CN113930484A - 一种快速、特异、灵敏、抗降解的微流控rna芯片及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速、特异、灵敏、抗降解和直接检测RNA的微流控RNA芯片及方法，该微流控RNA芯片使用的RNA探针为：5'‑DNA‑RNA‑DNA‑Z‑3'、5'‑DNA‑RNA‑Z‑3'、5'‑DNA‑(2'‑X‑RNA)‑DNA‑Z‑3'，或5'‑DNA‑(2'‑X‑RNA)‑Z‑3'，固相化的RNA探针通过碱基配对的方式特异性地结合待检测的靶标RNA分子，并作为特异性序列来引导切割水解酶对靶标RNA进行导向性切割，以及作为模板来引导聚合酶对靶标RNA的特异性延伸，以标记靶标RNA，靶标RNA为全长或部分降解的。本发明的微流控RNA芯片能快速、特异、灵敏、抗降解和直接地对RNA检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种微流控RNA芯片，具体涉及一种具有快速、特异、灵敏、抗降解和直接检测RNA能力的微流控RNA芯片及方法。
背景技术
RNA在生命中很重要，主要作为mRNA、tRNA和遗传物质等。RNA分析(例如基因表达分析和miRNA分析)可以提供有关转录调控和翻译调控的各种生物学过程的信息。据报道，mRNA的异常表达与许多人类疾病密切相关，因此可作为疾病早期筛查和诊断的潜在生物标志物。此外，RNA作为许多传染性RNA病毒的遗传物质。RNA病毒包括大多数植物病毒和流感病毒，以及具有致命感染能力的病毒，例如SARS和CVIOD-19病毒。此外，RNA可以是致病性的标志物，由于它们具有揭示病原体生存能力的能力，因此比DNA更好。
RNA直接检测对于疾病诊断和功能基因组学至关重要。传统地，首先将RNA反转录为cDNA，然后通过PCR扩增cDNA，然后进行荧光分析，测序或微阵列分析。由于这些步骤，RNA检测是间接的，扩增偏好的，耗时且昂贵的。此外，miRNA的检测极具挑战性，因为miRNA非常短(19-23nt)，其逆转录效率低。为了准确地检测miRNA，已经开发了一些方法，例如基于单分子阵列的技术，单分子RNA smFISH和RNA/DNA切割技术。不幸的是，这些技术在实际应用中存在困难，并且仅限于miRNA检测。
而且，RNA降解在实践中是不可避免的，并且会损害RNA的检测，特别是在需要逆转录(例如RT-PCR)的情况下，这需要cDNA合成的整体RNA靶标。例如，RT-PCR检测COVID-19(严重的全球大流行)具有很高的假阴性率(高达29％)，这部分可能的原因是RNA降解。因此，期望开发能够检测部分降解RNA的RNA检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有快速、特异、灵敏、抗降解和直接检测RNA能力的微流控RNA芯片及方法，解决了现有方法检测会因为RNA降解从而导致假阴性的问题，具有核酸酶抗性，检测快速，灵敏度高，并具有自动化和高通量的潜力。
为了达到上述目的，本发明提供了一种快速、特异、灵敏、抗降解的微流控RNA芯片，该微流控RNA芯片使用RNA探针，若干RNA探针以点阵的布局和化学键连接的形式被固定在芯片上，并作为特异性序列来引导水解酶对靶标RNA进行导向性切割，以及作为模板来引导聚合酶对靶标RNA进行特异性和标记性延伸以将被标记的靶标RNA检测。
优选地，所述RNA探针为：5'-DNA-RNA-DNA-Z-3'、5'-DNA-RNA-Z-3'、5'-DNA-(2'-X-RNA)-DNA-Z-3'，或5'-DNA-(2'-X-RNA)-Z-3'；所述Z选自氨基、巯基、醛基、酮基、羧基或含有任何链接基团的链；X选自甲氧基、乙氧基、氨基、氟、氯、溴、锁核酸基团，或其它2’-不影响延伸的取代基团。
优选地，所述靶标RNA为全长序列的靶标RNA或部分降解的靶标RNA；该微流控RNA芯片在10分钟可检测出结果，且可检测出个位数的RNA分子。
本发明的RNA探针具有能够特异性结合部分降解获得的较短的靶标RNA，较短的靶标RNA的长度为10～200nt。
优选地，所述RNA探针被固定的数量为2个到10万亿个。
优选地，所述化学键为化学共价键，包括：酰胺键、碳氮键、碳碳键、硫醚键或二硫键。
优选地，所述水解酶为RNaseH；延伸靶标RNA的酶选自Klenow(exo-)、Bst、Taq、Bsm、Sau或N9DNA聚合酶，或以DNA为模板的RNA聚合酶。
