CN113234798B - 基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用 - Google Patents

基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于体外转录和G4‑ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用，包括引物1、引物2、两种酶和硫黄素ThT；在逆转录酶作用下靶链与引物1杂交生成第一种DNA双链中间体，该中间体在T7 RNA聚合酶催化作用下体外转录扩增产生短单链RNA；引物2与RNA单链杂交形成RNA‑cDNA，然后在AMV反转录酶的作用下逆转录形成cDNA，得带有富C链的DNA；之后引物1又与带有富C链的DNA杂交生成第二种DNA双链中间体，然后在T7 RNA聚合酶作用下转录出带有RNAG4链的RNA，以此循环反应；RNAG4与硫黄素结合，增强荧光信号，收集荧光信号实现对HBV DNA的检测。本传感器灵敏度高、稳定性强、重现性好。

Description

基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用。
背景技术
乙型肝炎是肝脏的一种病毒性感染，是一个世界性的公共卫生问题，具有急性和慢性的临床后果。感染乙肝病毒(HBV)的人患肝癌和肝衰竭的风险很高。这种疾病通过血液和体液传播。为了筛选这种病毒，主要使用乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和可溶性抗原乙型肝炎e抗原(HBeAg。有时在感染的第一阶段，HBsAg不存在或检测不到。因此，发展超灵敏的方法对早期检测病毒是必要的。对于这种病毒的检测，HBV基因组DNA的检测比HBsAg更可靠。目前，临床上基于这种病毒的DNA分析主要使用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)。然而，这种方法费时费力，因此促使研究人员开发快速和高灵敏度的新方法来准确检测HBV DNA。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用，用于解决现有技术中HBV DNA检测方法qPCR法费时费力、成本高等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器，包括一对引物链、T7 RNA聚合酶、AMV反转录酶和硫黄素ThT，所述引物链包括DNA单链引物1和引物2，所述引物1包括T7序列部分和与靶链互补序列部分，所述引物2包括富C序列部分和与靶链相同序列部分；
所述靶链可与引物1的互补序列部分杂交，在逆转录酶作用下在引物1和靶链的两端延伸出第一种DNA双链中间体，所述第一种DNA双链中间体包含T7 RNA聚合酶识别位点，可在T7 RNA聚合酶催化作用下体外转录扩增产生大量短单链RNA；所述引物2与RNA单链杂交形成RNA-cDNA，RNA-cDNA在AMV反转录酶的作用下逆转录形成cDNA(互补DNA)，得到带有富C链的DNA；之后引物1又能与带有富C链的DNA杂交两边同时延伸成第二种DNA双链中间体，然后在T7 RNA聚合酶作用下转录出带有RNAG4链的RNA产物，以此循环反应，产生大量的RNAG4；RNAG4可与硫黄素ThT结合，使本身荧光量子产率很低的ThT荧光量子产率急剧增高，通过收集荧光信号实现对HBV DNA的检测。
进一步，所述引物1的核苷酸序列为：
5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACGGGGTAAAGGTTCAGATATTG-3'(SEQ ID NO.1)。
进一步，所述引物2的核苷酸序列为：
5'-TCCCAACCCGCCCTACCCAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACT-3'(SEQ IDNO.2)。
进一步，所述靶链的核苷酸序列为：
5'-AAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGCGTAAACAATATCTGAACCTTTACCCCGTT-3'(SEQ ID NO.3)。
