CN106702001A - 外引物可降解的巢式pcr - Google Patents

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Abstract

本专利“外引物可降解的巢式PCR”是一种酶解代替纯化的单管两轮PCR，其特征是引物末端至中部含1个或以上dU及RNA碱基的外引物PCR于矿物油密闭下预扩放大后，其RNA/dU外引物被加入UDG及RNA酶的内引物荧光PCR酶解，以及预设外引物PCR液中过量底物和Mg2+使内PCR液不用含Mg2+，加内PCR液时矿物油层面上残留液无Mg2+而无效扩增，加上内扩UDG系统防止产物气雾胶外源污染；并采用中部同序的内引物策略进一步减少内源PD非特异性，确保≥“1”分子有效检测和“0”无扩增反应的数字dPCR方法。

Description

外引物可降解的巢式PCR
技术领域：
本发明属于分子生物学及分子检验的核酸扩增PCR技术领域，具体涉及修饰外引物预扩增来提高灵敏度及修饰引物酶解而限制其非特异性的单管巢式PCR领域。
背景技术：
多聚酶链反应PCR背景可追溯至其历史发展源头，1953年Watson建立DNA双螺旋模型及半保留复制法则为PCR扩增奠定了其分子基础，甚至1971年Khorana就已发表了一核酸体外扩增(J.Molec.Biol.,56:341)相关论文；但直到1985年美国Cetus公司Mullis想到了PCR本质-指数扩增或几何级数式放大的巨大威力,才发明了一对特异引物结合、复制靶分子基因,体外(于试管内)模拟天然基因半保留复制的PCR技术，再经过一系列发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。扩增过程一般经靶DNA变性：加温94℃使双链解离成为单链；引物退火(复性)：降温至54℃左右使过量引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物延伸：升温至72℃左右，DNA单链模板—引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，遵循碱基反向配对与半保留复制原理，引物末端按5'-3'方向延伸、合成一条新的与模板DNA链反向互补的半保留复制链,不断重复循环变性--退火--延伸三过程，这种新链又可成为下次循环的模板，靶分子以2n级数产生更多的“半保留复制”新链。
超级灵敏度的指数放大或几何级数放大是PCR最核心的本质或优点，靶分子以2n级数放大,常规30个热循环反应230约等于109放大倍数,扩增放大倍数似原子裂变链式反应难以想象,也是一般线性放大检测方法无可比拟的,灵敏度远远大于普通检测方法的放大倍数,近40个循环反应可达飞克fg/ml或个位数分子水平检测。这也是PCR成为应用最广的最核心技术甚至多少个最形容也绝不过分的根本原因。同样，指数放大亦带来PCR高度特异性和顽固的非特异性，PCR特异性直接来源于引物序列的特异性,一端引物序列一点非特异错配扩增甚至完全配对扩增也仅是线性放大,自然远远赶不上指数扩增或几何级数放大，引物特异性任何一点降低或与靶一丁点不匹配导致扩增速率落下了,而远远赶不上特异的指数或几何级数放大；反过来说,只要是靶指数扩增或几何级数放大，PCR扩增检测就具有足够高特异性。非特异性同理，各种常规检验方法遇见的非特异性原因虽也存在于PCR技术,但终究赶不上指数扩增放大，仅一条引物非特异结合线性扩增远远赶不上指数非特异性,只有一对引物均非特异结合、延伸的扩增才是唯一指数非特异性原因,引物间互为模板、互为引物的二聚体PrimerDimer(PD)指数扩增是PCR非特异性本质,也是其难以克服的根本原因。一般3'末端数个碱基连续反向互补的引物对于不加模板的本底PCR扩增反应中约几个—十几个循环处即出现引物二聚体PD扩增；一对常规设计的引物于本底PCR反应30个循环开始出现显著的PD非特异性扩增，并遮盖位于30-38循环的数千以下靶分子的低浓度样本检测，这也是普通PCR只进行30个循环反应的主要原因。
然而飞克fg/ml及个位数靶分子水平检测需要扩增至38个循环,为了解决30个循环PCR方法灵敏度仍不足的局限，随后开始出现外侧与内侧引物两步扩增的巢式PCR(J MedVirol,30-2:85)，其采用外侧引物预扩增15-30个循环来提高灵敏度，再加以内侧引物继续扩增25-30个循环以超过40个循环指数扩增的极高灵敏度甚至为单个靶分子检出提供了可能；且随着巢式PCR新反应成份的补充，也推迟了从指数形式或对数期进入所谓“停滞效应”平台期的时间，保持了2n级数的几何扩增效率。然而巢式PCR外侧引物增加了系统复杂性进而增加了两轮PCR非特异性，外引物的残留促进内侧引物非特异扩增，将一般常规引物本底Ct值30个循环的非特异性提升至Ct值﹤25个循环以前的本底非特异性；巢式或两轮PCR增加的非特异性抵消了第一轮或外侧引物预扩增的放大作用。预扩增需要取出至少稀释20-50倍以上或通过凝胶电泳纯化靶产物以除去外侧引物的影响才能消除系统增加的非特异性，不但增加操作复杂性而且PCR后处理亦带来产物气雾胶交叉污染风险。
随后其它许多PCR新方法，新改进也不断涌现,发明，包括反转录RT-PCR,原位PCR,连接酶链反应(LCR)，标记PCR(Labeled primers-PCR)，反向PCR(reverse PCR)，不对称PCR(asymmetric PCR)，降落PCR(touchdown PCR)，重组PCR(recombinant PCR)，多重PCR(multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA差异PCR，链替换扩增(SDA)，依赖核酸序列的扩增(NASBA)，转录依赖的扩增系统(TAS)，Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA扩增,滚环扩增(RCA),环介导的等温扩增(LAMP)等。由于常规终末PCR因同样量的样本经PCR超级放大以后变化太大而产量不均一，致使难以定量检测，传统的终末/终点PCR只能PCR后凝胶电泳来区分特异与非特异扩增条带；1997年采用动态实时检测扩增对数期的循环数与靶初始量成反比(反对数关系)的实时荧光PCR(Real-time PCR)技术实现了从定性测定到精确定量的飞跃，根据发光原理不同分为荧光染料SYBR GreenⅠ实时荧光PCR和各种荧光核酸探针PCR两大类(BioTechniques1997,22:130-138)及巢式荧光PCR(Malaria Journal 2014,13:393)。