FI114716B - Menetelmä nukleiinihappojen herkkään osoitukseen - Google Patents

Description

114716

Menetelmä nukleiinihappojen herkkään osoitukseen - Förfarande för sensibel pävisning av nukleinsyror 5 Keksinnön kohteena on menetelmä nukleiinihappojen herkkään osoitukseen hybridisoimalla koetinnukleiinihappoa kohdenuk-leiinihapon kanssa, hajottamalla koetinnukleiinihapon hybri-disoidun osan ja osoittamalla pilkkomistuotteen, samoin kuin tähän sopiva reagenssien sarja.

10

Nukleiinihappohybridisoinnin käyttö on levinnyt molekyylianalyyseissä laajalle spesifisyytensä johdosta. On kehitetty suuri joukko erilaisia monistusmenetelmiä päämääränä kohottaa perinteisten detektiomenetelmien usein riittämätöntä herk-15 kyyttä koetinmolekyylien osoittamiseksi. Tällöin käytettiin sekä menetelmiä, jotka perustuivat kohdesekvenssin lisäämiseen, mutta myös sellaisia, jotka perustuvat kohdesekvenssi-spesifiseen signaalinvahvistukseen. Eräs esimerkki kohdesekvenssin lisäämisestä on julkaisussa EP-A-0 200 362 kuvattu 20 polymeraasiketjureaktio, jossa monistetaan kohdenukleiiniha- * : pon molempia juosteita in vitro -replikaatioreaktiossa. Reak tion lämpötilaa muutetaan syklisesti kaksijuosteisen kohde-nukleiinihapon denaturoimiseksi, initiaattorimolekyylien : : kanssa hybridisoimisen ja seuraavan DNA-synteesin mahdollis- ; ; 25 tamiseksi ja näiden vaiheiden toistamiseksi.

Kohdesekvenssien lisäämiseksi käytettiin kuitenkin myös in vitro -transkriptioita. Eräs esimerkki sellaisesta reaktiosta h,‘,t kuvataan julkaisussa W0 88/10315. Tässä monistuksessa käy te t- ;· 30 tiin samoin kahta aluketta, joista toinen sisältää kuitenkin • >· promoottorisekvenssin. Alukkeet ovat monistettavan sekvenssin : : eri juosteille komplementaariset. Julkaisussa EP-A-0 329 822 kuvataan tämän menetelmän edelleenkehitys, jossa välituottee-na muodostuneen kaksijuosteisen nukleiinihappotuotteen trans- l I t 35 kriptiolla muodostuneet ribonukleiinihapot hajotetaan hybridissä juuri syntetisoidun DNA:n uuden hybridisoinnin mahdollistamiseksi promoottorin sisältävällä alukemolekyylillä. Alunperin muodostuneiden transkriptien hajotuksella tulee 2 114716 mahdolliseksi muodostaa jokaisesta muodostuneesta RNA-mole-kyylistä uudelleen kaksijuosteinen, promoottorin sisältävä Nukleiinihappo, jota voidaan käyttää uuteen transkription aloitukseen.

5

Edellä kuvatuille menetelmille vastakohtana kohdesignaali-spesifinen signaalinvahvistus ei lisää osoitettavaa nukleiinihappoa, vaan sillä on päämääränä vain tämän spesifinen tunnistus. Tämän saavuttamiseksi signaalia vahvistetaan kohde-10 sekvenssin läsnäolosta riippuen. Eräs sellainen menetelmä kuvataan julkaisuissa WO 89109284 ja WO 89/10415. Tässä nk. "Cycling Probe" -reaktiossa (CPR) käytetään merkittyä, ki-meeristä DNA-RNA-DNA-koetinmolekyyliä, joka hybridisoidaan kohde-DNA-molekyylillä. Hybridisoinnilla muodostuu RNA-DNA-15 hybridi, joka on RNAasi H:n substraattia. Koska tämä entsyymi hajottaa spesifisesti RNA-DNA -hybridin RNA-osuuden, koetin-molekyyli lohkeaa, ja muodostuneet fragmentit dissosioituvat kohdesekvenssistä alhaisemman sulamispisteen perusteella.

Niin ollen kohdemolekyyli voidaan hybridisoida edelleen toi-; 20 sen koetinmolekyylin kanssa ja toistaa syklin uudelleen.

. Koetinmolekyylin fragmentit osoitetaan siihen olemassa ole- , valla merkinnällä.

! ' Keksinnön kohteena oli parantaa herkkyyttä menetelmillä, \ * 25 joissa kohdenukleiinihappo hybridisoidaan koetinmolekyylin i t ’ ’ kanssa ja koetinmolekyylin hajoamista käytetään kohdenukle- iinihapon määritykseen.

Tämän vuoksi keksinnön kohteena on menetelmä kohdenukleii-3 0 nihapon A herkkään osoitukseen * * » ‘- hybridisoimalla kohdenukleiinihapon A koetinnukleiiniha-polla B, joka sisältää ainakin yhden, kohdenukleiinihapon » d”! kanssa hybridisoituvan osan B1 ja yhden, kohdenukleiini- 35 hapon kanssa hybridisoitumattoman, nukleiinihappospesifi- sen osan B2, 3 114716 lohkaisemalla koetinnukleiinihappo B osassa Bl, jolloin saadaan lohkaisutuote B'( hybridisoimalla koetinnukleiinihapon B lohkaisutuotteen B’, joka sisältää kohdenukleiinihapon A kanssa hybridisoi-5 tumattoman osan B2, matriisinukleiinihapon C kanssa, joka sisältää lohkaisutuotteen osan B2 kanssa hybridisoituvan osan C2 ja koetinnukleiinihapon osan Bl hybridisoitumattoman osan Cl, ja määrittämällä lohkaisutuotteen B' ja matriisinukleiiniha-10 pon C hybridikohdenukleiinihapon A osoittamiseksi, samoin kuin reagenssipakkaus tämän menetelmän suorittamiseksi .

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on kuvattu oheisissa pa-15 tenttivaatimuksissa.

Keksinnön mukainen menetelmä palvelee kohdenukleiinihapon A osoittamiseksi. Tämä kohdenukleiinihappo voi olla alkuperältään mielivaltaista, esimerkiksi alkuperältään viraalisia, : *. 20 bakteriaalisia tai solunukleiinihappoja. Ne voivat olla liuoksessa, suspensiossa mutta myös kiinteille kappaleille ! kiinnitettyjä tai solupitoisissa väliaineissa, solunäytteis- ’! | sä, kiinnitetyissä soluissa, kudosleikkeissä tai kiinnite- ; ·' tyissä organismeissa. Edullisesti nukleiinihapot ovat liuok- : : : 25 sessa.

Tavallisesti osoitusmenetelmät alkavat vaiheella, jossa "·' analyyttinukleiinihappo tehdään vastaavilla reagensseilla.

: Tällöin voivat sekä pH-arvon muutokset (alkaliset), kuumuus, 30 äärimmäisten lämpötilamuutosten toisto (jäädyttäminen/sulatus) , fysiologisten kasvuolosuhteiden muutokset (osmoottinen ; paine), detergenttien, kaotrooppisten suolojen tai entsyymien (esimerkiksi proteaasien, lipaasien) vaikutus yksinään että , · yhdistelmänä myötävaikuttaa nukleiinihappojen vapautumiseen.