本发明第二方面提供一对引物链，用于构建HBV DNA的荧光检测体系，所述引物链包括DNA单链引物1和引物2，所述引物1包括T7序列部分和与靶链互补序列部分，所述引物2包括富C序列部分和与靶链相同序列部分。
进一步，所述引物1的核苷酸序列为：
5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACGGGGTAAAGGTTCAGATATTG-3'(SEQ ID NO.1)。
进一步，所述引物2的核苷酸序列为：
5'-TCCCAACCCGCCCTACCCAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACT-3'(SEQ IDNO.2)。
进一步，所述靶链的核苷酸序列为：
5'-AAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGCGTAAACAATATCTGAACCTTTACCCCGTT-3'(SEQ ID NO.3)。
本发明第三方面提供一种如第一方面所述的荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将DNA单链引物1、引物2、靶链混合，进行预反应，使靶标和引物1预先结合；
(2)加入T7 RNA聚合酶、AMV反转录酶、硫黄素ThT，孵育，进行扩增反应，得荧光检测体系。
进一步，所述步骤(1)中，所述引物1、引物2的摩尔浓度比为1：(0.25-4)，优选为1：(0.5-2)，更优选为1：0.5。
进一步，所述步骤(1)中，所述靶链的终浓度≥5aM。
进一步，所述步骤(1)中，还需加入预反应缓冲液、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)、NTP(核苷三磷酸)，所述预反应缓冲液包括：80mM Tris缓冲液，12mM MgCl2，70mM KCl，10mMDTT(二硫苏糖醇)，10％ DMSO，pH为8.5。
进一步，所述步骤(1)中，预反应温度为40-43℃，优选为41℃；预反应时间为5-10min，优选为5min。
进一步，所述步骤(1)中，用缓冲液将引物1、引物2、靶链分别稀释后，经变性退火后，再混合反应。
可选地，所述步骤(1)中，引物1的浓度为
可选地，所述步骤(1)中，缓冲液选自TE缓冲液、TBS缓冲液中的至少一种。
可选地，所述步骤(1)中，变性温度为90-100℃，优选为95℃；变性时间为5-10min，优选为5min。
可选地，所述步骤(1)中，退火温度为0-5℃；退火时间为8-12min，优选为10min。
进一步，所述步骤(2)中，ThT的终浓度为5-50μM，优选为5-25μM，更优选为25μM。
进一步，所述步骤(2)中，T7 RNA聚合酶的终浓度为2-4U/μL，优选为2-3.5U/μL，更优选为3U/μL。
进一步，所述步骤(2)中，AMV反转录酶的终浓度为0.20-0.40U/μL，优选为0.25-0.30U/μL，更优选为0.25U/μL。
进一步，所述步骤(2)中，还需加入核糖核酸酶抑制剂、10×反转录酶缓冲液。
进一步，所述步骤(2)中，孵育温度为40-43℃，优选为41℃；孵育时间为80-100min，优选为90min。
本发明第四方面提供一种HBV DNA的荧光检测方法，采用第一方面所述的荧光传感器和/或根据第三方面所述的方法制备得到的荧光传感器。
进一步，所述荧光检测方法包括如下步骤：在室温，设置仪器参数如下：激发波长440nm、发射波长范围450nm-600nm、激发波长的狭缝宽度5nm、发射波长的狭缝宽度10nm，用荧光分光光度计扫描荧光信号，选择发射波长490nm处的信号强度进行数据分析。
如上所述，本发明的基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用，具有以下有益效果：
(1)本发明构建了一种基于体外转录和ThT的无标记荧光传感器，所述传感器可以用于快速和高灵敏的HBV DNA检测。所述荧光传感器的线性范围为5aM-5pM，线性方程式为Y＝7599.77lg C+55949.69(R2＝0.99)，检测限为6.5aM，线性相关系数为0.99。
(2)本发明构建的荧光传感器灵敏度高、反应速度快：本发明首先将RNAG4序列引入体外转录产物中，利用ThT与RNAG4结合后的高荧光量子产率，降低背景，增加了靶物质检测灵敏度。
