JP2021532332A

JP2021532332A - ベータコア断片ｈＣＧをマーカーとして含む新規な妊娠診断装置

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Publication number: JP2021532332A
Application number: JP2019563176A
Authority: JP
Inventors: ドンチャン，ジン; ジンチョ，ソン
Original assignee: ADTECH Co Ltd
Current assignee: ADTECH Co Ltd
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-11-25
Anticipated expiration: 2039-07-31
Also published as: JP7144448B2; KR102079738B1; WO2021002528A1

Abstract

本発明の免疫装置は、１）分析しようとする被検試料を収容する検体領域と、２）前記検体領域と連動しており、探針物質-標識が接合された抗Ｉ-ｈＣＧ抗体、及び、探針物質-標識が接合された抗βｃｆｈＣＧ抗体を含むコンジュゲート領域と、３）前記検体領域に繋がっており、抗Ｉ-ｈＣＧ抗体が固定された第１検出ライン、抗βｃｆｈＣＧ抗体が固定された第２検出ライン、及び、対照ラインを含む、前記コンジュゲート領域と連動する信号検出領域と、４）信号検出反応が終了した被検試料を吸収する、前記信号検出領域のダウンストリームに位置する吸収領域とを含み、高濃度のｈＣＧによるＨｏｏｋ効果及び／又はｈＣＧ-βｃｆの干渉効果による偽陰性を最小化し、正確な妊娠診断が可能である。

Description

本発明は妊娠診断用免疫装置、そしてこれを用いた妊娠診断方法に関する。

ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈｕｍａｎｃｈｏｒｉｏｎｉｃｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ；ｈＣＧ）は、妊娠中に生産される糖タンパク質ホルモンである。ｈＣＧは胎盤の絨毛細胞栄養膜で生産され、妊娠初期にプロゲステロンを継続して生産するようにし、胎盤の機能が完成する妊娠１０週まで着床を維持させる機能をする。体内活性形態である完全型ｈＣＧ（ＩｎｔａｃｔｈＣＧ；Ｉ-ｈＣＧ）は約３７ｋＤａの分子量を有し、２４４個のアミノ酸で構成される。Ｉ-ｈＣＧは大きく分けてアルファ（α）とベータ（β）の２つのサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）からなり、アルファ-サブユニットは９２個のアミノ酸を含んでおり、ベータ-サブユニットは１４５個のアミノ酸を含む。Ｉ-ｈＣＧは一般に妊娠期間中に多様な段階にて存在し、体内に存在する主な構造であり、妊娠初期にはこのような活性型構造が、高い割合で多糖鎖ｈＣＧ（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄｈＣＧ；Ｈ-ｈＣＧ）の形態で存在する。前記活性型の他にもｈＣＧの多様な解離及び分解生成物が血液及び尿から見つかり、これらは、断片化ｈＣＧ（ｎｉｃｋｅｄｈＣＧ；Ｎ-ｈＣＧ）、遊離ベータｈＣＧ（ｆｒｅｅ β-ｈＣＧ）、遊離アルファｈＣＧ（ｆｒｅｅ α-ｈＣＧ）、遊離ベータコア断片ｈＣＧ（ｆｒｅｅ β-ｃｏｒｅｆｒａｇｍｅｎｔｈＣＧ）などとして存在する。

ベータコア断片ｈＣＧ（βｃｆｈＣＧ）は、ｈＣＧの１つの明確な分解産物であるｆｒｅｅ β-ｈＣＧの断片であり、約１４ｋＤａの分子量を有する。βｃｆｈＣＧは、妊娠２週以降から尿で、Ｉ-ｈＣＧと比べて少ない量である約０.０１ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度で現れ始め、妊娠週数が経過するにつれて次第に増加し、５週目が経過すると、Ｉ-ｈＣＧよりも高い濃度で現れる。また、βｃｆｈＣＧは、他の代謝産物とは異なり、専ら尿にのみ存在する（ＪＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，７６，１９９３，７０４-１０）。

