CN108085372B - 引物末端酶解二聚体法pcr - Google Patents

Abstract

引物末端酶解二聚体法PCR，其特征是采用3'最末端第1/2个碱基均为A/a腺嘌呤结尾的引物和底物dUTP/dU代替dTTP渗入PCR产物酶解污染策略；尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG酶解引物二聚体的缺/脱dU产物仍是引物结合模板，引物对3'最末a配对PD产物链脱dU处既缺碱基可匹配结合又无模板可复制；无a结尾引物须变一个3'末端RNA(rN)碱基以增加RNase酶解PD污染；使用eUDG、及RNaseH‑II和内切酶III‑VIII、限制内切酶消化前次或历次PCR产物气雾胶、靶交叉污染，联用中部同序引物减少内源PD产生，PCR成分加蔗糖分层缓释并矿物油封闭，热启动、热灭活不耐热酶。

Description

引物末端酶解二聚体法PCR

技术领域：

本发明属于分子生物学及分子检验的核酸扩增PCR技术领域，具体涉及碱基修饰引物末端的酶解来限制或去除其引物二聚体PD产物非特异性污染的PCR领域。

背景技术：

多聚酶链反应PCR背景可追溯至其历史发展源头，1953年Watson建立DNA双螺旋模型及半保留复制法则为PCR扩增奠定了其分子基础，甚至1971年Khorana就已发表了一核酸体外扩增(J.Molec.Biol.,56:341)相关论文；但限于当时技术条件不足,没有产生成熟的核酸扩增技术。直到1985年美国Cetus公司Mullis根据一端引物测序原理,想到了一对引物结合延伸-指数扩增或几何级数式放大的巨大威力,才发明了一对特异引物结合、复制靶分子基因,体外(于试管内)模拟天然基因半保留复制的PCR技术；再经过一系列发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。扩增过程一般经靶DNA变性：加温94℃使双链解离成为单链；引物退火(复性)：降温至54℃左右使过量引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物延伸：升温至72℃左右，DNA单链模板—引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，尊循碱基反向配对与半保留复制原理，引物末端按5'-3'方向延伸、合成一条新的与模板DNA链反向互补的半保留复制链，不断重复循环变性--退火--延伸三过程，这种新链又可成为下次循环的模板，靶分子以2ⁿ级数产生更多的“半保留复制”新链。

超级灵敏度的指数放大或几何级数放大是PCR最核心的本质或优点，靶分子以2ⁿ级数放大,常规30个热循环反应2³⁰约等于10⁹放大倍数,扩增放大倍数似原子裂变链式反应难以想象,也是一般线性放大检测方法无可比拟的,灵敏度远远大于普通检测方法的放大倍数,近40个循环反应放大10¹²倍或达飞克fg/ml即个位数分子水平检测。这也是PCR成为应用最广的最核心技术甚至多少个最形容也绝不过分的根本原因。同样，指数放大亦带来PCR高度特异性和顽固的非特异性，PCR特异性直接来源于引物序列的特异性,一端引物序列一点非特异错配扩增甚至仅一侧完全配对扩增也仅是线性放大,自然远远赶不上指数扩增或几何级数放大，引物特异性任何一点降低或与靶一丁点不匹配也就扩增速率落下了,而远远赶不上特异的指数或几何级数放大；反过来说,只要是靶分子以指数扩增或几何级数放大，PCR扩增检测就具有足够高特异性。非特异性同理，各种常规检验方法遇见的非特异性原因虽也存在于PCR技术,但终究赶不上指数扩增放大，仅一条引物非特异结合线性扩增远远赶不上指数非特异性,只有一对引物均非特异结合、延伸的扩增才是唯一指数非特异性原因,引物间非特异聚合并互为模板、互为引物的二聚体PrimerDimer(PD)指数扩增是PCR非特异性本质,也是其难以克服的根本原因,一般3'末端数个碱基连续反向互补的引物对于不加模板的本底PCR扩增反应中约几个—十几个循环处即出现引物二聚体PD扩增；一对常规设计的引物对于本底PCR反应30个循环开始出现显著的PD非特异性扩增，并遮盖和抑制位于30-38循环的数千拷贝数以下的低浓度靶分子扩增检测，这也是普通PCR只进行30个循环反应的主要原因。

随着PCR巨大优越性和广泛应用,其它许多PCR新方法，新改进也不断涌现,被发明，主要包括须PCR反应后处理/检测的终末/终点PCR和闭管分析的实时荧光定量PCR两大类。由于常规终末PCR因同样量的样本经PCR超级放大以后变化太大而产量不均一，致使难以定量检测，传统的终末/终点PCR只能PCR后凝胶电泳来区分特异与非特异扩增条带,且30个循环反应限制了低于数千拷贝测不出；1997年采用动态实时检测扩增对数期的循环数与靶初始量成反比(反对数关系)的实时荧光PCR(Real-time PCR)技术实现了从定性测定到精确定量的飞跃，扩增40个循环反应放大10¹²倍而可测个位数拷贝,根据发光原理不同分为荧光染料SYBR GreenⅠ实时荧光PCR和各种荧光核酸探针PCR两类(BioTechniques 1997,22:130-138)。染料法实时荧光PCR通过SYBR GreenⅠ结合产物DNA双链小沟使发射荧光增强1000倍而检测，但非特异性扩增双链产物也结合发射荧光，同样30个循环后非特异扩增也遮盖了低浓度样本检测；探针法TaqMan等实时荧光PCR的靶特异探针不针对引物序列而绕开了PD非特异性产物，但引物二聚体PD扩增于探针法荧光PCR不可见并不代表其不存在、不起作用，较高的Ct 30 PD扩增竞争性抑制同引物的低浓度靶扩增而降低其检测灵敏度；另一方面,过量引物与探针DNA链之间也产生一定程度的非特异聚合、延伸的扩增，不加靶模板的PCR本底系统,一对引物与任意一个荧光标记TaqMan探针均产生约Ct 33-35的非特异性扩增曲线，且随着反复重复同一PCR扩增,其扩增平台期荧光吸收峰值越来越高,Ct值也逐渐前移，产生一定的样本检测假阳性，假阳也无法与靶阳性区别。反而染料法荧光PCR通过融解曲线,常规PD产物特异Tm值小于77℃-78℃能区别靶产物Tm≥85℃-89℃；但一些优化引物对不易形成特定二聚体其PD产物因而不单一而无典型狭窄Tm值。

指数非特异性与超敏特异性扩增是PCR相关的两个重要方面，指数特异性扩增相关研发报导一直是生物学最热门领域；但指数非特异性障碍同样限制了PCR及荧光PCR应用，其相关研究报导却不多，大多研究焦点集中于PCR热启动来克服可能的引物低温结合所致非特异扩增，措施包括蜡包Mg²⁺离子热释放、聚合酶Taq修饰抑制包括端N缺失的KlenTaq(Nucelic Acids Res.2003,31-21:6139),抗Taq酶抗体和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar(J.Mol Biol.1997,271:100),以及四氧化戊烷热激活引物(Nucelic Acids Res.2008,36-20:e131)等热启动方法。但低温启动最多也仅扩增一个循环放大一倍/一次,远赶不上非特异指数放大，将无靶模板PCR反应置低温(10℃)数天PCR不增加本底Ct值,置室温(20°-40℃)启动数小时至过夜仅增加本底Ct值1-3个循环；且PCR在热变性后才手动加完全组份的绝对热启动本底Ct值也仅推后1-3个循环数；冰箱低温(＜10℃)时Taq酶无活性,低于室温Taq酶活性也很低,低温启动不是PD非特异性形成关键原因；低温退火才显著增加非特异性。试用各种控制非特异的措施如变化PCR组份、添加各种化学试剂等,其对特异与非特异扩增基本是平行的,显著抑制PCR非特异性也不同程度地干扰靶特异性扩增效率,反之不影响靶扩增效率又难以抑制PCR非特异性。引物引起的指数非特异性还是源于其碱基序列,一对完全同序引物绝没有引物非特异性。Hands技术(Homo-Tag assisted non-dimersystem,Nucleic Acids Res.Vol.25,No16:p3235-3241)采用完全同序引物Tag通过引物二聚体单链两端自身结合竞争游离引物,不仅显著抑制PD非特异性,也都没有选择地减低靶特异性扩增效率。单链结合蛋白Single Strand Binding-protein(SSB)、基因32蛋白和全引物结合反义碱基Oligo及互补“负”引物能显著降低优化引物非特异性,但也严重地影响靶特异性扩增效率及扩增曲线的线性关系。

