KR20030087636A

KR20030087636A - 전사 기초한 증폭을 이용하는 ｈｂｖｄｎａ의 증폭 및검출 방법

Info

Publication number: KR20030087636A
Application number: KR10-2003-7011679A
Authority: KR
Inventors: 데이만버짓알베르타루이자마리아; 프란트젠잉게마르욜레인; 스트립아놀디나마가레타빌헬미나
Original assignee: 바이오메리욱스 비.브이.
Priority date: 2001-03-07
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2003-11-14
Also published as: EP1383915B1; WO2002072881A3; KR100948020B1; CN1501983A; CN1269966C; US20080241891A1; AU2002235940A1; BR0207893A; BRPI0207893B8; BRPI0207893B1; US20060051740A1; EP1383915A2; HK1065338A1; US7723078B2; JP2004525632A; WO2002072881A2

Abstract

본 발명은 샘플 내에 임의로 존재하는 HBV DNA로부터 출발하는, 표적 HBV 핵산의 증폭을 위한 전사 기초한 증폭 방법에 관한 것인데, 이 방법은

- 선택된 제한 부위에서 HBV DNA를 절단할 수 있는 1종 이상의 제한 효소를 가진 증폭 완충액 내에서 HBV를 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 항온처리하는 단계로서, 상기 증폭 완충액은 상기 HBV DNA 스트랜드(들)의 한정된 3' 단부를 생성하는 제한 효소, DNA 의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 서열을 포함하는 5' 영역과 상기 DNA 스트랜드의 한정된 3' 말단에 상보적인 3' 영역을 보유하는 프로모터-프라이머, 상기 프로모터-프라이머의 반대 극성을 보유하고 상기 표적 서열의 5' 단부를 포함하는 제2 또는 역방향 프라이머, 및 표적 서열로서 HBV ssDNA의 경우, 제한 프라이머를 보유하는 것인 단계;

- 이렇게 생성된 반응 혼합물을 제한 효소에 의한 절단이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 유지하는 단계;

- 제한 효소를 불활성화시키고/시키거나 이중 스트랜드가 적어도 부분적으로 단일 스트랜드로 되기에 충분한 시간과 온도에서 이렇게 얻은 샘플을 열처리하는 단계;

- 상기 샘플에

RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소,

DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소,

RNase H 활성을 보유하는 효소, 및

RNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소

를 첨가하는 단계; 및

- 이렇게 생성된 반응 혼합물을 증폭이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 유지시키는 단계

를 포함한다.

Description

전사 기초한 증폭을 이용하는 ＨＢＶＤＮＡ의 증폭 및 검출 방법{METHOD FOR THE AMPLIFICATION AND DETECTION OF HBV DNA USING A TRANSCRIPTION BASED AMPLIFICATION}

핵산 증폭 방법은 분자생물학 및 재조합 DNA 기법 분야에서 사용된다. 이들 방법은 다양한 종류의 다른 핵산, RNA 및 DNA도 존재하는 환경에서 소량으로 존재하는 특정 핵산 서열의 사본수를 증가시키기 위해 사용된다. 구체적으로, 핵산 증폭 방법은 핵산의 검출 및 정량화를 용이하게 하는데 사용되며, 예를 들어 감염성 질병, 유전병 및 다양한 유형의 암을 진단하기 위해 중요하다. 또한, 핵산 증폭 방법은 핵산이 매우 소량으로 존재할 수 있는, 법의학, 고고학 또는 친부 확인 등과 같이 샘플을 조사하는 다른 분야에서 그들의 적용이 확인되어 왔다. 몇몇 핵산 증폭 기법은 상기한 작용 메카니즘에 기초하는 것으로 알려져 있다. 핵산 증폭을 위한 한가지 방법은 유럽 특허 출원 EP 200362 및 EP 201148에 기술된 "폴리머라제 연쇄 반응(PCR)"으로 알려져 있다.

본 발명은 "전사 기초한 증폭 기법"이라 칭하는 상이한 부류의 핵산 증폭 방법에 관한 것이다. 이들 방법을 이용하여 다수의 RNA 사본은 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 기능적 프로모터를 포함하는 DNA 주형으로부터 얻는다. 상기 RNA 사본은 새로운 DNA 주형이 얻어지는 표적으로서 사용된다. WO 88/10315에서 Gingeras 등 및 WO 89/1050에서 Burg 등은 이러한 방법을 기술하고 있다. 등온 전사 기초한 증폭 방법은 EP 323822에서 Davey 등(NASBA 방법과 관련되어 있음), EP 373960에서 Gingeras 등 및 EP 408295에서 Kacian 등에 의해 기술되어 있다. 또한, 전사 기초한 증폭 반응은 열안정성 효소를 이용하여 수행할 수 있다. 전사 기초한 증폭은 일반적으로 약 41℃의 온도에서 수행된다. 열안정성 효소는 반응을 더 높은 온도에서 수행하는 것을 가능하게 한다. 이러한 열안정성 방법은 도요 보세키 가부시키가이샤 명의로 출원된 EP 682121에 기술되어 있다. EP 323822, EP 373960 및 EP 408295에 기술된 바와 같은 방법은 등온 연속법이다. 이들 방법을 이용하여 증폭을 수행하기 위해서는 4개의 효소 활성, 즉 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성, DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성, RNase (H) 활성 및 RNA 폴리머라제 활성이 필요하다. 이들 활성의 일부분은 한 효소 내에 조합될 수 있으며, 따라서 통상적으로 단지 2개 또는 3개의 효소만이 필요하다. 역전사효소, 예를 들어 AMV(Avian Myoblastosis Virus; 조의 골수아세포증 바이러스) 또는 MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus; 쥐 백혈병 바이러스) 역전사효소와 같은 역전사효소는 RNA-의존성 및 DNA 의존성 DNA 폴리머라제를 보유하지만, 또한 고유의 RNase H 활성도 보유한다. 또한, RNase는 이. 콜리 RNase H와 같은 RNase를 전사 기초한 증폭 반응의 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. DNA 의존성 RNA 폴리머라제는 RNA 폴리머라제에 의해 인식된 프로모터를 포함하는 DNA 주형으로부터 다수의 RNA 사본을 합성한다. RNA 폴리머라제의 예로는 이. 콜리로부터 유래한 폴리머라제 및 박테리오파지 T7, T3 및 SP6으로부터 유래한 폴리머라제를 들 수 있다. 전사 기초한 증폭에 통상적으로 사용되는 RNA 폴리머라제의 예는 T7 폴리머라제이다. 따라서, RNA의 다수의 사본을 생성하기 위해 사용된 주형 내에 통합된 프로모터는 T7-프로모터이다. 통상적으로, 프로모터를 포함하는 주형은 표적 서열을 포함하는 핵산으로부터 출발하여 생성될 수 있다. 상기 핵산은 증폭 반응을 위한 주입물로서 사용되는 출발 물질내에 존재할 수 있다. 출발 물질내에 존재하는 핵산은 통상적으로 훨씬 더 긴 서열의 일부분으로서 표적 서열을 함유할 것이다. 추가의 핵산 서열은 표적 서열의 3'-단부 및 5'-단부 둘다에 존재할 수 있다. 증폭 반응은 출발 물질로부터 유래한 이 핵산, 함께 상기한 활성을 제공하는 적합한 효소 및 하나 이상이나 통상적으로 두개의 올리고뉴클레오티드(들)를 함께 제시함으로써 개시시킬 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드들중 하나 이상은 RNA 폴리머라제 프로모터의 서열을 포함하야만 한다. 전사 기초한 증폭 방법은, 단일 또는 이중 스트랜드 DNA가 주입 물질로서 사용될 수 있음에도 불구하고, 주입 물질이 단일 스트랜드 RNA인 경우, 특히 유용하다. 전사 기초한 증폭 방법이 표적 서열의 3'-단부 및 5'-단부 둘다에 추가 서열을 갖는 단일 스트랜드 RNA인 경우, 종래 기술에 기술된 바와 같은 방법과 함께 용이하게 사용되는 한쌍의 올리고뉴클레오티드는

