CN102533963A - 一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术 - Google Patents
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Abstract
本发明“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”为一种RNA扩增检测技术，其特征是选取靶RNA扩增序列，其两端引物选中间4-8base同序的引物序列并在其5’端加上噬菌体启动子序列，通过这种嵌合引物的“引入”，靶RNA逆转录成带启动子序列的cDNA，利用噬菌体RNA聚合酶识别、结合启动子并大量转录cDNA启动子下游序列成大量RNA片段。所述的带启动子中间部分同序引物限制了过量引物间二聚体非特异性扩增及转录，提高了转录等温扩增检测的可靠性。
Description
技术领域：
本发明属于分子生物学及分子诊断领域的等温核酸扩增技术领域，具体涉及一种减少引物间聚合非特异性扩增的转录等温扩增技术。
背景技术：
基因扩增技术是随着基因工程技术和分子生物学的发展而产生的，1987年，美国PE(Cetus)公司Kary Mullis发明了聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)专利技术(US Patent 4,683,202)。这种通过热循环使模板解链的DNA扩增技术不仅成为生命科学最关键、核心的基础技术。由于其呈几何级数放大的高灵敏度，也开始应用于临床检验等领域，特别是美国ABI公司于1997年推出实时荧光定量PCR(US Patent 6,485,903)技术将传统的检测信号相加的纳克(ng)级检验(部分技术整合级联信号放大可达pg级灵敏度)带进了信号指数放大的飞克(fg)级定量检验，以实时荧光定量PCR技术为代表的基因扩增技术使临床检验从此进入分子诊断及检验分析数字化时代。
与此同时，一系列的不依赖于热循环解链的等温(/恒温)基因扩增技术也有了长足的发展。核酸等温扩增术的特点是扩增反应的全过程(除初始的杂交步骤外)均在单一温度，无需专门的扩增仪器下进行，而不像PCR反应那样，需要经历几十个温度变化的循环过程。等温扩增技术的这一特点，使得它们对所需仪器的要求大大简化，检测时间显著缩短，因而适合于现场快检或床边检测。比较代表性的有：链置换扩增(Strand Displacement Amplification，SDA)，核酸序列依赖扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)，转录介导扩增(Transcription Mediated Amplification，TMA)，滚环扩增(Rolling CircleAmplification，RCA)，连环恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，解旋酶依赖扩增(Helicase Dependent Amplification，HDA)和寡核苷酸恒温扩增(Isothermal Amplificatio of Oligonucleotides)等。其中又以RNA扩增技术灵敏度最高，应用比较成熟。转录介导的扩增方法(即转录RNA扩增技术)包括TMA和NASBA。TMA(PNAS，USA87：p1874和US Patent：5,766,849)是一种利用AMV/M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶2种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统，主要扩增原理为：目标序列在逆转录酶作用下，以与T7启动子嵌合的引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成末端带T7启动子的双链DNA，并在T7RNA多聚酶作用下，一个DNA分子转录出七百条目标RNA序列，部分RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。NASBA[Nature350(6313)p91和US Patent：7,074,558]的原理与TMA相似，但仅一条引物5’端加上T7启动子序列，进而DNA仅一条链转录；在核酸提取和扩增产物及信号检测方法上也有所不同。转录介导的扩增方法扩增效率极高，灵敏度高于实时荧光定量PCR技术，反应条件简单，无需专门的扩增仪器，且因整个反应在1个试管中恒温进行，减少了热循环PCR产物气雾胶的交叉污染。与RT-PCR比较，该技术可减少样品中抑制性物质的影响，不受背景中DNA的干扰，单链RNA序列是特异的靶序列，产物RNA不易发生交叉污染，降低检测交叉污染的假阳性率。整个反应过程由三种酶控制，操作次数少，并大大缩短检测产生结果的时间。特异性好，忠实性高，其检测效率高于PCR。