一对常规设计引物3'末端相互少数碱基互补结合开始PD扩增,但仅3'末端碱基反向配对于热循环条件下结合力不够,须借力3'末端外序列或整个序列间非特异结合辅助而互为模板互为引物,使原引物序列3'末延伸合成引物互补链，经反复30个热循环产生PD指数扩增。中国专利(CN 201010105371.8和PCT/CN2013/088054)则根据一对完全同序引物绝没有非特异性现象，采用“部分同序”引物部分抑制PD扩增,将“同序”置于引物中部偏3'端能最大化地选择性抑制PD扩增而不影响靶扩增效率；PCR添加与引物中部同序部位配对结合的含反义碱基Oligo，因其仅保留结合功能而没有模板和引物作用,能进一步特异选择性地放大这种作用；“同序”和反义碱基Oligo破坏了引物间这种辅助“借力”。在末端无连续反向互补常规引物设计原则基础上,选择中部6-8base同序引物对和结合中部反义碱基5-9bOligo于实时荧光PCR40个循环反应内没有内生PD非特异性扩增的干扰。

多聚酶链反应PCR另一关键非特异性源自PCR产物的再次交叉污染,初期PCR多用矿物油密闭渐渐被仪器热盖所代替。荧光PCR“闭管分析”热盖情况下并不完全密闭，大多数0.2ml PCR试管或96孔板，在热循环95℃变性时，高温高压下会有一些气雾胶沿热软化的管盖边缘溢(挤)出，一个气雾胶颗粒就含有10⁶个分子拷贝,气雾胶不仅含高浓度已扩增阳性靶分子，更多的是过量一对引物间产生的小分子引物二聚体PD扩增,几乎每一个检测反应管/孔都会产生PD非特异性指数扩增,且小分子PD扩增产物气雾胶再污染仅靠过滤、GMP是隔绝不了的。随着重复同一PCR，泄漏的污染物会得到反复地指数扩增、积聚，随后的实时荧光PCR不是从0循环开始而是从上次PCR结束循环数开始，更禁不住反复PCR放大，污染物越积越多；产物气雾胶不仅污染实验室环境也进入一切开盖的试剂包括实验用水中,随试剂冷藏而长期保存；一对引物PD产物污染也于30循环/Ct非特异性扩增经反复PCR而逐渐提前。气雾胶再污染采用dUTP(dU)代替dTTP产物再结合尿嘧啶糖基酶(UDG)降解含dU产物(Gene1990,93:125-128),但酶消化做不到百分百100％而对放大10¹²作用有限；不连续配对的引物间都能聚合扩增,而脱dU二聚体产物剩余碱基序列仍能大概与引物配对而结合延伸、扩增。原引物序列引入RNA碱基(Nucleic acids Res.1993,21:4339)再RNaseA酶解无PD选择性,而且PD新合成的引物互补链仍是引物配对适宜模板,因PD产物的引物序列间大多插入少数碱基而部分延伸(Nucleic Acids Res.Vol.25,No16:p3235-3241),部分延长的引物对极易相互配对扩增。外源气雾胶与内源非特异性还相互影响，内生PD非特异性之源不消除而控制气雾胶污染无效,反之外源气雾胶不控制又成为内源PD扩增的持续模板。

引物二聚体(PD)由原引物整个序列间非特异结合而助力其3'末端相互少数碱基配对延伸进而合成新的引物互补链,或直接以前次PCR引物二聚体PD产物为非特异性模板扩增。通过修饰碱基dU随机部位渗入新合成链后UDG酶水解脱dU产物并不能消除非特异模板作用，PD平均1/4脱dU还剩约3/4连续碱基与引物序列匹配而比不连续匹配引物间更易结合扩增；只有引物3'最末端对应脱dU处才限制其延伸。为了解决常规dU产物–UDG酶解去二聚体方法的dU随机位置而不能消除PD非特异性模板效应，本发明“引物末端酶解二聚体法PCR”简称引物末端酶解PCR设置一对引物3'最末端A/a腺嘌呤结尾,以使对应的PD部位为dU–UDG酶解消除前次PCR产物PD非特异性污染；如无a结尾引物对3'末端须引入RNA碱基,联合使用UDG-EndoIII-VIII内切酶和杂交链选择性RNaseH/HII酶共同水解,使PD产物RNA碱基和随机多个脱dU处断裂开来,尽可能短的降解碎片缺了全长辅助力即使与引物序列匹配于热循环条件下也不能结合延伸；考虑引物修饰末端水解后产物片段仍接近原引物继续聚合扩增,故引物对一条中部至5'端可增加一个修饰的碱基而缩短水解片段使其不能有效聚合的非特异性扩增。

REFERENCES

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(2)Longo,M.C.,et al.,1990,Gene 93:125-128.

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(8)Lebedev AV,2008,Nucelic acids Res.,Vol.36,No20:e131.

发明内容：

本发明“引物末端酶解二聚体法PCR”简称引物末端酶解PCR，其特征是采用以下技术路线修饰引物末端碱基,在PCR成分混合前酶解污染去除引物二聚体的PCR方法：

(1)选取3'最末端第1/-2个碱基均为A/a腺嘌呤结尾设计的一对引物，底物dUTP/dU代替dTTP渗入PCR产物包括引物二聚体PD产物，通过PCR成分预先加入0.2-2％E.coliUDG(5U/μl,v/v)大肠杆菌尿嘧啶-DNA糖基化酶，各成分于混合前室温RT两小时至两天—或37℃20分钟至2小时消化前次或历次PCR产物气雾胶交叉污染,混合后至多37℃ 20分钟内PCR；

(2)无a结尾但离末尾小于7-8碱基或一端无a结尾一对引物均变一个3'末端RNA(rN)碱基(a之外),或一侧a结尾引物变一个3'末端rN碱基而无a结尾引物近末端变一个rN碱基，随机的dU代替dT渗入PCR产物,其PCR成分预先加入0.2-2％(v/v)eUDG+RNaseH/HII(5U/μl)和0.2-5‰(v/v)内切酶EndIII-VIII(10U/μl)三酶联用,成分混合前室温RT三小时至三天—或37℃半小时至三小时,彻底切断PD产物交叉污染,混合后至多37℃ 40分钟内PCR；

(3)最末1-2个a结尾一对引物a之外再3'端离最末小于6-10碱基处(嘧啶后面)变一个RNA(rN)碱基，底物dU代替dT渗入PCR产物，PCR成分预先加入0.5-1％(v/v)eUDG单独酶解；或PCR成分预先加入1％(v/v)eUDG和0.5％RNaseH/HII(5U/μl)先行酶解37℃1-3小时，Taq酶另加0.5-1％(v/v)内切酶EndIII-VIII(10U/μl)于PCR反应液混合后37℃ 0.5-1小时程序预设三酶顺次水解，加样后立即/尽快PCR。

根椐“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征为引物末端酶解PCR再选一条引物中部至5'端增加变一个RNA(rN)碱基/dI碱基或烷基修饰嘌呤；UDG酶联用RNaseHII酶/hAAG酶于物理隔绝情况下PCR以杜绝引物二聚体PD非特异性扩增。

根椐“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征为防止靶分子气雾胶造成微量污染试剂，则PCR试剂成分/各组分再加入不影响靶扩增的稀浓度靶序列限制内切酶(0.1％-0.5％v/v)2-4种混合酶液，利用PCR成分混合前长时间酶切消化靶分子交叉污染。

根椐“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征是PCR用水使用便宜的化学法替代酶法,新鲜纯化水采用加0.05-0.2‰体积即万分之一左右稀释的原次氯酸钠液(10％)室温1hr至2天长时消化DNA，再煮沸除去次氯酸钠后加0.05-0.1‰体积的外切酶ExoIII分装使用。