Ｉ-ｈＣＧの濃度は、血清及び尿で９〜１２週頃に最も高い数値を示し、妊産婦の尿中の濃度は１０週目に１５０、０００ｍＩＵ／ｍＬであり、個人差によって９００、０００ｍＩＵ／ｍＬの高い濃度で検出されることもある。現在用いられる妊娠診断キットは、妊娠初期（最終生理日基準３〜５週目）にＩ-ｈＣＧを定性診断して妊娠か否かを判定する。しかし、妊娠と判定された１１，７６０人に対して従来の妊娠診断キットで試験を行った結果、約０.２％に当たる２２人が偽陰性（Ｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅ）であることが分かり、これらに対するＩ-ｈＣＧの濃度は最大２６８、０２２.５ＩＵ／ｍＬと測定（Ｊ. ＥｍｅｒｇｅｎｃｙＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１３，４４:１５５）され、現在の妊娠診断キットに、フック現象（ＨｏｏｋＥｆｆｅｃｔ）による偽陰性の問題が発生していることを示唆する。

妊娠診断における偽陰性は、救急室（ｅｍｅｒｇｅｎｃｙｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、ＥＤ）の状況で深刻な結果をもたらす恐れがある。例えば、女性患者が妊娠しているにも拘らず、尿を利用して一般の妊娠診断キットで測定した際に偽陰性という結果が出されると、女性患者の治療において、胎児を考慮せずに治療を行ってしまうという医療事故が発生し得る。即ち、子宮外妊娠を診断できなかったり、妊娠時に禁止される薬物の投与又は胎児の放射線被爆、及びこれに起因する争訟などの問題を引き起こす。ＦＤＡのＭＡＵＤＥ（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒａｎｄｕｓｅｒｆａｃｉｌｉｔｙｄｅｖｉｃｅｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅ）調査の結果、妊娠定性検査で陰性と判定されて子宮頸部生検を実施したが、その後に血清検査でＩ-ｈＣＧが探知された事例や、尿を利用した妊娠テストで陰性と判定されてＣＴ撮影を行ったが、その後に妊娠８週目であることが判明した事例、妊娠陰性と判断されて子宮内避妊具を挿入したり、外科的手術を敢行したが、その後の検査で妊娠と判定された事例などが報告されている（Ｎｅｒｅｎｚｅｔａｌ.，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ６１:３，４８３-４８６，２０１５）。

尿を利用した妊娠診断キットは、一般にＩ-ｈＣＧに対する抗体を標識物質として用いて検出ライン（Ｔｅｓｔｌｉｎｅ）でＩ-ｈＣＧを検出するが、次の場合、妊娠診断において偽陰性の結果が出され得る。Ｉ-ｈＣＧが尿に多量に存在して、診断キットメンブレンに固定された検出抗体、及び、ゴールド又は蛍光などの探針物質-標識が接合された抗体を飽和させて、診断キットのＩ-ｈＣＧ検出ラインでのサンドイッチの形成を妨げる場合、即ちフック現象の場合、偽陰性の結果が出される可能性があるのであり、βｃｆｈＣＧが尿に高い濃度で存在して、探針物質-標識が接合された自由浮遊Ｉ-ｈＣＧ抗体がβｃｆｈＣＧと結合することにより、Ｉ-ｈＣＧとの結合を妨げ、干渉することによって、たとえＩ-ｈＣＧが診断キットの検出ラインに固定された検出抗体と結合していたとしても、βｃｆｈＣＧと結合した自由浮遊Ｉ-ｈＣＧ抗体が、抗原であるＩ-ｈＣＧと結合できず、サンドイッチの形成を妨げる場合が発生する（Ｇｒｉｆｆｅｙｅｔａｌ.，ＴｈｅｊｏｕｒｎａｌｏｆＥｍｅｒｇｅｎｃｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，４４，２０１３，１５５-１６０）。

即ち、尿を利用した妊娠診断キットは、Ｉ-ｈＣＧが高農渡である場合にはフック現象により妊娠診断において偽陰性の結果が出される可能性があり、またβｃｆｈＣＧが高濃度である場合にも偽陰性の結果を招く恐れがあると報告されている（Ｄｉｗａｎ，Ｍｅｄ. Ｌａｂ. Ｏｂｅｓｅｒｖｅｒ，２０１１，１８-２０；Ｃｅｒｖｉｎｓｋｉｅｔａｌ.，Ｃｌｉｎ. Ｃｈｅｍ. Ｌａｂ. Ｍｅｄ. ４８（７），２０１０，９３５-９４２；Ｇｒｏｎｏｗｓｋｉｅｔａｌ.，Ｃｌｉｎ. Ｃｈｅｍ.，５５（７），２００９，１３８９-１３９４）。従って、最終生理日（ｌａｓｔｍｅｎｓｔｒｕａｌｐｅｒｉｏｄ、ＬＭＰ）から約２週以降にはβｃｆｈＣＧの濃度が増加してＩ-ｈＣＧのサンドイッチの形成を妨げる干渉効果を示し、偽陰性の結果が出され得る。