优选地，所述嵌合探针印在带有醛基、氨基、羧基、巯基或其它偶联基团的微芯片上，在37℃水浴中孵育，最后在该微芯片上覆盖微通道板，从而获得微流控RNA芯片。
本发明的另一目的是提供基于所述的微流控RNA芯片对RNA检测的方法，该方法包含：将微流控RNA芯片上的嵌合探针与待检测的靶标RNA进行杂交，然后用水解酶对靶标RNA进行导向切割，进而通过聚合酶将修饰标记的三磷酸苷延伸到切割后的RNA末端；其中，所述修饰标记的三磷酸苷，依照标记基团的类型，标记物用于化学发光、荧光或其它信号检测。
优选地，所述修饰标记的三磷酸苷为Biotin-dNTP、Fluoro-dNTP或其它标记的三磷酸酐；其中，所述Fluoro-dNTP选自FAM-dNTP、Cy3-dNTP或Cy5-dNTP。
当所述修饰标记的三磷酸苷为Biotin-dNTP时，所述靶标RNA的标记为化学发光标记，将带有Biotin(生物素)标记的RNA经链霉亲和素-辣根过氧化物酶HRP偶联物处理，通过辣根过氧化物酶HRP与HRP底物作用发光，检测并分析来自微流控RNA芯片的化学发光信号；当所述修饰标记的三磷酸苷为Fluoro-dNTP时，所述靶标RNA的标记为荧光基团(Fluorophore，Fluoro)标记，将带有荧光标记的RNA进行荧光检测，并分析来自微流控RNA芯片的荧光信号。
优选地，水解靶标RNA的水解酶为RNase H；所述Biotin-dNTP选自Biotin-dATP、Biotin-dTTP、Biotin-dUTP、Biotin-dCTP或Biotin-dGTP；所述FAM-dNTP选自FAM-dATP、FAM-dTTP、FAM-dUTP、FAM-dCTP或FAM-dGTP(FAM为羧基荧光素；Cy3或Cy5为花青素荧光基团)；所述Cy3-dNTP选自Cy3-dATP、Cy3-dTTP、Cy3-dUTP、Cy3-dCTP或Cy3-dGTP；所述Cy5-dNTP选自Cy5-dATP、Cy5-dTTP、Cy5-dUTP、Cy5-dCTP或Cy5-dGTP。
优选地，该方法包含：将微流控RNA芯片上的嵌合探针与待检测的RNA样品在SSC缓冲液中于37℃孵育；然后，通过用TBS缓冲液漂洗，除去未结合的RNA；将RNA样品杂交的嵌合探针和反应混合物在37℃下温育，然后用TBS缓冲液冲洗；其中，反应混合物包含：RNase H缓冲液、RNase H、延伸靶标RNA的酶、dNTPs和水；所述dNTPs包含：Biotin-dNTP、dATP、dGTP和dCTP；所述Biotin-dNTP选自Biotin-dATP、Biotin-dTTP、Biotin-dUTP、Biotin-dCTP或Biotin-dGTP；随后，将微流控RNA芯片用链霉亲和素-辣根过氧化物酶HRP偶联物处理，再与HRP底物作用发光，最后检测并分析来自微流控RNA芯片的化学发光信号。
优选地，该方法包含：将微流控RNA芯片上的嵌合探针与待检测的RNA样品在SSC缓冲液中于37℃孵育；然后，通过用TBS缓冲液漂洗，除去未结合的RNA；将RNA样品杂交的嵌合探针和反应混合物在37℃下温育，然后用TBS缓冲液冲洗；其中，反应混合物包含：RNase H缓冲液、RNase H、延伸靶标RNA的酶、dNTPs和水；所述dNTPs包含：FAM-dNTP、dATP、dGTP和dCTP；所述FAM-dNTP选自FAM-dATP、FAM-dTTP、FAM-dUTP、FAM-dCTP或FAM-dGTP；随后清洗芯片，然后将带有荧光标记的RNA进行荧光检测，并分析来自微流控RNA芯片的荧光信号。具体地，可以直接用微芯片扫描仪获取荧光信号。
优选地，所述SSC缓冲液包含：1.5M NaCl和0.15M柠檬酸钠，pH＝7.0。
优选地，所述反应混合物包含：1μL RNase H缓冲液、0.3μL RNase H、0.3μL延伸靶标RNA的酶、1μL dNTPs和7.4μL水；其中，延伸靶标RNA的酶选自Klenow(exo-)、Bst、Taq、Bsm、Sau或N9 DNA聚合酶，或以DNA为模板的RNA聚合酶。
优选地，所述辣根过氧化物酶HRP的底物为鲁米诺和双氧水。
本发明的具有快速、特异、灵敏、抗降解和直接检测RNA能力的微流控RNA芯片及方法，解决了现有方法检测会损害RNA从而导致假阴性的问题，具有以下优点：
本发明的微流控RNA芯片，基于DNA聚合酶通过延伸DNA模板上的靶标RNA，从而引入修饰的dNTP，其原理和体内的DNA复制一致。本发明的微流控RNA芯片检测快速，灵敏度高，并具有自动化和高通量的潜力。