根椐“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征是采用一对中部6-8b同序引物部分减少引物二聚体程度/推后引物二聚体本底Ct值,能部分减少内源性引物二聚体扩增。

根椐“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征是联用一对中部6-8b同序引物和添加一引物中部互补的反义碱基5-9b中部干扰Oligo寡核苷酸，选择性抑制PCR反应内的内源性持续引物二聚体扩增/消除引物二聚体本底Ct值。

根据“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征是联合矿物油密闭PCR条件下采用一成分如一引物含10％蔗糖分层缓释-热启动PCR以减少气雾胶产量或无效扩增气雾胶。

根椐“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征是PCR反应液添加含甜菜碱Betain和聚阴离子多聚磷酸PPA增效剂，双向增强靶扩增效率和抑制PD非特异性扩增。

根椐“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征是应用探针法荧光PCR，除引物必须a结尾设计外,探针序列如TaqMan探针也必须3'最末端a结尾以使引物-探针非特异产物被UDG有效酶解；联用探针中部至5'端变1-2个RNA碱基/Lock DNA碱基,和近3'末端变一个反义(/无义)的如2'-甲氧碱基/2F-RNA碱基以增强结合力和同时失去模板作用。

根椐“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征是PCR于独立配液室混合试剂成分/组分,和于分隔的加样室进行样本DNA纯化及加样,过滤吸头加样后丢入次氯酸钠废液内，实验室每天用紫外灯和臭氧轮换消毒，每次实验前后用纯的10％次氯酸钠消化、清洁各一次。

根据“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征是使用物理空间隔离的密闭独立扩增仪器室，紫外灯和臭氧轮换消毒，荧光PCR/PCR扩增仪器采用机械密闭或隔离气雾胶的物理措施。

根据“引物末端酶解二聚体法PCR”，其特征在于其方法应用于核酸检测试剂盒，盒成份包括：样本核酸提取试剂，dNTPs及dUTP，Taq酶及其缓冲液，修饰引物F/R，染料SYBRGreen I及荧光探针，PCR增效剂；eUDG酶、RNaseH/HII及EndIII-VIII、内切混合酶预加入各PCR成分/组分，化学法处理水dH₂O，矿物油/石蜡油。

多聚酶链反应PCR指数扩增或几何级数放大带来检测超级灵敏度，但指数或几何放大本质上也同样带来非特异性指数扩增,包括内源性不断新生的引物聚合二聚体PD非特异性扩增；和前次PCR产物外源气雾胶作为二次模板再污染，即使矿物油密闭PCR反应的情况下油层面上残留微量反应对指数放大PCR也是难以克服的交叉污染；而且内源性非特异性与外源产物污染相互影响,内生PD非特异性之源不消除就难以控制气雾胶污染,反之外源气雾胶不清除也不能杜绝内源PD非特异性。由于脱氧尿嘧啶dUTP(简称dU/U)或单个RNA(简称rN/r)碱基引入PCR系统不影响Taq聚合酶扩增,通过引入dU/rN修饰碱基及含dU/rN碱基的产物酶解来清除产物气雾胶。目前普遍采用引物中A或靶序列A对应dU渗入产物和联用尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG水解含dU产物策略不足以完全清除非特异性，最直接的原因一方面：UDG酶水解脱dU的PD产物剩余碱基序列依然是结合力稍降低的引物配对模板,引物概略结合、3'末端能沿原引物序列模板延伸，甚至引物对无须以PD为结合模板而直接互为模板、互为引物开始PD非特异性扩增；且UDG酶解也不是100％完全有效，多数UDG酶至多能消化＜10⁵-10⁶/pMol分子，对于放大10¹²倍PCR产物而言即使99.99％以上酶解也只是部分有效,对指数PD扩增而言部分比例无用,全或无/黑至白100％才有效。另一方面：引物原序列中如引入修饰RNA碱基后RNaseA裂解,其引物互补的新合成链序列也仍然是引物适宜的扩增模板,游离引物结合后、3'末端还能延伸至断裂处,延长了的引物极易配对结合开始PD非特异性扩增；因此消除PD引物二聚体必须引物3'末端A腺嘌呤结尾联用dU产物-UDG脱dU,以使引物3'末端配对脱dU而不能结合延伸；随机位置脱dU产物必须引物3'末端引入RNA碱基rN，脱dU与rN处联合多酶裂解去PD,引物末端不仅是扩增主要部位也是PD产物降解的关键部位。

UDG酶作用靶产物还不同于PD产物,靶产物脱dU后仍能部分结合引物,但被聚合酶延伸一些序列直至任何脱dU处就终止了,脱dU后的靶产物直接失去了靶模板效应；脱dU后的PD产物失去全长PD模板效应但其酶解碎片仍然有模板效应,细究部分脱dU后的PD产物序列仍剩大约3/4碱基与引物配对互补,游离引物仍能概略结合PD,其3'末端与PD产物配对就能沿原引物序列被聚合酶延伸直至引物全长。引物二聚体PD生成直接由原引物序列延伸和新合成的引物互补链两部分形成,不同部位降解的除PD效果也还不一样,为了直观地显示不同部位dU的UDG酶脱dU而抑制PD扩增效果,假设仅引物5'端、中部、3'端分别含a碱基等三种典型特例,以便于理解UDG酶作用效果，如仅引物5'端含a碱基的PD每条链仅3'端脱dU,几乎不影响作为模板的结合作用,完全不影响延伸至整个引物长度；仅引物中部含a碱基的PD微微影响结合,也不影响延伸至整个引物长度；仅引物3'末端含a碱基的PD主要影响3'末端延伸效率；同理多处含a碱基的PD明显影响结合效率但也只是减少结合比例但不完全阻止结合,但a碱基越是靠近引物3'末端越影响3'末端延伸。类似原理,5'端至3'端引入RNA(/rN)碱基的引物其非特异扩增的PD模板效果也不同,尽管原引物序列能被RNaseA酶所裂解,但原引物序列5'端、中部、3'末端裂解后不影响新合成的引物互补链完整及作为模板的结合作用,游离引物沿原引物5'端裂解产物能延伸至原引物近全长序列,沿原引物中部裂解产物能延伸至原引物一半序列,沿3'末端裂解产物能延伸至断裂处,RNA(rN)碱基越是靠近引物3'末端延伸越少,但因PD产物的引物序列间大多插入少数碱基而仍有部分延伸；何况引物序列的RNaseA酶解对靶特异扩增与PD非特异扩增均是平行的作用；只有选择RNaseH/HII酶不作用单链引物RNA(rN)碱基,才选择性裂解DNA-RNA杂交链PD产物中rN碱基。

根据以上分析-引物二聚体PD产物由原引物序列和新合成链两部分构成,新合成链随机渗入dU和原引物引入rN后酶切均不能消除PD污染,采用a结尾引物对联合UDG系统/和联合引物末端rN多酶解才能有效彻底去除PD产物。本发明“引物末端酶解二聚体法PCR”，首先引物3'末端选用A/a碱基结尾或a尽量近最末尾以使新合成链脱dU部位对应引物3'最末端,从而新合成链结合的引物难以延伸；随机a/无a结尾引物3'末端须变一个rN碱基，或引物3'末端a以外选一碱基变为rN碱基,使用UDG或联合使用RNaseHII/H和UDG+Endo-nuclease III/IV/VIII酶水解PD产物,选择性的酶RNaseH/HII仅消化PD杂交链中RNA碱基以使延伸及早终止。引物修饰末端水解后产物片段仍接近原引物会重新配对聚合非特异扩增,故引物对一条中部可增加一个修饰RNA碱基而缩短水解片段使其不能有效聚合非特异扩增。再联用少量内切酶Endo-nuclease IV/VIII切断脱dU链以使产物PD碎片尽可能短。产物气雾胶极其过量情况下酶解反应还难以做到100％百分百有效,所以矿物油密闭PCR条件下采用一成分如一引物缓释以减少气雾胶产量或无效扩增气雾胶也是酶解作用最有效的前提保证,矿物油层不影响荧光光路及荧光强度；同时采用中部同序引物部分减少引物二聚体和反义碱基的中部干扰Oligo寡核苷酸选择性抑制内源性生成的引物二聚体扩增。