然而，等温(/恒温)基因扩增技术反应温度一般明显低于热循环PCR反应，使一对过量引物间杂交结合几率明显高于传统PCR反应的热启动情况，过量的一对引物3’末端少数互补碱基低温下更容易杂交、延伸形成引物二聚体，随后以引物二聚体为理想模板被更多游离的引物非特异性指数扩增。这种过量引物间的二聚体非特异性聚合随后被转录介导的扩增技术高效放大，导致本底信号高，易假阳性。本发明“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”根据大多数一对引物不同程度地产生引物二聚体非特异性扩增，而单一引物自身(同序)不会形成引物二聚体的普遍现象，采用中间部分同序的一对引物设计(CentralHomogenic Primers)，最大限度地近似单一引物，大大减少引物间聚合的非特异性扩增，也就减少了假阳性。最后扩增产物检测通过整合成熟的一种分子灯标/信标Molecular Beacon(Nat.Biotechnol：14，p303和US Patent：05925517)探针技术，分子灯标探针杂交增加了一道靶特异性检验，同时因探针分子内两末端自身结合而不易与过量引物分子间杂交聚合而非特异性扩增，较其他方法特异性高了许多。特异性杂交后释放出的荧光信号再采用便携式手持荧光阅读仪判读，或常规实时荧光PCR仪实时检测，或高通量微纳荧光PCR芯片并行分析。
发明内容：
为了克服一对引物间形成二聚体造成的转录等温扩增技术非特异性扩增的干扰，以及非特异扩增竟争性消耗转录等温扩增反应成份的局限。本发明“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”是借助带启动子引物将启动子引入cDNA的一种RNA扩增技术，通过一对中间部分同序引物策略减少了其非特异性扩增。其特征是一个RNA靶模板通过逆转录成带噬菌体启动子序列的cDNA，再转录成大量拷贝RNA并循环反应大量扩增的过程。所述的逆转录生成带启动子DNA步骤是指使用逆转录酶以RNA为模板合成互补的DNA链并通过引物在其前端引入噬菌体启动子序列，利用逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成双链cDNA。所述的转录RNA扩增过程是指利用噬菌体RNA聚合酶(Polymerase)特异性地识别并结合模板上噬菌体启动子序列，催化在双链和单链DNA噬菌体启动子下游基因转录合成单链RNA。所述的带启动子序列的引物是指选择靶特异性的中间4-8base同序的一对引物，其5’端均加上噬菌体启动子序列，如此高度近似的一对引物存在两段相同序列，最大程度地限制了过量引物间二聚体的非特异性扩增，大大提高了转录介导的恒温扩增技术可靠性。
所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的扩增模板选择靶基因代表性序列，长100-300bp，其两端选择有4-8base互补且下游取反义链后中间4-8base同序的序列作为引物。
所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的逆转录酶包括禽类髓母细胞瘤病毒AMV逆转录酶、鼠白血病病毒M-MuLV逆转录酶和RNase H活性失活的重组M-MuLV鼠白血病病毒逆转录酶，另加RNase H酶。
所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的噬菌体RNA聚合酶包括T7、T3、SP6等RNA聚合酶Polymerase。
所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的噬菌体启动子序列是指T7、T3、SP6结合识别序列。
所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的引物设计原则是在引物距3’末端3-5base远的中间部位选取4-8base同序策略，引物3’末端不能有两个以上互补且最末一个碱基绝不能互补，引物5’端不能有三个以上互补特别是连续互补，引物5’端均加上噬菌体启动子序列。