与传统方法相比，本发明的方法可以直接检测RNA，提供准确的RNA分析，具有高特异性，可以区分单核苷酸差异。此外，本发明的方法的步骤较少，最快可以在10分钟内完成RNA检测。
而且，基于本发明的方法原理，对靶标RNA分子的完整性要求较低，可以检测部分降解的RNA，并且微流控芯片可重复使用多次，因为其化学固定的探针是与可清洗除去的靶标杂交。本发明的微流控RNA芯片可以用于检测临床样本中的靶标RNA，例如mRNA和miRNA。
附图说明
图1为本发明的微流控RNA芯片的原理图(包括化学发光和荧光两种信号获取)。
图2为本发明的微流控RNA芯片的特异性检测结果；A：芯片上单个目标RNA的特异性检测；B：在大肠杆菌中表达的单个靶RNA的特异性检测；C：1-3分别为5、50和500ng大肠杆菌总RNA。
图3为本发明微流控RNA芯片的单核苷酸错配区别实验和结果。
图4为多通道同时检测多种不同的靶标RNA的实验和结果；10种不同的探针固定在六个通道中用于检测10种目标RNA，通道1加入了10个RNA，通道2-6分别加入减少2个RNA的混合样本，如：通道2加入RNA 3-10(少了RNA 1-2)；通道3加入RNA 1-2，5-10(少了RNA 3-4)；通道4加入RNA 1-4，7-10(少了RNA 5-6)；以此类推。
图5为本发明微流控RNA芯片的灵敏度检测实验和结果；靶RNA的不同检测浓度：0、1、5、10、20、100、200、400pM。
图6为本发明的微流控RNA芯片对降解RNA的检测实验和结果；A-C：为芯片在不同时间分别与RNase T1、血清和唾液孵育后检测到RNA样品；D：使用芯片和RT-PCR对部分降解(处理5分钟)的RNA进行检测比较，用RNase T1消化后，芯片和RT-PCR检测之间的比率分别为2500、43,000和74,000倍。
图7为本发明的微流控RNA芯片的重复使用实验和结果；A：重复使用检测系统的示意图；B：同一芯片使用了3次；u：使用；w：清洗。
图8为本发明的微流控RNA芯片进行临床样品检测实验和结果；PH、PM和PN分别为人类β球蛋白mRNA、miRNA-141和COVID-19 N基因片段的检测探针。
图9为在人源总RNA背景干扰存在下荧光微流控RNA芯片依然能够特异性地检测靶标RNA的实验和结果。
图10为荧光微流控RNA芯片的检测灵敏度实验和曲线图；靶标RNA的不同检测浓度：0、0.5、2、10、20、50、100pM；误差棒是三个重复实验的标准偏差。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1探针合成和微流控RNA芯片的制备
通过DNA固相合成仪合成嵌合RNA探针(DNA-RNA-DNA，5'-DNA-(2'-Me-RNA)-DNA-NH2-3'，或者DNA-RNA，或者5'-DNA-(2'-Me-RNA)-NH2-3')，然后将它们通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)和尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(urea-PAGE)进行纯化。在磷酸钠(100mM，pH8.5)中将纯化后的探针的浓度调节至50μM，并将探针印在带有醛基的微芯片上(晶芯-光学级醛基基片，购自博奥生物科技有限公司)，然后在37℃水浴中孵育持续4h。并且，带有探针的微芯片被带有微通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)覆盖，获得微流控RNA芯片。
实验例2微流控RNA芯片快速直接地对RNA检测
用体外转录试剂盒(购自New England Biolabs Co.)制备靶RNA。人和大肠杆菌的总RNA分别从其细胞中分离出来，用分光光度计定量所有RNA。
将通道上固定的探针与RNA样品(1～400amol)在10μL SSC缓冲液(1.5M NaCl和0.15M柠檬酸钠，pH＝7.0)中于37℃孵育5min。然后，通过用2mL的TBS洗涤缓冲液(136.8mMNaCl、2.7mM KCl和24.8mM Tris，通过HCl调节pH＝7.4)快速漂洗，除去未结合的RNA。