为了直观地表达本专利“引物末端酶解二聚体法PCR”简称引物末端酶解PCR的原理依据,以下采用卡通示意图再进一步假定引物二聚体PD产物酶解的几种极端典型特例分析:

指数扩增是过量一对引物结合模板并在引物序列末端上直接延伸而成,产物PD构成由原引物序列和按配对引物模板延伸合成的新链两部分形成,新合成链部分渗入尿嘧啶dU修饰和原引物序列引入RNA碱基rN修饰,PCR前通过尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG水解前次PD产物dU修饰合成链；杂交链选择性RNaseHII(不降解引物单链中rN)水解前次PD双链原引物中rN修饰碱基；酶再被PCR热变性灭活而不水解随后PCR扩增产物及不干扰本次PCR反应。

一、PD不同部位含dU产物UDG酶解-脱dU情况:

尿嘧啶dU代替正常dT底物渗入PCR产物仅稍微影响PCR靶扩增效率,一般能被标准定量曲线所矫正或通过添加甜菜碱PCR增效剂所补偿。

(1)附图1.a假设原引物序列5'端含a碱基(实线代表原引物),对应的PD新合成链(虚线代表)仅3'端脱dU,一般引物5'端不匹配不影响模板结合,所以几乎不影响作为模板的结合作用,游离引物结合PD新合成链后沿原引物序列模板延伸,完全不影响延伸至整个引物长度,产生新一轮的PD产物(u代表含dU及UDG脱dU处)；

(2)附图1.b假设引物中部含a碱基的对应PD合成链中部脱dU仅微微影响结合,少数碱基不匹配仅影响一点PCR退火温度,甚至脱dU处还减少近邻两侧碱基配对的空间限制,也完全不影响延伸至整个原引物长度；

(3)附图1.c假设引物3'末端含a碱基的脱dU对应PD不仅影响引物末端结合还特别影响3'末端延伸而很难产生新一轮PD产物；引物对3'最末1-2个碱基a腺嘌呤结尾是采用dU产物及UDG脱dU起到消除非特异作用的前提条件；此时PD产物原引物序列间插入一些碱基也不会影响脱dU干扰延伸。且由于PD仅单链就是有效模板,一对引物必须3'最末端均含a碱基对应PD酶解后才能消除PD产物模板作用。

(4)附图1.d脱dU对应PD再联合被内切酶Endo-nucleaseIII/VIII从脱dU处切断磷酸二酯键(×代表断开),由于PD产物原引物序列间大多插入一些碱基(细虚线代表),脱dU处切开的原引物序列总会带一段互补碱基,末端延长且互补的引物对反而增加PD非特异性扩增；且脱dU产物长期也会逐渐出现自然降解-脱dU处缓慢断裂而增加非特异性。

二、引物不同部位含rN碱基的产物酶解情况:

引物中引入一个rN碱基对靶扩增与PD扩增平均前移一个循环或提前一个Ct值；两个rN碱基特别靠近或连续rN明显抑制PCR扩增效率或平行推后扩增几个Ct值；4个rN就彻底抑制Taq酶扩增；位于引物末端或某些序列的rN可能还会增加PD非特异性；将rN尽量置于引物中嘧啶碱基之后有利于被环境微量RNase酶自然降解。

(1)附图2.a假设原引物序列5'端引入rN碱基(实线代表原引物),配对的新合成链(虚线代表)不含rN碱基而不被酶解,因与原引物序列匹配而完全不影响作为模板的结合作用,游离引物匹配结合PD酶解后的合成链部分,其3'末端沿对应引物模板延伸至近全长引物的rN碱基酶解断裂处(r+×代表)停止,延长了的引物极易配对结合开始下一轮PD非特异性扩增；

(2)附图2.b假设原引物(实线代表)中部含rN碱基,配对的新合成链(虚线代表)与原引物序列匹配而完全不影响作为模板的结合作用,游离引物结合PD酶解后的合成链片段,其3'末端沿对应引物模板延伸至一半引物,即rN碱基酶解断裂处(r+×代表)停止,延长了的引物极易配对结合开始PD非特异性扩增；

(3)附图2.c假设引物3'最末端含rN碱基,PD新合成链也完全不影响作为模板的结合作用,游离引物结合后末端沿对应引物模板刚延伸理应立即遇到rN碱基酶解断开处(r+×代表)终止；但由于PD产物原引物序列间大多插入一些碱基(细虚线代表),rN碱基做不到“最末端”,游离引物对3'末端总会沿少数插入碱基延伸几个相互互补碱基而增加PD非特异性扩增；引物3'最末端rN酶解仅减少对应引物末端延伸程度而对必须完全去PD而言作用有限；

(4)附图2.d显示引物末端无a结尾或一引物无a结尾联用其末端含rN情况,对应dU与rN处必须均酶解断开的小于7-8base短碎片才完全失去PD模板作用,所以a离两引物3'末尾小于5-6base的dU和相应rN位于引物末尾都酶解断开才能碎片尽量短(至少a结尾一端置rN尽量位于3'末尾)；杂交链选择性RNaseHII(不降解引物单链中rN)水解PD双链原引物中rN修饰碱基再UDG联合内切酶Endo-nucleaseIII/VIII从脱dU处切断磷酸二酯键(×代表断开),形成尽量最短的PD酶解碎片,短于10base碎片序列虽与引物末端配对互补但显著失去了长序列的辅助协同作用。

因此,引物末端酶解PCR消除PD产物非特异性的技术策略:

(1)采用dU渗入产物-UDG酶解去二聚体策略必须一对引物3'最末端1-2个碱基为a腺嘌呤结尾设计,以使引物对3'最末端配对PD产物链脱dU处既没有碱基匹配结合又无模板复制延伸,否则平均1/4脱dU的PD产物链剩余约3/4连续配对碱基继续起PD非特异性结合作用；通过dU代替dT和PCR成分预先加入0.2-2％优选0.5-1％E.coli UDG(5U/μl,v/v)大肠杆菌尿嘧啶-DNA糖基化酶,各成分于混合前可置室温RT 2小时至2天—37℃ 20分钟至2小时消化前次或历次PCR产物气雾胶交叉污染，试剂混合、封闭后可37℃至多20-30分钟,加样本DNA后立即PCR扩增,PCR变性前可50℃消化2分钟；

(2)如无a结尾或一端无a结尾一对引物必须联用引物3'末端rN碱基及dU与rN处均须酶解断开,且a离3'末端小于7-8b最好5-6base,越近酶解碎片越短；但引物3'末端均rN容易增加本底,可一侧rN离3'尾7-8b以内,而结尾rN须置a结尾同侧3'末端才能使碎片最短，三酶UDG+RNaseH/HII+Endonuclease III-VIII必须联用才彻底切断PD产物；随机dU渗入PCR产物,其PCR成分预先加入0.2-2％(v/v)UDG+RNaseH/HII(5U/μl)和0.2-5‰(v/v)内切酶Endo III-VIII(10U/μl)三酶联用彻底酶解PD产物交叉污染，PCR成分混合前置室温RT 3小时至3天—37℃ 30分钟至3小时，试剂混合后可37℃至多30-40分钟,加样本DNA后立即PCR；

(3)综合(1)+(2):一对引物3'最末端a结尾联用rN位于3'端/末端，引物a结尾就无须rN位于3'最末端但离最末端须小于10b内最好5-8base，使用dU代替dT和PCR成分加入0.5-1％E.coli UDG(5U/μl,v/v),置室温RT 2-3小时至2-3天—37℃ 1至3小时,再借助rN自然酶降解历次产物交叉污染；或者依次eUDG+RNaseHII/H+Endo强化水解PD产物37℃ 1至3小时；不先用Endo酶切断脱dU是避免于过量PD产物情况下Endo酶单独或先行RNase酶作用反而额外增加非特异性，采用脱dU和rN酶解后再联用Endo酶且设计后于RNase酶起作用；各PCR成分预先加入1％eUDG和0.5％RNaseHII先行酶解，Taq酶内再加0.5-1％内切酶Endo IV(10U/μl)于PCR反应液混合后37℃至多30分钟程序预设三酶顺次水解，加样后立即PCR。