染料法实时荧光PCR通过SYBR GreenⅠ结合产物DNA双链小沟使发射荧光增强1000倍而检测，但非特异性扩增产物也结合发射荧光，同样30个循环后非特异扩增也遮盖了低浓度样本检测；探针法TaqMan等实时荧光PCR的靶特异探针不针对引物序列而绕开了PD非特异性产物,但引物二聚体PD扩增于探针法荧光PCR不可见并不代表其不存在、不起作用，较高的Ct 30PD扩增竞争性抑制同引物的低浓度靶扩增而降低其检测灵敏度；另一方面,过量引物与探针DNA链之间也产生一定程度的非特异聚合、延伸的扩增，不加靶模板的PCR本底系统,一对引物与任意一个荧光标记TaqMan探针均产生约Ct 33-35的非特异性扩增曲线，且随着反复重复同一PCR扩增,其扩增平台期荧光吸收峰值越来越高,Ct值也逐渐前移，产生一定的样本检测假阳性。目前实时荧光PCR有限灵敏度和一定非特异性仍妨碍了极低浓度样本检测或单分子检出。
定量检验方法很早就出现过稀释定量法概念，即通过样本倍比稀释靶分子直至无靶分子反应再算稀释倍数的倍比稀释定量方法；进一步出现了基于样本有限稀释和泊松分布计数的数字化定量PCR理念。即确保阳性单个分子或单个以上分子均有检测信号而定为1、阴性绝对无反应信号而定为0的条件下，样本稀释、分散至大量的微型分隔单元使理论上每检测单元含0-1个靶分子，通过检测单元反应信号0-1计数和有限稀释倍数而对靶分子进行定量的方法,以便于计算机0或1模式的自动化操作,但前提必须是检测方法本身对1个分子或0分子可靠区分。然而传统的化学反应、酶免疫反应等均是检测信号强度与待测分子含量成线性比例且信号简单相加的纳克级低灵敏度检测方法，线性传统低灵敏度方法远远区分不了1个靶分子和0分子的差别，所以无法适用于有限稀释法的数字化定量检测方法。1992年,Sykes等人(Biotechniques13:p444)初步尝试了基于样本有限稀释和泊松分布计数的定量巢式PCR,并首次提出了数字化定量理念，但由于这类PCR系统内多引物聚合体扩增和体系外气雾胶交叉污染的严重非特异性而抵消了二次扩增放大作用。
限制数字PCR其它非特异性原因众多,大多研究焦点集中于PCR热启动来克服可能的引物低温结合所致非特异扩增，措施包括蜡包Mg2+离子热释放、聚合酶Taq修饰抑制包括端N缺失的KlenTaq,抗Taq酶抗体和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar,以及四氧化戊烷热激活引物等热启动方法。但低温启动最多也仅扩增一个循环放大一倍/一次,远赶不上非特异指数放大。且PCR在热变性后才手动加完全组份的绝对热启动本底Ct值也仅推后1-3个循环数，低于40℃度时Taq酶活性很低,低温启动不是PD非特异性形成的关键原因。试验使用各种控制非特异的措施如变化PCR组份、添加各种化学试剂等,其对特异与非特异扩增基本是平行的,显著抑制PCR非特异性也不同程度地干扰靶特异性扩增效率,反之不影响靶扩增效率又难以抑制PCR非特异性。引物引起的指数非特异性还是源于其碱基序列,一对完全同序引物绝没有引物非特异性。Hands技术(Homo-Tag assisted non-dimer system,Nucleic AcidsRes.Vol.25,No16:p3235-3241)采用完全同序引物Tag通过引物二聚体单链两端自身结合竞争游离引物,不仅显著抑制PD非特异性,也都没有选择地减低靶特异性扩增效率。单链结合蛋白Single Strand Binding-protein(SSB)、基因32蛋白和全引物结合反义碱基Oligo能显著降低优化的引物非特异性,但也严重地影响靶特异性扩增效率及扩增曲线的线性关系。
中国专利(CN 201010105371.8和PCT/CN2013/088054)根据一对完全同序引物绝没有非特异性现象，采用部分同序引物部分抑制PD扩增,将“同序”置于引物中部偏3'端能最大化地选择性抑制PD扩增而不影响靶扩增效率；PCR添加与引物中部同序部位配对结合的含反义碱基Oligo,因其仅保留结合功能而没有模板和引物作用,能进一步特异选择性地放大这种作用。在无末端反向互补常规引物设计原则基础上,选择中部部分同序引物对和结合中部反义碱基Oligo于实时荧光PCR 40个循环反应内消除内源PD非特异性扩增干扰；内源非特异性PD气雾胶持续成为后续PCR交叉污染模板，一般采用dU代替dT底物来形成含dU产物，水解dU的UDG酶降解dU产物气雾胶。
深一步Vogelstein&Kinzler于1999年报导微升级96孔板的致癌突变基因ras定量PCR及首创数字(digital)PCR概念(PNAS,USA 96:9236),d-PCR是一种基于单分子PCR方法来进行计数的第三代绝对定量PCR方法,采用分析化学领域的微流控或微滴化方法,将大量稀释后的核酸溶液分散至微反应器单元或微滴中,每个反应单元的核酸模板数少于或等于一个。经过PCR热循环反应之后,扩增产物与加入的荧光探针杂交,有一个核酸分子模板的反应单元有扩增而给出荧光信号,没有模板的反应单元没有扩增而无荧光信号。根据稀释比例和反应单元体积,就可以推算出原始溶液的核酸浓度,通过计数及泊松分布统计,就可以实现起始DNA模板的绝对定量。近年来缩微至微流控万级(即纳升)乃至百万级反应单元(皮升级)体积装置(Anal.Chem.2011,83:8604)的成熟而d-PCR开始走向应用。
所以，常规PCR及实时荧光PCR对单分子检测灵敏度仍稍显不够，需要预扩增放大来进一步提高系统灵敏度；但PCR又限制于非特异性对低浓度样本检测的遮盖，超敏PCR甚至单分子有效检测取决于PCR增敏和非特异性去除两个方面。本发明“外引物可降解的巢式PCR”采用末端含RNA碱基或dU碱基外引物于外侧预扩增后UDG或RNA酶降解策略而不增加随后的内侧扩增内引物聚合非特异性，外侧引物预扩近15个循环的有限预放大可增敏内引物荧光定量PCR；外引物预扩20个循环放大变化过大而内引物荧光PCR数字化法定量。两轮双扩增的巢式PCR以及UDG和矿物油封闭来彻底杜绝引物二聚体PD非特异性扩增；巢式双扩增PCR数字定量方法可作为重要的临检样本、核酸参考品和科研样本的手动/手工d-PCR方法,同时为更快捷、高效超级单元微囊/微滴化的微流控装置的研制提供前期研究工具和发展思路。
REFERENCES
(1)Porter-Jordan k；et al.,1990,J.Med Virol 30(2):85-91.