将经RNA杂交的探针和10μL反应混合物，在37℃下温育8分钟，然后用TBS缓冲液(5mL)冲洗。其中，反应混合物包含：1μL RNase H缓冲液(500mM Tris-HCl、80mM MgCl2和400mM KCl)、0.3μL RNase H(1U，购自Thermo Scientific Co.)、0.3μL Klenow片段(exo-)(1U，购自Thermo Scientific Co)、1μL dNTPs(生物素-dNTP、dATP、dGTP和dCTP，每个250μM)和7.4μL水。
随后，将通道用5mL的链霉亲和素-辣根过氧化物酶HRP偶联物处理(用TBS缓冲液稀释5000倍；购自Beyotime Bio-technology，中国)，然后用2mL的TBS缓冲液洗涤，并用20μL的TBS缓冲液处理HRP底物(购自Thermo Scientific Co)，将HRP底物加入通道，HRP底物与HRP作用，产生化学发光。最后，使用超灵敏CCD相机检测并分析了来自微流体通道的化学发光信号。
如图1所示，为本发明的RNA探针和RNA微流体的原理图，RNA标记和检测利用了核酸酶和聚合酶的活性。将RNA样品与固定在芯片上的探针杂交，然后用RNase H进行RNA消化，用DNA聚合酶进行延伸和标记，与结合剂-酶结合物一起孵育，并添加底物。最后，使用CCD摄像机检测来自芯片的化学发光信号。本发明的芯片在RNA检测和分析中直接且快速，探针浓度为50μM时可提供最大的信号强度。
为了验证本发明的微流控RNA芯片的特异性，在人类或大肠杆菌总RNA(背景RNA)的存在下检测了靶标RNA(N和1ab COVID-19基因产物的RNA片段)，从而检测了两种复杂RNA样品。如图2所示，为本发明的微流控RNA芯片的特异性检测结果，图中A为微流控RNA芯片上目标RNA的特异性检测(靶标RNA是400amol，背景是5ng/μL的人总RNA)；B为在大肠杆菌中加入单个靶RNA的特异性检测(靶标RNA是400amol，大肠杆菌是5ng/μL)；C为靶标RNA在大肠杆菌内表达的检测结果，其中0-3分别为混合0、5ng、50ng和500ng的大肠杆菌总RNA。从检测结果可以看出，这些靶标RNA片段无论是一起或单独存在于样品中，都被分别检测出，而背景总RNA并没有产生任何可检测到的信号。而且，在有或没有背景RNA的情况下，RNA检测的信号强度几乎相同。即使在复杂的背景下，微流控RNA芯片也可以提供高检测特异性而不会丢失信号强度，对靶标RNA具有特异性。
如图3所示，为本发明的微流控RNA芯片的单核苷酸错配识别结果，通过使用具有匹配和错配序列的不同RNA探针(P1-P4)探索单核苷酸识别。当使用完全匹配的探针时，它产生的检测信号要强于带有5'-DNA携带单核苷酸错配靶基因的探针。特别地，当错配位于5'-DNA的中间时，未观察到信号。这归因于RNaseH在RNA消化中更喜欢完全匹配的DNA/RNA杂合体，而对错配的则几乎没有活性。延伸消化的RNA，并用DNA聚合酶标记。与仅基于杂交的常规DNA和miRNA芯片不同，本发明的微流控RNA芯片涉及三种鉴别方式：靶标分子与特异性探针杂交、RNaseH消化和DNA聚合酶延伸，这三种策略可以使RNA芯片具有高度特异性。
如图4所示，为多通道同时检测多种不同的目标RNA的结果，旨在验证该微流控RNA芯片的高通量潜力。在6个通道中对10个目标RNA分别采用10个探针进行检测，各通道加入的目标RNA和探针如表1所示。
表1为目标RNA 1-10和Probe 1-10的具体序列
实验例3检测部分降解的RNA
通过用核酸酶、唾液或血清处理待检测RNA，可以制备部分降解的RNA样品。具体地，分别在37℃下分别用RNase T1(10U)、唾液(10μL)和血清(10μL)对100amol待检测RNA进行0、5、10、25、40、60min的处理。通过将样品在95℃加热5min来终止降解。然后，通过微流控芯片对部分降解的RNA进行分析，与常规方法RT-qPCR(采用Titanium One-step RT-PCRKit，来自Takara Co.)进行比较，根据试剂盒说明进行RT-qPCR实验。
为了研究本发明的微流控RNA芯片的灵敏度，准备并分析了各种浓度(或数量)的RNA样品，发现当RNA(从0到400amol)的添加量增加时，信号强度增加，表明RNA芯片具有数量依赖性。而且，本发明的微流控RNA芯片的检测限为1amol(图5)。在实践中，由于RNase普遍存在，RNA样品很容易被污染并部分降解，从而降低了检测灵敏度，甚至引起假阴性结果，因为常规的RT-PCR扩增和检测需要全长RNA，而本发明的芯片用于短RNA检测。