35 Koska keksinnön mukainen menetelmä on hyvin herkkä ja selektiivinen, voidaan osoittaa myös pieniä nukleiinihappomääriä muiden aineiden, esimerkiksi proteiinien, solujen ja solu- 4 114716 fragmenttien, mutta myös ei-osoitettavien nukleiinihappojen läsnä ollessa.

Sopivia kohdenukleiinihappoja ovat esimerkiksi ribonukleiini-5 hapot ja deoksiribonukleiinihapot. Nukleiinihapot voivat olla myös modifioituja, esimerkiksi aikaisemmin suoritetuilla käsittelyvaiheilla. Sellaiset käsittelyvaiheet voivat sisältää esimerkiksi nukleiinihappojen sulatuksen, esimerkiksi rest-riktiosentsyymillä. Erityisen edullista kohdenukleiinihappona 10 on deoksiribonukleiinihappo (DNA).

Keksinnön mukaisessa menetelmässä on kyseessä hybridisointi-ominaisuuteen perustuvan testin erityisestä suoritusmuodosta, erityisesti kohdesekvenssispesifinen signaalinvahvistus. Hyb-15 ridisointiominaisuuteen perustuvat testit ovat pääpiirteiltään nukleiinihappodiagnostiikka-alan ammattimiehen tuntemia. Sikäli kuin jatkossa ei esitetä kokeellisia yksityiskohtia, viitataan kokonaisuudessaan teokseen "Nucleic acid hybridisation" , julkaisijat B.D. Hames ja S.J. Higgins, IRL Press, | ;; 20 1986, esimerkiksi lukuihin 1 (Hybridisation Strategy), 3 ,. Quantitative Analysis of Solution Hbyridisation) ja 4 (Quan titative Filter Hybridisation), Current Protocols in Mole-cular Biology, toimittaja F.M. Ausubel et al. , J. Wiley and I ( Son, 1987, ja käsikirjaan Molecular Cloning, toimittaja J.

**· · 25 Sambrook et al., CSH 1989. Tunnettuihin menetelmiin kuuluu * * * • « · ’·’ * myös merkittyjen nukleosiditrifosfaattien valmistus julkai sussa EP-A-0 324 474 kuvatulla tavalla, modifioitujen ja ..M’ modifioimattornien oligonukleotidien kemiallinen synteesi, : nukleiinihappojen lohkaisu restriktioentsyymien avulla, ;·’ 30 hybridisointiolosuhteiden valinta, joilla voidaan saavuttaa spesifisyys, joka riippuu hybridisoitavien nukleiinihappojen välisen komplementaarisuuden laajuudesta, niiden GC-pitoisuu-,,Η’ desta ja niiden pituudesta, samoin kuin nukleiinihappojen : muodostaminen nukleosiditrifosfaateista polymeraasien avulla, 35 mahdollisesti nk. alukkeita käyttämällä.

5 114716

Merkintä koostuu keksinnön mielessä suoraan tai epäsuoraan osoitettavasta ryhmästä L. Suoraan osoitettavia ryhmiä ovat esimerkiksi radioaktiiviset (32P) , värilliset tai fluoresoivat ryhmät tai metalliatomit. Epäsuorasti osoitettavia ryhmiä 5 ovat esimerkiksi immunologisesti tai entsymaattisesti vaikuttavat yhdisteet, kuten vasta-aineet, antigeenit, hapteenit tai entsyymit tai entsymaattisesti aktiiviset osaentsyymit.

Nämä ilmaistaan seuraavassa reaktiossa tai reaktiojaksossa. Erityisen edullisia ovat hapteenit, koska niillä merkityt 10 nukleosiditrifosfaatit ovat yleensä erityisen hyvin polyme-raasien substraatteina käytettävissä, ja seuraava reaktio merkityllä vasta-aineella hapteenia tai haptenisoitua nukleo-sidia vastaan voidaan suorittaa helposti. Sellaisia nukleosi-ditrifosfaatteja ovat esimerkiksi bromi-nukleosiditrifosfaa-15 tit tai digoksigeniini-, digoksiini-, biotiini- tai fluore-seiiniliitetyt nukleosiditrifosfaatit. Aivan erityisen sopiviksi ovat osoittautuneet julkaisussa EP-A-0 324 474 mainitut steroidit ja niiden ilmaiseminen. Nukleiihappoihin sisällyttämisen suhteen viitataan täten julkaisuun EP-A-0 324 474.

: . ·. 2 0

Nukleosiditrifosfaatit (NTP) ovat ribo (rNTP)- tai deoksi-ribonukleosiditrifosfaatteja (dNTP).

; ; Koetinnukleiinihappoina B ovat sopivia molekyylit, jotka ·;; · 25 sisältävät kaksi keskenään liitettyä osaa Bl ja B2 . Osalle B1 *·' on tunnusomaista, että se voi hybridisoitua kohdenukleiiniha- pon tai sen osan kanssa. Tämä osa on sitä varten riittävän komplementaarinen. Tämän lisäksi on osa Bl voitava lohkaista : ( : sen ollessa kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoituneessa ;·' 30 muodossa. Lohkaisulla ymmärretään tällöin osan Bl jakaminen kahteen tai useampaan ei enää toisiinsa liittyneeseen osaan, jolloin kohdenukleiinihappo ei lohkea. Tämän vuoksi osa Bl voi sisältää esimerkiksi ribonukleotidi- tai ei-emässekvens-; sejä. Eräässä edullisessa tapauksessa osa Bl sisältää kaksi 35 tai useampia, nukleiinihapoissa tavallisella tavalla keskenään liitettyä monoribonukleotidiyksikköä, kun taas kohdenukleiinihapon tälle komplementaarinen osa on deoksiribonukleii- 6 114716 nihappo. Tässä tapauksessa koetinnukleiinihapon B lohkaisu osassa Bl voi tapahtua siten, että muodostunut hybridi saatetaan kontaktiin RNAasi H:n kanssa. Ei-emäs-sekvenssien läsnäolon tapauksessa hajotus voi tapahtua AP-endonukleaasin 5 avulla.

Tällöin sulatetaan ainakin osa hybridisoituvasta osasta Bl. Tämän kautta muodostuu lohkaisutuote B', jossa sisältää koh-denukleiinihapon kanssa hybridisoitumattoman, nukleiinihap-10 poselektiivisen osan B2 samoin kuin mahdollisia alunperin kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoituvan osan Bl osia.

Kohdenukleiinihapon koetinnukleiinihapon kanssa hybridisoin-nin olosuhteet valitaan erikoisesti niin, että tapahtuu eri-15 tyisesti koetinnukleiinihapon selektiivinen hybridisointi kohdenukleiinihapon kanssa, eikä erityisesti tapahdu koetinnukleiinihapon epäselektiivistä hybridisointia näytteen muiden, ei osoitettavien nukleiinihappojen kanssa. Koetinnukleiinihapon lohkaisulla muodostuvat murtokappaleet, näiden : 20 joukossa myös lohkaisutuote B', ovat lyhyempiä kuin alkupe- « · * · räinen koetinnukleiinihappo, ja eivätkä tämän vuoksi voi enää muodostaa valituissa olosuhteissa stabiilia hybridiä kohde- !!' nukleiinihapon kanssa. Tämän vuoksi ne vapauttavat kohdenuk- • · * ; ; leiinihapon A valituissa olosuhteissa.

25 ‘ Koetinnukleiinihapon lohkaisulla voi muodostua myös erilaisia murtokappaleita B', jotka sisältävät joko vain osan B2 yksi-nään tai lisäksi myös osan Bl jäänteitä. Tämä riippuu kul-: : loinkin käytetyistä olosuhteista.