(3)本发明的传感器对HBV DNA的测定显示了灵敏度高、稳定性强、重现性好的能力。与现有技术比较，本发明的传感器成本低，灵敏度高，反应速度快，有望应用于实际样品和临床标本的测定，发展成为具有临床应用价值的传感器。
附图说明
图1显示为本发明所述方法的检测原理图。
图2显示为实施例2中NASBA成功进行的电泳图。
图3显示为实施例2中本发明方案在荧光平台的可行性分析结果图。
图4显示为实施例2中本发明方案在化学发光平台的可行性。
图5显示为实施例3中本发明方案中AMV-RT浓度的优化分析结果图。
图6显示为实施例3中本发明方案中T7 RNA聚合酶浓度的优化分析结果图。
图7显示为实施例3中本发明方案中一对引物浓度的优化分析结果图。
图8显示为实施例3中本发明方案中ThT浓度的优化分析结果图。
图9显示为实施例4中对本发明的荧光传感器的性能分析结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供的技术方案为：基于体外转录和G4-ThT设计一种新型荧光传感器，用于快速和高灵敏的HBV DNA检测。本发明的研究思路在于：
核酸等温扩增技术是一种方便实用的工具，具有扩增效率高、仪器要求低、实验过程简单等诸多优点。其中基于核酸序列的扩增(NASBA)该技术是由一对特异的引物介导的、三种酶催化的以单链RNA或者DNA为模板的恒温扩增技术，具有操作简单、特异性强、灵敏度高、不易被污染等优点。与qPCR相比，NASBA的主要优点是：(1)在等温条件下工作，通常在41℃恒温下工作；2)NASBA比qPCR快速、灵敏。
硫黄素ThT是一种优越的荧光探针，本身的荧光量子产率很低，意味着拥有背景低的优势。在与G4(DNA或RNA)链体组装之后，荧光量子产率很高，非常适合做生物传感器的信号输出系统。
本发明的技术方案结合NASBA的快速、高效和RNA G4-ThT信号元素，设计了一种简单、快速的基于NASBA和RNA G4-ThT的HBV DNA核酸检测新方法，无需严格的温控装置、复杂操作步骤，实现简单、快速、高灵敏的HBV核酸检测。首先，设计含T7序列的引物1和富C序列的引物2，NASBA在41℃条件下，一对引物、三种酶的作用下对靶RNA直接高效扩增，可在90min左右将模板RNA扩增约109-1012倍，无需特殊的仪器；最后，在T7RNA聚合酶作用下，通过NASBA循环转录出大量含富G序列的RNA产物，在ThT的诱导下产生RNA G4结构，且ThT嵌入RNA G4结构后荧光大大加强，从而通过荧光信号来对NASBA产物量进行检测。从而实验简单快速、高灵敏度的HBV核酸检测。
本发明的具体实施过程如下：
实施例1
制备荧光传感器并检测HBV DNA
1.材料与方法
1.1材料
禽骨髓母细胞病毒逆转录酶(AMV-RT)购自美国New England Biolabs公司。T7RNA聚合酶、从美国赛默飞世尔公司购得。所有寡核苷酸探针、焦碳酸二乙酯(DEPC)、30％过氧化氢(H2O2)、dNTP混合液、NTP混合液、重组核糖核酸酶抑制剂均购自上海Sangon有限公司。DNA Marker(20bp)、核酸染料gold view均购自中国大连TaKaRa公司。ThT从阿拉丁购得。实验中使用的所有化学品和试剂均为分析纯，无需进一步纯化。
1.2检测仪器
英国爱丁堡仪器公司Spectrofluorometer FS5。
1.3检测原理
图1说明了基于NASBA和ThT的无标记荧光生物传感器检测HBV DNA的原理。该策略由一对引物链(DNA单链引物1、引物2)、两种酶(T7 RNA聚合酶、AMV反转录酶)和硫黄素ThT组成。DNA单链引物1由两部分组成：T7序列部分和与靶链互补部分；DNA单链引物2也由两部分组成：富C序列部分和与靶链(靶DNA)相同部分。靶链可以与引物1的互补部分杂交，并在逆转录酶作用下开始在引物1和靶链的两端延伸出第一种DNA双链中间体，第一种DNA双链中间体包含完整的T7 RNA聚合酶识别位点，可在T7 RNA聚合酶催化作用下体外转录扩增产生大量短单链RNA。此时带有富C链的引物2与RNA单链杂交，AMV反转录酶的作用下逆转录形成互补DNA。AMV反转录酶的RNA水解活性可使RNA-cDNA杂合链上的RNA被水解而保留下cDNA链。通过这一步得到了带有富C链的DNA，之后引物1又能够与带有富C链的DNA杂交两边同时延伸成第二种DNA双链中间体，然后在T7 RNA聚合酶作用下转录出带有RNAG4链的RNA产物，以此循环。RNAG4可与硫黄素ThT结合，使得本身荧光量子产率很低的ThT荧光量子产率急剧增高。收集荧光信号，实现对HBV DNA的检测。