所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的实验条件同于一般转录介导的等温扩增技术。酶共同反应条件：pH8.5的4mM Tris-CL，5mM KCL，1.2mMMgCL，0.2mM DTT和1.5％DMSO，引物浓度3-5μM。
所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的灯标荧光探针设计原则是：探针环长16-32base，总长最好＜40nt，Tm值比引物的Tm值要高5-10℃；选择的序列接近扩增产物中心，距两引物≥6base；探针锅柄区/发夹区选靶为长4-8bp互补序列以形成锅柄样结构；5’端不能是G碱基，标荧光素，3’端标淬灭剂且必须封闭。
所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的检测方式包括便携式掌上荧光阅读仪快速即时现场检测；也可以实时荧光等温扩增分析，和通过微纳PCR芯片对多靶基因、多基因位点进行等温扩增-阵列快速检测。
所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，dNTPs，rNTPs，T7polymerase，逆转录酶M-MLV及其缓冲液，灯标荧光探针，带T7上游引物F/下游引物R，标准对照物，DEPC纯化水dH2O，RNasin，矿物油。
本发明“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”是一种基于基因转录的扩增(Transcription-based Amplification System，TAS，PNAS，USA87：p1874)技术，主要利用噬菌体RNA聚合酶包括T7、T3、SP6等RNA Polymerase依赖DNA模板的合成RNA的活性，如T7等RNA聚合酶无需启始引物，能高度特异性地识别并结合T7等噬菌体启动子序列，催化在双链和单链DNA噬菌体启动子下游基因转录合成单链RNA，最适条件下1摩尔的模板DNA可得到大于700摩尔的RNA转录产物(Nucleic Acids Res.，18，p83)；再结合逆转录酶包括禽类髓母细胞瘤病毒AMV逆转录酶、/鼠白血病病毒M-MuLV逆转录酶的逆转录活性以RNA为模板从引物开始合成互补的DNA链，利用逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成双链cDNA。在设计合成引物时有目的地引入T7等噬菌体启动子序列，一是待测靶模板RNA逆转录成cDNA时借预设引物引入了启动子序列，带启动子序列的cDNA在T7等RNA聚合酶作用下大量转录RNA产物；二是部分RNA产物又可进入逆转录反应成为带启动子序列的cDNA，再大量转录RNA产物。如此循环完成自催化DNA扩增和大量转录RNA的基因扩增过程，原理见附图1。扩增一对引物两5’端都可加上噬菌体启动子序列，从而cDNA双链均带有启动子序列，双链同时大量转录RNA和负链(anti-sense)RNA产物，其扩增灵敏度极高，非特异性扩增也容易极度放大；适度采用一条引物5’端带上噬菌体启动子序列，而另一条引物不带启动子或部分比列带启动子使cDNA仅一条或部分链转录RNA，适当调低扩增灵敏度，以期适应不同检测本底要求的灵敏度窗口。等温扩增反应一般于简易恒温金属浴或水浴箱中进行。
基因扩增技术非特异性扩增主要源于过量一对引物间3’末端互补碱基配对、3’-3’对头式杂交、延伸形成引物二聚体，随后以引物二聚体为理想模板被更多游离的引物非特异性指数扩增；而引物末端与非特异性模板杂交、扩增因碱基配对短而随机、不聚焦和模板浓度低而大大受限。一对引物间3’末端多个连续互补碱基可以通过引物设计软件设限而避免，由于基因仅4种碱基排列方式，一对引物间3’末端有1-2个碱基互补就不可避免，引物链可弯曲转向，一对引物3’末端少数互补碱基就可借助一条链转向后3’末端外的多个互补碱基合力而杂交、延伸形成引物二聚体。所以，按目前仅避免引物间多个连续互补碱基、没有二级结构等一般性原则设计的引物均不同程度地存在引物二聚体非特异性扩增现象。不具备常规PCR热启动-热循环条件，在等温扩增技术的低温扩增条件下，过量的一对传统引物末端低温更容易杂交、延伸形成引物二聚体，随后以此二聚体作为模板被过量游离的引物非特异性扩增；再被转录介导的扩增技术高效放大，导致本底信号高，易假阳性。本发明“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”根据单一引物自身(同序)不会形成引物二聚体的普遍现象，通过选择部分同序的一对引物使其最大限度地近似单一引物从而减少二聚体的程度，并将这种部分相同序列，放在引物最关键部位，采用5’-3’平行比对中间部分同序的一对引物(CentralHomogenic Primers)策略，中间部分相同序列碱基相互排斥，其分散和抵消了一对引物间少数互补碱基的氢键结合力，大大减少引物间相吸、聚合的非特异性扩增。最后，一对引物两5’端加上噬菌体启动子序列，其中一条引物加短一些启动子序列或部分比列带短启动子，中间部分同序的一对引物5’端再加上相同噬菌体启动子序列，如此高度同序引物对基本上将引物间聚合形成引物二聚体非特异性扩增降到极低限度，结果是克服了转录介导的等温扩增技术难以逾越的引物二聚体非特异性扩增障碍。