为了避免末端降解后近全长片段可能会重新配对聚合扩增及rN非特异性,上述rN位于一引物3'末端和另一引物中部,或加选一条引物中部至5'端变一个次黄嘌呤dI碱基或烷基修饰嘌呤；UDG-End酶联用RNaseHII酶/和hAAG酶于物理隔绝条件下如矿物油封闭配合一PCR成分加糖重比重分层缓释–热启动来彻底杜绝引物二聚体PD非特异性扩增。

引物二聚体PD产物多酶降解还不同于靶产物多处酶解的协同增强作用，靶产物一处dU部分酶解部分抑制模板效应,但多处dU酶解的叠加后增强抑制模板效应；而PD产物合成链与原引物序列分别单独酶解后碎片反而增加非特异性扩增，只有多处酶解都100％降解才彻底抑制PD非特异性扩增。

(4)靶分子交叉污染试剂预处理：含dU气雾胶靶产物和a结尾引物二聚体PD产物均能有效地UDG酶解消化，如果过高浓度靶分子气雾胶造成微量污染试剂,则PCR试剂成分/各组分加入不影响靶扩增的稀浓度靶序列内切酶(0.1％-0.5％v/v)2-4种混合酶液,利用PCR成分混合前长时间酶切消化靶分子交叉污染；大量PCR用水还可加0.05-0.2‰约万分之一体积的次氯酸钠原液(10％)长时消化，再煮沸除去次氯酸钠后加0.05‰-0.1‰体积的外切酶ExoIII分装使用。

(5)应用荧光探针PCR：除引物必须如上设计外，探针序列如TaqMan探针也必须3'最末端a结尾或3'最末1-2个a碱基才能使引物-探针聚合扩增非特异产物被UDG有效酶解；联用探针中部至5'端变1-2个RNA碱基/Lock DNA碱基,和近3'末端变一个反义(/无义)的如2'-甲氧碱基/2F-RNA碱基以增强探针结合力和同时使探针失去扩增模板作用。

荧光PCR/PCR非特异性由相互影响的内源PD产生和外源PD气雾胶污染,内生PD非特异性之源不消除就难以研究气雾胶污染,反之外源气雾胶不清除也无法杜绝内源PD非特异性。根据专利(PCT/CN2013/088054)一对中部6-8b同序引物部分减少/推后引物二聚体7-10Ct值和反义碱基的5-9b中部干扰Oligo寡核苷酸选择性抑制PCR反应内的内源引物二聚体扩增；产物气雾胶极其过量情况下酶解反应还难以做到100％百分百有效,特别无a结尾联用引物3'末端rN情况下dU与rN裂解任一处漏切(leaking)都增加非特异性,所以矿物油密闭PCR条件下采用一成分如一引物含10％蔗糖分层缓释—热启动以减少气雾胶产量或无效扩增气雾胶也是本专利“引物末端酶解二聚体法PCR”酶解作用有效的前提必要条件，矿物油层不影响荧光光路或荧光强度。

在本专利“引物末端酶解二聚体法PCR”实施应用前，首先需要确立最有效的检验方法工具及试验出各种的引物末端酶解PCR实验条件与作用范围，指数放大定量技术荧光染料SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR本身就是样本分子可数(定量)的精确方法工具,因为其独特的直接指数扩增检测及操作最简便而线性关系及变异系数CV最好，并不代表本发明“引物末端酶解二聚体法PCR”仅限于SYBR GreenⅠ实时荧光PCR；采用各种荧光PCR成分变化及不同试验条件可试验确立荧光PCR条件及边界范围。本专利引物末端酶解PCR所用引物寡核苷酸和含RNA碱基/rN的修饰引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，底物dUTP/dU及dNTP亦购自生工生物工程(上海)有限公司；尿嘧啶-DNA糖基化酶E.Coli UDG、RNaseH/HII、Endonuclease简称End III-VIII及靶限制性内切酶购自新英格兰生物公司NEB(北京)公司。试验设备实时荧光定量PCR仪器采用SLAN-96P(上海宏石医疗科技有限公司)。下面依次列出荧光PCR标准程序和支持试验结果。

标准SYBR GreenⅠ实时荧光PCR程序：

以下配方为标准常规SYBR GreenⅠ荧光PCR反应液配制方法，单次(/个)反应为PCR各成分浓度及配制加入量,缓释引物含重比重10％蔗糖，配方10次反应便于一组试验反应液计算配制，相对应的单次(/个)反应50倍或100倍体积PCR成分为试剂盒组分；其中配方dNTP、Taq、10×buffer、/和SYBR Green混一起等于5×倍浓缩的反应混合液。本专利染料法荧光PCR以一系列标准品DNA梯度稀释液和待测靶分子样本纯化DNA液分别加入一组标准PCR试验，也可以不加入扩增靶模板来测试无靶模板的PCR体系引物二聚体PD本底及影响本底扩增情况；一般常以5μl体积观察对象代替靶模板试验PCR反应条件，SYBR GreenⅠ荧光PCR本身就是观察各种影响荧光PCR条件的最强有力的方法工具。

按以下次序加样,

(1)每个PCR反应管中先加入2μL缓释引物/+染料于管底(不必换吸头)；

(2)加入18μL余下反应混合液于PCR反应管管壁中部(小心不换吸头)；

(3)再沿PCR反应管管壁上部小心加入30μL矿物油,高速离心，可置37℃至多20-40分钟；

(4)最后加入5μL提取样本的DNA溶液/定量标准品/阴性对照品/阳性对照品于矿物油液面下(用过滤芯吸头，每一管必须换一吸头,用后吸头丢入次氯酸钠废液缸内)；

(5)不要混匀，以免破坏缓释层，盖紧PCR反应管管盖，瞬时高速离心，立即/尽快进行PCR反应，热变性混匀缓释层而启动PCR扩增。

仪器PCR设置：首先进行94℃变性2-3分钟后,再运行40个热循环94℃变性20-30秒、54℃退火30秒、72℃延伸30秒并读取荧光值的PCR无热盖扩增。

(1)、冷、热启动PCR试验：

采用以上不加靶模板的配方体系测试PCR前的冷/低温启动不同时间和手动绝对热启动PD本底Ct值，任意配对引物和中部同序引物(实施例2乙肝病毒HBcF/HBcaR)PCR反应液预置于4℃低温1-4天、20℃室温6-24hrs和37℃孵30—120mins启动不同时间后再荧光PCR本底的影响,和少一成分PCR反应液在94℃热变性后才手动加完全成份的绝对热启动PCR本底。实验结果见下面表1和扩增曲线见附图3,结果各种冷/低温启动对比直接启动对照组至多增加本底Ct值1-3个循环；且少一成分如一端引物PCR在热变性后才手动加完一端引物组份于矿物油层下面的绝对热启动本底Ct值也仅推后1-3个循环数；实验结论：冷/低温启动不是引物二聚体PD非特异性扩增的主要原因。中部同序的优化引物联用PCR增效剂进一步推后本底Ct值至40个循环以后；而PCR退火温度减低几度增加本底几个Ct值(退火data未列)。

表1

(2)、引物末端酶解试验：使用未进行过靶扩增的引物对或错配引物无模板的本底PCR系统,或加入靶序列限制内切酶的本底PCR系统引物二聚体PD扩增,以免/或排除靶扩增产物和靶模板分子的交叉干扰、影响PD扩增；靶分子扩增系统以大约Ct值20的靶分子质粒作为模板。采用实施例1转基因启动子序列无a(/一端a)结尾引物CamF/CamR和3'最末端a结尾引物NcmF/NcmR,或错配引物CamR/HBcaR；实施例2乙肝病毒3'末端a结尾引物HBcF/HBcaR,或错配引物NcmF/HBcaR；以底物dUTP代替dTTP常规PCR 40个热循环扩增产物稀释10³-10⁴倍来模拟PCR产物酶解试验,稀释的引物二聚体PD产物和靶产物分别进行如下表无酶解直接扩增、单用eUDG酶解后扩增、三酶解后扩增试验。实验结果见下面表2和扩增曲线见附图4,多次结果一端a结尾引物CamF/CamR二聚体产物单独eUDG酶解对比未酶解Ct值至多推后6-13个循环,三酶解对比单独UDG酶解Ct值多推后3-5个循环；3'最末a结尾引物NcmF/NcmR和末端a结尾引物HBcF/HBcaR的PD产物和靶产物单独eUDG酶解对比未酶解均推后20个Ct值循环,HBcF/HBcaR的PD产物三酶解较单独UDG酶解多推后3-5.5Ct值或引物无扩增Ct值。