従来の妊娠診断キットは、Ｉ-ｈＣＧのみを検知するのが大半であり、診断において偽陰性の問題を解決するために、一部の妊娠診断キットの場合、Ｉ-ｈＣＧ以外にｈＣＧ-Ｈ及びｈＣＧ-βの一部の組み合わせを検知している。従って、高濃度のＩ-ｈＣＧによるフック現象による偽陰性或いはβｃｆｈＣＧによる正常なサンドイッチ形成の妨害による偽陰性の結果がもたらされた。また、Ｉ-ｈＣＧとβｃｆｈＣＧ、そして他の種類のｈＣＧホルモンを１つの検出ラインで同時に検知する製品の場合は、βｃｆｈＣＧに反応性を示すが、高濃度のＩ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧが混合されている検体に対して、１つのラインで相互干渉効果による偽陰性の結果を引き起こした。例えば、Ｃ＆Ｄ社製の妊娠診断キットは、１つの検出ラインにＩ-ｈＣＧ以外に、βｃｆｈＣＧ、及び、他の種類の変移したｈＣＧを検知する抗体を含んでいるが、相互干渉効果により検出ラインでの敏感度が低下して、偽陰性の結果が出されるという問題が発生している。

そこで、本発明者らは、妊娠診断キットと関連する従来技術の問題を解決すべく鋭意研究した結果、Ｉ-ｈＣＧを検知する検出ライン以外に、βｃｆｈＣＧを検知する検出ラインを別途に追加し、相互干渉現象が発生しないＩ-ｈＣＧ抗体及びβｃｆｈＣＧ抗体をそれぞれ配置することによって、高濃度のＩ-ｈＣＧによるフック現象が発生してもβｃｆｈＣＧ検出ラインの発色によって妊娠か否かを正確に診断し、偽陰性の結果を最小化した妊娠診断キットを発明するに至った。

そこで、本発明者らは、妊娠診断キットと関連する従来技術の問題であるフック現象などによる偽陰性の結果を最小化したものとして、Ｉ-ｈＣＧを検知する第１検出ライン以外にβｃｆｈＣＧを検知する第２検出ラインを別途に追加した免疫装置を開発することで、高濃度のＩ-ｈＣＧによるフック現象が発生してもβｃｆｈＣＧの検知によって妊娠か否かを診断し、βｃｆｈＣＧの干渉現象による偽陰性を最小化した免疫装置及び妊娠診断方法を発明し、正確な妊娠診断を可能にするようにした。

前記目的を達成するために、本発明はβｃｆｈＣＧを特異的に認識する抗体を含む妊娠診断キットを提供する。

また、本発明は、１）分析しようとする被検試料を収容する検体領域（Ｓａｍｐｌｅｒｅｇｉｏｎ）と、２）前記検体領域と連動しており、探針物質（Ｐｒｏｂｅ）に接合された抗Ｉ-ｈＣＧ抗体、及び、探針物質に接合された抗βｃｆｈＣＧ抗体を含むコンジュゲート領域（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｒｅｇｉｏｎ）と、３）前記検体領域に繋がっており、抗Ｉ-ｈＣＧ抗体が固定された第１検出ライン、抗βｃｆｈＣＧ抗体が固定された第２検出ライン、及び、対照ラインを含む、前記コンジュゲート領域と連動する信号検出領域と、４）信号検出反応が終了した被検試料を吸収する、前記信号検出領域のダウンストリームに位置する吸湿領域とを含む妊娠診断用免疫装置を提供する。

本発明の一実施例によれば、前記２）の探針物質は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍｄｏｔ）ナノ粒子、カーボンナノ粒子、ラテックスビーズ／蛍光ナノ粒子、セルロースナノ粒子、磁気ナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマービーズ（ｐｏｌｙｍｅｒｂｅａｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、発光物質（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）、色素（ｄｙｅ）、タンパク質で構成された群より１つ以上選択されることを特徴とする。