- 올리고뉴클레오티드가 그의 5'-단부(이 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화 부분은 주입 물질로서 사용된 표적 RNA로서 반대 극성을 가짐)에 부착된 프로모터(바람직하게는 T7 프로모터)의 서열을 보유하는, 표적 서열의 3'-단부에 하이브리드화할 수 있는 제1 올리고뉴클레오티드(통상적으로 "프로모터-프라이머" 또는 "순방향-프라이머"라 칭함);및

- 표적 서열의 5'-단부(이 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA와 동일한 극성을 보유함)를 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드(통상적으로 "역방향 프라이머"라 칭함)

로 구성된다. 적합한 활성을 가진 모든 효소 및 필요한 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드의 충분한 공급과 함께 상기한 바와 같은 한 쌍의 올리고뉴클레오티드는 함께 한 반응 혼합물 내에 존재하고, 충분한 시간 동안 적합한 조건(즉, 적합한 온도에서 적합한 완충 조건) 하에 존재하는 경우, 증폭 반응이 개시될 것이다. 상기한 방법의 여러가지 변형된 방법들이 종래 기술에 기재되어 있다. 전사 기초한 증폭 반응은 RNA 폴리머라제(예를 들어, T7 RNA 폴리머라제)에 의해 인식된 프로모터(예를 들어, T7 프로모터)를 포함하는 주형으로부터 단일 스트랜드 RNA 전사체의 합성을 포함한다. 프로모터 서열을 포함하는 순방향 프라이머는 표적 RNA에 상보적인 DNA의 스트랜드의 합성을 개시하기 위한 프라이머로서 작용한다.

상기 프라이머는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제의 활성에 의해 신장될 것이다. 형성된 RNA-cDNA 하이브리드는 RNase H에 의해 분해될 것이다. 이는 cDNA에 대한 특정 역방향 프라이머의 하이브리드화를 가능하게 한다. cDNA의 5' 단부까지 RNA 의존성 DNA 폴리머라제에 의한 이 프라이머의 신장은 이중 스트랜드 프로모터 서열을 형성시킴으로써 순방향 프라이머의 부분인 프로모터 서열이 주형으로서 사용된다. 이어서, 상기 이중 스트랜드 프로모터는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제에 의해 표적 RNA에 상보적인 다수의 새로운 RNA 분자를 생성하기 위해 사용될 것이다. 이러한 개시 단계 이후, 증폭은 순환 단계로 진입한다. 실제로, 샘플 내에서 단일 스트랜드 RNA로부터 출발하는 전체 서열의 이벤트는 모든 성분이 함께 투입되며, 혼합물이 적합한 온도에 이르러 모든 효소가 활성을 갖게 되자마자 일어날 것이다. 상기 방법의 실시자는 이들 단계중 임의의 단계를 수행하기 위해 중단시킬 필요가 없다.

상기한 바와 같이, 전사 기초한 증폭 방법은 단일 스트래드 RNA로부터 출발하는 증폭에 특히 유용하다. 증폭하려는 핵산을 포함하는 출발 물질은 한정된 길이의 RNA로서 표적 핵산을 함유할 수 없다. 전사 기초한 증폭 방법이 단지 이중 스트랜드 DNA(환형 DNA 또는 선형 DNA)로서 표적 서열을 포함하는 출발 물질 상에서 수행되는 경우, DNA는 단일 스트랜드 핵산으로 전환되어야만 한다. 이는 고온(100℃ 이하)을 가하여 이중 스트랜드 DNA의 스트랜드를 분리함으로써 수행할 수 있다. 증폭에서 프라이머로서 사용된 제1 올리고뉴클레오티드는 단일 스트랜드중 하나에 어닐링될 수 있다. 현재의 전사 기초한 증폭 방법과 함께 사용된 효소는 이러한 고온을 견딜 수 없으며, 결과적으로 DNA 스트랜드가 분리된 이후에 첨가하여야 한다. 올리고뉴클레오티드중 하나가 단일 스트랜드 DNA에 어닐링되고 신장되는 경우, 이중 스트랜드 DNA가 다시 생성되며, 반응 혼합물은 이중 스트랜드 DNA를 그의 다시 분리된 스트랜드로 용융시키기에 충분히 높은 온도로 가열하여야만 한다. 또한, 효소는 불활성화되며, 가열 단계를 수행한 이후에 새로운 효소를 첨가하여야만 한다. 제2 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 제1 단계에서 신장된 제1 올리고뉴클레오티드로부터 생성된 스트랜드에 어닐링될 수 있다. 올리고뉴클레오티드중 하나가 DNA 의존성 RNA 폴리머라제의 5' 프로모터 서열을 포함하기 때문에(상기 참조), 이중 스트랜드 작용성 프로모터를 포함하는 이중 스트랜드 DNA 주형이 획득되며, 이로부터 RNA 생성의 제1 단계가 일어날 수 있다. 생성된 RNA 전사체는 증폭의 순환 단계로 진입할 수 있으며, 상기 가정은 추가로 등온 과정일 수 있다. 상기한 바로부터 이중 스트랜드 DNA로부터 전사 기초한 증폭 방법을 개시하는 것은 지루한 과정일 수 있는 것으로 입증되었다. 이는 실시자에 의해 채택되어야만 하는 몇몇 특정 작업을 필요로하며; 샘플은 가열과 냉각을 반복해야 하며, 효소는 각각의 가열 단계 이후에 폐기하여야만 한다.

상기한 바와 같은 지루한 과정을 회피하고, dsDNA를 순환 등온 전사 기초한 증폭을 위한 주입물로서 사용될 수 있는 ssRNA로 전환시키기 위해, dsDNA로부터 출발할 수 있는 전사 기초한 증폭 방법을 개발하기 위한 몇몇 연구가 이미 이루어졌다.

오히려 dsDNA를 위한 단순한 전사 기초한 증폭 방법은 WO 99/25868에 기재되어 있다. WO 99/25868에 기재된 방법에 따라, 샘플 내의 dsDNA는 임의의 열 처리 단계[90℃ 이상]를 전혀 사용하지 않고, 바람직하게는 단지 1회의 초기 열 처리 단계만을 이용하고 전사 기초한 증폭 프로토콜을 직접적으로 이용하여 증폭시킬 수 있다. 상대적으로 짧은 dsDNA는 이 방법에 적합할 수 있다. 실질적으로, 상기 방법은 ssRNA를 증폭시키는 종래의 전사 기초한 증폭 프로토콜과 본질적으로 다르지 않다.

대안으로, 출발 물질내의 이중 스트랜드 DNA는 증폭 개시 이전에 RNA로 전사될 수 있다. 이러한 부가 단계는 효소, 예를 들어 폴리머라제 결합 부위로 칭하는 프로모터 서열을 이용하지 않고도 이중 스트랜드 DNA를 RNA로 전사시키는 이. 콜리 RNA 폴리머라제에 기초할 수 있다. 이러한 전사 기초한 증폭 방법에 의한 이중 스트랜드 DNA의 증폭을 용이하게 하는 여분의 과정은 WO 96/02668에 기재되어 있다. 상기 문헌에 기재된 여분의 과정은 여분의 처리 단계 및 처리 시간 뿐만 아니라 추가 성분, 즉 이. 콜리 RNA 폴리머라제의 이용을 포함한다.

dsDNA를 위한 전사 기초한 증폭 방법을 위한 적합한 주형을 제조하기 위한 다른 방법은 EP 397269에 기술되어 있다. 상기 특허에 기술된 방법에서, dsDNA는 제한 효소를 이용하여 전처리한다. 제한 효소를 이용하는 전처리 후, 단일 스트랜드 DNA(ssDNA)를 생성하기 위해 단지 하나의 열 분리 단계만이 필요하다. 이 방법에 따르면, RNA 폴리머라제(예를 들어, T7 RNA 폴리머라제)에 의해 인식된 프로모터 서열을 포함하는 5' 단부 및 DNA의 단일 스트랜드중 하나의 바로 3' 단부에 상보적인 서열을 포함하는 3' 부분을 보유하는 순방향 프라이머(프로모터-프라이머)가 사용된다. 상기 프로모터-프라이머가 DNA의 단일 스트랜드의 3' 단부에 하이브리드화되는 경우, 이중 스트랜드 복합체가 형성되는데, 이는 순방향 프라이머의 5' 프로모터 서열이 DNA 스트랜드의 3' 단부으로부터 출발하는 신장 반응을 위한 주형으로서 사용될 수 있는 것이다. 따라서, 이중 스트랜드 프로모터는 DNA 의존성 DNA 폴리머라제에 의해 형성되며, 생성된 복합체는 다수의 RNA 사본을 합성하는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 위한 주형으로서 기능할 수 있다.