:·! 30

Nukleiinihapon nukleiinihappospesifisellä osalla ymmärretään seuraavassa sekvenssi, joka voi hybridisoitua kohdenukleiini-happona olevan toisen sekvenssin kanssa, jolloin valituissa olosuhteissa tapahtuu spesifinen hybridisointi, ts. ei tapah-35 du kokonaismenetelmälle merkityksellistä hybridisoitumista muiden asiattomien, reaktioseoksessa esiintyvien nukleiinihappojen kanssa. Tyypillisiä nukleiinihappospesifisiä osia 7 114716 ovat koetinnukleiinihapon osa B2 ja matriisinukleiinihapon osa C2.

Koetinnukleiinihapon kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoi-5 tumattoman, nukleiinihappospesifisen osan B2 on täytettävä ehdot, että se ei hajoa osan Bl kohdesekvenssispesifisen hajoamisen olosuhteissa. Lisäksi sen on voitava hybridisoitua myöhemmin määritellyn matriisioligonukleotidin kanssa. Osan B2 sekvenssi voidaan periaatteessa valita vapaasti. Tällöin 10 on kuitenkin otettava huomioon, että lohkaisutuotteen B' hybridisointia matriisioligonukleotidin kanssa vaikeuttaa kohdenukleiinihapon komplementaarisuus, jonka kautta herkkyys on todennäköisesti alentunut optimaaliseen tapaukseen verrattuna. Tämän lisäksi olisi otettava huomioon, ettei koetinmo-15 lekyylillä ole taipumusta osittaisten kaksoisjuosteiden muodostukseen. Samoin voi B2 olla ribonukleiinihappoa, deoksiribonukleiinihappoa tai modifioitua nukleiinihappoa. Siinä tapauksessa, että hybridisoituva osa Bl sisältää ribonukleiinihappoa ja lohkaisu suoritetaan RNAasin avulla, ei osa B2 : 20 ole näissä olosuhteissa lohkeavaa ribonukleiinihappoa, edul lisesti se on deoksiribonukleiinihappoa. B2 voi kuitenkin olla myös niin modifioitua ribonukleiinihappoa, ettei RNAasi enää voi lohkaista sitä. Eräs muu mahdollisuus on nukleiini- « » * happoanalogien käyttö, joilla on kylläkin vielä nukleiini-

• » I

·;’ · 25 hapon hybridisointiominaisuuksia, muttei kuitenkaan enää *·* ' fosfaatti-sokeri -ket junosuutta. Tähän ovat sopivia erityi sesti PNA-molekyylit, jotka kuvataan julkaisuissa W0 92120702 ja WO 86105518. Ehto, ettei tämä osuus saa hybridisoitua kohdenukleiinihapon kanssa, tarkoittaa erikoisesti koetinnuk-30 leiinihapon kohdenukleiinihapon kanssa hybridisoinnin aikana t i i käytettyjä olosuhteita. Edullisesti osa B2 valitaan niin, ;* ettei se myöskään hybridisoidu ei-osoitettavien nukleiinihap- 7 pojen kanssa. Osan B2 on kuitenkin sisällettävä sekvenssin, : joka voi hybridisoitua matriisinukleiinihapon C kanssa.

35 Kohdenukleiinihapon koetinnukleiinihapon ja matriisinukleiinihapon lohkaisutuotteen B' kanssa hybridisointien olosuhteet voidaan valita toisistaan riippumatta.

8 114716

Keksinnön mukainen matriisinukleiinihappo C sisältää osan C2, joka voi hybridisoitua lohkaisutuotteen B' ja erityisesti sen nukleiinihappospesifisen osan B2 tai sen osan ja mahdollisesti Bl:n mahdollisesti vielä läsnä olevien jään-5 teiden kanssa. Matriisinukleiinihapoksi C soveltuvat kaikki molekyylit, jotka sallivat sellaisen hybridisoinnin, ts. nukleiinihapot, jotka on muodostettu luonnollisista nukle-otidirakenneosista, kuitenkin myös nukleiinihappoanalogit, jotka on muodostettu rakenneosista, joita ei esiinny luon-10 nollisesti, tai sisältävät sellaisia rakenneosia. Tämän lisäksi matriisinukleiinihapon olisi oltava valituissa olosuhteissa hajoamista vastaan stabiilia. Siinä tapauksessa, että koetinnukleiinihapon lohkaisu suoritetaan RNAasilla, on matriisinukleiinihapon kohdalla erityisen edullisesti ky-15 seessä deoksiribonukleiinihappo. Osan C2 ohella matriisinukleiinihappo sisältää osan Cl, joka ei voi hybridisoitua koetinnukleiinihapon pelkän osan Bl tai osan Bl jäljellä olevien jäänteiden kanssa. Erityisen edullisesti tämä osa Cl ei muodosta myöskään näytteessä olevien osoitettavien nukle-20 iinihappojen ja itse kohdenukleiinihapon kanssa valituissa ! : olosuhteissa stabiileja hybridejä. Edullisesti osa Cl si- ·· jaitsee 5'-suunnassa, osasta C2 katsottuna.

Matriisinukleiinihappo tai nukleiinihappospesifinen osa B2 ; 25 valitaan edullisesti niin, että lohkaisutuotteen B' tai '!!.* koetinnukleiinihapon 5'-pää ei ulotu hybridisoidussa tilassa matriisinukleiinihapon 3'-pään yli, kun deoksinukleotidien rakenne osoitetaan jälkeen kytketyllä reaktiolla. Tämän on :·· : estettävä matriisinukleiinihapon entsymaattisen pitenemisen, v · 30 Sama vaikutus voidaan saavuttaa siten, että matriisinukle iinihapon 3'-pää on suojattu entsymaattista pidentymistä .· *, vastaan, esimerkiksi käyttämällä mononukleotidia, joka ei voi pidentyä.

35 Joka tapauksessa olisi taattava, että lohkaisutuot(t)e(et) B' voi(vat) hybridisoitua matriisinukleiinihapon kanssa siten, että B' hybridisoituu myös lohkeamisella muodostu- 9 114716 neella päällä matriisinukleiinihapon kanssa ja osa Cl mat-riisinukleiinihaposta yltää hybridisoidussa tilassa vielä lohkaisutuotteen B' lohkaisussa muodostuneen pään yli.

5 Seuraavassa vaiheessa määritetään lohkaisutuotteen B' ja matriisinukleiinihapon C hybridi, jolloin määritys suoritetaan niin, ettei määritetä lohkaisemattomasta koetinnukle-iinihaposta B ja matriisinukleiinihaposta C mahdollisesti muodostuneita hybridejä.