引物1的核苷酸序列为：
5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAAC GGG GTA AAG GTT CAG ATA TTG-3'(SEQ ID NO.1)。
引物2的核苷酸序列为：
5'-TCC CAA CCC GCC CTA CCC AAG CAG GCT TTC ACT TTC TCG CCA ACT-3'(SEQID NO.2)。
靶链的核苷酸序列为：
5'-AAG CAG GCT TTC ACT TTC TCG CCA ACT TAC AAG GCC TTT CTG CGT AAACAA TAT CTG AAC CTT TAC CCC GTT-3'(SEQ ID NO.3)。
1.4制备过程
(1)DNA链溶解：
用TE缓冲液将引物1、引物2和合成的靶链(靶DNA)分别溶解稀释至特定的终浓度，经95℃变性5min后迅速置于冰盒上退火10min，以避免形成不必要的二级结构或发生引物二聚化。以上所制备的探针均置于4℃冰箱备用。
(2)预反应：200μL的PCR管中加入27μL预反应缓冲液(80mM Tris，12mM MgCl2，70mM KCl，10mM DTT，10％ DMSO，pH 8.5)、3μL dNTP(0.5mM)、6μL NTP(1mM)、3μL引物1(100nM)和3μL引物2(50nM)并于41℃条件下孵育5min使靶链和引物1预先结合。
(3)扩增反应：迅速加入15μL酶混合液(60U T7 RNA聚合酶，10U AMV反转录酶，1.2μL核糖核酸酶抑制剂，6μL 10×反转录酶缓冲液)和3μL ThT(25μM)并于41℃孵育90min进行恒温指数扩增反应。然后，用预反应缓冲液补足溶液体积至100μL，获得荧光检测用反应液。
(4)荧光检测：将反应液加入荧光比色皿中；在室温条件下，设置仪器参数如下：激发波长440nm、发射波长范围450nm-600nm、激发波长的狭缝宽度5nm、发射波长的狭缝宽度10nm。点击检测，用荧光分光光度计扫描荧光信号，选择发射波长490nm处的信号强度进行数据分析。
实施例2
验证检测HBV DNA的荧光传感器的可行性
1、NASBA过程验证。
通过PAGE实验确定HBV DNA是否触发NASBA，具体实验方法为：NASBA产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时置于1×TBE缓冲液中，在110v恒定电压下放置50min，然后凝胶在gold view染色20min后在紫外光下拍摄电泳图，电泳如图2所示。
如图2所示，泳道1、2、3和4分别对应于靶链、引物1、引物2和三条链的混合物。泳道4出现了一条靠后的新条带，说明靶链能和引物1结合形成双链。泳道5和泳道6分别是有靶链和无靶链的情况下做NASBA扩增后跑出来的条带，可以看到泳道5在靶链靠后的位置出现了一条较厚的条带，此为NASBA扩增的产物，说明NASBA扩增这一步是成功的。
2、传感器的荧光平台验证。
前面通过PAGE验证了NASBA产物，然后需要用荧光光谱来验证产物是否为理论产物(即是否产生了RNA G4序列)，具体实验方法为：将ThT加入扩增反应体系中，经1.5h扩增完成后，将产物转移至荧光比色皿中，用荧光分光光度计测得ThT的荧光光谱(仪器参数为：激发波长440nm、发射波长范围450nm-600nm、激发波长的狭缝宽度5nm、发射波长的狭缝宽度10nm)。
如图3所示，在有靶链的阳性管(红色曲线)里产生了很强的荧光信号，而无靶链的阴性管(黑色曲线)和空白管(绿色曲线)信号则很低，说明NASBA产物是理论上应该有的RNAG4链，能够与ThT结合并在490nm处发射荧光。通过荧光平台的验证，说明本发明的策略是可行的。
3、化学发光平台的验证。
为了多平台充分说明本发明策略的可行性，利用G4-Hemin的辣根过氧化物酶活性催化化学发光的特质，在化学发光平台进行了验证。
如图3所示，在有靶链的阳性管(红色曲线)里产生了很强的化学发光信号，而无靶链的阴性管(黑色曲线)和空白管(蓝色曲线)信号则很低，说明NASBA产物是理论上应该有的RNA G4链，能够与Hemin组装形成模拟酶，在过氧化氢条件下催化鲁米诺化学发光。通过化学发光平台的验证，再次说明本发明的策略是可行的。
实施例3
检测HBV DNA的荧光传感器及其使用条件的优化