结论：无a(/一端a)结尾引物UDG酶解99％-99.9％产物,但作用对PCR仍有限；3'末端a结尾引物UDG酶解PD产物能达到甚至超过靶产物酶解作用程度约达10⁶分子，三酶同时降解能进一步酶解PD产物多10倍或高一个数量级。

表2

附图说明:

图1.假定引物5'、中、3'脱dU示意图,仅a结尾引物3'末端配对脱dU而无模板可复制延伸；实线代表原引物序列，虚线代表新合成链，u代表脱dU处，细虚线代表插入引物间碱基。

图2.假定引物5'、中、3'端rN情况,原引物序列rN酶解后不影响二聚体新合成链的模板作用。

图3.置4℃-37℃启动对比直接PCR增加本底Ct值1-3个循环,冷/低温启动不是PD主要原因。

图4.引物末端酶解试验,3'a结尾引物UDG效用超过靶产物,比无a结尾强千倍,三酶作用更强。

图5.转基因两组引物标准扩增曲线较一致,3'a结尾NcmF/R无PD扩增,可校准定值转基因量。

图6.九个梯度乙型肝炎病毒染料法PCR标准扩增曲线,线性关系、变异系数、重复性均极好。

图7.乙型肝炎病毒改良TaqMan探针法PCR标准扩增曲线,质粒pUC-HBcore标准定量曲线。

具体实施例：

以下实施例进一步说明本专利的内容，但不应理解为对本专利的限制。在不背离本专利精神和实质的情况下，对本专利方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于本发明专利的范围。

(一)食品转基因实时荧光PCR定量检测:

转基因技术突破自然资源的限制,大幅度提高了农业效益和农产品产量、品质，同时亦带来了转基因食品生物安全问题,并日益受到世界各国政府和社会公众的广泛关注。随之,食品转基因成份定量检测及荧光PCR实时定量检测的需求也快速上升。转基因作物已从大豆、玉米、棉花等主要农作物发展至数十种转基因作物种类；转基因类型大多为各种抗除草剂型、抗虫型、或抗除草和抗虫复合型，且也已拓展至改变亚麻酸含量、高赖氨酸型、延迟熟软及抗病毒等一系列新型转基因种类。选择某一转基因靶分子作为转基因实时荧光PCR定量检测已不太容易作为广泛检测使用，然而多数转基因型均采用花叶病毒CaMV 35S启动子表达、调控，采用共同的启动子序列可以优先作为转基因实时荧光PCR检定及定量检测的初筛工具。本专利以转基因大豆/豆油为应用实施例来进行CaMV 35S启动子荧光PCR检测。

⑴CaMV 35S启动子序列无a(/一端a)结尾引物和3'末端a结尾引物设计：

遵循Hands技术70％以上同序引物对不会产生引物二聚体原则和离引物3'末端3-5b的中部天然同序6-8base序列的引物对一般推后PD约6-10个循环策略。从CaMV 35S启动子序列选择inverted repeat即一对6base同序序列作为一侧a结尾的F/R上下游引物:

CamF：5'-g aag gtg gct cct ac/r

/a-3'

CamR：5'-t ttc cac/r

/at gct cct c-3'/黑体/为RNA碱基,

一对6base同序序列以a结尾的靶引物如下：

NcmF：5'-att gtg aag ata gtg gaa a-3'

NcmR：5'-ct tac gtc agt gga gat a-3'(下划线序列为6b同序),

另以包括引物内一段CaMV 35S启动子序列克隆至pUC₁₉载体质粒pCaM(MW～10⁶)作为转基因CaMV标准曲线稀释梯度参考和阳性对照。

⑵PCR组分处理及配制：引物CamF/R各PCR组分加1％体积三酶及0.2％内切酶混合液37℃2-3hrs，NcmF/R各PCR组分加1％体积eUDG和0.2％内切酶Mn1I和hpyCH4IV混合液37℃ 1hrs后,按以下配方制备两组引物PCR反应混合液，分取20μl混合液/管PCR，30μl矿物油封闭:

(3)植物CTAB法DNA提取：植物样本于灭菌研钵中加液氮捣碎，再加入500μL十六烷基三甲基溴化铵CTAB研磨，然后转入1.5mL塑料EP管65℃水浴1小时,加等体积的氯仿-异戊醇(24+1)抽提一次，微磁球结合或2倍酒精盐液沉淀，加40μL的TE洗脱或溶解DNA。豆油根据(中国农业科学2007,40(5):1069)提取DNA方法：取金龙鱼牌食用转基因大豆油10mL加10mL正己烷于烧杯中磁力搅拌2hr,加20mL的PBS继续搅拌3hr，转入50mL塑料管离心12000g×20mins，小心取出下层水相，转入一新50mL管加等体积的异丙醇并混匀，置-20℃×20mins再离心12000g×20mins，弃上清，沉淀加dH₂O 100μL溶解，加500μL的5×倍DNA结合缓冲液过DNA结合离心柱，洗液洗柱两次，离心柱加50μL的TE洗脱DNA。纯化质粒pCaM(约～0.4μg/μl)作为原液按下表3作8个梯次10倍稀释为标准曲线梯度,

取9个塑料PCR管,每管先加入45μL纯化水,取5μL质粒pCaM原液加入第1管水中、并用吸头轻轻混匀、此为原液×10^-1倍,从第1管中取5μL的10倍稀液加入第2管水中、并轻混为原液×10^-2倍,每管换一吸头,原液×10^-3…依次类推…原液×10^-9；第10为样本DNA管。

(4)荧光PCR：组分如上消化、混合,将两组PCR管依次加入20μl混合液、30μl矿物油、再加5μl梯度或样本DNA，立即PCR 95℃变性2分钟后,进行40个热循环94℃变性20秒、54℃退火30秒、72℃延伸30秒并读荧光值的实时荧光PCR无热盖扩增,结果见下表3和附图5。

表3.

转基因标准定值：

NcmF/NcmR扩增Ct值较CamF/R组平行推后1个数量级,扩增曲线见附图5。引物CamF/R组PCR 36-36.5Ct后梯度分不开；引物NcmF/NcmR组PCR本底更好,甚至最低浓度靶分子梯度均匀、重复性极好,无靶-水对照组40循环以后直线扩增无Ct值。豆油抽提纯化DNA样本Ct值约为22个循环,对比标准曲线梯度约5×10⁷拷贝/10mL样本,换算成纯化DNA样本2.5×10⁵/5μL,等于约2.5×10⁵转基因分子/mL豆油或2.5×10⁶转基因分子/10mL豆油。

(二)乙型肝炎病毒(HBV)实时荧光PCR定量检测：

乙型病毒性肝炎(简称乙肝)由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的一种世界性的传染性疾病，据世界卫生组织WHO报道全球约20亿人感染过乙肝病毒。我国人群中乙肝感染率非常高(近10％)，主要由乙肝病毒引发的肝癌已位列我国肿瘤首位，极大的危害了人们的身体健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法、放免法、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增(PCR)荧光定量法等。传统酶免疫法应用较广，但灵敏度不足；实时荧光PCR定量和数字定量PCR法可以精确测定乙型肝炎病人的病毒载量,对感染者病毒复制水平的判断,病情传染性及抗病毒药物疗效监测具有无法替代的重要作用。

乙型肝炎病毒(HBV)为部分双链DNA病毒，主要有三段种型特异保守区，分别位于表面抗原HBsAg区,X区和核心Core区,大部分HBV实时荧光PCR研究集中选择核心Core区和表面抗原HBsAg区。HBV核心Core区有正负双链DNA,表面抗原HBsAg区仅含负链DNA单链,且大量二级结构亦集中于此区域,影响PCR扩增效率。

本实例精选乙型肝炎病毒(HBV)核心Core区(CDR:2306-2444)一段序列作为HBV同序引物置换的核酸扩增靶特异序列，展示两端各20碱基Core区(nt:2306-2444)序列如下：