10

Eräs näistä mahdollisuuksista perustuu siihen, että loh-kaisutuote B' pidennetään matriisinukleiinihappoa C käyttämällä, kun taas lohkaisematonta koetinnukleiinihappoa B ei pidennetä. Tämä perustuu matriisinukleiinihapon edellä ku-15 vattuun rakenteelliseen ominaisuuteen, ettei se hybridisoidu koetinnukleiinihapon osan Bl kanssa, kun taas lohkaisutuote B' hybridisoituu matriisinukleiinihapon kanssa. Lohkaisutuote B' hybridisoituu erityisesti lohkaisupaikkaan, (B':n 3'-päässä) C:n kanssa. Koska matriisinukleiinihapon pää on loh-20 kaisutuotteen pään ulkopuolella, voidaan pidennysreaktiossa : ; : liittää nukleiinihappo-osa, joka on matriisinukleiinihapon C

··· vastaavalle osalle komplementaarinen. Sellaiseen pidennys- reaktioon on olemassa joukko mahdollisuuksia. Eräs näistä mahdollisuuksista on mononukleotidien liittäminen DNA-poly-; · 25 meraasin avulla. Eräässä edullisessa tapauksessa käytetyt mononukleosiditrifosfaatit ovat merkittyjä, esimerkiksi julkaisun EP-A-0 324 474 mukaan. Kun mononukleosiditrifosfaatit eivät ole merkittyjä, pidennystuotteen muodostuminen • - ’> voidaan osoittaa esimerkiksi geelielektroforeesilla erotta- . · 30 maila. Eräässä erityisessä suoritusmuodossa voidaan muodos taa myös kaksi erilaista merkintää. Tällöin toisella merkinnällä voidaan suorittaa muodostuneiden pidennystuotteiden immobilisointi ja toisella merkinnällä osoitus. Tähän ovat mahdollisia esimerkiksi julkaisussa EP-A-0 437 774 kuvatut 35 olosuhteet.

ίο 114716

Edelleen eräässä suoritusmuodossa lohkaisutuote B' toimii polymeraasiketjureaktion alukkeena. Koetinnukleiinihappo B ei voi toimia lohkaisemattomassa tilassa alukkeena. Tällöin PCR:n templaatti on matriisinukleiinihappo C. Kahta erilais-5 ta koetinnukleiinihappoa B käytettäessä, ts. kun nämä hybri-disoituvat keskenään komplementaarisen kohdenukleiinihapon eri alueille, molemmat alukkeet voivat valmistaa PCR;n.

Edelleen eräs mahdollisuus, lohkaisutuotteen B' pidentämi-10 nen, on mahdollinen ligaasireaktion avulla. Tähän käytetään oligonukleotidia, joka hybridisoituu matriisinukleiinihapon kanssa niin, että hybridisoidun lohkaisutuotteen B' ja tämän oligonukleotidin välille jää niska, joka voidaan sulkea ligaasin avulla.

15

Edelleen eräässä edullisessa suoritusmuodossa matriisinukleiinihapon osa Cl sisältää transkription- tai replikaation-aloitussekvenssin. Edullisesti Cl sisältää promoottorisek-venssin. Lohkaisutuotteen B' matriisikontrolloidulla piden-20 nyksellä muodostetaan funktionaalinen, täydellinen promootio | tori. Transkription aloituksen jälkeen, joka voi tapahtua ·· vain, kun pidennys on tapahtunut tosiasiassa, voidaan osoit- ··> taa lohkaisutuotteiden muodostuminen ja siten kohdenukleii- nihapon läsnäolo. Tätä varten reaktioseos sekoitetaan kaik-: 25 kien transkriptioon vaadittavien reagenssien kanssa, joihin >’·’ kuuluvat promoottoriin sovitettu RNA-polymeraasi, esimerkik si T7 RNA-polymeraasi samoin kuin ribonukleosiditrifosfaat-teja, joista osassa on edullisesti merkki. Tällöin trans-*kriptin läsnäoloa voidaan käyttää kohdenukleiinihapon 30 osoittamiseen. Reagenssit ja olosuhteet, joita vaaditaan in ·'. vitro -transkriptioon, voidaan päätellä esimerkiksi julkai- ,*·. susta EP-A-0 329 822. Jälkeen kytketyssä transkriptiossa saavutetaan ensimmäiseen suoritusmuotoon verrattuna suurempi herkkyys.

Keksinnön mukaisen menetelmän lämpötila valitaan niin, että käytettyjen entsyymien aktiivisuudet ovat mahdollisimman op- :35 11 114716 timaalisia ja hybridisointiolosuhteet sallivat samanaikaisesti riittävän spesifisyyden. Ei lämpöostabiilia RNAasia käytettäessä on esimerkiksi lämpötila-alue välillä 30 ja 60 °C, erityisen edullisesti lämpötila 42 °C tarkoituksenmukai-5 nen. Lämpöstabiilia RNAasia käytettäessä ovat korkeammat lämpötilat mahdollisia. Pidennysreaktiota varten lämpötila määräytyy samoin pidennykseen käytetyn entsyymin mukaan. Tällöin olämpöstabiileja entsyymejä, esimerkiksi Taq-DNA-polymeraasia käytettäessä edullinen alue välillä 50 ja 80 10 °C, ja erityisen edullisen noin 60 - 70 °C. Transkriboivaa entsyymiä käytettäessä optimaalinen lämpötila määräytyy samoin entsyymin aktiivisuuden mukaan, esimerkiksi T3-, T7-ja SP6-polymeraasilla välille 25 ja 45 °C, erityisen edullisesti 37 °C:seen. Entsyymien reaktioalueella olon todennä-15 köisyyttä kohottamalla pitäisi olla mahdollista lisätä reaktionopeuksia ja täten lyhentää vaadittavaa reaktioaikaa tai lisätä herkkyyttä.

Matriisinukleiinihappo voi olla myös rengasmainen molekyyli.

20 Tässä tapauksessa on edullista käyttää pidennysentsyymiä, ·,. · jolla on juosteensyrjäytysaktiivisuutta.

Suuri joustavuus ja mahdollinen kaksoismerkintä mahdollista-: vat menetelmän käytön testisuikaleilla tai osoituksen liit- ; 25 tämällä helmiin ja niiden osoituksen läpivirtaussytometrial- ··,·. la tai kapillaarielektroforeesilla.

Eräässä mahdollisessa suoritusmuodossa matriisinukleiiniha- i > t : pon osa sisältää sekvenssin, joka toimii replikoituvan « » « ’·' ' 30 RNA:n, esimerkiksi MDV 1 RNA:n tai lyhyempien sekvenssien, synteesin matriisina.

i

Koetinnukleiinihappo ja matriisinukleiinihappo voidaan valmistaa periaatteessa tunnetuilla menetelmillä heti, kun sen 35 osien sekvenssi on vahvistettu. Edullisessa tapauksessa, että kyseessä ovat oligonukleotidit, joiden pituus on alle 100 mononukleotidirakenneyksikköä, on edullinen synteesi 12 114716 tavallisilla kemiallisilla menetelmillä (esimerkiksi kiinto-faasisynteesi Merrifield'ille analogisesti). Tämä mahdollistaa myös sekaoligonukleotidien (RNA/DNA -kimeerien) yksinkertaisen synteesin. Suuremmilla nukleiinihapoilla ovat 5 edullisia yhdistelmä-DNA-valmistusmenetelmät tai kemiallis-entsymaattiset menetelmät, jollaiset kuvataan julkaisussa EP-A-325 970. Osa Bl on edullisesti 12 - 35, osa B2 edullisesti 15 - 50, osa Cl edullisesti 10 - 100 ja osa C2 15 - 50 nukleotidia pitkä.

10

Kuviossa 1 esitetään keksinnön ensimmäinen suoritusmuoto, joka perustuu radioaktiivisesti merkitsemättömien deoksiri-bonukleotiditrifosfaattien kokoamiseen DNA-polymeraasilla.

15 Kuviossa 2 esitetään kaaviomaisesti suoritusmuoto, jossa matriisioligonukleotidi sisältää promoottorisekvenssin, joka tehdään toimintakykyiseksi promoottoriksi ja seuraavaa transkriptio. Promoottorisekvenssi esitetään vinoviivoituksella.