本発明の一実施例によれば、前記３）の信号検出領域は、抗Ｉ-ｈＣＧ抗体が固定された第１検出ライン、前記第１検出ラインのダウンストリームに抗βｃｆｈＣＧ抗体が固定された第２検出ライン、及び、前記第２検出ラインのダウンストリームにある対照ラインを含むことができる。本発明の他の実施例によれば、前記３）の信号検出領域は、抗βｃｆｈＣＧ抗体が固定された第２検出ライン、前記第２検出ラインのダウンストリームに抗Ｉ-ｈＣＧ抗体が固定された第１検出ライン、及び、前記第１検出ラインのダウンストリームにある対照ラインを含むことができる。

本発明の一実施例によれば、前記３）の信号検出領域はニトロセルロース、セルロース、ポリエチレン、ポリエーテルサルフォン（ポリエーテルスルホン）、及び、ナイロンで構成された群より選択された何れか１つであることを特徴とする。

前記４）の吸湿領域は、多孔性支持体、及び、前記多孔性支持体の空洞（ｐｏｒｅ）に分散されるか、多孔性支持体の繊維糸に吸着又はコーティングされている、吸収剤を含むことを特徴とする。

前記免疫装置は、１）対照ライン及び第１検出ライン、２）対照ライン及び第２検出ライン又は３）対照ライン、第１検出ライン及び第２検出ラインに発色線が現れたとき、妊娠であると判定することを特徴とする。

本発明の他の態様によれば、１）試料を前記免疫装置に適用して試料内のＩ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧが探針物質-標識が接合された抗Ｉ-ｈＣＧ抗体及び抗βｃｆｈＣＧ抗体と反応する段階と、２）第１検出ライン及び第２検出ラインにより試料内のＩ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧの反応を確認する段階であって、Ｉ-ｈＣＧ、βｃｆｈＣＧは、それぞれの検出ラインで、サンドイッチ複合体の存在により発生する信号によって検知される段階と、３）対照ライン及び第１検出ラインに発色線が現れるか、対照ライン及び第２検出ラインに発色線が現れるか、対照ライン、第１検出ライン及び第２検出ラインに発色線が現れるかの、いずれかであるときに妊娠であると判定する段階とを含む妊娠診断に必要な情報を提供する方法を提供する。

本発明の一実施例による免疫クロマトグラフィーストリップは、Ｉ-ｈＣＧを検知する検出ライン以外にβｃｆｈＣＧを検知する検出ラインを追加で含んでおり、高濃度のＩ-ｈＣＧによるフック現象及び／又はβｃｆｈＣＧの干渉現象による偽陰性を最小化することで、正確な妊娠診断を可能にするという効果を奏する。

本発明によって製造された免疫クロマトグラフィーストリップの実現例を示す概要図である。本発明による免疫クロマトグラフィーストリップをキットに適用する具体例を示す模式図である。１は診断キットの判定窓を示し、２は試験の終了を示す対照ラインである。３と４は検出ラインを示し、５は被検試料を投入する検体領域を示す。Ｉ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧ濃度に応じた、本発明によって製造された免疫クロマトグラフィーストリップを含むキットについての、第１及び第２検出ライン及び対照ラインの様相を示す。他社の妊娠診断キットと比較した、本発明の免疫クロマトグラフィーストリップを含むキットについてのβｃｆｈＣＧ反応評価結果を示す。一般の妊娠診断免疫クロマトグラフィーストリップで偽陰性に判定される場合にも、本発明の異種検出ラインを備えた免疫クロマトグラフィーストリップで、妊娠陽性と判定可能であることを比較して示す。比較例１（Ｃ＆Ｄ社製の妊娠診断キット）と本発明との比較実験結果を示す。

本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、添付の図面と共に詳細に後述されている一連の実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で実現することができる。但し、これらの実施例は本発明の開示を完全なものにし、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に理解させるために提供されるものであり、本発明は請求範囲の範疇により定義されるだけである。以下、添付の図面を参照して本発明の実施のための具体的な内容を詳細に説明する。図面と関係なく同一の参照番号は同一の構成要素を示し、「及び／又は」は、言及されたアイテムの、それぞれ及び１つ以上の全ての組み合わせを含む。