等温扩增产物通过分子灯标(信标)的荧光检测，分子灯标是一种长度为16-32mer靶特异序列探针的两端分别加上5-8mer序列互补的锅柄区。在自由状态时由于锅柄区互补序列的结合使探针分子形成锅柄样结构，又称发夹状探针。其5′末端及3′末端分别联用荧光素分子及猝灭剂分子。5′端常标记荧光素包括5-碘乙酰胺-荧光素(5-iodoacetamidofluorescein)，6-羧基-荧光素(FAM)，四氯-6羧基荧光素(TET)和六-6-羧基荧光素(HEX)等；3′端标记二甲氨基偶氮苯甲酚Dabcyl-(4-[4-dimethylaminophenylazo]benzonic acid)为淬灭剂。自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与淬灭分子靠近(约为7-10nm)，此时发生荧光共振能量转移，使荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，当分子灯标与特异性靶标序列互补结合形成双链杂交体时，灯标锅柄互补区被拉开，荧光分子和淬灭分子相对分离开，灯标分子得以发射荧光。特异性灯标探针的杂交增加了一道靶特异性检验，同时因灯标探针分子内两末端自身结合而不易与过量引物分子间杂交聚合而非特异性扩增，特异性又提高了一层。
中间部分同序的一对引物设计原则：(1)首先遵守一般引物设计所有原则，选取长度16～24base，无四个或四个以上连续互补碱基及内部二级结构，G+C含量40％-60％，Tm值54-56℃，不以GG、CC夹或T结尾等等；(2)引物中间位置，平行以5′-3′方向选取一段4～10base完全相同的序列，优选6～8base相同序列；(3)引物3′末端(即相同序列下游尾端)为1～5个base靶特异性序列，优选2～4base双向都没有连续互补的靶特异性序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，最多允许一对互补，还不能留在最末端；(4)引物5′端区(即相同序列上游首端区)为5～9个base靶特异性序列，优选6～8base没有两个以上连续互补的靶特异性序列，尽量选择较少的不连续的单个互补，最多允许间隔的3对不连续互补碱基。(5)一对引物两5′端加上噬菌体启动子序列。
分子灯标(信标)探针设计的一般原则：(1)灯标探针环长16-32base；(2)探针的Tm值比引物的Tm值要高5-10℃；(3)探针序列接近扩增产物中心，距两引物≥6base；(4)探针锅柄区/发夹区选靶无关序列，长4-8bp，优选5-7bp；(5)探针5’端不能是G碱基，直接邻近的碱基G也具有淬灭标记荧光素作用；(6)避免单一核苷酸成串，尤其是G；(7)富含AT的序列要增加长度，以达到符合要求的Tm值，但探针总长最好＜40nt；(8)探针的3’端必须封闭以防止PCR扩增时延伸；(9)探针锅柄/发夹区序列可变通为一端仍然选择靶特异序列，另一端就必须选其互补序列以形成锅柄样结构。
转录介导的等温扩增反应一般于EP离心管密闭在温度41℃反应，但“闭管操作”多数情况下并不完全封闭，除螺旋盖试管外，大多数PCR试管扣式盖不严实，加温条件下总会有一些汽雾溢(挤)出，产生汽雾胶交叉污染，汽雾胶成份不仅包括阳性样本扩增产物、阳性对照扩增产物，而且每一个检测反应管包括大多阴性管都会产生引物二聚体扩增，随着重复同一PCR扩增，小分子的二聚体容易反复地扩增、泄漏、积聚……，等温扩增荧光PCR不是从零开始而是从上次PCR结束产物开始。一般试验室环境污染需要停止同样试验一两月才能自净。因此反应液表面必须(小心)多加一层矿物油密闭，但是临检等应用试验室大量检测操作难保所有PCR反应管不被振动、混合，矿物油面上管壁残留任何一点反应液都仍会有效扩增、汽雾胶溢出、泄漏。所以，应用试验室在配试剂、加样本区外，有必要设置一远隔的独立扩增检测室并专人操作，从物理空间上彻底隔绝扩增产物交叉污染的可能。转录介导的等温扩增技术预防污染还需要在试剂盒作一些防污染挫施，(1)在洁净环境下分装PCR试剂成小包装一次用完；(2)等温扩增上游引物F缓释，其不是溶于纯化水而是融于50％PEG6000(融点55-63℃)1.3μM再分装PCR反应管(2-4μl/管)，预制PEG包裹引物F凝固于管底，这样矿物油面上残留的任何反应液因成份不全而不会扩增，缓释反应液被矿物油密封；(3)下游引物R锚定，其5’端加Oligo-dA通过Oligo-dT微磁球固化，或通过5’端预联的羟基/氨基交联微磁球表面，固相化引物R既用于核酸提取又直接逆转录。