采用本发明的微流控RNA芯片检测的方法，将RNA样品与固定在芯片上的探针杂交，在杂交探针上用RNase H消化长RNA，然后进行生物素标记。通过用RNase T1、血清或唾液处理RNA样品后采用该方法检测，发现在将RNA大量暴露于核酸酶后仍能检测到部分降解的RNA(图6)，而RT-PCR却未检测到。这些实验结果表明，本发明的方法可以耐受核酸酶污染，本发明的微流控RNA芯片具有直接检测RNA的巨大潜力，特别是对于难以控制RNA质量的即时诊断。
实验例4微流控RNA芯片的回收和再利用
用过的微流控RNA芯片先用5mL尿素溶液(8M，95℃)洗涤，再用2mLTBS缓冲液(95℃)洗涤。微流控RNA芯片在信号强度降至初始强度的一半之前，可重复使用。
为了检查探针的固定稳定性并降低芯片检测的成本，在高温下用变性缓冲液冲洗掉了标记的RNA。为了证明回收芯片的清洁度，再次将化学发光级的底物加载到芯片上，以确认不存在酶促活性，表明已去除RNA，然后重新使用芯片(图7)。本发明的微流控RNA芯片多次运行良好，并且检测信号强度仍大于初始芯片的50％。
实验例5用微流控RNA芯片检测临床样品
用总RNA细胞试剂盒(Thermo科学公司)提取血液和LNCaP细胞的总RNA。用TaqManABC miRNA纯化试剂盒(Thermo science Co.)提取血液和LNCaP细胞的总miRNA。用微流控RNA芯片分析RNA样品。
为了证明微流控RNA芯片在医学诊断中的潜力，用该芯片在临床样品中检测RNA靶标，例如miRNA-141(23nt)和血红蛋白β链mRNA(两个总RNA；图8)，miRNA-141是胰腺癌和前列腺癌的早期检测和预后的有前途的生物标志物，血红蛋白β链mRNA是与地中海贫血有关的生物标志物。根据它们的独特序列，将其检测探针分别设计为PM(miRNA-141探针)和PH(血红蛋白β链mRNA探针)，发现这两个临床RNA(总RNA)可以根据其疾病起源单独正确地检测出来。此外，阴性对照探针在两种总RNA均不存在的情况下显示信号，而在提供RNA靶标时显示信号。实验结果表明，这种微流体技术具有特异性和准确性，可用于直接检测临床RNA靶标。
探针PH的序列如下：
d(ACCTCACC)-2’-Me-r(ACCAACUUCAUCCAC)-d(GTTCACCTTGCC)
探针PM的序列如下：
d(TCCAACA)-2’-Me-r(CUGUACUGGAAGAUGG)-d(ACCCAGGGCCGG)。
实验例6用荧光标记以及微流控RNA芯片的荧光检测
用体外转录试剂盒(New England Biolabs Co.)制备靶标RNA。人和大肠杆菌的总RNA分别从其细胞中分离出来。用分光光度计定量所有RNA。在RNA芯片上(图9)，将固定的RNA探针与RNA样品(1-400amol)在10微升SSC缓冲液[NaCl(1.5M)，柠檬酸钠(0.15M)，pH7.0]中于37℃孵育5分钟。然后，用2mL的TBS洗涤缓冲液[NaCl(136.8mM)，KCl(2.7mM)，Tris(24.8mM)，pH7.4]快速漂洗芯片，除去未结合的RNA。而后，将10微升反应混合物[1μL RNaseH缓冲液(Tris-HCl(500mM)，MgCl2(80mM)，KCl(400mM))，0.3μL RNase H(1U，ThermoScientific Co.)，0.3μL Klenow片段(exo-)(1U，Thermo Scientific Co)，1μL dNTPs(Fluoro-dUTP，dATP，dGTP和dCTP：每样250μM)和7.4μL水]加在芯片上，在37℃下孵育8分钟，然后用TBS缓冲液(5mL)冲洗。最后，使用芯片扫描仪检测荧光信号，结果如图10所示。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序 列 表
<110> 纽奥维特（成都）生物科技有限公司
<120> 一种快速、特异、灵敏、抗降解的微流控RNA芯片及方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gucuguaccg ucugcgguau guggaaaggu uaug 34
<210> 2
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
uugacagauu gaaccagcuu gagagcaaaa ugucu 35
<210> 3