20 Kuviossa 3 esitetään kuvion 1 mukaisen menetelmän herkkyys ; koetinnukleiinihapon määrästä riippuen ja määrällä 10 pmol :· matriisinukleiinihappoa/erä.

- «

Kuviossa 4-6 osoitetaan DNA-sekvenssien osoituksen spesi-| 25 fisyys kuvion 1 mukaisessa menetelmässä hybridisointi- ja hajotusreaktion inkubointilämpötilasta riippuen (42 °C, 50 °C ja 56 °C).

: Kuviossa 7 esitetään kuvion 2 menetelmän mukaisen osoituksen V : 30 herkkyys.

* * • Kuviossa 8 esitetään kaaviomaisesti yksi suoritusmuoto, jossa koetinnukleiinihappo ja matriisinukleiinihappo on , liitetty yhteen.

: 35

Kuvioissa esitetyt vaiheet voidaan suorittaa peräjälkeen lisäten kulloinkin tarvittavat reagenssit. Kaikki tarvitta- 13 114716 vat komponentit voidaan kuitenkin lisätä komponenttien vastaavassa suunnittelussa jo reaktion alussa niin, että prosessi etenee samanaikaisesti.

5 Eräässä ensimmäisessä edullisessa suoritusmuodossa (Kuvio 1) näytettä, joka sisältää kohde-DNA:ta, sekoitetaan kimeerisen RNA-DNA- tai DNA-RNA-DNA -koetinmolekyylin kanssa niin, että tapahtuu hybridisoituminen. Koettimen kohdesignaalispesifi-nen RNA-osuus hajotetaan RNAasi Hilla. Tämän jälkeen lisä-10 tään matriisioligonukleotidi sopivat hybridisointiolosuhteet säätäen yhdessä DNA-polymeraasin ja merkitsemättömien ja merkittyjen deoksiribonukleosiditrifosfaattien kanssa. Merkittyjen mononukleotidien kokoaminen voidaan osoittaa esimerkiksi nukleiinihappojen reagoimattomista merkityistä 15 deoksiribonukleosiditrifosfaateista erottamisen jälkeen.

Toisten erilailla merkittyjen nukleotidien käyttö mahdollistaa suoran kiintofaasiin sidotun osoituksen. Kun näyte ei sisällä lainkaan kohde-DNA:ta, matriisioligonukleotidi hyb-ridisoituu vain kimeerisen RNA-DNA-koetinmolekyylin kanssa.

20 Koetinmolekyylin pidentymistä ei voi tapahtua, koska 3'-pää : : ei ole hybridisortunut matriisioligonukleotidin kanssa.

Eräässä toisessa, edullisessa suoritusmuodossa (Kuvio 2) saatetaan kohde-DNA:ta sisältävä näyte samoin ensin hybri- t » ;25 disoitumaan kimeerisen RNA-DNA-koetinmolekyylin tai DNA-RNA- • « , ·;·’ DNA-koetinmolekyylin kanssa. Kohdesignaalispesifisen RNA- < 1 » osuuden RNAasi H:11a hajotuksen jälkeen lohkaisutuote saatetaan hybridisoitumaan oligonukleotidin kanssa, jonka 5'-pää * I · : yltää lohkaisutuotteen pään yli ja sisältää yksijuosteisen ’ 30 promoottorisekvenssin. Lohkaisutuotteen 3'-pää pidennetään ';\t DNA-polymeraasia ja deoksiribonukleotiditrifosfaatteja li- ,···. säämällä niin, että muodostuu toimintakykyinen promoottori.

Muodostunut kaksijuosteinen nukleiinihappo alistetaan transkriptiolle RNA-polymeraasilla ja nukleosiditrifosfaateilla.

35 Promoottorisekvenssit ovat ammattimiehen erilaisille polyme-raaseille tunnettuja (esimerkiksi Nucl. Acids. Res. 12, 7035-7056 (1984)).

14 114716

Eräässä kolmannessa suoritusmuodossa (Kuvio 8) koetinnukle-iinihappo ja matriisinukleiinihappo eivät ole erillisiä molekyylejä, vaan ne ovat liittyneet yhteen. Tätä varten matriisinukleiinihapon pää ripustetaan koetinnukleiinihapon 5 osan B2 Bl:stä poispäin olevaan päähän niin, että osa C2 voi hybridisoitua osan B2 kanssa, jolloin muodostuu hiusneulara-kenne, ja osat B1 ja Cl ovat hiusneularakenteen päitä. Osien B2 ja C2 liittäminen voi tapahtua mielivaltaisella tavalla, esimerkiksi kovalenttisella liitoksella, edullisesti mono-10 nukleotidiyksiköillä, esimerkiksi oligo-dA. Jotta hiusneula-rakenne voi muodostua, on suositeltavaa varustaa keskenään hybridisoituvien osien C2 ja B2 välille linkkeri, joka on 3 - 20 nukleotidin tai ekvivalentin pituinen. Siinä tapauksessa, että B2 sijaitsee koetinmolekyylin 5'-päässä, liitos 15 tapahtuu B2:n 5'-pään ja C2:n 3'-pään välillä. Tällä suoritusmuodolla on etu, että koetinnukleiinihapon ja matriisinukleiinihapon keskenään hybridisoituvien osien avaruudellisella läheisyydellä voidaan saavuttaa reaktionopeuden kasvu.

20 Kuviossa 8 kuvattu suoritusmuotoa on voidaan soveltaa analo- · gisesti myös kuviolle 2 (Promoottorin luominen).

Eräs keksinnön mukaisen menetelmän etu on, ettei koetinnu-• kleiinihapon B tarvitse sisältää merkkiä. Tämä helpottaa ; 25 koetinnukleiinihapon synteesiä, mutta johtaa kuitenkin myös , siihen, ettei myöhemmässä osoitusreaktiossa voi esiintyä taustasignaalia näiden merkkien kautta. Keksinnön mukaisessa . , menetelmässä ei monisteta kohdesekvenssiä. Tämän vuoksi ; voidaan sulkea pois edeltävistä kokeista olevilla moniste- ’ 30 tuilla molekyyleillä kontaminoitumisen vaara. Keksinnön mukaisessa menetelmässä viimeisen osavaiheen tuote ei toimi >“ ; ensimmäisen osareaktion substraattina. Tästä syystä reaktion kulku on helpommin kontrolloitavissa. Sen kautta, että amp-lifiointi on oleellisen lineaarista, kvantitatiivinen ana-35 lyysi helpottuu. Toisekseen on väärien positiivisten tulosten vaara alunperin negatiivisten näytteiden ristikontami-naatiolla vähäisillä määrillä todella positiivisia näytteitä 15 114716 eksponentiaalisiin amplifiointijärjestelmiin verrattuna pienentynyt. Keksinnön mukainen menetelmä ei vaadi laitteita inkubointilämpötilan sykliseen vaihteluun. Keksinnön mukainen menetelmä on myös sikäli joustava, että käyttämällä 5 kahta erilaista julkaisun EP-A-0 437 774 mukaista ei-radio-aktiivista merkkiä on mahdollista sekä tuotteiden seinämälle kiinnittäminen että osoittaminen. Koska keksinnön mukaisessa menetelmässä osareaktioiden edelleen eteneminen riippuu ehdottomasti koetinmolekyylin spesifisestä kohdesekvenssin 10 kanssa hybridisoitumisesta, ei voi muodostua taustasignaale-ja epäspesifisellä sitoutumisella tai hybridisoitumattomien koetinmolekyylien pysymisen kautta, jollaisia esiintyy esimerkiksi amplifioitaessa replikoituvien ribonukleiinihappo-sekvenssien avulla (QB-replikaatio). Vastakohtana menetel-15 mille, joissa kaksi tai useampia oligonukleotideja, joilla on erilainen sekvenssi, saatetaan reagoimaan yhdessä erässä, voidaan oligonukleotidien keskinäinen epäspesifinen reaktio (kuten esimerkiksi aluke-dimeeri PCR:ssä) sulkea lähes pois keksinnön mukaisessa menetelmässä. Keksinnön mukainen mene-20 telinä voidaan suorittaa ei-tarkoissa hybridisointiolosuh- ; ; teissä. Tämän kautta käytettyjen sekvenssien osoitus tulee mahdolliseksi. Suoritus hyvin tarkoissa olosuhteissa mahdollistaa pistemutaatioiden osoituksen. Sen kautta, ettei osoi-tus keksinnön mukaisessa menetelmässä tapahdu merkityn ly- ; 25 hennetyn koetinmolekyylin osoituksella alunperin käytettyjen » <· » k merkittyjen koetinmolekyylien ohella, vältetään geelielekt- ♦ * roforeettiset menetelmät näiden sekvenssien erottamiseksi.