如果配试剂、加样本区/试验室不慎污染，产物RNA污染可通过常规清洁卫生挫施清除，并用紫外线(UV)照射，10％次氯酸钠(漂白剂)清洁污染区及70％乙醇清洗等一般性挫施。疑似产物DNA污染的样本RNA或反应液Mix(不包括引物)一般加DNaseI(1U/μl不含RNase)1μl于37℃消化10分钟，再74℃酶灭活20分钟。疑似产物DNA污染的引物一般加核酸外切酶III(100U/μl)1μl于37℃消化10分钟，再74℃酶灭活20分钟。这些综合处理能十分有效地弥补操作不慎所带来的甚至严重交叉污染，仍可取得可靠的正确检测结果。
转录介导的等温扩增产物量经分子灯标特异性杂交荧光信号通过(1)便携式掌上荧光阅读仪快速即时现场检测，荧光阅读仪激发波长491nm，发射光515nm读值；(2)也可以实时荧光等温扩增分析，采用激发波长470nm，发射光520/550/580nm实时荧光PCR仪通过设置65℃5分钟后40-60循环41℃1-3分钟，41℃30秒并读取荧光值；(3)可以通过微纳PCR芯片对多靶基因、多基因位点进行等温扩增-阵列(Isothermal amplification-Array)快速检测，芯片是利用集成电路光刻工艺在硅片或石英玻璃上刻上许多微腔体，并用纳升液体分配系统将不同的试剂准确地分配到纳升级的微反应孔中。
转录介导的等温扩增反应实施方式：
(1)恒温金属浴反应及便携式掌上荧光仪阅读：
10×缓冲液(pH8.5的40mM Tris-CL，50mM KCL，12mM MgCL，2mM DTT和15％DMSO)，于0.5ml的EP管，水浴65℃变性5分钟，再41℃5分钟后加各1μl的T7polymerase，M-MLV和RNaseH(0.2U)，最后加40μl矿物油封闭，于金属浴41℃反应60-90分钟。反应90分钟后加1μl的5μM灯标探针检测，置EP管于便携式掌上荧光阅读仪在激发波长491nm检测，发射光515nm读值。
(2)实时荧光等温扩增反应分析：
10×缓冲液(pH8.5的40mM Tris-CL，50mM KCL，12mM MgCL，2mM DTT和15％DMSO)，于0.2ml的PCR试管，变性65℃5分钟，再41℃5分钟后加各1μl的T7polymerase，M-MLV和RNaseH(0.2U)，最后加20μl矿物油封闭，于41℃60-90分钟。采用激发波长470nm，发射光520/550/580nm的普通实时荧光PCR仪通过设置65℃5分钟后40-60循环41℃1-3分钟，41℃30秒并读取荧光值。
(3)微纳PCR芯片等温扩增-阵列分析
上游引物F/下游引物R(5μM)采用纳升液体分配系统将0.1μl的引物准确地分配到纳升级的微反应孔中；而反应混合液如下配制：
于0.2ml的PCR试管，变性65℃5分钟后加各0.1μl的T7polymerase，M-MLV和RNaseH(0.2U)，含模板5μl反应液分置于PCR芯片微孔，每孔25nl，最后加4μl矿物油分置于PCR芯片封闭，PCR芯片本身再封闭，于41℃60-90分钟。扩增须采用激发波长470nm，发射光520/550/580nm的专用微纳PCR芯片实时荧光扩增仪通过设置40-60循环41℃1-3分钟，41℃30秒并读取荧光值。
本发明优点：
(1).等温扩增所需设备要求简单，适合现场快速筛查，转录介导的等温扩增灵敏度远高于传统PCR。
(2)等温扩增技术存在气雾胶交叉污染的情况较常规热循环PCR轻得多，尤其转录介导的等温扩增，产物RNA容易降解自净。
(3)选择中间部分同序一对特异性引物加上同序的5’端T7启动子，最大限度地近似单一引物，一次反应引物二聚体非特异性扩增减到了最低限度。
(4)特殊的互斥引物设计加上防产物气雾胶污染的引物缓释或锚定措施彻底消除了非特异性扩增的假阳性。
(5)可与便携式掌上荧光阅读仪；常规实时荧光PCR仪实现等温扩增实时分析；和通过微纳PCR芯片扩增实时分析系统配套，以适合各种不同应用需求。
附图说明：
图1.为转录介导的等温扩增技术示意图，波浪线代表待测模板RNA及断续波浪线代表RNaseH切割的RNA，长直线代表cDNA链及条形块代表所带的T7启动子序列，条形块加短直线示意5’端带T7启动子的引物；模板RNA逆转录时通过带T7启动子的引物生成带启动子的cDNA链，转录大量RNA并再一次循环。