(2)Sykes,P.J.；et al.,1992,BioTechniques 13:444-449.
(3)Wittwer,C.；et al.,1997,BioTechniques 22:130-138.
(4)Brownie J.,et al,1997,Nucleic Acids Res.Vol.25,No16:3235-3241.
(5)Vogelstein,B.；Kinzler,K.W.1999,PNAS,USA 96:9236-9241.
(6)Hindson B.J.,et al.,2011,Anal.Chem.83:8604-8610.
(7)Tran M.T.,2014,Malaria Journal 13:393。
发明内容
本发明“外引物可降解的巢式PCR”采用含dU或RNA碱基外引物于外侧预扩增后UDG或RNA酶降解策略而不增加随后的内侧扩增内引物聚合非特异性，外侧引物预扩10-15个循环的有限预放大可增敏内引物荧光定量PCR；外引物预扩15-20个循环放大变化过大而内引物荧光PCR数字化法定量。两轮双扩增的巢式PCR以及UDG和矿物油封闭来彻底杜绝引物二聚体PD非特异性扩增；巢式双扩增PCR数字定量方法可作为重要的临检样本、核酸参考品和科研样本的手动/手工d-PCR方法,同时为更快捷、高效超级单元微囊/微滴化的微流控装置的研制提供前期研究工具和发展思路。
本发明提供的技术方案概括如下：
外引物可降解的巢式PCR，其特征在于：在单个反应管/孔中巢式PCR完成以下步骤：
(1)外引物扩增：PCR管中加入修饰的外引物PCR反应液，并加入矿物油对PCR反应液进行密封，完成预定扩增程序；所述外引物PCR反应液中采用的外引物末端至中部含有1个或1个以上dU碱基和/或RNA碱基修饰，所述外引物PCR使用Taq、K Taq、H.K Taq,含1-2×常规量的dNTP底物和Mg2+缓冲液；
(2)内引物扩增：于矿物油表层下加入内引物PCR反应液稀释外引物PCR 2-4×倍体积，
所述内引物PCR反应液中含有UDG和/或RNA酶，内引物PCR前50℃ 2-10分钟消化、降解外引物PCR反应液中采用的所述含有1-3个dU碱基修饰和/或RNA碱基修饰的外引物；
内引物PCR反应液含0-1×倍量常规底物和Mg2+。
优选地，所述内引物PCR反应液中采用的内引物为中部同序引物。
优选地，所述含末端RNA碱基和含1-3个dU修饰的外引物中，修饰dU碱基和/或RNA碱基位列于3'末端/或末端和中部，且所述外引物PCR反应液中含有过量的dNTP底物和Mg2+。
优选地，所述外引物PCR反应液中仅单侧采用外引物即单侧一条外引物含有所述dU碱基和/或RNA碱基修饰；其另一侧内引物与同侧外引物共用同一序列引物。
优选地，内外引物间隔距离可以200base至0个base接近，作为特例其一端/单侧乃至共用1-3个引物序列，含dU碱基和/或RNA碱基修饰的外侧序列作为设定的外引物，无修饰靠内侧序列为设定的内引物；另一侧常规内外引物，两轮扩增的巢式PCR增敏和dU-UDG加矿物油封闭来彻底杜绝内外引物聚合非特异性。
优选地，所述外引物PCR反应液中的成分如下：dNTP,其中dA、dG、dC的终浓度是dT的2倍，含Mg2+终浓度3.5mM的缓冲液；所述内引物PCR反应液与外引物PCR反应液体积相同，不含常规底物dA、dG、dC，含dUTP且与所述dT的终浓度相同。
优选地，所述内引物PCR反应液中，UDG酶40×使用浓度为0.05-2.0U/μl，即5U/μl稀释2.5-102倍；RNaseA酶40×使用浓度为0.4-40ug/ml，即4mg/ml稀释102-104倍，或RNaseI5000U/ml。
优选地，增敏荧光实时定量PCR时，外引物扩增12-15个循环；内引物扩增30-35个循环；采用倍比稀释定量PCR时，样本于EP管进行倍比梯度稀释，即取样本×100～1×10-9开始10×倍稀释5-10次或再等比稀释5-10个梯度，确保有靶分子管稀至无靶分子管的转折点落在梯度范围内，外引物扩增20个循环，内引物扩增30-35个循环。
采用简易数字定量PCR时，内引物扩增30-35个循环后，每孔加入0.5μg/mLEB 2-5μL于矿物油层下面,置反应管于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测。
优选地，待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至100-10000个反应单元的聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行所述外引物扩增和所述内引物扩增。
用于检测乙型肝炎病毒，内引物对为：
HBcF:5'—aat gcc cct atc tta tca a–3'
HBcR:5'–gat tga gat ctt atg cga c–3'，其中第13位的a为c人工变异设计而来，
外引物对为：
WhBcF:5'–gtg gat tcg cac Ucc Tc–3'
反向引物为HBcR或dU修饰的HBcR。
用于检测食品转基因启动子CaMV 35S，
内引物为:
CaMV F：5'-gaa ggt ggc tcc tac aa-3'
CaMV R：5'-tcc acg atg ctc ctc gt-3'
外引物对：
WCaMV F：5'-tca ctt tat tgt gaa gaU tag U-3'
WCaMV R：5'-cca ctt gct Utg aag acG t-3'
一种用于权利要求1-12任一所述外引物可降解的巢式PCR方法的试剂盒，其特征在于：包括用于外引物扩增的试剂和用于内引物扩增的试剂；
所述外引物扩增的试剂包括含有过量Mg2+的PCR反应缓冲液；
所述内引物扩增的试剂包括不含Mg2+的PCR反应缓冲液,以及UDG酶和/或RNA酶。
本发明“外引物可降解的巢式PCR”，其特征是样本经引物末端至中部含1个或以上dU碱基和/或RNA碱基的外引物PCR于矿物油密闭下预扩增后，其含dU和/RNA外引物PCR被2-4×加入含UDG和RNA酶的内引物荧光PCR酶解的单管两轮巢式PCR，通过外引物水解来代替凝胶电泳纯化或大量20-50×稀释以消除外引物残留对内引物聚合非特异性影响，以及预设的外引物PCR液中过量底物dNTP和Mg2+使内PCR液不用含Mg2+，加内PCR液时矿物油层面上残留液无Mg2+而无效扩增，加上内扩底物dU代替dT及UDG酶解系统防止产物气雾胶外源污染；并采用中部同序的内引物策略进一步减少内源PD非特异性。