本实施例对实验过程中几个重要的条件即对两个关键酶的浓度、引物浓度、ThT浓度这几个对本发明方案实验测定影响较大的测定条件进行了进一步的优化，对每一个优化条件都由低值到高值分别选取至少五个点进行一系列实验。
为考察AMV-RT(AMV反转录酶)浓度对本荧光传感器检测结果的影响，本实验采用了不同的AMV-RT浓度(0.20、0.25、0.30、0.35、0.40U/μL)构建荧光传感器。如图5所示，荧光强度随AMV-RT浓度变化而变化，当AMV-RT浓度为0.25U/μL时，信号最高，而后续继续增加AMV-RT浓度信号强度开始下降，说明0.25U/μL为最佳AMV-RT浓度。
为考察T7 RNA聚合酶浓度对HBV DNA检测结果的影响，本实验采用了不同的T7RNA聚合酶浓度(2、2.5、3、3.5、4U/μL)构建荧光传感器。如图6所示，随着T7 RNA聚合酶浓度的增加，荧光信号强度也随T7 RNA浓度的升高而增强，与此同时背景信号也随之增大，因此我们选择信噪比最高的T7 RNA浓度为最佳浓度；当T7浓度为3U/μL时，信噪比达到最高，其后随着T7浓度的升高信噪比下降，因此，选择3U/μL作为T7 RNA聚合酶的最佳浓度。
为考察一对引物的浓度对HBV DNA检测结果的影响，本实验采用了不同的引物浓度比例(引物1：引物2(CP1/CP2)＝1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4)构建荧光传感器。本发明基于传统的NASBA对引物2进行了加尾，所以与引物1的比例显得尤为重要，因此本实施例固定引物1的浓度为100nM，探究最佳的引物浓度比例。如图7所示，随着引物2浓度比例的增加，荧光信号强度也随之升高而增强，当二者浓度为1:0.5时，获得了最高的荧光信号和最低的背景信号，因此，选择1:0.5作为一对引物的最佳比例。
为考察ThT浓度对HBV DNA检测结果的影响，本实验采用了不同的ThT浓度(5、10、25、35、50μM)构建荧光传感器。如图8所示，随着ThT浓度的增加，荧光信号强度也随ThT浓度的升高而增强，与此同时背景信号也随之增大，因此我们选择信噪比最高的ThT浓度为最佳浓度；当ThT浓度为25μM时，信噪比达到最高，其后随着ThT浓度的升高信噪比下降，因此，选择25μM作为ThT的最佳浓度。
实施例4
检测HBV DNA的荧光传感器的性能分析
图9所示的检测实验结果表明，当HBV DNA浓度在5aM到5pM之间时，得到的荧光强度与HBV DNA浓度的对数呈线性相关，线性方程为Y＝7599.77lg C+55949.69(R2＝0.99)，检测限为6.5aM，线性相关系数为0.99。将传感器在空白溶液中重复检测3次，并重复检测3次，计算平均值和标准差。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学
<120> 基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用
<130> PCQYK2110474-HZ
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物1
<400> 1
aattctaata cgactcacta tagggaacgg ggtaaaggtt cagatattg 49
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物2
<400> 2
tcccaacccg ccctacccaa gcaggctttc actttctcgc caact 45
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶链
<400> 3
aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgcgtaaaca atatctgaac 60
ctttaccccg tt 72

Claims (12)

1.一种基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器，其特征在于，包括一对引物链、T7 RNA聚合酶、AMV反转录酶和硫黄素ThT，所述引物链包括DNA单链引物1和引物2，所述引物1包括T7序列部分和与靶链互补序列部分，所述引物2包括富C序列部分和与靶链相同序列部分；
所述引物1的核苷酸序列为：
Figure FDA0004093110890000011