AB540584Core区(nt:2306-2444)

CAAATGCCCC TATCTTATCAAC––––––GTCGCAGAAGATCTCAATCTC

(1)HBVcore实时荧光PCR引物设计:

本发明根椐一般引物选取原则及部分同序部分减少引物二聚体原则来综合考虑、设计:

选取含种型特异保守序列的100-300bp片段作为靶保守区；(2)引物长16-24base,解链温度Tm在52-60℃,引物间差小于2-3℃；(3)一对引物GC含量50％,尽量分布均匀；(4)一对引物间特别是3'末端间不要有连续碱基反向互补序列；(5)引物3'末端最后5个碱基避免连续2-3个以上G/C碱基；(6)一对离3'最末3-5b距离的引物中部6-8b同序能部分减少引物二聚体PD扩增；(7)引物3'最末端1-2个碱基选择A结尾,以使UDG酶有效作用。

HBVc引物上游F/下游R序列如下:

HBcF:5'-at gcc cc/r

/atc tta tca ac-3'/黑体/为RNA碱基,

HBcaR:5'-g att gag atc tt

tgc/r

/ac-3'(

由c人为变异),

其中F不以a最末结尾因为有非特性,R因为此处病毒基因二级结构而必须ac结尾。

另以临床检验的已知HBV阳性标本血清煮沸法上清为模板,选定全长Core区(1900-2450)片段两侧序列合成带酶切位点引物扩增模板550bp片段,将该片段酶切并克隆至pUC₁₉载体作为乙肝模拟定量对照DNA(pHBc),从0.1μg/ml点开始作10倍稀释6-9次生成10倍梯度定量标准品,最后加DNA保护剂冻存。

(2)PCR组分处理及配制：

引物HBcF/HBcaR,以HBcaR稀释加10％蔗糖作为缓释引物,各PCR组分加1％体积eUDG和1％体积RNaseHII于37℃ 1hrs,再0.2％体积EndoIV酶及0.5％内切酶HpaII、HpyIII、Mn1I、sau3AI混合液37℃ 1hrs,按以下配方制备引物PCR反应液，分装2+18μl/管，30μl矿物油封闭:

(3)血标本DNA提取：

一步煮沸纯化法，取50μl-100μl血清加等量的煮沸缓冲液(用前充分混匀微珠,剪大口吸头吸取)，轻混,置沸水浴10分钟,经4℃短暂冷确后高速离心10分钟，取上清5μl加样。

二步PEG沉淀法，弱阳性标本采用PEG沉淀HBV,取血清500μl加500μl 2×PEG液(16％w/v PEG&0.7M NaCl)，Vortex混匀，高速离心10分钟，弃上清950μl，浓缩沉淀留50μl后加50μl煮沸缓冲液，余同上煮沸法,取5-10μl梯度稀释加样。但PEG沉淀回收率平均为50％-60％，定量检测必须计算损失。

微磁珠结合法：采用0.2-1M异硫氰酸胍与0.2-1g％SDS裂解,核酸在0.1-0.3M钠盐条件下结合至含0.1M的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(pH6.5)的聚苯乙烯微磁球(0.1-0.4mg/mL)硅烷化表面羟基(Melzak et al,1996),用小于pH6.0的0.1-0.3M氯化钠缓冲液洗涤,大于pH8.5的TE缓冲液洗脱。

2×煮沸缓冲液:0.02N NaOH,0.02％SDS(w/v),25mM KoAc,10mM(NH₄)₂SO₄,0.5％G25(v/v),0.5M Betaine,0.5％Glycerol(v/v)和0.05％Gelatin(w/v)。

(4)实时荧光PCR检测：将标准品和样本PCR管依次加入2+18μl反应液、30μl矿物油、再加5μl梯度或样本DNA，尽快PCR 95℃变性2-3分钟后,进行40个热循环94℃变性20秒、54℃退火30秒、72℃延伸30秒并读荧光值的实时荧光PCR无热盖扩增。

实验结果7个标准品10倍稀释曲线浓度梯度对应扩增数据见下表4；其9个标准稀释梯度扩增曲线图见附图6。并完成了1000病例三家三甲医院临床检验实验及中检院注册检验,通过了中国食药监局CFDA注册,注册证号：国械注准20153402086。

表4.定量标准曲线：0.1μg/ml依次十倍稀释.加5μl

阳性pHBc质粒MW:2.1×10⁶

(三)应用TaqMan探针HBV实时荧光PCR：采用改良水解探针实时荧光PCR反应，选取靶基因(临近下游一端引物)的一段代表性序列(nt:2306-2444)，靶特异性序列(/互补序列)5’端标记报告荧光染料FAM，利用Taq酶5’-3’外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放荧光基团；探针3’端靶序列外添加5～8个与离5’端3～14个碱基后面的中部序列反向互补的碱基再标记淬灭基团TAMRA，由于环状结合部分较短杂交使自身较难形成锅柄样结构，但两探针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了Molecular beacon本底低和TaqMan灵敏、特异的优点，从而消除或减少了引物和探针聚合出现指数扩增而干扰检测结果。

(1)根椐一般引物选取原则和一对部分同序引物部分减少其二聚体的原则综合考虑，设计HBVcore探针法荧光PCR引物：

HBVc引物序列如下:

THBVFc:5'-ca aat gcc cct atc tta tca ac-3'

THBVRc:5'-gag att gag atc ttc tgc gac-3'

根椐一般探针选取原则和改良水解探针综合考虑，设计HBVcore探针法荧光PCR改良式水解探针：

TqHBc:5’-FAM-cgt ctg c/

/a ggc/

/ag gga gtt ctt ctt c/i2ome t/a agaac-TAMRA-3’

其中/粗黑体

/为RNA碱基,/i2ome t/为反义碱基；

(2)TaqMan实时荧光PCR反应：

由于TaqMan探针PCR每个模板每次循环最多释放一个荧光基团，其反应荧光强度远低于SYBR Green I荧光染料法(每3-4bp DNA能结合一个SYBR Green I分子)，所以TaqMan法必须采用较大体积的50μL反应体系，以使PCR仪器能接受到足够强度的荧光信号。

首先每个PCR反应管加2μL缓释引物R(2.5μM)，缓释引物热启动和防产物气雾胶污染。再按以下配方取1.5mL的EP管配制不含待测模板和引物R的反应混合液。

(^☆探针荧光会逐渐衰减，旧标记探针可相应多加一些。所用引物、dNTPs，TaqDNA聚合酶，荧光探针，引物F/引物R等均购自上海生工生物工程有限公司，10×PCR buffer有本公司自主生产。)

所配的反应混合液共0.95mL分装于预加缓释引物的PCR反应管/或8联排管，每管38μL分装25管。其中一管加10μL纯化水dH₂O作为PCR系统阴性对照，其余管按顺序加入10μL待检DNA后，表面再小心、缓慢地沿管壁加上50μL矿物油，短瞬高速离心，切记不要混匀！以防破坏缓释。为了检测结果的可靠性，每次检测必须设立实验阳性阴性对照和定量校准品(根据是否定量需要)。每个检测可平行2-3份×50μL计平均Ct值，分析统计结果。

标准曲线:以pUC-HBcore(3.36kb，分子量MW＝2.1×10⁶，计1μg＝2.8×10¹¹copy分子)计算，相应标准品梯度分子拷贝数为：2.8×10⁹copies/mL，2.8×10⁸copies/mL，2.8×10⁷copies/mL，2.8×10⁶copies/mL，2.8×10⁵copies/mL，2.8×10⁴copies/mL和2.8×10³copies/mL。

反应管上实时荧光PCR仪(调整仪器激发光波长FAM:480nm,检测光波长FAM:520nm)。按使用说明书设置运行程序，首先进行一个预反应50℃2分-94℃3分钟；然后PCR扩增40个热循环：94℃30秒，58℃60秒；于58℃读取荧光值。

(3)实验结果分析：

HBV核心抗原质粒对照pUC-HBcore标准定量曲线从左开始为2.8×10⁹copies/mL-2.8×10³copies/mL10倍稀释扩增曲线，最后一条直线为没有模板的本底对照；结果见附图7本底对照为一直线无Ct值,扩增30个循环后有点受内标抑制而低浓度Ct值稍滞后。