根椐“外引物可降解的巢式PCR”，其特征是将dU/RNA碱基置于外引物3'末端/末端和中部1-3个,所述外引物1-3个修饰碱基首选引物3'最末1-2碱基位置1个修饰碱，第2、3个修饰碱基则散布引物中部，外引物对至少有一条3'最末端含dU/RNA或上下游外引物3'最末端均含1个dU碱基；外引物PCR液含2×dNTP(终0.2mM,其中dT0.1mM)和Mg2+(终3.5mM)及常规Taq/Klen Taq/H.K Taq于矿物油密闭条件下预扩增，第一轮外引物预扩12-15个循环的有限预放大可作增敏的荧光定量PCR，外引物预扩18-20个循环放大变量过大而内引物荧光PCR只能稀释数字法定量；含E.coli UDG或RNaseA/I酶、仅5mM dUTP(终0.1mM)和无Mg2+10×buffer及Taq、中部同序的内引物PCR液等比加入PCR管矿物油表层下，吸头尖不要接触预扩反应液，稀释预扩液经内PCR热混匀启动，第二轮实时荧光PCR反应30-35个循环，第二轮PCR前50℃ 2-40分钟消化dU/RNA引物。
根椐“外引物可降解的巢式PCR”，其特征是半巢式PCR仅单侧或一端设置内外不同序列引物，另一端共用同一序列引物；仅一端外引物dU/RNA碱基修饰于矿物油密闭条件下预扩增来提高系统检测灵敏度；通过预加2×倍Mg2+预扩PCR和含UDG/RNA酶和无Mg2+的内引物荧光PCR酶解外引物和部分同序内引物策略限制其内引物荧光PCR非特异性。
根椐“外引物可降解的巢式PCR”，其特征作为半/巢式PCR一个特例，内外引物距离也可接近，极端例子单侧内外引物靠近乃至数个碱基重迭，RNA/dU碱基修饰的外序列作为设定的外引物，无修饰饰内序列为设定的内引物；另一侧常规内外引物，两轮扩增的巢式PCR增敏和dU-UDG加矿物油封闭来彻底杜绝内外引物聚合非特异性。
根据“外引物可降解的巢式PCR”，其特征是样本一组梯度稀释的简易数字定量PCR，样本于EP管进行倍比梯度稀释，取样本×100～×10-9开始10×(倍)稀释5-10次或再2×(等比)稀释5-10个梯度，确保有靶分子管稀至无靶分子管的转折点落在梯度范围内，外引物dU碱基修饰于矿物油密闭条件下预扩增15-20个热循环第一轮PCR无热盖扩增；于第一轮同一管中加含UDG和无Mg2+的内引物荧光PCR液,用加样吸头插入矿物油表层下面加入,进行30-35个热循环第二轮荧光PCR无热盖扩增。如第二轮PCR反应后每孔加入2-5μL的EB(0.5μg/mL)于矿物油层下面,置反应管于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测。
根据“外引物可降解的巢式PCR”，其特征是待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至96-10000个反应单元聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行两轮巢式PCR数字定量。
根据“外引物可降解的巢式PCR”，其特征在于其方法用于基因检测试剂盒,盒成份包括：核酸提取试剂，dNTPs及dUTP，UDG、RNaseI/A酶，Taq，HKTaq酶及其缓冲液，预扩外引物F+R，内引物F+R，染料EB及SYBR Green I，纯化水dH2O，矿物油。
多聚酶链反应PCR指数扩增或几何级数放大带来检测超级灵敏度，但对数个甚至单个分子检出仍稍显灵敏度不够；同时指数或几何放大亦带来本底位于30个循环的引物二聚体非特异性扩增，导致PCR产物气雾胶作为二次模板再污染，即使矿物油密闭PCR反应情况下油层面上残留微量反应对指数放大PCR也是难以克服的交叉污染。巢式PCR两轮扩增放大能检出单个分子极高灵敏度，但外引物的残留浓度和首轮循环次数及产物累积依次是后续内引物PCR非特异性增加的主要原因；凝胶电泳纯化靶产物以除去残留外引物及其产物PD，或首轮PCR产物稀20-50倍以上以稀释外引物及其PD是排除首轮PCR非特异性干扰的常用方法，但增加了预扩后操作污染风险。根据UDG或RNaseA/I酶高效消化核酸中dU或RNA碱基的现象，引入含dU或RNA碱基外引物预扩增后被加入UDG或RNaseA/I的优化内引物PCR液消化、水解，试验8碱基以下寡核苷酸片段完全不增加PCR非特异性，预扩产物作为内扩PCR模板因使用dNTP(不含dU)而不降解，实现无需预扩后纯化或大量稀释的单管反应两步扩增巢式PCR；为防止加内反应液时泄露污染，采用内扩PCR成分预先以双倍量加入外扩反应液，加内PCR液时因缺完全成分而矿物油层面上残留液无效扩增，加上内扩dU及UDG系统防止产物气雾胶外源污染；采用中部同序的内侧引物进一步减少内源PD非特异性。
本发明“外引物可降解的巢式PCR”为单管两步扩增PCR，采用含dU或RNA碱基(RNA碱基置于dC/dT之后)外引物于外PCR预扩后通过加入含UDG或RNaseA/I酶的内PCR液使外引物降解而不影响随后的内侧扩增内引物聚合非特异性，修饰碱基置于外引物3'末端/末端和中部1-3个，优先置于3'末端以使外引物PD也能最大程度酶解，第二置于中部使酶解片段最小；外引物预扩后加内引物反应液小量稀释2-4×倍及UDGR及NaseA/I酶解后进行内扩增。为防止加内反应液时泄露污染，通过内引物PCR液的底物和Mg2+预先2×倍加入预扩PCR液使加内PCR液时缺Mg2+而油层面上残留液无效扩增，外引物PCR加2×倍dNTP(dT 1×)和2×Mg2+及Klen Taq(/HK Taq)于矿物油密闭条件下预扩增，外侧引物预扩12-15个循环的有限预放大可增敏内引物荧光定量PCR；外引物预扩18-20个循环放大变量过大而内引物荧光PCR最好数字化法定量；预扩超过20个循环则非特异PD急剧增加而无必要。含UDG或RNaseA/I酶、仅底物dUTP和无Mg2+的buffer及Taq、中部同序的内引物PCR液等比加入PCR管矿物油表层下(吸头尖不要接触预扩反应液)，稀释预扩液经内PCR热混匀启动，于矿物油密闭下实时荧光PCR 30-35个循环。总反应大于40个循环的两轮扩增巢式PCR确保≥“1”分子有效检出和无模板“0”无非特异性反应，根据样本稀释至零个靶分子的倍数、体积可推算靶分子含量。