또한, WO 91/04340에는 단일 스트랜드 DNA를 위한 전사 기초한 증폭 반응을 개시하기 위한 몇몇 방법이 기술되어 있다. 프로모터 프라이머의 3' 서열과 하이브리드화할 수 있는, DNA의 적합한 3' 단부를 생성하기 위해 제한 효소를 사용할 수 있다. WO 91/04340에는 ssDNA를 절단하는 제한 효소를 이용하여 ssDNA 상에 한정된 3' 단부가 어떻게 생성되는지 기술되어 있다. 동일한 방법의 다른 구체예에서, dsDNA를 절단하는 제한 효소와 함께 표적 ssDNA에 하이브리드화하는 제한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제한 효소에 의해 절단될 수 있는 이중 스트랜드 DNA 조각을 생성하고, 적합한 3' 단부를 생성한다. 이 방법에서, 제한 효소가 이중 스트랜드 복합체를 절단한 후, 제한 올리고뉴클레오티드의 작은 조각은 잔류할 것이다. 그러나, WO 91/04340의 개시 내용에 따르면, 제한 올리고뉴클레오티드는 절단 후에 잔류 조각이 ssDNA의 3' 단부에 하이브리드화할 정도로 작아 프로모터 올리고뉴클레오티드를 위한 여지를 남겨두는 방식으로 선택되는 것이 명백하다. 그러나, 종래 기술의 방법을 사용하는 경우와 같이 제한 효소를 이용하는 전처리는, 민감한 전사 기초한 분석법임에도 불구하고, 많은 여분의 처리 단계 및 처리 시간을 필요로한다.

인간에게 B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 만연되어 있다. B형 간염을 유발하는 이 바이러스는 인간과 침팬지만을 감염시킨다. 간염의 감염은 3개의 일반적인 메카니즘, 즉 (1) 수혈과 같이 다량으로 또는 우발적인 피부상처에 의해 소량으로 감염된 혈액 또는 체액의 비경구 접종; (2) 가까운 가족 또는 성적 접촉; 및 (3) 신생아에게 바이러스를 전달하는 일부의 모친에 의해 전달된다. 천연 조건 하에서,HBV는 감염성이 매우 높은 것은 아니다. 감염이 일어나더라도 흡입에 의한 전달은 거의 일어나지 않는다. 오염된 혈액 또는 혈액 생성물을 통한 전달 경로가 인간의 건강을 주로 위협한다. 종종, HBV 감염은 준임상적 자가 제한 간 질환 또는 급성 자가 제한 간 질환을 을 유발하거나 만성적인 장기간의 감염을 유발할 수 있다. 만성적인 HBV 감염은 가장 심각한 형태의 만성적인 활성 감염으로부터 덜 심각한 만성적인 지속성 간염과 자각증상이 없는 보균 상태에 이르기까지 다양한 질병을 유발한다. 최근 여러가지 종류의 진단 분석법이 개발되어 임상병리사로 하여금 B형 간염과 다른 종류의 바이러스에 의한 간염(A형 간염, C 간염 또는 E형 간염)을 구별할 수 있도록 도움을 주고 있다. 그러나, 급성 B형 간염 감염과 증상이 있는 만성 B형 간염 감염을 구별할 수 있는 능력은 아직 문제가 있다. 만성 활성 간염 및 만성적인 지속성 간염 환자는 종종 간 손상의 급작스러운 악화와 정상적인 간 기능이 번갈이 일어나는 것을 특징으로 하는 간염의 순환 패턴을 나타내고 있기 때문에, 이는 특히 중요한 문제이다.

HBV 감염후, 다량의 바이러스 및 관련 입자가 혈청 내에 존재한다. 감염의 증후성 단계중에, 급성 및 만성 HBV 환자 둘다는 간 효소 레벨이 상승하며, 그들의 혈청 내에 B형 간염 표면 항원(HBsAg)을 보유하며, 뉴클레오캡시드 항원(HBcAg)에 대한 항체를 형성한다. HBsAg 또는 B형 간염 e 항원(HBeAg)에 특이적인 항체는 검출되지 않았다. HBsAg에 대한 항체의 출현은 통상적으로 순환하는 HBsAg가 사라진 후 약 2개월이 될 때까지 관찰되지 않았다. 혈청 내에 존재하는 바이러스 입자는 코어 항원(HBcAg)로 알려진 뉴클레오캡시드를 노출하는 그들의 표면 코트를 숨기는것으로 알려져 있다. HBcAg의 항체 생성은 HBV 감염의 급속 단계의 과정에서 초기에 일어나며, 수년간 지속될 수 있으며, 만성적으로 감염된 환자는 높은 역가의 항-HBc 항체를 생성할 수 있다.

HBsAg는 급성 또는 만성 B형 간염 감염의 가장 중요한 마커인데, 감염된 개체의 혈청 내에서 검출할 수 있다. 예를 들어, 공여체 혈액의 HBsAg 스크리닝은 B형 간염의 전달을 피하기 위해서 필수적인 것이다. 감도가 진단적 HBV 분석법에서 매우 중요한 것은 명백하다.

HBV는 알려진 가장 작은 DNA 바이러스이며; 그의 게놈은 매우 팩킹된 구조를 나타낸다. HBV의 복제 사이클에서 톡특한 점은 예비 게놈 mRNA가 제1 바이러스 DNA 스트랜드의 합성을 위한 주형으로서 작용한다는 것이다. 후속적으로, HBV DNA 폴리머라제의 RNase H 활성은 mRNA를 제거하고, 이어서 상보적인 DNA 스트랜드가 합성되고, 비리온 내에 팩킹하기 위해 부분적으로 이중 스트랜드인 DNA를 생성한다. 성공적인 바이러스 진입이 이루어지면, 부분적으로 이중 스트랜드인 DNA 분자는 완전히 이중 스트랜드인 DNA로 전환된다. HBV DNA는 90% 이상의 경우에 HBsAg 및 HBeAg 양성인 감염된 숙주의 혈액 내에서 검출할 수 있다. 감염성 입자의 양을 측정하는 방법은 혈청 또는 혈장 내에서 바이러스 DNA의 양을 측정함으로써 이루어지는데, 그 이유는 이러한 방법이 복제하는 바이러스의 양을 가장 신뢰할 수 있도록 반영하기 때문이다. 몇몇 분석법은 이러한 목적을 위해 사용되는데, 그 예로는 분지된 DNA(bDNA) 분석법[참조: Hendricks DA, Stowe BJ, Hoo BS, Kolberg J, Irvine BD, Neuwald PD, Urdea MS, Perrillo RP, 1995, Quantitation of HBV DNA in humanserum using a branched DNA(bDNA) signal amplification assay. Am J Clin Pathol 104: 537-546], DNA 하이브리드화 분석법 및 정성적 PCR[참조: Pawlotsky JM, Bastile A,vLonjon I, Remire J, Darthuy F, Soussy CJ, Dhumeaux D, 1997. What technique should be used for routine detection and quantitation of HBV DNA in Clinical samples? Joirnal of Virological Methods 65: 245-253; Zaaijer HL, ter Borg F, Cuypers HT, Hermus MC, Lelie PN 1994. Comparision of methods for detection of hepatitis B virus DNA. J Clin Microbial 32: 2088-2091]를 들 수 있다. 그러나, 이들 대부분의 분석법은 단지 제한된 감도만을 보유한다.