所述引物2的核苷酸序列为：
Figure FDA0004093110890000012
所述靶链可与引物1的互补序列部分杂交，在AMV反转录酶作用下在引物1和靶链的两端延伸出第一种DNA双链中间体，所述第一种DNA双链中间体包含T7 RNA聚合酶识别位点，可在T7 RNA聚合酶催化作用下体外转录扩增产生大量短单链RNA；所述引物2与RNA单链杂交形成RNA-cDNA，RNA-cDNA在AMV反转录酶的作用下逆转录形成cDNA，得到带有富C链的DNA；之后引物1又能与带有富C链的DNA杂交两边同时延伸成第二种DNA双链中间体，然后在T7 RNA聚合酶作用下转录出带有RNAG4链的RNA产物，以此循环反应，产生大量的RNAG4；RNAG4可与硫黄素ThT结合，使本身荧光量子产率很低的ThT荧光量子产率急剧增高，通过收集荧光信号实现对HBV DNA的检测。
2.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于：所述靶链的核苷酸序列为：
Figure FDA0004093110890000013
3.一对引物链，用于构建HBV DNA的荧光检测体系，其特征在于：所述引物链包括DNA单链引物1和引物2，所述引物1包括T7序列部分和与靶链互补序列部分，所述引物2包括富C序列部分和与靶链相同序列部分；
所述引物1的核苷酸序列为：
Figure FDA0004093110890000014
所述引物2的核苷酸序列为：
Figure FDA0004093110890000015
4.根据权利要求1所述的荧光传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将DNA单链引物1、引物2、靶链混合，进行预反应，使靶标和引物1预先结合；
(2)加入T7 RNA聚合酶、AMV反转录酶、硫黄素ThT，孵育，进行扩增反应，得荧光检测体系。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述引物1、引物2的摩尔浓度比为1：(0.25-4)；
和/或，所述步骤(1)中，所述靶链的终浓度≥5aM；
和/或，所述步骤(1)中，预反应温度为40-43℃，预反应时间为5-10min。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，还需加入预反应缓冲液、dNTP、NTP，所述预反应缓冲液包括：80mM Tris缓冲液，12mM MgCl2，70mMKCl，10mM DTT，10％DMSO，pH为8.5。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，用缓冲液将引物1、引物2、靶链分别稀释后，经变性退火后，再混合反应。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，缓冲液选自TE缓冲液、TBS缓冲液中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，变性温度为90-100℃，变性时间为5-10min；
和/或，所述步骤(1)中，退火温度为0-5℃，退火时间为8-12min。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，ThT的终浓度为5-50μM；
和/或，所述步骤(2)中，T7 RNA聚合酶的终浓度为2-4U/μL；
和/或，所述步骤(2)中，AMV反转录酶的终浓度为0.20-0.40U/μL；
和/或，所述步骤(2)中，还需加入核糖核酸酶抑制剂、10×反转录酶缓冲液；
和/或，所述步骤(2)中，孵育温度为40-43℃，孵育时间为80-100min。
11.一种非疾病诊断或治疗目的的HBV DNA的荧光检测方法，采用如权利要求1所述的荧光传感器和/或根据权利要求4-10任一项所述的方法制备得到的荧光传感器。
12.根据权利要求11所述的荧光检测方法，其特征在于：所述荧光检测方法包括如下步骤：在室温，设置仪器参数如下：激发波长440nm、发射波长范围450nm-600nm、激发波长的狭缝宽度5nm、发射波长的狭缝宽度10nm，用荧光分光光度计扫描荧光信号，选择发射波长490nm处的信号强度进行数据分析。
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