CN101403755A - 一种氟乙酰胺类毒药的免疫层析检测试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种氟乙酰胺类毒药的免疫层析检测试纸条及其制备方法，属于免疫检测技术领域。本发明以一种抗氟乙酸钠的簇特异性抗体与显色物质胶体金的结合物作为检测试剂组装试剂条，进行氟乙酰胺类毒药的中毒筛选检测，成本低廉，快速，仅需要5－10分钟；便携，适合现场检测；操作简便，不需要专业技术人员。本发明可以用于氟乙酰胺类毒药的中毒筛选检测。
Description
技术领域
一种氟乙酰胺类毒药的免疫层析检测试纸条及其制备方法，属于免疫检测技术领域，具体涉及到免疫胶体金试剂的制备及试纸条的制备。
背景技术
氟乙酰胺、氟乙酸钠、氟乙酸均属于氟乙酰胺类剧毒药，其毒性、中毒症状同毒鼠强相近。氟乙酰胺类毒药已成为我国刑事案件中最常见的毒物之一。氟乙酰胺进入生物体后，很快在体内代谢产生氟乙酸根阴离子，所以检验工作最终归结到对生物检材中痕量氟乙酸根阴离子的分析。现有的能实现多中毒检测的方法主要是仪器分析，其中包括有离子色谱法、毛细管电泳法及衍生化后GC-NPD、GC-ECD、GC-MS法。但这些检测方法需要昂贵的仪器设备，操作需要专业技术人员，且不能适应高通量，现场的快速检测。因此实现具有快速，便携优点的免疫检测方法的中毒检测具有现实意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有检测技术的缺陷，提供一种便携，快速适合进行现场检测的免疫层析色谱检测法(gold immunochromatography assay，GICA)，实现氟乙酰胺类毒药的中毒检测。同时提供该检测试纸条的制备方法。
本发明的技术方案：一种氟乙酰胺类毒药的免疫层析检测试纸条，由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬组成，PVC背衬上依次粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，金标垫上包被了抗氟乙酰胺类毒药的簇特异性抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上依次包被了氟乙酸钠-OVA和羊抗兔IgG。
所述的氟乙酰胺类毒药的免疫层析检测试纸条的制备方法，制备步骤为：
(1)制备氟乙酸钠-OVA偶联物：将氟乙酸钠与OVA以50∶1摩尔比溶于pH8、0.01mol/L的PBS缓冲溶液中、搅拌下加入碳二亚胺EDC交联剂，EDC摩尔用量为氟乙酸钠摩尔量的1/10，反应3h，4℃透析3天，形成氟乙酸钠-OVA偶联物；
(2)制备抗氟乙酸钠的多克隆抗体：用EDC法制备氟乙酸钠-BSA偶联物，用氟乙酸钠-BSA偶联物免疫得到抗氟乙酸钠的多克隆抗体；
(3)制备胶体金：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒；
(4)制备抗氟乙酰胺类毒药的簇特异性抗体-胶体金标记物：将3mL胶体金调至pH 9，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.075mg/mL的抗氟乙酸钠的多克隆抗体0.2mL，放置30min后加入牛血清蛋白BSA使终浓度为1％，放置至少30min后，10000转60min离心并用pH 9.0、0.002mol/L的硼酸盐缓冲液3mL重悬两次，最后用0.3mL重悬液重悬，得到稳定的抗氟乙酸钠抗体-胶体金标记物；
(5)将抗氟乙酸钠抗体-胶体金标记物包被在金标垫上，将氟乙酸钠-OVA偶联物和羊抗兔IgG分别包被在作为反应点的硝酸纤维素膜的测试线和质控线，在37℃烘箱充分干燥；
(6)试纸条的组装：将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，用切条机切割成3mm宽的细条，即得到用于检测的免疫层析检测试纸条。
本发明的有益效果：快速，仅需要5-10分钟；便携，适合现场检测；操作简便，不需要专业技术人员。
附图说明
图1组装完成的免疫层析检测试纸条结构示意图。
具体实施方式
实施例1
PVC背衬一端依次粘贴样品垫、金标垫，中间粘附硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫，金标垫上包被了抗氟乙酰胺类毒药的簇特异性抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被了氟乙酸钠-OVA和羊抗兔IgG。