본 발명은 HBV DNA의 증폭을 위한 전사 기초한 증폭 방법에 관한 것이다.

도 1은 제한 효소 절단을 포함하는 DNA NASBA의 모식도이다. 제한 효소(화살표)는 NASBA의 개시 단계 중에만 활성을 유지하였다. 절단 후, 순방향 프라이머는 주형에 하이브리드화된다. AMV RT는 주형으로서 T7 프로모터 서열(암회색)을 포함하는 순방향 프라이머를 이용하여 DNA의 표적 스트랜드(흑색)의 3' 단부를 신장시킬 것이다. T7 DdRp는 이중 스트랜드 T7 프로모터 서열을 인지할 것이며, RNA 앰플리콘(밝은 회색) 생성이 개시될 것이다. RNA 앰플리콘 서열은 표적 DNA 스트랜드에 상보적이다. 순환 단계중에, RNA 앰플리콘은 증폭될 것이며, 분자 비컨 기법에 의해 검출될 것이다. RNase H 및 역방향 프라이머는 단지 순환 단계에서만 필요하다.

도 2는 순방향 프라이머 S-p3.8과 함께 XbaI을 이용하여 절단 및 절단하지 않은 HBV DNA의 NASBA를 나타낸다. XbaI을 이용하는 절단 후, S-p3.8은 표적 DNA의 신장을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 프라이머 S-p4.5는 역방향 프라이머 및프로브로서 분자 비컨 S-WT2로 사용된다. 무주형(NT) 샘플은 음성 대조군으로 사용된다.

도 3은 순방향 프라이머 S-p3.10과 함께 BssSI을 이용하여 절단 및 절단하지 않은 HBV DNA의 NASBA를 나타낸다. BssSI을 이용하는 절단 후, S-p3.10은 표적 DNA의 신장을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 프라이머 S-p4.5는 역방향 프라이머 및 프로브로서 분자 비컨 S-WT2로 사용된다. 무주형(NT) 샘플은 음성 대조군으로 사용된다.

도 4는 순방향 프라이머 S-p3.10과 함께 XbaI을 이용하여 절단 및 절단하지 않은 HBV DNA의 NASBA를 나타낸다. XbaI을 이용하는 절단 후, S-p3.10은 표적 DNA의 신장을 위한 주형으로서 사용될 수 없었다. 프라이머 S-p4.5는 역방향 프라이머 및 프로브로서 분자 비컨 S-WT2로 사용된다. 무주형(NT) 샘플은 음성 대조군으로 사용된다.

도 5는 순방향 프라이머 S-p3.8과 함께 BssSI을 이용하여 절단 및 절단하지 않은 HBV DNA의 NASBA를 나타낸다. BssSI을 이용하는 절단 후, S-p3.8은 표적 DNA의 신장을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 프라이머 S-p4.5는 역방향 프라이머 및 프로브로서 분자 비컨 S-WT2로 사용된다. 무주형(NT) 샘플은 음성 대조군으로 사용된다.

도 6은 순방향 프라이머 S-p3.5와 함께 AvrII를 이용하여 절단 및 절단하지 않은 HBV DNA의 NASBA를 나타낸다. AvrII를 이용하는 절단 후, S-p3.5는 표적 DNA의 신장을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 프라이머 S-p4.4는 역방향 프라이머및 프로브로서 분자 비컨 S-WT2로 사용된다. 무주형(NT) 샘플은 음성 대조군으로 사용된다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가 예시될 것이다.

본 발명은 제한 효소 절단을 포함하는 전사 기초한 증폭 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 H형 간염 바이러스의 DNA의 민감성 및 특이성 증폭 (및 후속 검출)을 가능하게 한다. 본 발명의 방법을 이용하면, HBV DNA는 종래 기술의 전사 기초한 증폭 방법 보다 더 효율적인 방식으로 증폭 및 검출할 수 있다. 종래 기술의 방법과는 대조적으로, 제한 효소의 이용은 본 발명의 방법에서 사용된 과정을 복잡하게 만들지 않는다.

본 발명은 샘플내에 임의로 존재하는 HBV DNA로부터 출발하는, 표적 HBV 핵산 서열의 전사 기초한 증폭 방법을 제공하는데, 이 방법은

- 선택된 제한 부위에서 DNA를 절단할 수 있는 1종 이상의 제한 효소를 가진 증폭 완충액 내에서 HBV를 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 항온처리하는 단계로서, 상기 증폭 완충액은 상기 HBV DNA 스트랜드(들)의 한정된 3' 단부를 생성하는제한 효소, DNA 의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 서열을 포함하는 5' 영역과 상기 DNA 스트랜드의 한정된 3' 말단에 상보적인 3' 영역을 보유하는 프로모터-프라이머, 상기 프로모터-프라이머의 반대 극성을 보유하고 상기 표적 서열의 5' 단부를 포함하는 제2 또는 역방향 프라이머, 및 표적 서열로서 HBV ssDNA의 경우, 제한 프라이머를 보유하는 것인 단계;

- 이렇게 생성된 반응 혼합물을 제한 효소에 의한 절단이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 유지시키는 단계;

- 제한 효소를 불활성화시키고/시키거나 이중 스트랜드가 적어도 부분적으로 단일 스트랜드로 되기에 충분한 시간과 온도에서 이렇게 얻은 샘플을 열 처리하는 단계;

- 상기 샘플에

RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소,

DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소,

RNase H 활성을 보유하는 효소, 및

RNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소

를 첨가하는 단계; 및

를 포함한다.

[적합한 증폭을 위해] 필요한 (적합한) 뉴클레오시드 트리포스페이트는 제한효소(들)와 함께하는 항온처리 단계 중에, 예를 들어 상기 증폭 완충액의 일부분으로서 이미 존재할 수 있다. 그러나, 이들은 상기 과정 이후에 첨가될 수도 있는데, 예를 들어 열 처리 후 효소와 함께 첨가할 수 있다.

당업자는 전사 기초한 증폭 방법을 위해 사용된 효소들 및 전사 기초한 증폭 방법이 수행되는 조건을 알고 있으며, 전사 기초한 증폭 반응을 최적화시키는 것에 관해 수행될 수 있는 일반적인 변경을 모두 인식할 수 있을 것이다. 예를 들어, 순방향 프라이머 즉, 프로모터 프라이머는 프라이머의 5' 단부 상의 프로모터 서열과 상기 프라이머의 3' 단부 상의 하이브리드화 서열 사이의 퓨린 영역을 포함할 수 있다. 상기 프라이머의 서열은 선택된 제한 부위의 위치에 의해 대략 결정된다. 순방향 프라이머의 3' 단부는 제한 부위에 바로 인접하는 표적 서열에 어닐링되어야만 한다. 상기 프라이머는 증폭 반응에 사용된 조건 하에서 하이브리드화할 정도로 충분히 긴 길이이기만하면 그 길이는 가변적일 수 있다. 일반적으로, 상기 프라이머의 하이브리드화 부분은 약 10개 내지 약 35개의 뉴클레오티드로 구성된다.

표적이 HBV ssDNA인 경우, 본 발명의 방법에 사용된 제한 프라이머는 그들이 순방향 프라이머와 함께 나타내는 중첩이 최소이며, 제한 부위의 서열은 제한 효소가 DNA를 실질적이며 효율적으로 절단하는 방식으로 혼입될 필요가 있다.