图2.以含阳性核酸质粒作为模拟阳性的对照，使用对照梯度初步测试转录介导的等温扩增技术及所设计的引物的实时扩增分析曲线。
具体实施实例：
1.丙型肝炎病毒HCV基因检测：
丙型肝炎病毒HCV为RNA病毒，其5’非编码区UTR是高度变异基因组中最保守部分，绝大多数PCR试剂设计的引物都选在此区域。根据以上引物、探针设计原则
引物设计：HCVF(nt66-85)：5’-ac gca gaa agc gtc tag cca-3’
HCVR(nt344-325)：5’-ca tgg tgc acg gtc ta cga-3’
带T7启动子引物：
T7HCVF： TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA G+5’-ac gca gaa agc gtc ta g cca-3’
T7HCVR：AATC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGAGA+5’-ca tgg tgc acg gtc ta cga-3’
探针设计：
TmHCV(nt311-272)：5’FAM-ctc gca agc acc cta tca ggc agt acc aca agg cct tgc gag-Dabcyl-3’
标本RNA纯化：
血标本0.1ml加裂解液(/Trizol)1ml(0.5ml的4M GTC液+0.5ml水饱和酚)，漩涡振荡，再加0.1ml氯仿混匀，台式高速离心10分钟，裂解上清加等量异丙醇沉淀，70％冷乙醇洗涤，加50μl DEPC处理的dH2O溶解RNA。或裂解上清加微磁球交联固相化下游引物R纯化。
(GTC液：65℃溶解的4M异硫氰酸胍+0.1mM DTT和0.5％Sarkosyl.)
实时荧光等温扩增反应分析：
10×缓冲液(pH8.5的40mM Tris-CL，50mM KCL，12mM MgCL，2mM DTT和15％DMSO)，于0.2ml的PCR试管，变性65℃5分钟，再41℃5分钟后加各1μl的T7polymerase，M-MLV和RNaseH(0.2U)，最后加20μl矿物油封闭，于41℃60-90分钟。采用普通实时荧光PCR仪通过设置65℃5分钟后40-60循环41℃1-3分钟，41℃30秒并读取荧光值。
2.艾滋病毒HIV1/2基因检测：
艾滋HIV为灵长类反转录RNA病毒，全基因组高度变异，分别综合HIV1基因组/HIV2基因组长末端5’LTR至gag起始基因，及尊循以上引物、探针设计原则
HIV1引物设计：HIV1F(nt697-714)：5’-ca gag gag ctc tct c gac-3’
HIV1R(nt825-806)：5’-gc gcc cat ctc tct c ctt c-3’
HIV1探针设计：
TmHIV1(nt721-757)：5’FAM-ctc ggc ttg ctg aag Ygc gcg cgg caa gag gcg agg aa gcc gag-Dabcyl-3’
带T7启动子引物：
T7 HIV1F： TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA+5’-ca gag gag ctc tct c gac-3’
T7 HIV1R：AATC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGAGA+5’-gc gcc cat ctc tct c ctt c-3’和
HIV2引物设计：HIV2F(nt947-964)：5’-gac gga gtg ct cc t Rt aa-3’
HIV2R(nt1092-1075)：5’-tcg cgc cca t ct cc c ac-3’
HIV2探针设计：
TmHIV2(nt1062-1027)：5’JOE-cct cta gag atg aca att caa aat tcg gag tac tta tc tag agg-Dabcyl-3’
标本RNA纯化：
血标本0.1ml加裂解液(/Trizol)1ml(0.5ml的4M GTC液+0.5ml水饱和酚)，漩涡振荡，再加0.1ml氯仿混匀，最高速离心10分钟，裂解上清加等量异丙醇沉淀，70％冷乙醇洗涤，加50μl DEPC处理的dH2O溶解。或裂解上清加微磁球交联固相化下游引物R纯化。
(GTC液：65℃溶解的4M异硫氰酸胍+0.1mM DTT和0.5％Sarkosyl.)