本明細書で用いられた用語は、実施例を説明するためのものであり、本発明を制限しようとするものではない。本明細書において、単数型は特に言及しない限り複数型も含む。明細書で用いられる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び／又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言及された構成要素以外に１つ以上の他の構成要素の存在又は追加を排除しない。

他の定義がなければ、本明細書で用いられる全ての用語（技術及び科学的用語を含む）は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が共通して理解できる意味として用いられうるであろう。また、一般に用いられる辞典に定義されている用語は、明白に特別に定義されていない限り、理想的に又は過度に解釈されない。

以下、本発明の実施例による妊娠診断用免疫装置及びこれを用いた妊娠診断方法について説明する。

本発明の一実施例による妊娠診断用免疫装置は、１）分析しようとする被検試料を収容する検体領域と、２）前記検体領域と連動しており、探針物質-標識が接合された抗Ｉ-ｈＣＧ抗体と、探針物質-標識が接合された抗βｃｆｈＣＧ抗体とを結合させたコンジュゲート領域と、３）前記検体領域に繋がっており、抗Ｉ-ｈＣＧ抗体が固定された第１検出ライン、抗βｃｆｈＣＧ抗体が固定された第２検出ライン及び対照ラインを含む、前記コンジュゲート領域と連動する信号検出領域と、４）信号検出反応が終了した被検試料を吸収する、前記信号検出領域のダウンストリームに位置する吸湿領域とを含む。

前記検体領域は、妊娠可能年齢の女性の血液又は尿といった液状試料を収容することが好ましいが、Ｉ-ｈＣＧ及び／又はβｃｆｈＣＧを含むと予想される試料であれば、何れも使用可能である。

前記検体領域は、分析物質に対する選択性をより向上させるために、又は前記試料に含まれ得る干渉物質による影響を最小化するために、フィルタリング機能を追加で有することができる。必要な場合、前記検体領域のアップストリームに、分析物質とコンジュゲート間の反応を増加させるか、又は干渉物質により影響を排除できる物質を含む補助領域を追加で備えることができる。

前記コンジュゲート領域の対照ラインは、被検試料中のＩ-ｈＣＧ又はβｃｆｈＣＧの濃度と関係なく、一定の信号を出す部分を意味する。前記対照ラインは、Ｉ-ｈＣＧ又はβｃｆｈＣＧとは結合せずに被検試料と共に移動相により検出領域に沿って移動する、第３コンジュゲートと結合するリガンドを、固定させて形成できる。検体中のＩ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧの存在有無と関係なく、一定の信号を放出できるリガンドを固定させるのである。従って、第１コンジュゲート及び／又は第２コンジュゲートがターゲット試料と結合されず、第１検出ライン及び／又は第２検出ラインを行き過ぎても、第３コンジュゲートが試料と結合して、対照ライン上で捕獲されうる。例えば、試料内にターゲット試料が存在しない場合、検出ラインで色などが発現しなくても、対照ラインでは色などが発現する。このように、前記対照ラインでの応答（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、液状サンプルがセンサを適切に通過していることを意味する。前記第３コンジュゲートは、マウスＩｇＧ又はニワトリＩｇＹなどが用いられるうる。前記対照ラインにて、抗-ウサギＩｇＧ、抗-ニワトリＩｇＹ、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、ウシ血清アルブミン、ヤギ抗-マウスＩｇＧ又はヤギ-抗-ニワトリＩｇＹなどが用いられうる。

前記コンジュゲート領域の探針物質は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍｄｏｔ）ナノ粒子、カーボンナノ粒子、ラテックスビーズ／蛍光ナノ粒子、セルロースナノ粒子、磁気ナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマービーズ（ｐｏｌｙｍｅｒｂｅａｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、発光物質（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）、色素（ｄｙｅ）及びタンパク質からなる群より選択される１つ以上の探針物質が用いられうる。本発明の一実施例によれば、探針物質がコロイド状金ナノ粒子であるが、これに限定されない。