제한 효소는 선택된 부위(즉, 제한 효소에 의해 인식되는 특이적인 뉴클레오티드 서열)에서 dsDNA를 절단할 수 있는 효소이다. 본 발명의 방법을 위해 적합한 제한 효소를 선택함에 있어서, 주의를 기울여야 하는 사항은 제한 부위가 표적 DNA의 모든 이형내에 존재하도록 해야 하다는 것이다(예를 들어, 증폭이 샘플 내에서바이러스 DNA를 검출하기 위해 수행되는 경우, 특정 바이러스의 모든 유전형 내에 존재하는 제한 부위). 제한 부위는 프라이머들 사이의 DNA 서열 내에 존재해서는 안된다.

제한 효소의 첨가는 DNA의 표적 스트랜드의 한정된 3' 단부를 생성시키는데, 이어서 이는 프로모터 프라이머의 하이브리드화 부분에 결합할 수 있다. 이러한 관점에서, 절단으로 인해 상기 DNA의 그 부분의 변성은 개선될 것이며, 따라서 프라이머 결합이 용이해질 것이다.

T7-프로모터 서열을 함유하는 프로모터 올리고뉴크레오티드는 하이브리드화 부분이 제한 부위의 직 상류에서 주형과 상호작용하는 방식으로 설계되어야만 한다. DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소(일반적으로 MMLV-RT 또는 AMV-RT와 같은 역전사효소)는 주형으로서 프라이머를 이용하여 제한 효소를 이용하는 절단에 의해 생성된 DNA의 표적 스트랜드의 3' 단부를 신장시킬 수 있다. 이중 스트랜드 T7 프로모터 서열이 형성될 것이며, 앰플리콘 RNA의 생성이 개시될 것이다.

놀랍게도, 제한 효소는 전사 기초한 HBV DNA 증폭 과정에 적합하며 이에 적용되는 환경에서 효율적으로 사용될 수 있음이 확인되었다. 달리 표현하면, 전사 기초한 증폭을 위한 주입물로서 사용되는 HBV DNA를 절단하기 위한 제한 효소의 이용은 복합하고 부가적인 샘플의 처리를 유발하지 않는 것으로 확인되었다. 제한 효소의 이용은 전사 기초한 DNA 증폭을 위한 프로토콜의 이미 일반적인 부분인 단계에 혼입되어, 상기 단계의 일부분이다. 모든 기존의 방법은 실질적인 전사 기초한증폭 이전에 별도의 전처리로서 전사 기초한 증폭용 DNA 주형의 제조에서 제한 효소의 이용을 기술한다. 결과적으로, 종래 DNA 주형을 제조함에 있어서 제한 효소의 이용은 제한 효소의 별도의 불활성화 및 DNA의 별도의 정제와 같은 샘플의 추가 처리를 유발한다. 이는 전체적인 증폭 과정을 복잡하게 하며, 특히 자동화된 과정을 복잡하게 하며, 오염의 위험성을 증가시킨다. 제한 효소와 함께 제한 올리고뉴클레오티드의 첨가가 WO 91/04340에 이미 기술되어 있음에도 불구하고, 본 발명의 이전에 전사 기초한 증폭과 함께 제한 효소(및 올리고뉴클레오티드)가 어떻게 효율적으로 사용될 수 있는가는 개시된 바 없다. 종래 기술에서는 추가 샘플 처리 단계 및 시약 첨가 단계를 사용하지않고 제한 효소를 전사 기초한 증폭과 함께 이용하는 것은 개시된 바 없다. 본 발명의 방법은 종래 기술의 전사 기초한 DNA 증폭 과정을 복잡하게 하지 않고 이를 함께 이용하는 것이다.

본 발명의 방법은 통상적인 전사 기초한 증폭 방법과 거의 다르지 않다. 본 발명에서 고려한 유일한 추가 단계는 제한 효소와 함께 샘플의 "빌트 인 항온처리(built in incubation)"인데, 이는 샘플의 실질적인 처리가 기존의/종래 전사 기초한 DNA 증폭 과정과 다르지 않은 방식으로 제한 효소를 사용하는 것을 의미한다. 물론, 본 발명의 방법에 사용된 바람직한 제한 효소는 상대적으로 안정하며, 증폭 완충액(상대적으로 고농도의 염을 함유함)을 포함하는 반응 혼합물에 첨가되는 조건 하에서 높은 활성을 보유하는 효소이다.

제한 효소를 첨가한 후, 샘플은 효소가 활성을 갖게 되는 적합한 조건 하에서 적합한 시간 동안 항온처리할 필요가 있다. 샘플은 명백하게는 사용된 제한 효소의 특성에 따라 약 35℃ 내지 약 45℃, 더 구체적으로 약 37 내지 41℃에서 상대적으로 짧은 시간, 바람직하게는 약 10 내지 20분, 더 바람직하게는 약 15분 동안 제한 효소와 함께 항온처리할 수 있다. 실제로, 이는, 종래의 전사 기초한 DNA 증폭 방법과 비교하는 경우, 단지 추가로 고려해야 하는 사항이다. 본 발명의 방법은 제한 효소와 함께 항온처리한 후 샘플을 가열하는 단계를 포함한다. 이와 같은 가열 중에, 제한 효소는 불활성화되며, 이중 스트랜드 DNA는 [적어도 부분적으로] 단일 스트랜드로 된다. 이 가열 단계는 이미 전사 기초한 증폭 방법을 수행하기 위한 프로토콜의 일부이다. 이들 방법은 프라이머 어닐링을 위한 최적 환경을 생성하기 위해, 프라이머-첨가후 샘플의 열 처리를 포함한다. (핵산은 신장되고, 핵산의 스트랜드 및 내부 루프는 분리되고, 냉각중 주형에 대한 프라이머의 하이브리드화는 용이해진다.). 상기 효소와 함께 항온처리한 후의 가열은 약 50℃ 또는 그 이상의 더 낮은 온도에서 수행할 수 있으나, 90℃ 이상의 온도 및 바람직하게는 95 +/-3℃에서 짧은 항온처리 기간(약 5분) 동안 수행하는 것이 바람직하다. 그후, 샘플은 전사 기초한 증폭이 일어날 수 있는 적합한 온도(통상적으로 약 41℃)로 냉각할 수 있다.

가열로 인해, 이중 스트랜드 DNA중 적어도 일부분은 단일 스트랜드로 된다. 프라이머, 특히 프로모터 올리고뉴클레오티드가 샘플의 가열 이전에 이미 존재하기 때문에, 열 처리는 DNA에 대한 프라이머 어닐링을 용이하게 할 수 있다.

따라서, 제한 효소로 처리한 후 샘플로부터 DNA를 정제할 필요가 없다. 상기 효소는 이미 전사 기초한 증폭 과정의 일부분인 열 처리에서 간단히 불활성화된다.본 발명의 방법은 제한 효소가 실질적인 전사 기초한 증폭 반응을 방해할 위험을 제거하기에 충분하다는 사실이 밝혀졌다. 열 처리 후, 전사 기초한 증폭을 위한 추가의 증폭 시약은 통상적인 방식으로 첨가되며, 전사 기초한 증폭은 당업자에게 공지된 통상적인 방식으로 수행할 수 있다.

증폭 효소는 단지 열 처리 후에 첨가되어 열 처리 중 효소의 분해를 예방한다(물론, 이는 열안정성 효소를 사용하지 않는 경우에 국한되는 기술이다).

본 발명의 방법의 주 잇점은, 추가 시약(예를 들어, 제한 효소)을 사용하는 경우에도, 추가의 (별도) 반응 단계 또는 활성화를 수행할 필요가 없다는 점에 있다.

샘플의 추가 처리가 불필요하다는 사실은 특히 중요한데, 그 이유는 샘플의 모든 추가 처리가 오염의 위험성을 증가시키며, 어떠한 대가를 치르더라도 특히 증폭 반응에서는 회피해야만 하는 것이기 때문이다. 또한, 추가 샘플 처리 단계가 필요한 경우, 상기 방법의 자동화를 복잡하게 만든다.