按以下步骤制备：
(1)制备氟乙酸钠-OVA偶联物：将氟乙酸钠与OVA以50∶1摩尔比溶于PBS(0.01mol/L pH8)，搅拌下加入EDC交联剂，反应3h，4℃透析3天，形成氟乙酸钠-OVA偶联物；
(2)制备抗氟乙酸钠的多克隆抗体：用上述EDC方法制备氟乙酸钠-BSA偶联物，用此偶联物免疫得到高纯度的抗氟乙酸钠的多克隆抗体；
(3)制备胶体金：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒；
(4)制备多克隆抗体-胶体金标记物：将胶体金调至pH9左右，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.075mg/mL的抗氟乙酸钠的多克隆抗体0.2mL，放置30min后加入牛血清蛋白BSA使终浓度为1％，放置至少30min后，10000转60min离心并用pH 9.0、0.002mol/L的硼酸盐缓冲液3mL重悬两次，最后用0.3mL重悬液重悬，得到稳定的抗氟乙酸钠抗体-胶体金标记物；
(5)将抗氟乙酸钠抗体-胶体金标记物包被在金标垫上，将氟乙酸钠-OVA偶联物和羊抗兔IgG分别包被在作为反应点的硝酸纤维素膜的测试线和质控线，在37℃烘箱充分干燥。
(6)试纸条的组装：将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，用切条机切割成3mm宽的细条，即得到用于检测的免疫层析检测试纸条。4℃冷藏备用。
检测时将吸水垫浸入样本溶液，液面不得超过MARK线，10s后取出平放在操作台上；5-15min内可以判定结果，30min后结果无效。结果判断：样品中有氟乙酸钠存在且达到500ng/mL，则测试线将不出现红色条带，而在质控线出现红色条带，此时结果为阳性；如果样本中没有氟乙酸钠存在或数量在500ng/mL检测限以下，则测试线出现红色条带，质控线也同时出现红色条带，此时结果为阴性；无论测试线是否出现红色条带，质控线如果没有红色条带出现则表示该试纸条无效。
Claims (2)
1、一种氟乙酰胺类毒药的免疫层析检测试纸条，其特征在于由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬组成，PVC背衬上依次粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，金标垫上包被了抗氟乙酰胺类毒药的簇特异性抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上依次包被了氟乙酸钠-OVA和羊抗兔IgG。
2、一种权利要求1所述的氟乙酰胺类毒药的免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于制备步骤为：
(1)制备氟乙酸钠-OVA偶联物：将氟乙酸钠与OVA以50∶1摩尔比溶于pH8、0.01mol/L的PBS缓冲溶液中、搅拌下加入碳二亚胺EDC交联剂，EDC摩尔用量为氟乙酸钠摩尔量的1/10，反应3h，4℃透析3天，形成氟乙酸钠-OVA偶联物；
(2)制备抗氟乙酸钠的多克隆抗体：用EDC法制备氟乙酸钠-BSA偶联物，用氟乙酸钠-BSA偶联物免疫得到抗氟乙酸钠的多克隆抗体；
(3)制备胶体金：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒；
(4)制备抗氟乙酰胺类毒药的簇特异性抗体-胶体金标记物：将3mL胶体金调至pH 9，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.075mg/mL的抗氟乙酸钠的多克隆抗体0.2mL，放置30min后加入牛血清蛋白BSA使终浓度为1％，放置至少30min后，10000转60min离心并用pH 9.0、0.002mol/L的硼酸盐缓冲液3mL重悬两次，最后用0.3mL重悬液重悬，得到稳定的抗氟乙酸钠抗体-胶体金标记物；
(5)将抗氟乙酸钠抗体-胶体金标记物包被在金标垫上，将氟乙酸钠-OVA偶联物和羊抗兔IgG分别包被在作为反应点的硝酸纤维素膜的测试线和质控线，在37℃烘箱充分干燥；
(6)试纸条的组装：将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，用切条机切割成3mm宽的细条，即得到用于检测的免疫层析检测试纸条。
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