购买中检所乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量标准品(批号0711)线性灵敏度参考品(图7)及阳性参考品检测结果基本一致，阴性参考品全为基线反应。线性灵敏度参考品的灵敏度可达Ct35-37。

(4)临床试验结果：

临床研究对比上海克隆生物高技术有限公司检测700份临床样本，包括慢性乙型肝炎332例，急性乙型肝炎156例，乙型肝炎带原者56例，肝癌6例，其中B基因型103例，C基因型436例，D基因型11例；肝硬化8例，肝囊肿7例，丙型肝炎8例，甲肝3例，戊肝2例，健康人102例，糖尿病等其他疾病20例。本研究共包含干扰样本10例(溶血样本4例，脂血样本3例，甘油三酯样本3例)，检测结果均为阴性，表明干扰物质对检测结果无显著影响。

与上海克隆生物高技术有限公司试剂相比，阳性符合率为99.64％，阴性符合率为98.01％，总体符合率为99.29％。经Kappa检验，kappa值为0.966，大于0.8，说明两种试剂的检测结果高度一致。本试剂试剂测量值为Y变量，对比试剂测量值为X变量拟合线性回归方程，Y＝0.969x+0.373，其斜率为(95％可信区间)为0.969，P<0.001，线性回归方程具有统计学意义(F值46518.951，P<0.001)，相关系数(R)为0.993，P<0.001，R²为0.985。说明两试剂检测结果具有高度相关性。

序列表

<110>江洪

<120>引物末端酶解二聚体法PCR

<160>10

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gaa ggt ggc tcc tac aa 17

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ttt cca cga tgc tcc tc 17

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

att gtg aag ata gtg gaa a 19

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctt acg tca gtg gag ata 18

<210>5

<211>43

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒（HBV）部分序列

<400>5

caa atg ccc cta tct tat caa c––gtc gca gaa gat ctc aat ctc 43

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atg ccc cta tct tat caa c 19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gat tga gat ctt atg cga c 19

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

caa atg ccc cta tct tat caa c 22

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gag att gag atc ttc tgc gac 21

<210>10

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cgt ctg cga ggc gag gga gtt ctt ctt cta aga ac 35

Claims (13)

1.引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征是采用引物末端碱基修饰并且在PCR反应试剂混合之前进行修饰产物酶解去除污染引物二聚体的PCR技术，具体为以下三种方法中的任意一种：

(1)选取3'最末端倒数第1/2个碱基或1-2个碱基均为A/a腺嘌呤结尾设计的一对引物，底物dUTP/dU代替dTTP渗入PCR产物包括引物二聚体产物，通过PCR试剂成分预先加入体积百分比0.2-2％的浓度为5U/μl的UDG酶，各成分于混合前室温两小时至两天或37℃二十分钟至两小时消化前次或历次PCR产物气雾胶交叉污染，然后依次混合所述PCR试剂并加入待测纯化样本，立即PCR反应；

(2)无a结尾但离3’末尾小于7-8碱基或一端无a结尾则一对引物均在a之外变一个3'末端rN碱基,或一侧a结尾引物变一个3'末端rN碱基而无a结尾引物近3'末端变一个rN碱基，随机dU代替dT渗入PCR产物，其PCR成分预先加入体积百分比0.2-2％的UDG酶，体积百分比0.2-2％的浓度为5U/μl的RNaseH/HII和体积百分比0.2-5‰的浓度为10U/μl的内切酶EndIII-VIII三酶,成分混合前室温三小时至三天或37℃半小时至三小时，彻底酶解切断引物二聚体产物污染，然后依次混合所述PCR试剂并加入待测纯化样本，尽快PCR反应；

(3)3’最末1-2个a结尾一对引物a之外再3'端离3’最末小于6-10碱基处在嘧啶后面变一个rN碱基，底物dU代替dT渗入PCR产物，PCR成分预先加入体积百分比0.5-1％的UDG酶单独酶解；或PCR成分预先加入体积百分比1％的UDG酶和0.5％浓度为5U/μl的RNaseH/HII先行酶解37℃1-3小时，Taq酶中另加体积百分比0.5-1％的浓度为10U/μl的内切酶EndIII-VIII于PCR反应液混合后37℃不超过30分钟，程序预设三酶顺次水解，然后加样、启动PCR反应。

2.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：所述上下游引物中的一条的引物中部至5'端增加变一个rN碱基、dI碱基或烷基修饰嘌呤；对应地，所有PCR试剂成分在混合前添加UDG酶,RNaseHII酶和hAAG酶，于物理隔绝情况下PCR以杜绝引物二聚体非特异性扩增。

3.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：为防止靶分子气雾胶造成微量污染试剂，PCR试剂成分/各组分混合前还加入不影响靶扩增的稀浓度0.2％-0.5％(v/v)靶序列限制内切酶2-4种混合酶液，利用PCR成分混合前室温两小时至两天或37℃二十分钟至两小时酶切消化靶模板分子交叉污染。

4.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：PCR用水使用便宜的化学法替代酶法消化污染，新鲜纯化水采用加0.1‰-0.2‰(v/v)稀释的10％次氯酸钠液室温1-2天消化污染DNA，再开盖煮沸除去次氯酸钠后加0.05‰-0.1‰(v/v)外切酶ExoIII，冷藏待用。

5.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：所述上下游引物具有中部6-8b同序/相同碱基序列的引物，用于减少引物二聚体程度/推后引物二聚体本底扩增Ct值，部分减少内源性引物二聚体扩增。

6.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：所述上下游引物中部6-8b同序并且添加一引物中部互补的反义碱基5-9b中部干扰Oligo寡核苷酸抑制剂，选择性抑制PCR反应内的内源性持续引物二聚体扩增以及消除引物二聚体本底Ct值。

7.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：在矿物油密闭PCR反应的情况下，采用含10％蔗糖的引物，结合热启动PCR以减少气雾胶的产生。

8.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：PCR反应液添加含甜菜碱和聚阴离子多聚磷酸PCR增效剂，双向增强靶扩增效率和抑制引物二聚体非特异性扩增。

9.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：所述PCR应用探针法荧光PCR，采用所述上下游引物必须以a结尾设计外，探针序列也必须在3'最末端以a结尾，从而使得引物-探针非特异产物能被UDG酶有效酶解；联用探针中部至5'端变1-2个RNA碱基或Lock DNA碱基，和近3'末端变一个反义或无义的碱基以增强结合力和同时消除引物二聚体PD产物作为模板的作用。

10.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：于独立配液室混合所述PCR反应试剂，并在分隔的加样室进行样本DNA纯化及加样，加样使用过滤芯吸头及用后丢入次氯酸钠废液内，实验室每天用紫外灯和臭氧轮换消毒，每次实验前后用纯的10％次氯酸钠消化、清洁各一次。

11.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：使用物理空间隔离的密闭独立扩增仪器室，紫外灯和臭氧轮换消毒，荧光PCR/PCR扩增仪器采用机械密闭或隔离气雾胶的物理措施。

12.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，所述的PCR方法操作步骤如下：

(1)每个PCR反应管中先加入2μL含蔗糖的缓释引物和染料于管底；

(2)混合其余PCR反应试剂，并吸取反应混合液18μL于PCR反应管管壁中部；

(3)沿PCR管管壁上部加入30μL矿物油,高速离心，可置于37℃，20-40分钟；

(4)加5μL提取样本的DNA溶液、定量标准品、阴性对照品或阳性对照品于矿物油层表面下，加样吸头采用过滤芯吸头，每一管换一吸头；

(5)避免混匀，以免破坏缓释层，盖紧PCR反应管管盖，高速离心，尽快或立即进行PCR反应，热变性混匀缓释层而启动PCR扩增。

13.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于其方法应用于核酸检测试剂盒，盒成份包括：样本核酸提取试剂，dNTPs及dUTP，Taq酶及其缓冲液，修饰引物，染料SYBR Green I及荧光探针，PCR增效剂；UDG酶、RNaseH/HII、及EndIII-VIII、限制内切酶混合酶、经化学法处理的水，矿物油或石蜡油。

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