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggcaagguga acguggauga aguugguggu gaggu 35
<210> 4
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccggcccugg guccaucuuc caguacagug uugga 35
<210> 5
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
uacuggcuuu ggugcuaugg acuuuacuac auua 34
<210> 6
<211> 33
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
guuuagugug ggccugugcu ggaguggaaa uug 33
<210> 7
<211> 33
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
acaggcuuug gugcuaugaa uuuugcugau uug 33
<210> 8
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ggacaugguu gauacaggcu uuggugcuau gaau 34
<210> 9
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cgugagguau augacuuugc uuuucgggau uuaug 35
<210> 10
<211> 35
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ggcaagguga acguggauga aguugguggu gaggu 35
Claims (15)
1.一种快速、特异、灵敏、抗降解的微流控RNA芯片，其特征在于，该微流控RNA芯片使用RNA探针，若干RNA探针以点阵的布局和化学键连接的形式被固定在芯片上，并作为特异性序列来引导水解酶对靶标RNA进行导向性切割，以及作为模板来引导聚合酶对靶标RNA进行特异性和标记性延伸以将被标记的靶标RNA检测。
2.根据权利要求1所述的微流控RNA芯片，其特征在于，所述RNA探针为：5'-DNA-RNA-DNA-Z-3'、5'-DNA-RNA-Z-3'、5'-DNA-(2'-X-RNA)-DNA-Z-3'，或5'-DNA-(2'-X-RNA)-Z-3'；Z选自氨基、巯基、醛基、酮基、羧基或含有任何链接基团的链；X选自甲氧基、乙氧基、氨基、氟、氯、溴、锁核酸基团，或其它2’-不影响延伸的取代基团。
3.根据权利要求1或2所述的微流控RNA芯片，所述靶标RNA为全长序列的靶标RNA或部分降解的靶标RNA。
4.根据权利要求1或2所述的微流控RNA芯片，其特征在于，所述RNA探针被固定的数量为2个到10万亿个。
5.根据权利要求1或2所述的微流控RNA芯片，其特征在于，所述化学键为化学共价键，包括：酰胺键、碳氮键、碳碳键、硫醚键或二硫键。
6.根据权利要求1或2所述的微流控RNA芯片，其特征在于，所述水解酶为RNase H；延伸靶标RNA的酶选自Klenow(exo-)、Bst、Taq、Bsm、Sau或N9 DNA聚合酶，或以DNA为模板的RNA聚合酶。
7.根据权利要求1或2所述的微流控RNA芯片，其特征在于，所述嵌合探针印在带有醛基、氨基、羧基、巯基或其它偶联基团的微芯片上，在37℃水浴中孵育，最后在该微芯片上覆盖微通道板，从而获得微流控RNA芯片。
8.基于如权利要求1-7中任意一项所述的微流控RNA芯片对RNA检测的方法，其特征在于，该方法包含：
将微流控RNA芯片上的嵌合探针与待检测的靶标RNA进行杂交，然后用水解酶对靶标RNA进行导向切割，进而通过聚合酶将修饰标记的三磷酸苷延伸到切割后的RNA末端；
其中，所述修饰标记的三磷酸苷，依照标记基团的类型，标记物用于化学发光、荧光或其它信号检测。
9.根据权利要求8所述的微流控RNA芯片，其特征在于，所述修饰标记的三磷酸苷为Biotin-dNTP、Fluoro-dNTP或其它标记的三磷酸酐；
其中，所述Fluoro-dNTP选自FAM-dNTP、Cy3-dNTP或Cy5-dNTP；