前記信号検出領域は移動相と試料が展開される媒質であって、移動相と被検試料は、信号検出領域の多孔性メンブレンの毛管現象により移動できる。信号検出領域には、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ポリビニール（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）樹脂又はポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂でもって合成されたウェルプレート（Ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）及びガラスで構成されるスライドグラス（Ｓｌｉｄｅｇｌａｓｓ）からなる群より選択されるものが用いられうる。本発明の一実施例によれば、信号検出領域にはニトロセルロースが用いられるが、これに限定されない。本発明の一実施例によれば、５〜１５μmの空孔を有するニトロセルロースメンブレンが用いられうるが、これに限定されない。

前記吸湿領域は、多孔性支持体及び前記多孔性支持体の空洞（空隙）に分散されるか、多孔性支持体の繊維糸に吸着又はコーティングされている吸収剤を含むことができ、前記多孔性支持体の上面に、多孔性フィルム層を追加で含むことができるが、これに限定されない。前記吸収剤は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、珪藻土、ベントナイト、苦灰石、石膏、シリカゲル及びこれらの混合物で構成される群より選択されうるが、これに限定されない。

本発明において、第１検出ライン及び第２検出ラインの信号強度を通じて試料内の標的物質の濃度を測定する範囲が、Ｉ-ｈＣＧは２５ｍＩＵ／ｍＬ以上であり、βｃｆｈＣＧは１ｐｍｏｌ／ｍＬ以上である。

従来の免疫クロマトグラフィーストリップは、検体内の標的物質が一定濃度を超えると、フック現象の発生により、検出ラインでの信号強度がむしろ減少する現象を示す。しかし、本発明の２つの検出ラインからなる免疫装置は、検体内のＩ-ｈＣＧ濃度が増加しても、Ｉ-ｈＣＧ濃度の増加によるフック現象と関係なく、βｃｆｈＣＧを検知する検出ラインにより、妊娠と診断可能であり、検体内のβｃｆｈＣＧ濃度の増加により発生する、干渉現象による偽陰性を最小化するために、検出ラインに抗βｃｆｈＣＧ抗体を含む。従って、免疫クロマトグラフィーストリップ上の、対照ライン及び第１検出ライン、対照ライン及び第２検出ライン、又は、対照ライン及び第１、２検出ラインに、着色線が現れたとき、妊娠であると判定する。従って、妊娠約３週以降に、βｃｆｈＣＧの増加による干渉現象により、偽陰性に判断されていた従来の妊娠診断キットとは異なり、抗βｃｆｈＣＧ抗体を備えた別途の検出ラインにより、βｃｆｈＣＧの存在を検出して妊娠か否かを正確に診断する。従って、第１検出ラインと第２検出ラインとの組み合わせにより、従来の１つの検出ラインで限界があった妊娠診断の範囲を広げ、正確度を改善したという特徴がある。

本発明において、前記コンジュゲート領域内に存在する抗Ｉ-ｈＣＧ抗体の第１コンジュゲートは、妊娠可能年齢の女性の血液又は尿などといった液状検体がメンブレンの側へ移動展開する際に、検体内のＩ-ｈＣＧと結合して、（Ｉ-ｈＣＧ）-コンジュゲートの第１複合体を形成する。前記コンジュゲート領域内に存在する抗βｃｆｈＣＧ抗体の第２コンジュゲートは、液状検体が信号検出領域へ移動展開する際に、検体内のβｃｆｈＣＧと結合して、βｃｆｈＣＧ-コンジュゲートの第２複合体を形成する。前記第１複合体は、展開される過程で、第１検出ラインに固定された抗Ｉ-ｈＣＧ抗体と反応し、前記第２複合体は、展開中に、第２検出ラインに固定された抗βｃｆｈＣＧ抗体と反応する。Ｉ-ｈＣＧ検出ラインの信号の強度は、検体内のＩ-ｈＣＧ濃度が増加するにつれて増加するが、一定濃度以上に増加すると、フック現象により、むしろ信号の強度が減少する結果を示す。本発明の免疫クロマトグラフィーストリップは、多量のＩ-ｈＣＧによりフック現象が発生しても、第２検出ラインによりβｃｆｈＣＧを敏感に検出することで、フック現象の影響を受けずに陽性と判定できるようにした。

本発明のＩ-ｈＣＧ濃度の増加による第１検出ライン及び第２検出ラインの結果は、図３に示した。フック現象が発生するＩ-ｈＣＧの濃度で、第２検出ラインは、βｃｆｈＣＧを検出して妊娠と診断するということを確認した。