在本专利“外引物可降解的巢式PCR”应用检测前，首先需要试验出UDG或RNaseA酶作用范围和增敏扩增或数字PCR定量所需的预扩循环数。本专利含dU或RNA碱基的修饰引物和常规寡核苷酸由生工生物工程(上海)有限公司合成，酶RNaseA亦购自生工生物工程(上海)有限公司；酶E.Coli UDG及RNaseI购自NEB(北京)公司；荧光PCR仪器采用SLAN-96P(上海宏石医疗科技有限公司)。试验方法采用荧光染料SYBR GreenⅠ实时荧光PCR是因为其原理及操作最直接简便而线性关系及变异系数CV最好，并不代表本发明“外引物可降解的巢式PCR”仅限于SYBR GreenⅠ实时荧光PCR。
酶UDG或RNaseA稀释梯度作用修饰外引物的试验：将一系列UDG或RNaseA梯度稀释液分别加入含dU或RNA引物(实例一)的直接荧光PCR试验，按以下10次配方制备PCR液，模板一次加入10次PCR液，以5μl酶UDG或RNaseA梯度液为试验目标：
取UDG或RNaseA依次按下表1和表2的梯度稀释液5μl加入PCR管，再依次加入20μL/管的PCR反应液,再分别加入30μl/管的矿物油,进行50℃ 2分钟后94℃变性2分钟,40个热循环94℃变性20秒、54℃退火30秒、72℃延伸30秒的荧光PCR无热盖扩增,扩增曲线分别见附图1和附图2，UDG(原浓度5U/μl)稀释梯度对应扩增Ct值见下表1,结果UDG稀释至10-2倍完全抑制含dU引物扩增，至10-3倍仍小部分抑制dU引物扩增。
酶RNaseA(原浓度4mg/ml)稀释梯度对应扩增Ct值见下表2,结果RNaseA稀释至10-4倍几乎完全抑制含RNA引物扩增，至10-5倍仍大部分抑制RNA引物扩增。
增敏预扩循环数或数字定量所需预扩循环数试验：
同样靶标本外引物预扩5、10、15、20个循环后内引物实时荧光PCR对比直接实时荧光PCR的Ct值比较试验，测定所需预扩放大倍数。按以下外引物可降解的巢式PCR配方配液，第一轮含dU或RNA外引物普通PCR:按以下配方制备2×的预扩外引物PCR反应液10μl/每反应,等量加样本靶模板10μl/每反应。
※终浓度3.5mM of Mg2+；每管加50μl矿物油密闭后无热盖预扩增5-20不同循环数。
第二轮内引物SYBR Green I实时荧光PCR:按以下配方制备1×靶内侧PCR反应混合液,但巢式第二轮PCR引物须双倍，单侧巢式PCR仅一侧引物双倍；等量加入后为1×PCR反应。
※10×Taq buffer：0.6M Tris-Cl(pH8.3),100mM KCl,50mM(NH4)2SO4。
为防止加样时残留液扩增泄露，从管底依次加10μl修饰外引物及HK Taq预扩2×倍PCR反应液(终浓度dNTP2×但dT 1×)，等量10μl纯化样本，沿管壁加50μl矿物油密闭下普通PCR预扩10-15个循环；再小心吸头于矿物油表层下加入等比20μl含UDG酶及仅底物dUTP和无Mg2+的buffer及Taq的1×倍内侧PCR反应液(对应外引物降解侧的内引物2×而共用内引物1×)，加样吸头尖不要接触预扩反应液，一管换一吸头，稀释预扩液经内PCR热混匀启动，于矿物油密闭下实时荧光PCR50℃2分钟后再94℃预变性2分钟,进行30-35个热循环94℃变性20秒、540-60℃退火30秒、74℃延伸30秒的第二轮实时荧光PCR无热盖扩增。
结果采用靶模板质粒(pHBc)稀释梯度：原、原×10-1、原×10-2、原×10-3、无pHBc直接实时荧光PCR对应的Ct值19.04、22.80、26.19、31.46、—(无)；将同样量pHBc原×10-2、原×10-3巢式荧光PCR预扩5-20循环后所对应的Ct值见表3：，扩增曲线见附图3。
所以，对比原×10-3预扩10-20个循环的Ct值与直接PCR原×10-3—原×10-1的Ct值类同，推算预扩增10、15、20个循环依次约放大101、102、103倍，较浓一些模板多放大1-2倍。预扩近15个循环的有限预放大适合增敏30-35个循环内引物荧光定量PCR；外引物预扩20个循环预放大变量过大而内引物荧光PCR最好30个循环数字化法定量。
而同样PCR反应条件下，不加样本靶模板的对比PCR，同样外引物预扩0、5、10、15、20个循环后，相同的内引物荧光PCR进行非酶切组本底Ct值为35.0、32.0、27.5、21.5、18，随预扩循环数增加的非特异性反应遮盖靶特异性扩增；UDG/和RNase I酶切组全部为直线无扩增Ct值；见说明书附图4巢式PCR本底扩增曲线，外引物降解的巢式PCR无非特异性。
在应用数字PCR于微流控或微滴化装置之前，先行手动倍比稀释定量PCR。首先样本一组梯度稀释的简易数字定量PCR，样本于EP管进行倍比梯度稀释，确保有靶分子管稀至无靶分子管的转折点落在梯度范围内。因此，判断浓度较稀的样本先10×(倍)稀释几(5)个梯度再2×(等比)稀释5次；而对于大多数生物样本先从样本×10-2-×10-3开始10×(倍)稀释检测再确定范围2×(等比)稀释检测。并改进传统的两轮PCR操作方式,设计第一轮预扩可降解的外引物和第二轮内侧引物,于PCR单管两轮PCR反应,第一轮PCR每管先加入10μL的外引物2×PCR反应液于管底尖,和加10μL稀释样本液,再轻轻沿管壁加入50μL矿物油层密闭,进行15-20个循环的普通PCR外扩增；第二轮PCR于上一轮同一孔中加20μL的1×内侧PCR(降解侧引物2×)反应液,加样枪吸头插入矿物油表层下小心加入,进行30-35个热循环荧光PCR内扩增。配合矿物油密闭隔绝PCR系统外气雾胶交叉污染和内引物PCR的UDG系统去除残留气雾胶污染。
d-PCR终产物荧光显色及计数定量：
第二轮PCR反应可改染料SYBR Green I反应后每孔加入4μL的溴化乙锭EB(0.5μg/mL)于矿物油层下面,置PCR管或96孔板于254nm波长紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测；或PCR反应后每管或孔加入针对野生与突变基因不同波长的红绿两种分子信标探针可进行高野生背景下突变定量检测。对于0-1结果判断不清楚的临界组PCR产物可进一步进行1.5％Agarose凝胶电泳检测。