当所述修饰标记的三磷酸苷为Biotin-dNTP时，所述靶标RNA的标记可为化学发光标记，将带有Biotin标记的RNA经链霉亲和素-辣根过氧化物酶HRP偶联物处理，通过辣根过氧化物酶HRP与HRP底物作用发光，检测并分析来自微流控RNA芯片的化学发光信号；
当所述修饰标记的三磷酸苷为Fluoro-dNTP时，所述靶标RNA的标记可为荧光基团标记，将带有荧光标记的RNA进行荧光检测，并分析来自微流控RNA芯片的荧光信号。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，水解靶标RNA的水解酶为RNase H；所述Biotin-dNTP选自Biotin-dATP、Biotin-dTTP、Biotin-dUTP、Biotin-dCTP或Biotin-dGTP；所述FAM-dNTP选自FAM-dATP、FAM-dTTP、FAM-dUTP、FAM-dCTP或FAM-dGTP；所述Cy3-dNTP选自Cy3-dATP、Cy3-dTTP、Cy3-dUTP、Cy3-dCTP或Cy3-dGTP；所述Cy5-dNTP选自Cy5-dATP、Cy5-dTTP、Cy5-dUTP、Cy5-dCTP或Cy5-dGTP。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，该方法包含：
将微流控RNA芯片上的嵌合探针与待检测的RNA样品在SSC缓冲液中于37℃孵育；然后，通过用TBS缓冲液漂洗，除去未结合的RNA；
将RNA样品杂交的嵌合探针和反应混合物在37℃下温育，然后用TBS缓冲液冲洗；其中，反应混合物包含：RNase H缓冲液、RNase H、延伸靶标RNA的酶、dNTPs和水；所述dNTPs包含：Biotin-dNTP、dATP、dGTP和dCTP；所述Biotin-dNTP选自Biotin-dATP、Biotin-dTTP、Biotin-dUTP、Biotin-dCTP或Biotin-dGTP；
随后，将微流控RNA芯片用链霉亲和素-辣根过氧化物酶HRP偶联物处理，再与HRP底物作用发光，最后检测并分析来自微流控RNA芯片的化学发光信号。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，该方法包含：
将微流控RNA芯片上的嵌合探针与待检测的RNA样品在SSC缓冲液中于37℃孵育；然后，通过用TBS缓冲液漂洗，除去未结合的RNA；
将RNA样品杂交的嵌合探针和反应混合物在37℃下温育，然后用TBS缓冲液冲洗；其中，反应混合物包含：RNase H缓冲液、RNase H、延伸靶标RNA的酶、dNTPs和水；所述dNTPs包含：FAM-dNTP、dATP、dGTP和dCTP；所述FAM-dNTP选自FAM-dATP、FAM-dTTP、FAM-dUTP、FAM-dCTP或FAM-dGTP；
随后清洗芯片，然后将带有荧光标记的RNA进行荧光检测，并分析来自微流控RNA芯片的荧光信号。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述SSC缓冲液包含：1.5M NaCl和0.15M柠檬酸钠，pH＝7.0。
14.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述反应混合物包含：1μL RNase H缓冲液、0.3μL RNase H、0.3μL延伸靶标RNA的酶、1μL dNTPs和7.4μL水；其中，延伸靶标RNA的酶选自Klenow(exo-)、Bst、Taq、Bsm、Sau或N9 DNA聚合酶，或以DNA为模板的RNA聚合酶。
15.根据权利要求9或11所述的方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶HRP的底物为鲁米诺和双氧水。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SHUN ZHANG等: "A novel microfluidic RNA chip for direct, single-nucleotide specific, rapid and partially-degraded RNA detection", TALANTA, vol. 239, pages 2 - 3 * |
| 汪冰: "生物化学", 30 November 2020, 东北大学出版社, pages: 402 * |
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