. , Tämän kautta menetelmä tulee automatisoimiskelpoiseksi ja ' * 1 täten rutiininomaisessa analytiikassa käytettäväksi.

V : 30 ;’>,, Samoin keksinnön kohteena on edellä mainitun osoitusmenetel- män suorittamiseen tarkoitettu reagenssipakkaus. Tämä pakkaus sisältää koetinnukleiinihappoa B ja erillään tai samas- i sa astiassa matriisinukleiinihappoa C. Edullisesti reagens- 35 sipakkaus sisältää lisäksi puskuria hybridisointi- ja hajo-tusreaktion tai pidennysreaktion suoritukseen. Erityisen edullisesti pakkaus sisältää osoitettavasti merkittyjä mo- 16 114716 nonukleosiditrifosfaatteja. Mikäli reagenssit on jaettu kahteen eri astiaan, sisältää ensimmäinen astia edullisesti koetinnukleiinihappoa, entsyymiä hajotusreaktion suoritukseen, samoin kuin sopivia puskureita. Toisessa astiassa on 5 tällöin matriisinukleiinihappoa, samoin kuin ainakin yhtä entsyymiä pidennysreaktion suorittamiseen mononukleosiditri-fosfaattien kanssa, samoin kuin sopivaa puskuria.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä lähemmin.

10

Esimerkki 1

Menetelmä merkittyjä mononukleotideia yhdistäen Seuraavassa käytetään oligonukleotideissa deoksiribonukle-otidiyksiköillä suuria kirjaimia ja ribonukleotidiyksiköillä 15 pieniä kirjaimia.

Menettelytapa: 1 pmol, 10 pmol tai 100 pmol RNA-DNA-koetinmolekyyliä : 20 (LPR03_19R: ,.! 5'-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgccgcgucgcagaagauc-3 ' (SEQ. ID. NO:1) : · tai • : : LPR03_25R: . ·: \ 25 5'-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgccgcgucgcagaagaucucaauc-3' (SEQ. ID NO:2) inkuboitiin kulloinkin osoitettavan DNA:n . (DHBVl: 5'-GATTGAGATCTTCTGCGACGCGGCGGT-3'(SEQ. ID. NO:3)) vaihtelevien määrien kanssa tilavuudessa 10 μΐ 42 eC:ssa 3

• « I

tunnin ajan puskurissa P2 (10 mM Hepes, 1 mM MgCl2, pH 8,0) • ‘·· 30 lisäten 3 μg RSA:ta, 20 U RNasiinia ja 4 U RNaasi H:ta.

, ; Sitten lisättiin 10 pmol matriisioligonukleotidia TAQ (5'-

ATTCCATGATTCATTGATTATTGTCGCGGCGGTGAGTCGT

ATTACTTCCAGTCCGATC-3' (SEQ. ID. NO 4)), erää kuumennettiin 1 min ajan 100 °C:seen, ja jäähdytettiin heti jäällä. Täyt-35 töreaktiota varten eriä täytettiin 2 pl:lla Taq-puskuria (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCI,1 1,5 mM MgCl2, 0,1 mg/ml gelatiinia), nukleotidiseoksella 1_3 (kulloinkin 1 μΜ DATP, DGTP, 17 114716 DCTP, DIG-DUTP (Boehringer Mannheim) ja BIO-dUTP:llä (Boeh-ringer Mannheim)), 20 U RNasiinia, 1 U Taq-DNA-polymeraasia ja H20:lla 20 pl:aan, ja inkuboitiin 60 °C:ssa 15 min ajan.

5 Reaktioerät laimennettiin kulloinkin osoitusta varten puskurilla D (10 mM HEPES (pH 8,0), 30 mM NaCl, 1 mM MnCl2 210 piiksi. BIO-DIG-merkityt synteesituotteet immobilisoitiin streptavidiinipäällysteiselle mikrotiitterilevylle (MTP) (TRSA-SA-MTP, yhtiö MicroCoat), jolloin kulloinkin kaksi 10 kertaa 100 pl puskurilla D laimennettua reaktioerää pipetoi-tiin pesupuskurilla (0,5 % (tilavuus/tilavuus) Tween 20 PBS:ssä (fosfaattipuskuroitu suolaliuos)) edeltä käsin pestyn SA-MTP:n kaivoihin. MTP:tä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C:ssa ravistellen (Well-Warml, yhtiö Denley Instruments 15 GmbH).

MTP, jossa oli immobilisoituja nukleiinihappomolekyylejä, pestiin viidesti kulloinkin 200 piillä pesupuskuria. Sitten lisättiin kulloinkin 100 pl konjugaattilaimennosta (poly-: 20 klonaalisia <DIG>-S-Fab-PODpoly-konjugaatteja (Boehringer

Mannheim GmbH), 200 mU/ml konjugaattpuskurissa (100 mM Na-;· fosfaattia (pH 7,5), 0,9 % (paino/tilavuus) NaCl, 1 % (pai- no/tilavuus) Ralufon F4J tai RSA Fraktion V; konjugaattipus-kuri käsiteltiin DEPCillä, steriilisuodatettiin (0,2-pm , 25 suodatin, Nalgene) ja pidettiin 4 °C:ssa)), ja inkuboitiin uudelleen samoissa olosuhteissa.

Liittymättömät konjugaattimolekyylit poistettiin pesemällä viidesti. Nyt lisättiin kaivoa kohden 100 pl substraattili-30 uosta (2,2 '-atsino-di-[3-etyylibentstiatsoliinisulfaat- ti(6)], ABTS). Värireaktio tapahtui 37 °C:ssa ravistellen. Reagoineen ABTS:n optinen tiheys 405 mn:llä mitattiin MTP:n ’· lyhyen ravistelun jälkeen välittömästi ennen mittausta ELI- SA-lukijalla (SLT) 492-mn vertailusuodatinta vastaan ja 35 nolla-arvon (vain ABTS) vähentämisen jälkeen laskettiin kaksoismääritysten keskiarvot (SLT Easy-Base Version 4.01).