实时荧光等温扩增反应分析：
10×缓冲液(pH8.5的40mM Tris-CL，50mM KCL，12mM MgCL，2mM DTT和15％DMSO)，于0.2ml的PCR试管，变性65℃5分钟，再41℃5分钟后加各1μl的T7polymerase，M-MLV和RNaseH(0.2U)，最后加20μl矿物油封闭，于41℃60-90分钟。HIV1/2既可采用普通单荧光实时PCR仪分别检测，又可使用双(多)荧光实时PCR仪多重检测，设置65℃5分钟后40-60循环41℃1-3分钟，41℃30秒并读取荧光值。
采用含阳性核酸质粒作为模拟阳性标本的模拟对照，采用实时荧光恒温扩增，初步测试转录介导的等温扩增技术及所设计的引物，结果见图2稀释梯度与荧光Ct值线性良好，初步显示转录介导的等温扩增检测结果可靠。
Claims (10)
1.“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其特征是借助cDNA步骤的等温扩增大量RNA产物，靶RNA加入带噬菌体启动子序列的引物，以逆转录酶催化生成第一链或两条链均带启动子的cDNA，再以噬菌体RNA聚合酶结合启动子转录大量拷贝RNA产物并循环反应大量扩增的过程，扩增产物通过特异性荧光探针检测。所述的带启动子序列的引物是指选择靶特异性的中间4-8base同序的一对引物，其5’端均加上噬菌体启动子序列，如此高度近似的一对引物存在两段相同序列，最大程度地限制了过量引物间二聚体的非特异性扩增及转录，大大提高了转录介导的恒温扩增技术可靠性。
2.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的扩增模板选择靶基因代表性序列，长100-300bp，其两端选择有4-8base互补且下游取反义链后中间4-8base同序的序列作为引物。
3.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的逆转录酶包括禽类髓母细胞瘤病毒AMV逆转录酶、鼠白血病病毒M-MuLV逆转录酶和RNase H活性失活的重组M-MuLV鼠白血病病毒逆转录酶，另加RNase H酶。
4.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的噬菌体RNA聚合酶包括T7、T3、SP6等RNA聚合酶Polymerase。
5.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的噬菌体启动子序列是指T7、T3、SP6结合识别序列。
6.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的引物设计原则是在引物距3’末端3-5base远的中间部位选取4-8base同序策略，引物3’末端不能有两个以上互补且最末一个碱基绝不能互补，引物5’端不能有三个以上互补特别是连续互补，引物5’端均加上噬菌体启动子序列。
7.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的实验条件同于一般转录介导的等温扩增技术。酶共同反应条件：pH8.5的4mMTris-CL，5mM KCL，1.2mM MgCL，0.2mM DTT和1.5％DMSO，引物浓度3-5μM。
8.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的灯标荧光探针设计原则是：探针环长16-32base，总长最好＜40nt，Tm值比引物的Tm值要高5-10℃；选择的序列接近扩增产物中心，距两引物≥6base；探针锅柄区/发夹区选靶为长4-8bp互补序列以形成锅柄样结构；5’端不能是G碱基，标荧光素，3’端标淬灭剂且必须封闭。
9.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的检测方式包括便携式掌上荧光阅读仪快速即时现场检测；也可以实时荧光等温扩增分析，和通过微纳PCR芯片对多靶基因、多基因位点进行等温扩增-阵列快速检测。
10.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，dNTPs，rNTPs，T7polymerase，逆转录酶M-MLV及其缓冲液，灯标荧光探针，带T7上游引物F/下游引物R，标准对照物，DEPC纯化水dH2O，RNasin，矿物油。
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| CN2010106222106A CN102533963A (zh) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | 一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834441A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-06-13 | 澳門帝傑數碼基因有限公司 | 一种同序双扩增的数字定量pcr方法 |
| CN108085372A (zh) * | 2018-01-02 | 2018-05-29 | 江洪 | 引物末端酶解二聚体法pcr |
| CN109055499A (zh) * | 2018-08-30 | 2018-12-21 | 杭州杰毅麦特医疗器械有限公司 | 基于CRISPR-Cas的等温核酸检测方法及试剂盒 |
-
2010
- 2010-12-27 CN CN2010106222106A patent/CN102533963A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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