또한, 본 발명의 방법은 단일 스트랜드 DNA에 대해 사용할 수도 있다. 상기 DNA가 단일 스트랜드인경우, 표적 DNA의 제한 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열을 포함하는 제한 올리고뉴클레오티드 또는 제한 프라이머는 제한 효소와 함께 첨가된다. 제한 올리고뉴클레오티드[제한 프라이머]는 단일 스트랜드 DNA에 하이브리드화하며, 제한 효소를 이용하여 절단할 수 있는 이중 스트랜드 복합체를 형성한다. 그러나, 다른 시약(제한 올리고뉴클레오티드)의 첨가는 실시자에 의해 수행되어야 하는 추가 단계를 초래하지 않는다. 상기 제한 올리고뉴클레오티드는 단순히제한 효소 및 증폭을 위해 필요한 다른 올리고뉴클레오티드와 함께 첨가될 수 있다. 따라서, 다른 시약의 첨가를 위해 증폭 시스템을 개방시킬 필요는 없는 것이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 제한 올리고뉴클레오티드의 기능은 DNA 의존성 RNA 폴리머라제(조합된 프로모터 및 제한 프라이머)에 의해 인식되는 프로모터의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 내에 통합된다. 이러한 방식에서, 증폭을 위해 단지 2개의 올리고, 즉 제한 부위를 포함하는 표적 영역에 상보적인 서열이 통합된 프로모터[또는 순방향] 프라이머 및 증폭을 위한 제2 프라이머[또는 역방향] 프라이머가 필요하다. 이 바람직한 [조합된 프로모터 및 제한] 프라이머의 제한 부위를 포함하는 서열은 다음과 같은 방식으로 할당되어야 하는 것이 바람직하다:

- 절단 후, 상기 프라이머의 잔류부는 가열 단계 중에 표적으로부터 변성될 것이다.

- 상기 표적의 하이브리드화 서열의 잔류부는 새로운 조합된 프로모터 및 제한 프라이머가 결합하기에 충분히 길다.

- 제한 부위 주위의 여분의 뉴클레오티드는, 제한 효소의 활성을 위해 필요한 경우, 하이브리드화에 포함된다.

따라서, 조합된 프로모터 및 제한 프라이머의 한 부분은 제한 올리고뉴클레오티드로 작용할 것이며; 이것은 표적 DNA에 어닐링하여 제한 효소에 의해 인식된 제한 부위를 포함하는 dsDNA를 생성한다. 이어서, 상기 제한 효소는 상기 dsDNA를절단할 것이며, 따라서 상기 DNA 상에 한정된 3' 단부를 제공할 것이다.

표적 DNA의 양에 비해 1000배 이상 과량의 조합된 프로모터 및 제한 프라이머가 존재하게 되는 것이 바람직한데, 이는 전사 기초한 증폭 반응에서 종래의 프로모터 프라이머를 위해 이미 일반적인 것이다.

본 발명의 방법은 특히, 상기한 바와 같은 HBV 프라이머 및 HBV 프로브를 이용하여 B형 간염 바이러스(HBV)를 함유하고 있을 것으로 생각되는 샘플 내에서 바이러스 DNA를 증폭 및 검출하는 효율적이며 민감한 방법을 제공한다. 따라서, 이들 HBV 프라이머 및 HBV 프로브는 본 발명의 다른 구체예를 나타낸다.

본 발명의 방법에서 선택된 제한 부위는 HBV의 상이한 유전형 중에서 보존되는 것이 바람직하다. 표적 서열 및 제한 부위가 표면 항원을 암호화하는 HBV 게놈의 부분내에 위치하는 경우, 양호한 결과가 얻어진다. 본 발명의 방법에 특히 유용한 HBsAg 암호 영역 내의 보존된 제한 부위(이들 부위를 절단하는 제한 효소와 함께)는 EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 247-252에 위치하는 XbaI, EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 253-258에 위치하는 BssSI 부위 및 EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 178-183에 위치하는 AvrII 부위이다.

물론, 프라이머의 올리고뉴클레오티드 서열은 선택된 제한 부위의 위치에 의해 거의 결정되었다. 상기 프라이머는 길이가 다양할 수 있는데, 이는 증폭 반응과 함께 사용된 조건 하에서 하이브리드화되기에 충분한 길이임을 조건으로 한다. 일반적으로, 프라이머의 하이브리드화 부분은 약 10 내지 약 35개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드로 구성된다. 순방향 프라이머의 5' 단부는 제한 부위 바로 다음의 표적 서열에 어닐링된다. 역방향 프라이머의 위치는 덜 결정적인데, 이는 프로브가 순방향 프라이머 영역 및 역방향 프라이머 영역 사이의 영역에서 증폭된 표적 서열에 하이브리드화하도록 하는 순방향 프라이머의 위치로부터 충분히 떨어진 보존된 영역의 일부분의 서열을 보유하여야만 한다. 바람직한 제한 프라이머는 순방향 프라이머와의 최소 중첩을 보유하는 올리고뉴크레오티드이며, 제한 효소가 이렇게 형성된 dsDNA를 실질적으로 절단할 수 있는 방식으로 제한 부위의 서열을 포함하며, 충분한 방식으로 HBV DNA와 하이브리드화하기 위해 충분히 길다.

XbaI, BssSI 및/또는 AvrII 제한 효소와 함께 사용하는 것이 특히 유용한 올리고뉴클레오티드 순방향 프라이머는 본 발명의 바람직한 구체예이다. 구체적으로, 제한 효소 XbaI과 함께 서열 번호 1의 HBV 하이브리드화 부분[서열 번호 10으로 나타낸 하이브리드화 부분], 제한 효소 BssSI와 함께 서열 번호 2의 HBV 하이브리드화 부분[서열 번호 11로 나타낸 하이브리드화 부분] 및/또는 제한 효소 AvrII와 함께 서열 번호 3의 하이브리드화 부분[서열 번호 12로 나타낸 하이브리드화 부분]의 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드[절단 부위로부터 계수함]가 바람직하다.

제한 프라이머로 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드는 관련있는 HBV DNA 제한 부위에 "측접하는", 구체적으로 EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 247-252에 위치하는 XbaI 부위, EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 253-258에 위치하는 BssSI 부위 또는 EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 178-183에 위치하는 AvrII 부위에 "측접하는" 10개 이상 및 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 특히 적합한 제한 프라이머는 서열 번호 8 및 서열 번호 9에 나타낸 올리고뉴클레오티드 서열이다. 증폭된 HBV 표적의 검출을 위해 적합한 프로브는 증폭된 HBV 표적에 하이브리드화하는 약 10개 내지 약 35개, 더 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 함유하며, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 HBV 하이브리드화 부분의 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. (이들 서열의 HBV 하이브리드화 부분은 표 1에 나타냈으며, 각각 서열 번호 13 및 서열 번호 15로 나타냈다. 표 1에 나타낸 프로브는 전적으로 또는 가끔 몇몇 HBV 뉴클레오티드와 함께 프로브의 "스템"을 형성하는 비-HBV 뉴클레오티드를 갖는 양 말단에서 추가로제공되며; 상기 스템은 선택된 검출 시스템의 일부분이다.). 적합한 역방향 프라이머는 HBV의 보존된 영역의 약 10개 내지 약 35개, 더 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 함유한다. 바람직한 역방향 프라이머는 서열 번호 4 및 서열 번호 5의 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예는 본 발명에 따른 HBV DNA의 전사 기초한 증폭 및 검출을 수행하기에 적합한 테스트 키트를 제공하는데, 이 키트는

- 상기한 바와 같은 제한 효소;

- 상기 설명한 바와 같이 선택된 제한 효소의 절단 부위와 상응하며, 프로모터 서열을 구비한 순방향 프라이머;

- 전사 기초한 증폭 반응을 수행하기 위한 기타 시약;

- 증폭된 HBV DNA를 검출하기 위한 수단; 및

- 사용 지침서

를 포함한다.