附图说明:
图1.UDG作用范围：稀释至10-2倍无扩增而完全抑制含dU引物扩增；至10-3倍Ct18.9对比无UDG的Ct16，仍小部分抑制dU引物扩增。
图2.RNaseA作用范围：稀释至10-4倍Ct33.83几乎完全抑制含RNA引物扩增，至10-5倍Ct28.97对比无UDG的Ct16，仍大部分抑制RNA引物扩增。
图3.巢式PCR所需预扩循环数的荧光扩增曲线：原模板×10-3预扩10-20个循环的荧光扩增Ct值25.71、23.43、18.59与直接荧光PCR原×10-3—原×10-1的Ct值26.19、22.80、19.04近似，推算预扩增10、15、20个循环依次约放大101、102、103倍，较浓一些模板多放大一倍。
图4.巢式PCR本底扩增曲线对比：同样外引物预扩0、5、10、15、20个循环后，相同的内引物荧光PCR进行非酶切组本底Ct值为35.0、32.0、27.5、21.5、18，随预扩循环数增加的严重非特异性扩增；UDG/和RNase I酶切组全部为直线无扩增Ct值；外引物降解的巢式PCR无任何非特异性。
图5.乙肝HBV增敏半巢式荧光PCR梯度多稀释两个数量级的扩增曲线及Ct值与直接荧光PCR浓两个数量级的扩增曲线及Ct值相当，预扩可对应比例地增敏荧光PCR。
具体实施例：
以下实施例进一步说明本专利的内容，但不应理解为对本专利的限制。在不背离本专利精神和实质的情况下，对本专利方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于本发明专利的范围。
(一)乙型肝炎病毒(HBV)外引物可降解的半巢式PCR：
乙型病毒性肝炎(简称乙肝)由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染的一种世界性III类传染性疾病，据世界卫生组织WHO报道全球约20亿人携带乙肝病毒。我国人群中乙肝感染率非常高(近10％)，主要由肝炎病毒引发的肝癌已位列肿瘤首位，极大的危害了人民的身体健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法5项/7项、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增(PCR)荧光定量法等。传统酶免疫法应用较广，但灵敏度不足；实时荧光PCR定量和数字定量PCR法可以精确测定乙型肝炎病人的病毒载量,对感染者病毒复制水平的判断,病情传染性及抗病毒药物疗效监测具有无法替代的重要作用。本实施例乙肝病毒(HBV)外引物可降解的半巢式PCR，选取乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)C区(1905-2498)序列克隆至pUC19载体质粒pHBc(MW 2.1×106)作为乙肝病毒阳性对照序列。
AB540584C区(2275-2439)
GTGGATTCGC ACTCCTCCCG CTTACAGACC ACCAATGCCC CTATCTTATC
AACACTTCCG……GTCGCAGAAG ATCTCAATCT
选取一段倒置重复/“引物同序”碱基置于靶引物对中部作为靶内侧引物，试验不影响扩增效率情况下变异一个碱基以增加“同序”数，中部7b同序能选择性减低引物二聚体PD非特异性近10个Ct值，靶内引物对和外引物对序列如下:(下划线序列为中部同序)
内引物对HBcF:5'—aat gcc cct atc tta tca a–3'
HBcR:5'–gat tga gat ctt atg cga c–3'(原c人为变异a)
外引物对WhBcF:5'–gtg gat tcg cac dUcc Tc–3'
R引物可共用HBcR或dU修饰HBcR。
(1)血标本DNA提取：
简易煮沸裂解法，取50μl-100μl血清加等量的煮沸裂解液(用前充分混匀微珠,剪大口吸头吸取)，轻混,置沸水浴10分钟,经4℃短暂冷确后高速离心10分钟，取上清5μl加样。或大量裂解上清可再经微磁球试剂进一步纯化。
病毒PEG沉淀法，弱阳性标本采用PEG沉淀HBV,取血清500μl加500μl 2×PEG液(16％w/v PEG&0.7M NaCl)，Vortex混匀，高速离心10分钟，弃上清950μl，浓缩沉淀留50μl后加50μl煮沸裂解液，余同上煮沸法,取5-10μl梯度稀释加样。此PEG沉淀回收率为50％。2×煮沸裂解液:0.02N NaOH,0.02％SDS(w/v),25mM KoAc,10mM(NH4)2SO4,0.5M Betaine,0.5％Glycerol(v/v)和0.05％Gelatin(w/v)。
(2)乙肝病毒HBV增敏半巢式荧光PCR：
先从管底加10μl含dU外引物及HK Taq预扩2×倍PCR反应液(终浓度dNTP2×但dT1×)，再加等量10μl纯化样本，沿管壁加50μl矿物油密闭下普通PCR预扩12-15个循环；再小心用吸头于矿物油表层下加入20μl含UDG酶及仅底物dUTP和无Mg2+的buffer及Taq的1×倍内侧PCR反应液(对应外引物降解侧的内引物2×而共用内引物1×)，加样吸头尖不要接触预扩反应液，实时荧光PCR 30-35个循环。乙肝病毒HBV核心抗原C基因克隆质粒pHBc(0.1μg/ml)为模板作10×(倍)稀释系列梯度0.1μg/ml×10-1、×10-2、×10-3、×10-4、×10-5、×10-6、×10-7,梯度0.1μg/ml×10-1—10-4直接一步实时荧光PCR，对比梯度多稀释3个数量级0.1μg/ml×10-4—10-7预扩15个循环后实时荧光PCR。
按巢式PCR标准配方制备第一轮可降解外引物PCR反应液，
于矿物油密闭下外引物普通PCR预扩增15个循环。
按以下配方制备1×靶内侧PCR反应混合液,但巢式第二轮PCR引物须双倍，单侧巢式PCR仅一侧引物双倍；等量加入预扩反应后仍为1×PCR反应。
※10×Taq buffer：0.6M Tris-Cl(pH8.3),100mM KCl,50mM(NH4)2SO4。
预扩管于矿物油表层下加入20μl含UDG酶的内侧PCR反应液(加样吸头尖不要接触预扩反应液)，宏石SLAN-96P荧光PCR仪实时荧光PCR 35个循环。结果见附图5巢式PCR梯度多稀释两个数量级的扩增曲线及Ct值与直接荧光PCR浓两个数量级的扩增曲线及Ct值相当，预扩可对应比例地增敏荧光PCR。