18 114716

Herkkyys

Menetelmän herkkyyden selville saamiseksi käytettiin edellä kuvaillussa reaktioerässä matriisinukleiinihappoa konsent-raatiossa 10 pmol. Tulos esitetään kuviossa 3. Kuviossa 3 5 olevat käyrät johtavat siihen tulokseen, että valituissa reaktio-olosuhteissa (10 pmol matriisioligonukleotidia, RNaasi H:n määrä, inkubointitilavuus, inkubointilämpötila ja vastaavat) saavutettiin herkin osoitus 10 pmoolilla koetin-molekyyliä. Vain 1 pmoolin käyttö koetinnukleiinihappona 10 rajoittaa todennäköisesti reaktion ensimmäistä osareaktiota, hybridisointi- ja hajotusreaktiota. Jos käytetään 100 pmol koetinnukleiinihappoa, ei kaikkia hajonneita koetinmolekyy-lejä voida hybridisoida matriisioligonukleotidilla ja täten pidentää. Voidaan myös määrittää, että valituissa olosuh-15 teissä saavutettiin suurin herkkyys 10 pmoolilla koetinnuk-leiinihappoa/erä, ja että näissä olosuhteissa voitiin osoittaa 10 amol kohdenukleiinihappoa. Tämä osoitusraja on kertoimella noin 10 pienempi kuin julkaisun WO 89/10415 mukaisessa menetelmässä, jossa ekvivalenteissa olosuhteissa ha-20 valttiin 0,1 f mol kohdenukleiinihappoa.

; Lämpötilariippuvuus : ’ ; Esimerkissä 1 esitetyn, keksinnön mukaisen menetelmän lämpö- | tilariippuvuuden kuvaamiseksi käytettiin erää kohden 10 pmol 25 koetinnukleiinihappoa ja inkuboitiin kulloinkin 0,01 - 100 amoolia kohdenukleiinihappoa läsnä ollessa RNAasi H:n kanssa . . 42 eC:ssa (Kuvio 4), 50 °C:ssa (Kuvio 5) tai 56 °C:ssa (Ku- vio 6). Seuraava täyttöreaktio tapahtui kaikissa tapauksissa 60 °C:ssa. Mittaus tapahtui sen jälkeen, kun oli inkuboitu 1’ .. 30 30 min ajan ABTS:n kanssa. Koetinnukleiinihappona käytettiin : " ; HBV 1: tä tai MM 1 DHBV l:tä (5 ' -GATTGAGATCTTATGCGACGCGGCGGT-

3', SEQ. ID. No. 7) (yksi emäksen väärin pariutuminen) tai MM 3 DHBV 1:tä (5'-GATTGAGATCTCACG

CGACGCGGCGGT-3', SEQ. ID. No. 8) (kolme emäksen väärin pa-35 riutumista). Hajotusreaktion inkubointilämpötilassa 42 °C koe johti lähes identtiseen käyrän muotoon ja siten keksinnön mukaisen menetelmän vähäiseen sekvenssispesifisyyteen.

19 114716

Sitovuuden kohottaminen kohottamalla inkubointilämpötilan 50 °C:seen antoi osoitukselle tulokseksi täydellisesti komplementaarisen oligonukleotidin HBV 1, ja yhden emäksen virheellisen pariutumisen muodostuvan oligonukleotidin osoituk-5 selle samankaltaisen käyränmuodon, kuitenkin herkkyyden menetyksellä verrattuna inkubointilämpötilaan 42 °C. Syy tähän oli RNA-osuuden vähemmän täydellinen hajoaminen. Selvästi pienemmän signaalit aiheutti kolmen emäksen virheellisen pariutumisen muodostava oligonukleotidi, mikä oli johdetta-10 vissa pienemmästä hybridisoitumisnopeudesta ja sitovammista olosuhteista. Suurin spesifisyys saavutettiin inkubointiläm-pötilassa 56 °C. Tällöin 100 amol DHBV lstä aiheutti selvän signaalin, 100 amol MM 1 DIHBV lstä johti optisen tiheyden pienempään arvoon, ja 100 amol MM 3 DHBV lstä ei voitu 15 osoittaa. Täten on osoitettu, että nukleiinihappojen sek- venssispesifinen osoitus on mahdollista keksinnön mukaisella menetelmällä. 3 x 3-sarjoissa käytettiin 10 pmol koetinnuk-leiinihappoa eri määrien (0,01 - 100 amol) kanssa täydellisen komplementaarista kohdenukleiinihappoa DHBV 1, yhden 20 sentraalisen emäksen väärän pariutumisen muodostavaa koh-,, denukleiinihappoa MM 1 HBV 1 ja kolme sentraalista emäksen väärin pariutumista muodostavaa kohdenukleiinihappoa MM 3 : DHBV 1. Ensimmäisiä 3 sarjaa inkuboitiin 42 °Csssa, toisia ; ; 50 °C:ssa ja kolmansia 56 °C:ssa. Negatiivisina kontrolleina 25 käytettiin kulloinkin eriä ilman kohdenukleiinihappoa. Täyt-tämisreaktio tapahtui kaikissa tapauksissa 60 °C:ssa. Seu-. , raavassa osoitusreaktiossa streptavidiinilla päällystetyssä mikrotiitterilevyssä mitatut arvot esitetään graafisesti kuviossa 4-6.

30

Esimerkki 2

Menetelmä toimintakykyisen promoottorin muodostaen Menettelytapa:

35 Kulloinkin 10 pmol RDCPTAQ s ta (5'-ATGATAGTTGATGATAGTTGGA-TATcgccgccuggcagaagauc-3'(SEQ. ID. NO. 5)) inkuboitiin 1 tunnin ajan 42 °C:ssa DHBVl:n (5'-GATTGAGATCTTCT

20 114716 GCGACGCGGCGGT-3' (SEQ. ID. NO. 5)), 0,01 amol - 10 fmol) kanssa tilavuudessa 10 μΐ RNaasi H:n kanssa puskurissa P2 (10 mM Hepes, 1 mM MgCl2, pH 8,0) lisäten 3 μ% RSA:ta, 20 U RNasiinia ja 4 U RNaasi H:ta. Negatiivisina kontrolleina 5 toimi erä ilman DHBVlrtä. Sitten jokaiseen erään lisättiin 10 pmol QAT2:ta (5'-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACTATAGGGCGGCGA TATCCAACTATCATCAACTATCAT-3' (SEQ. ID. NO. 6)), 2 μΐ Taq-puskuria (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 01, mg/ml gelatiinia) ja kulloinkin 1 mM dATG:tä, dGTP:tä, 10 dCTP:tä ja dTTPrtä, ja Taq-DNA-polymeraasi-katalysoitua täyttöreaktiota suoritettiin 15 min ajan 60 °C:ssa lisäten reaktiotilavuuden 20 pl:aan. Seuraavaksi lisättiin kulloinkin 3 μΐ transkriptiopuskuria (40 mM Tris pH 7,9, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM spermidiiniä), 20 U RNasiinia, 0,5 μΐ 15 1 % Triton X-100:aa ja 500 U T7-RNA-polymeraasia, ja nukleo- tidiseoksena käytettiin seosta, jossa oli CPl:tä DIG- ja BIO-UTP:n kanssa (9,84 μΜ ATP, 4,92 μΜ GTP, 2,46 μΜ CTP, 3,28 μΜ UTP, 820 nM DIG-UTP ja 820 nM BIO-UTP); kokonaistilavuus oli nyt 30 μΐ. Inkubointi tapahtui 37 °C:ssa 2 tunnin ; 20 ajan. Kaikki eräs laimennettiin havaitsemisreaktiota varten puskurilla D 210 μl:aan, ja pipetoitriin kulloinkin kahdesti 100 μΐ SA-MTP:n kaivoihin. Osoitus tapahtui <DIG>-PODpoly:n ja ABTSrn (Boehringer Mannheim) avulla esimerkissä 1 kuva-i ·/; tulla tavalla; mitatut arvot esitetään graafisesti kuviossa ;'i‘: 25 7· . . Kuten käyrän muodosta ilmenee, voitiin valituissa reaktio- olosuhteissa osoittaa 1 amol kohdesekvenssiä DHBV 1. Tämä osoitusraja on kertoimella noin 10 pienempi kuin menetelmäs-i 30 sä, jossa yhdistettiin merkittyjä deoksiribonukleotideja Γ"; (Esimerkki 1), ja jossa havaittiin ekvivalenteissa olosuh teissa 10 amol kohdenukleiinihappoa.