본 발명의 방법은 B형 간염 바이러스(HBV)로부터 DNA의 증폭 및 검출을 위해 특히 유용하나, 본 발명의 방법은 임의 유형의 DNA, 샘플 내에서 검출하고자 하는 바이러스 DNA 또는 심지어 게놈 DNA와 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 방법은 B형 간염 바이러스(HBV)로부터 DNA를 증폭 및 검출하는 데 특히 유용하지만, 본 발명의 방법은 샘플 내에서 검출하고자 하는 임의 유형의 DNA, 바이러스 DNA 또는 심지어 게놈 DNA에 적용할 수도 있다.

실시예 1: HBV DNA의 증폭

2개의 보존된 제한 부위(XbaI 및 BssSI)는 HBV DNA의 S-gen의 보존된 영역(EcoRI-위치에 따른 nt 244 내지 285) 내에서 암호화되었다. S-영역은 네가티브 극성의 단일 스트랜드 DNA일 수 있기 때문에, 상기 제한 부위 서열을 포함하는 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드('제한 프라이머(RP)')를 첨가하여 모든 게놈 DNA를 위한 이중 스트랜드 제한 부위를 생성하였다. HBV DNA는 뉴클리센스 추출기(오르가논 테크니카)를 이용하여 3 x 10⁹gep/ml의 HBV 유전형 A로 감염시킨 일련의 혈장 희석액으로부터 분리하였다. RNA 분리를 위해 기술된 바와 같이[참조: Operator Manual Extractor, 41001-9, rev A, (1999)] 표준 과정을 수행한 후, 추출물 50 ㎕를 얻었다. 하나의 분석을 위해 추출물 5 ㎕를 사용하였다. 제한 효소 절단은 NASBA 완충액[40 mM 트리스-HCl pH 8.5, 12 mM MgCl₂, 70 mM KCl, 15% v/v DMSO, 5 mM DTT, 1 mM 각각의 dNTP, 2 mM ATP, 2 mM CTP, 2 mM UTP, 1.5 mM GTP, 0.5 mM ITP, 0.2 μM 순방향 프라이머(XbaI을 위한 S-p3.8 및 BssSI을 위한 S-p3.10, 표 1), 0.2 μM 역방향 프라이머(S-p4.5, 표 1), 0.1 μM 분자 비컨 프로브(S-WT2, 표 1), 0.17 μM 제한 프라이머(RP-3, 표 1)] 및 제한 효소 BssSI(미국 메사추세츠 비벌리에 소재하는 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크.) 0.2 유닛 또는 제한 효소 XbaI(미국 메사추세츠 비벌리에 소재하는 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크.) 0.3 유닛 내에서 수행하였다. 41℃에서 15분 동안 항온처리한 후, 제한 효소는 열불활성화시키고, DNA 주형은 95℃에서 5분 동안 변성시켰다. 프라이머의 하이브리드화는 41℃에서 3분 동안 냉각하는 과정 중에 발생하였다. 이어서, NASBA 효소(BSA 2.1 ㎍, RNase H 0.08 유닛, T7 RNA 폴리머라제 32 유닛 및 AMV 역전사효소 6.4 유닛)를 첨가하고, 반응 혼합물은 부드럽게 탭핑하고 짧게 원심분리하여 혼합하고, 증폭 및 실시간 검출을 개시하였다. 반응 혼합물은 뉴클리센스 이지큐 분석기(오르가논 테크니카) 내에서 41℃에서 120분 동안 항온처리하였으며, 1분마다 형광 모니터링을 수행하였다. 반응은 485 nm에서 여기하였으며, 방출 신호는 518 nm에서 측정하였다.

실시예 1.1: Xbal 절단을 포함하는 HBV DNA의 증폭

제한 효소 XbaI을 이용하는 처리를 동반하는 NASBA 분석 및 동반하지 않은 NASBA 분석을 수행하였다. XbaI의 최적 농도는 NASBA 조건 하에서 HBV DNA의 앰플리콘 영역을 포함하는 PCR 단편의 10⁹사본을 절단함으로써 측정하였으며, 3 유닛으로 확인되었다. S-p3.8은 순방향 프라이머로 사용하였으며, XbaI을 이용한 절단 후, 주형 DNA를 신장시키기 위한 AMV RT에 의해 주형으로써 사용할 수 있었다. 절단하지 않은 경우, 3 x 10⁶geq/ml의 감도가 획득된 반면, 절단 후의 감도는 3 x 10³gep/ml였는데, 이는 감도가 1000배 증가되었음을 의미하는 것이다(도 2). 또한,절단하지 않은 경우 확실성(TTP)까지 소요 시간은 약 16분인 반면, XbaI 절단 후에는 약 10분이었는데, 이는 TTP에서 약 10분의 감소가 있었음을 의미하는 것이다(도 2). 이들은 모두 개선된 증폭 반응을 의미하는 것이다.

실시예 1.2: BssSI 절단을 포함하는 HBV DNA의 증폭

제한 효소 BssSI을 이용하는 처리를 동반하는 NASBA 분석 및 동반하지 않은 NASBA 분석은 동일한 HBV DNA 추출물 및 상기한 바와 같은 필적하는 반응 조건을 이용하여 수행하였다. BssSI의 최적 농도는 NASBA 조건 하에서 HBV DNA의 앰플리콘 영역을 포함하는 PCR 단편의 10⁹사본을 절단함으로써 측정하였으며, 0.2 유닛으로 확인되었다. S-p3.10은 순방향 프라이머로 사용하였으며, BssSI을 이용한 절단 후, 주형 DNA를 신장시키기 위한 AMV RT에 의해 주형으로써 사용할 수 있었다. 또한, 유의적인 테스트 개선점은 제한 효소 BssSI을 이용하는 처리 결과로서 획득되었다(도 3). 절단하지 않은 경우, 3 x 10⁷geq/ml의 감도가 획득된 반면, 절단 후의 감도는 3 x 10⁴gep/ml였는데, 이는 감도가 1000배 증가되었음을 의미하는 것이다(도 3). 또한, 절단하지 않은 경우 확실성(TTP)에 이르는 소요 시간은 약 21분인 반면, BssSI 절단 후에는 약 11분이었는데, 이는 TTP에서 다시 약 10분의 감소가 있었음을 의미하는 것이다(도 3). 이들 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, NASBA 반응 이전에 제한 효소를 이용하는 HBV DNA의 절단은 증폭을 상당히 개선시켰으며, 따라서 HBV DNA의 검출도 상당히 개선될 수 있었다.

실시예 1.3: Xbal 절단을 포함하는 HBV DNA의 증폭 - 2

제한 효소 자체 또는 제한 효소와 선택된 프라이머의 병용에 의한 절단이 개선된 분석 결과의 기초가 되는지 여부를 테스트하기 위해, XbaI 절단을 포함하는 분석을 반복하였는데, 이 때 S-p3.8 대신에 프라이머 S-p3.10을 사용하였다. AMV RT는 XbaI을 이용한 절단 후 표적 서열을 신장시키기 위한 주형으로서 S-p3.10을 사용할 수 없었다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, XbaI을 이용한 절단과 S-p3.10을 병용한 후, 단지 감도에서 약간의 증가(10배) 및 TTP에서 약간의 감소(약 5분, 21분에서 16분)가 획득되었다. 이는 NASBA의 개시중에 주형의 신장이 XbaI 및 프라이머 S-p3.8과 BssSI 및 프라이머 S-3.10을 이용하여 얻은 결과와 같은 개선된 결과를 나타내는 것을 의미한다.