(二)食品转基因启动子外引物可降解的巢式dPCR:
转基因技术突破自然资源的限制,大幅度提高了农业效益和农产品产量、品质，同时亦带来了转基因食品生物安全问题,并日益受到世界各国政府和社会公众的广泛关注。随之,食品转基因成份定量检测及dPCR绝对定量检测的需求也快速上升。转基因作物已从棉花、大豆、玉米等主要农作物发展至数十种转基因作物种类；转基因类型大多为各种抗除草剂型、抗虫型、或抗除草和抗虫复合型，且也已拓展至改变亚麻酸含量、高赖氨酸型、延迟熟软及抗病毒等一系列新型转基因种类。选择某一特定转基因分子作为靶基因qPCR或dPCR定量检测已不太容易广泛检测使用，然而多数转基因型均采用花叶病毒CaMV 35S启动子表达、调控，采用共同的启动子序列可以优先作为转基因qPCR或dPCR检测的通用工具。本专利以转基因豆油为应用实施例来进行CaMV 35S启动子dPCR检测。
(1)CaMV 35S启动子序列外引物和内引物设计：
选取转基因CaMV 35S启动子如下部分序列(Eur.Food Res.Technol.,2004,218:496)，…TCACTTTATT GTGAAGATAG TGGAAAAGGA AGGTGGCTCC TACAAAATGCC……ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA AGCAAGTGGA…作为模板并克隆至pUC19载体为质粒pCaMV对照。
选择其倒置重复inverted repeat即引物对6base同序序列作为内引物如下:
CaMV F：5'-gaa ggt ggc tcc tac aa-3'
CaMV R：5'-tcc acg atg ctc ctc gt-3'
以及修饰外引物对：
WCaMV F：5'-tca ctt tat tgt gaa gaU tag U-3'
WCaMV R：5'-cca ctt gct Utg aag acg U-3'(下划线序列为同序)(2)植物标本DNA提取：
CTAB简便提取法：
固体植物于液氮中磨碎，0.2-0.3g加1ml的2％十六烷基溴化铵(CTAB)65℃水浴20-60分钟，等体积的氯仿(1/24异戊醇)混旋、离心，抽提上清加2倍体积的无水乙醇-20℃沉淀，离心后弃上清，DNA溶于50μL的TE缓冲液。
豆油样本DNA抽提及柱纯化：
根据(中国农业科学2007,40(5):1069)提取DNA方法：取金龙鱼牌食用转基因大豆油10mL加10mL正己烷于烧杯中磁力搅拌2hr,加20mL的PBS继续搅拌3hr，转入50mL塑料管离心12000g×20mins，小心取出下层水相，转入一新50mL管加等体积的异丙醇并混匀，置-20℃×20mins再离心12000g×20mins，弃上清，沉淀加dH2O 100μL溶解，加500μL结合缓冲液过离心柱，洗液洗柱两次，柱瞬离干燥后加50μL的TE洗脱DNA。纯化的样本DNA进行稀释定量巢式PCR反应。
(3)按以下配方制备2×PCR反应液10次单个反应:
纯化的样本DNA按原液×10-1、×10-2、×10-3、×10-4、×10-5、×10-6、×10-7、×10-8、×10-9顺序作9个梯次10倍稀释,取9个1.5mL塑料EP管,每管先加入18μL纯化水,取2μL待测样本原液加入第1管水中、并用吸头轻轻混匀、此为原液×10-1倍,从第1管中取2μL的10倍稀液加入第2管水中、并轻混为原液×10-2倍,每管换一吸头,原液×10-3…依次类推…原液×10-9。
取10个微型PCR反应管,每管均先加10μl的2×PCR反应液，再加10μl的稀释原液×10-2、原液×10-3、…依次类推…原液×10-9,最后加两管10μl阳性对照和10μl dH2O阴性本底对照；再加入50μl矿物油，进行95℃变性2分钟后,进行20个热循环94℃变性20秒、54℃退火30秒、72℃延伸30秒的第一轮普通PCR扩增。
(4)第一轮普通PCR反应后，按以下配方配制第二轮1×PCR反应液10次×20μl,
取内侧引物1×PCR反应液20μl/管,用加样吸头插入矿物油表层下面小心加入,预先50℃ 2分钟后94℃变性2分钟,再进行30个热循环94℃变性20秒、53℃退火30秒、74℃延伸30秒的第二轮荧光PCR无热盖扩增。
(5)d-PCR终产物荧光显色及计数定量：
第二轮PCR反应后PCR产物管于西安天隆公司荧光检测仪来读取相对荧光吸收值。计数判读:原液×10-2至×10-4管荧光值﹥3000定为1个靶分子/10μL样本；原液×10-5至×10-9管荧光值﹤50定为阴性0个靶分子/10μL样本。推算管原液×10-4至少含1个靶启动子分子/10μL，豆油10mL含10×1000/10×104倍＝1.0×107启动子转基因分子，或约含1.0×106转基因分子/mL豆油。
<110>北京泰格瑞分子检验有限公司
<120>外引物可降解的巢式PCR
<160>9
<210>1
<211>80
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒HBV基因部分序列
<400>1
GTGGATTCGC ACTCCTCCCG CTTACAGACC ACCAATGCCC CTATCTTATC AACACTTCCG 60
… GTCGCAGAAG ATCTCAATCT 80
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aat gcc cct atc tta tca a 19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gat tga gat ctt atg cga c 19
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gtg gat tcg cac ucc tc 17
<210>5
<211>110
<212>DNA
<213>CaMV 35S promoter部分序列
<400>5
TCACTTTATT GTGAAGATAG TGGAAAAGGA AGGTGGCTCC TACAAAATGCC 50
… ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA AGCAAGTGGA 110
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gaa ggt ggc tcc tac aa 17
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tcc acg atg ctc ctc gt 17
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
tca ctt tat tgt gaa gau tag u 22
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
cca ctt gct utg aag acg t 19

Claims (13)

1.外引物可降解的巢式PCR，其特征在于：在单个反应管/孔中巢式PCR完成以下步骤：
(1)外引物扩增：PCR管中加入修饰的外引物PCR反应液，并加入矿物油对PCR反应液进行密封，完成预定扩增程序；所述外引物PCR反应液中采用的外引物末端至中部含有1个或1个以上dU碱基和/或RNA碱基修饰，所述外引物PCR使用Taq、K Taq、H.K Taq,含1-2×常规量的dNTP底物和Mg2+缓冲液；
(2)内引物扩增：于矿物油表层下加入内引物PCR反应液稀释外引物PCR 2-4×倍体积，所述内引物PCR反应液中含有UDG和/或RNA酶，内引物PCR前500C 2-10分钟消化、降解外引物PCR反应液中采用的所述含有1-3个dU碱基修饰和/或RNA碱基修饰的外引物；
内引物PCR反应液含0-1×倍量常规底物和Mg2+。
2.根据权利要求1所述的外引物可降解的巢式PCR，其特征在于：所述内引物PCR反应液中采用的内引物为中部同序引物。
3.根椐权利要求1所述的外引物可降解的巢式PCR，其特征在于，所述含末端RNA碱基和含1-3个dU修饰的外引物中，修饰dU碱基和/或RNA碱基位列于3'末端/或末端和中部，且所述外引物PCR反应液中含有过量的dNTP底物和Mg2+。
4.根椐权利要求1的外引物可降解的单侧半巢式PCR，其特征在于：
所述外引物PCR反应液中仅单侧采用外引物即单侧一条外引物含有所述dU碱基和/或RNA碱基修饰；其另一侧内引物与同侧外引物共用同一序列引物。
5.根椐权利要求1-4任一所述的外引物可降解的巢式PCR，其特征在于：内外引物间隔距离可以200base至0个base接近，作为特例其一端/单侧乃至共用1-3个引物序列，含dU碱基和/或RNA碱基修饰的外侧序列作为设定的外引物，无修饰靠内侧序列为设定的内引物；另一侧常规内外引物，两轮扩增的巢式PCR增敏和dU-UDG加矿物油封闭来彻底杜绝内外引物聚合非特异性。
6.根椐权利要求1所述的外引物可降解的巢式PCR，其特征在于：
所述外引物PCR反应液中的成分如下：dNTP,其中dA、dG、dC的终浓度是dT的2倍，含Mg2+终浓度3.5mM的缓冲液；
所述内引物PCR反应液与外引物PCR反应液体积相同，不含常规底物dA、dG、dC，含dUTP且与所述dT的终浓度相同。
7.根椐权利要求1所述的外引物可降解的巢式PCR，其特征在于：
所述内引物PCR反应液中，UDG酶40×使用浓度为0.05-2.0U/μl，即5U/μl稀释2.5-102倍；RNaseA酶40×使用浓度为0.4-40ug/ml，即4mg/ml稀释102-104倍，或RNaseI 5000U/ml。
8.根椐权利要求1的外引物可降解的巢式PCR，其特征在于：
增敏荧光实时定量PCR时，外引物扩增12-15个循环；内引物扩增30-35个循环；
采用倍比稀释定量PCR时，样本于EP管进行倍比梯度稀释，即取样本×100～1×10-9开始10×倍稀释5-10次或再等比稀释5-10个梯度，确保有靶分子管稀至无靶分子管的转折点落在梯度范围内，外引物扩增20个循环，内引物扩增30-35个循环。
9.根椐权利要求8的外引物可降解的巢式PCR，采用简易数字定量PCR时，内引物扩增30-35个循环后，每孔加入0.5μg/mLEB 2-5μL于矿物油层下面,置反应管于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测。
10.根椐权利要求8所述的外引物可降解的巢式PCR，其特征在于：待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至100-10000个反应单元的聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行所述外引物扩增和所述内引物扩增。
11.根据权利要求1所述的外引物可降解的巢式PCR，其特征在于，用于检测乙型肝炎病毒，
内引物对为：
HBcF:5'—aat gcc cct atc tta tca a–3'
HBcR:5'–gat tga gat ctt atg cga c–3'，其中第13位的a为c人工变异设计而来，
外引物对为：
WhBcF:5'–gtg gat tcg cac Ucc Tc–3'
反向引物为HBcR或dU修饰的HBcR。
12.根据权利要求1所述的外引物可降解的巢式PCR，其特征在于，用于检测食品转基因启动子CaMV 35S，
内引物为:
CaMV F：5'-gaa ggt ggc tcc tac aa-3'
CaMV R：5'-tcc acg atg ctc ctc gt-3'
外引物对：
WCaMV F：5'-tca ctt tat tgt gaa gaU tag U-3'
WCaMV R：5'-cca ctt gct Utg aag acG t-3'。
13.一种用于权利要求1-12任一所述外引物可降解的巢式PCR方法的试剂盒，其特征在于：包括用于外引物扩增的试剂和用于内引物扩增的试剂；
所述外引物扩增的试剂包括含有过量Mg2+的PCR反应缓冲液；
所述内引物扩增的试剂包括不含Mg2+的PCR反应缓冲液,以及UDG酶和/或RNA酶。
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