR或RT-PCR產物檢測反應。此外，集液空間(205)的入口，也就是與導流單元(204)相鄰之開孔面積，相較於集液空間(205)的出口，也就是與試紙置放空間(206)相鄰之開孔面積，較為狹窄，可使液體順暢地往固定方向流動。且為了加速反應進行，增加液體與試紙的接觸面積，集液空間(205)的出口設於試紙置放空間(206)的長邊，如此一來，當液體流出集液空間(205)時，即可直接與試紙大範圍地接處，加快進行反應。

使用上，首先將包含待分析之目標基因片段、專一性抗原及其他試劑注入第二管體(30)中，並進行熱對流式PCR或RT-PCR，當反應完成時，PCR或RT-PCR產物及同時帶有DIG以及Avidin兩種抗原；同時，將噴塗有呈色物質及專一性抗體且尾端附有吸水棉之試紙置放於連接體(20)的試紙置放空間(206)中，再將連接體(20)與第二管體(30)之第二連接部(301)連接組裝，使得試紙被置入第二管體(30)的容置空間(303)並固定。在本實施例中，呈色物質為膠體金，一種專一性抗原為DIG，另一種專一性抗原為Avidin，二者對應之專一性抗體為Anti-DIG以及Biotin，且Biotin與膠體金結合為膠體金-Biotin複合物。

待熱對流式PCR或RT-PCR反應完成後，不須移除第二管體(30)的反應試劑，而直接將連接體(20)以及第一管體(10)依第1圖所示之第一管體(10)-連接體(20)-第二管體(30)組合連接組裝，使檢測管(1)成為一完全封閉之管體。接著將檢測管(1)進行180度倒置，亦即將第1圖上下翻轉，此時原本位於第二管體(30)之包含熱對流式PCR或RT-PCR產物之試劑，會順著導流坡面(2041)流向集液空間(205)及試紙置放空間(206)，並在試紙置放空間(206)與待測試紙接觸。由於試紙之一端附有吸水棉，因此帶有PCR或RT-PCR產物之試劑將會從試紙置放空間(206)端因毛細現象之影響，而逐步往吸水棉端移動。 在帶有PCR或RT-PCR產物之試劑移動過程中，Avidin將會與Biotin專一性結合，並形成Avidin-Biotin-膠體金的複合物，此複合物會因毛細現象繼續往吸水棉端移動，當移動到Anti-DIG噴塗的位置時，DIG將會與其專一性結合後，固定於該處並呈色，使用者得以藉由呈色與否判讀結果。 以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。

1‧‧‧檢測管

10‧‧‧第一管體

101‧‧‧第一連接部

102‧‧‧觀測部

103‧‧‧手持部

104‧‧‧檢測空間

105‧‧‧第一嵌合結構

1051‧‧‧環狀凸出單元

20‧‧‧連接體

201‧‧‧第一部位

202‧‧‧第二部位

203‧‧‧第三嵌合結構

2031‧‧‧ 環狀凸出單元

204‧‧‧導流單元

2041‧‧‧ 導流坡面

205‧‧‧集液空間

206‧‧‧試紙置放空間

207‧‧‧開口

30‧‧‧第二管體

301‧‧‧第二連接部

302‧‧‧毛細管部

303‧‧‧容置空間

304‧‧‧第二嵌合結構

3041‧‧‧環狀凸出單元

第1圖是本發明一較佳實施例的零件爆炸圖及組合圖。 第2a圖是本發明第一管體(10)之B-B方向剖面圖。 第2b圖是本發明第一管體(10)之A-A方向剖面圖。 第3圖是本發明第一管體之下視圖。 第4圖是本發明第二管體之C-C方向剖面圖。 第5圖是本發明連接體之D-D方向剖面圖。

Claims (9)

1. 一種兩階段操作核酸反應檢測管，包含有：一第一管體，具有一第一連接部及一檢測空間，前述檢測空間可容納前述試紙；一第二管體，具有一第二連接部及一容置空間，前述容置空間可容納前述液體；以及一連接體，具有一第一部位及一第二部位，分別連接於前述第一管體的第一連接部及前述第二管體的第二連接部，前述連接體的第一部位具有一導流單元及一集液空間，前述導流單元可將前述容置空間的液體引導至前述集液空間，前述第二部位具有一試紙置放空間，且前述試紙置放空間與前述集液空間連接，前述第一、第二連接部分別具有一第一、第二嵌合結構，用於連接前述連接體。
2. 如申請專利範圍第1項所述之兩階段操作核酸反應檢測管，其中，前述第一管體的外周面呈一圓管，前述檢測空間則為一具有二相對平面的長圓形空間。
3. 如申請專利範圍第1項所述之兩階段操作核酸反應檢測管，前述第二管體更具有一毛細管部。
4. 如申請專利範圍第1項所述之兩階段操作核酸反應檢測管，其中，前述連接體的試紙置放空間為一具有一致管徑的長形通道。
5. 如申請專利範圍第4項所述之兩階段操作核酸反應檢測管，其中，前 述集液空間具有一出口，用於將前述液體導出，且前述出口的位置為於前述試紙置放空間的長邊。
6. 如申請專利範圍第1項所述之兩階段操作核酸反應檢測管，前述集液空間為一腔室，與前述試紙置放空間連接。
7. 如申請專利範圍第1項所述之兩階段操作核酸反應檢測管，其中前述集液空間具有一鄰近前述導流單元的入口及一鄰近前述試紙置放空間的出口，且前述出口的開孔面積較前述入口大。
8. 如申請專利範圍第1項所述之兩階段操作核酸反應檢測管，其中，前述導流單元為一朝向前述集液空間的導流坡面，可引導位於前述第二管體內的液體流入前述集液空間。
9. 如申請專利範圍第1項所述之兩階段操作核酸反應檢測管，其中，前述第一、第二嵌合結構為至少一環狀凸出單元，用以連接前述連接體。