실시예 1.4: BssSI 절단을 포함하는 HBV DNA의 증폭 - 2

표적의 신장이 실제로 개선된 분석 결과의 기초가 되는지 테스트하기 위해, BssSI 절단을 포함하는 분석을 반복하였는데, S-p3.10 대신에 프라이머 S-p3.8을 사용하였다. AMV RT는 BssSI을 이용하는 절단 후 표적 서열을 신장시키기 위한 주형으로 사용할 수 있었다. 그러나, BssSI을 이용하는 절단 후, 단지 17개의 뉴클레오티드가 표적 서열에 대한 프라이머의 하이브리드화에 포함되었으나, 일반적인 경우는 약 20개의 뉴클레오티드가 포함된다. 이러한 차이에도 불구하고, BssSI을 이용하는 분해 후에는 또다시 명백한 테스트 개선점이 획득되었다(도 5). 이중 절단은 NASBA 내에 포함된 XbaI 및 BssSI을 이용하여 수행하였으며, 프라이머 S-p3.8 및 S-p4.5, 제한 프라이머 RT-3 및 분자 비컨 S-WT2를 사용하였으나, 단일 절단 NASBA 분석에 비해 증폭 효율의 손실은 없었다.

실시예 1.5: AvrII 절단을 포함하는 HBV DNA의 증폭

제한 부위(AvrII)는 HBV DNA의 S-gen의 다른 보존된 영역(EcoRI-위치에 따른 nt 177 내지 192) 내에서 암호화되었다. 순방향 프라이머 S-p3.5, 역방향 프라이머 S-p4.4, 분자 비컨 S-WT4 및 제한 프라이머 RP-1(표 1)을 NASBA 내에 사용하였다. AMV RT는 AvrII를 이용하는 절단 후 주형으로서 S-p3.5를 이용하여 HBV DNA의 표적 스트랜드를 신장시켰다. 상기한 바와 같은 동일한 반응 조건을 사용하였다. 제한 효소 AvrII를 이용하는 절단을 동반한 NASBA 반응 및 동반하지 않은 NASBA 반응은 상기한 바와 같이 동일한 HBA DNA를 이용하여 수행하였으며, 반응당 AvrII 2 유닛을 사용하였다. 절단하지 않은 경우, >10⁸gep/ml의 감도가 획득된 반면, 절단 후 감도는 1 x 10⁵gep/ml 이었는데, 이는 절단 결과 >10³배 증가하였음을 나타내는 것이다. 또한, 이들 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, NASBA 내에 포함된 제한 효소 분해를 이용하는 HBV DNA 분해는 HBV DNA의 증폭을 상당히 개선시킬 수 있었다.

Claims

샘플 내에 임의로 존재하는 HBV DNA로부터 출발하는 표적 핵산 서열의 전사 기초한 증폭 방법으로서, 이 방법은

- 선택된 제한 부위에서 HBV DNA를 절단할 수 있는 1종 이상의 제한 효소를 가진 증폭 완충액 내에서 HBV를 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 항온처리하는 단계로서, 상기 증폭 완충액은 상기 HBV DNA 스트랜드(들)의 한정된 3' 단부를 생성하는 제한 효소, DNA 의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 서열을 포함하는 5' 영역과 상기 DNA 스트랜드의 한정된 3' 말단에 상보적인 3' 영역을 보유하는 프로모터-프라이머, 상기 프로모터-프라이머의 반대 극성을 보유하고 상기 표적 서열의 5' 단부를 포함하는 제2 또는 역방향 프라이머, 및 표적 서열로서 HBV ssDNA의 경우, 제한 프라이머를 보유하는 것인 단계;

- 이렇게 생성된 반응 혼합물을 제한 효소에 의한 절단이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 유지하는 단계;

- 제한 효소를 불활성화시키고/시키거나 이중 스트랜드가 적어도 부분적으로 단일 스트랜드로 되기에 충분한 시간과 온도에서 이렇게 얻은 샘플을 열처리하는 단계;

- 상기 샘플에

RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소,

DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소,

RNase H 활성을 보유하는 효소, 및

RNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소

를 첨가하는 단계; 및

- 이렇게 생성된 반응 혼합물을 증폭이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 유지시키는 단계

를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA가 이중 스트랜드 HBV DNA인 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA는 단일 스트랜드이며, 상기 프로모터 프라이머의 기능과 제한 프라이머의 기능은 조합 프로모터 및 표적 ssDNA의 제한 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열과 DNA 의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 서열을 포함하는 제한 프라이머의 사용으로 조합되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 적합한 뉴클레오시드 트리포스페이트는 열처리 이전에 초기 항온처리 혼합물에 첨가하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 역전사 효소는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소의 활성과

DNA 의존성 DNA 활성을 보유하는 효소의 활성을 조합하여 사용하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 3개의 효소, 즉 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소, DNA 의존성 DNA 활성을 보유하는 효소 뿐만아니라 RNase H 활성을 보유하는 효소를 대체하는 고유 RNase H 활성 보유하는 역전사 효소를 사용하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 항온처리 온도는 35℃ 내지 약 45℃, 바람직하게는 약 37℃ 내지 41℃인 방법.
제1항에 있어서, 상기 가열 단계는 92℃ 내지 98℃, 바람직하게는 약 95℃에서 수행하는 것인 방법.
제1항에 있어서, HBV의 상이한 유전형 중에서 보존된 부위에서 HBV DNA를 절단하는 제한 효소를 사용하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제한 부위는 표면 항원을 암호화하는 HBV 게놈의 부분에 위치하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 제한 부위는 EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 247-252에 위치하는 XbaI 부위, EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 253 내지 258에 위치하는 BssSI 부위 또는 EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 178-183에 위치하는 AvrII 부위이고, 사용된 제한 효소는 각각 XbaI, BssSI 또는 AvrII 제한 효소인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제한 프라이머는 EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 247-252에 위치하는 XbaI 부위, EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 253-258에 위치하는 BssSI 부위 또는 EcoRI 부위에 따른 뉴클레오티드 178-183에 위치하는 AvrII 부위에 "측접하는" 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하며 HBV 표적에 하이브리드화하는 10개 내지 약 35개, 더 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드인 방법.
제12항에 있어서, 상기 제한 프라이머는 서열 번호 8 및 서열 번호 9에 나타낸 올리고뉴클레오티드 서열을 보유하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 프로모터 또는 순방향 프라이머는 프로모터 서열에 결합되어 있는, 제한 효소 XbaI과 함께 서열 번호 10, 제한 효소 BssSI와 함께 서열 번호 11 또는 제한 효소 AvrII와 함께 서열 번호 12의 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드[절단 부위로부터 계수함]를 포함하고, HBV 표적에 하이브리드화하는 10개 내지 약 35개, 더 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드인 방법.
제14항에 있어서, 상기 프로모터 올리고뉴클레오티드는 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 보유하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 증폭된 HBV 핵산은 서열 번호 13 및 서열 번호 14의 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하며 증폭된 HBV 표적에 하이브리드화하는 10개 내지 약 35개, 더 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 하이브리드화 프로브를 이용하여 추가로 검출되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 프로브는 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 올리고뉴클레오티드 서열을 보유하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 또는 역방향 프라이머는 서열 번호 4 및 서열 번호 5의 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 10개 내지 약 35개, 더 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드인 방법.
서열 번호 1 내지 서열번호 14로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖고 서열 번호 14를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
제14항의 프로모터 프라이머 및 제18항의 역방향 프라이머를 포함하고 제1항의 HBV 핵산의 증폭에 사용하기에 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
제1항의 HBV DNA의 전사 기초한 증폭 및 검출을 수행하기에 적합한 테스트 키트로서,

- 상기한 바와 같은 제한 효소;

- 상기 설명한 바와 같이 선택된 제한 효소의 절단 부위와 상응하며, 프로모터 서열을 구비한 순방향 프라이머;

- 전사 기초한 증폭 반응을 수행하기 위한 기타 시약;

- 증폭된 HBV DNA를 검출하기 위한 수단; 및

- 사용 지침서

를 포함하는 것인 테스트 키트.