21 114716 SEKVENSSILUETTELO (1) YLEISET TIEDOT: 5 (i) HAKIJA:

(A) NIMI: Boehringer Mannheim GmbH

(B) KATU: Sandhoferstr. 116 (C) KAUPUNKI: Mannheim

(E) MAA: DE

10 (F) POSTINUMERO: 68305 (G) PUHELIN: 06217594348 (H) TELEFAX: 06217594457 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Menetelmä nukleiinihappojen herkkään 15 osoitukseen (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 8 (iv) KONEKOODIMUOTO: i 20 (A) VÄLINETYYPPI: levyke (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPÄ) ϊ : : 25 (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: ; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 46 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo • '·· 30 (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen i ; (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (perimän) 35 (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: misc_feature (B) SIJAINTI: 1..46 22 114716 (D) LISÄTIEDOT: /note= "Nukleotidit 28 - 46 ovat ribonuk-leotideja, nukleotidit 1-27 ovat deoksiribonukleotide-ja" 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID N0:1: GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACCGC CGCGUCGCAG AAGAUC 46 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: 10 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 52 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen 15 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (perimän) (ix) OMINAISPIIRTEET: : 20 (A) NIMI/SELITYS: misc_feature ..ii' (B) SIJAINTI: 1..52 ;;· (D) LISÄTIEDOT: /note= "Nukleotidit 28 - 52 ovat ribonuk- I · : leotideja, nukleotidit 1-27 ovat deoksiribonukleotide- i ja" •T: 25 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2: GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACCGC CGCGUCGCAG ' AAGAUCUCAA UC 52 Γ\. 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia 35 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 23 114716 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (perimän) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: 5 GATTGAGATC TTCTGCGACG CGGCGGT 27 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 10 (A) SIJAINTI: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 15 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (perimän) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 4: ATTCCATGAT TCATTGATTA TTGTCGCGGC GGTGAGTCGT ATTACTTCCA 20 GTCCGATC 58 (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: i ; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: . 25 (A) PITUUS: 45 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo . (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen i » t :*·.· 30 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (perimän) i’’ ;

(ix) OMINAISPIIRTEET

, (A) NIMI/SELITYS: misc_feature (B) SIJAINTI: 1..45 35 (D) LISÄTIEDOT: /note= "Nukleotidit 27 - 45 ovat ribonuk- leotideja, nukleotidit 1-26 ovat deoksiribonukleotide-ja" 24 114716 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:5: ATGATAGTTG ATGATAGTTG GATATACGCC GCCUGGCAGA AGAUC 45 5 2) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 64 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 10 (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (perimän) 15 (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: promoottori (B) SIJAINTI: 15..31 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6: 20 GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACTAT AGGGCGGCGA TATCCAACTA TCATCAACTA TCAT 64 (2) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: 25 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo

i · I

’·’ (C) JUOSTEISUUS: yksi juosteinen 30 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen i ’ : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (perimän) (ix) OMINAISPIIRTEET: 35 (A) NIMI/SELITYS: mutaatio (B) SIJAINTI: replace(13, "" ) (D) LISÄTIEDOT: /note= "ero SEQ.ID.NO.3:een" 25 114716 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7: GATTGAGATC TTATGCGACG CGGCGGT 27 5 (2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 10 (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (perimän) 15 (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: mutaatio (B) ASEMA: replace(12..14, "") (D) LISÄTIEDOT: /note= "erot SEQ.ID.NO. 3:een" i 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:8: GATTGAGATC TCACGCGACG CGGCGGT 27 i :

Claims (9)

114716 Pat ent tivaat imukset

1. Menetelmä kohdenukleiinihapon A herkkään osoitukseen, tunnettu siitä, että 5 hybridisoidaan kohdenukleiinihappo A koetinnukleiiniha-polla B, joka sisältää kohdenukleiinihapon kanssa hybri-disoituvan osan Bl ja kohdenukleiinihapon kanssa hybri-disoitumattoman, nukleiinihappospesifisen osan B2, 10 lohkaistaan koetinnukleiinihappo B osassa Bl, jolloin saadaan lohkaisutuote B', hybridisoidaan koetinnukleiinihapon lohkaisutuote B', 15 joka sisältää kohdenukleiinihapon A kanssa hybridisoitu mattoman osan B2, matriisinukleiinihappo C:n kanssa, joka sisältää lohkaisutuotteen osan B2 kanssa hybridisoi-tuvan osan C2 ja osan Cl, joka ei hybridisoidu koetinnukleiinihapon osan Bl kanssa, ja 20 - määritetään lohkaisutuotteen B' ja matriisinukleiiniha-' pon C hybridi kohdenukleiinihapon A osoittamiseksi. \ 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu : 25 siitä, että lohkaisutuote B' pidennetään muodostamalla nuk leiinihappo, joka on komplementaarinen matriisinukleiiniha-pon C osalle Cl, matriisinukleiinihappoa C käyttämällä, kun ·’ taas koetinnukleiinihappoa ei pidennetä. *

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että matriisinukleiinihappo C sisältää osassa Cl pro-moottorisekvenssin. 1

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 35 että pidennys tapahtuu ei-radioaktiivisesti merkittyjä mono- nukleotideja käyttämällä. 114716

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että osa Cl sijaitsee osan C2 5'-pään suunnalla.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu 5 siitä, että matriisinukleiinihapon 3'-pää on suojattu pitenemistä vastaan.

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lohkaisutuotteen B' tai koetinnukleiinihapon 5'- 10 pää ei ulotu hybridisoidussa tilassa matriisinukleiinihapon 31-pään yli.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdenukleiinihappo A hybridisoidaan koetinnu- 15 kleiinihapon lohkaisun jälkeen uudelleen koetinnukleiinihap-pomolekyylin B kanssa.

9. Reagenssipakkaus, joka on tarkoitettu kohdenukleiiniha-pon osoitukseen patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmäl- 20 lä, tunnettu siitä, että se sisältää » 1 ,1 - koetinnukleiinihappoa B, joka sisältää kohdenukleiiniha- !!’! pon kanssa hybridisoituvan osan B1 ja kohdenukleiini- * t > ; ; hapon kanssa hybridisoitumattoman, nukleiinihappospesi- • · t · 2 5 fisen osan B2, f I 4 t 1 t matriisinukleiinihappoa C, joka sisältää koetinnukleii-nihapon kanssa osassa B2 hybridisoituvan osan C2 ja 30. koetinnukleiinihapon osan B1 kanssa hybridisoitumattoman * osan Cl, entsyymiä nukleiinihappojen matriisista riippuvaan syn-; teesiin ja 35 sopivia puskureita. 114716 Pat exit kr av