また、本発明の免疫装置は、下部に固体支持台を含むことができる。

前記固体支持台は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ガラス及びプラスチックからなる群より選択された材料で形成されることができる。前記固体支持台上にストリップを取付・付着して製造するので、ストリップの耐久性を向上させることができ、取り扱い及び保管を容易にすることができる。また、追加的な外部デバイスの装着を容易にすることができる。

前記固体支持台として使用され得るプラスチック材質としては、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）フィルム、ポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ）フィルム、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）フィルム、アクリル（ａｃｒｙｌｉｃ）フィルムなどが用いられうるが、これに限定されない。

また、一態様として、本発明は前記免疫装置を、さらにデバイス内に固定したキットであって、下部デバイスにはガイド及びストリップ支持部が備えられており、上部デバイスには、検体投入口と、第１検出ライン及び第２検出ライン並びに対照ラインに対応する位置にある結果確認窓とが備えられたキットを提供する。

前記上部及び下部デバイスは、通常のプラスチック素材を用いて製造されうるのであり、例えば、ポリカーボネート、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅｂｕｔａｄｉｅｎｅｓｔｙｒｅｎｅ；ＡＢＳ）などの素材が用いられうるが、これに限定されない。

本発明の一実施例によれば、本発明の妊娠診断用免疫装置は、１）対照ライン及び第１検出ライン、２）対照ライン及び第２検出ライン、又は３）対照ライン、第１検出ライン及び第２検出ラインに発色線が現れたとき、妊娠であると判定することを特徴とする。

本発明の他の態様によれば、１）被検試料を前記免疫装置に適用して、試料内のＩ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧは、探針物質-標識が接合された抗Ｉ-ｈＣＧ抗体、及び、探針物質-標識が接合された抗βｃｆｈＣＧ抗体と、それぞれ反応する段階と、２）第１検出ライン及び第２検出ラインにより、試料内のＩ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧの反応を確認する段階であって、Ｉ-ｈＣＧ、βｃｆｈＣＧは、それぞれの検出ラインで、サンドイッチ複合体の存在により発生する信号によって検知される段階と、３）対照ライン及び第１検出ラインに発色線が現れたか、対照ライン及び第２検出ラインに発色線が現れたか、対照ライン、第１検出ライン及び第２検出ラインに発色線が現れたかの、いずれかであるとき、妊娠であると判定する段階とを含む妊娠診断に必要な情報を提供する方法を提供する。

本発明の他の態様によれば、前記免疫クロマトグラフィーストリップを用いて妊娠を診断する方法を提供する。

１）被検試料を前記免疫装置に適用して、試料内のＩ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧは、探針物質-標識が接合された抗Ｉ-ｈＣＧ抗体、及び、探針物質-標識が接合された抗βｃｆｈＣＧ抗体と、それぞれ反応する段階と、２）第１検出ライン及び第２検出ラインにより、試料内のＩ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧの反応を確認する段階であって、Ｉ-ｈＣＧ、βｃｆｈＣＧは、それぞれの検出ラインで、サンドイッチ複合体の存在により発生する信号によって検知される段階と、３）対照ライン及び第１検出ラインに発色線が現れるか、対照ライン及び第２検出ラインに発色線が現れるか、対照ライン、第１検出ライン及び第２検出ラインに発色線が現れたとき、妊娠であると判定する妊娠診断方法を提供する。

以下、本発明を下記の実施例により詳細に説明する。

但し、下記の実施例は本発明を例示するものであって、本発明の内容が下記の実施例により限定されるものではない。

（実施例１:免疫クロマトグラフィーストリップの製造）
＜Ａ．第１検出ライン、第２検出ライン及び対照線が形成されたメンブレンの製作＞
３つの分析リガンドをメンブレン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｍｅｍｂｒａｎｅ）に分注した。第１検出ラインのＩ-ｈＣＧ抗体として抗-Ｉ-ｈＣＧモノクローナル抗体（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔＩ-ｈＣＧ）を、第２検出ラインのβｃｆｈＣＧ抗体として抗-βｃｆｈＣＧモノクローナル抗体（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔＩ-βｃｆｈＣＧ）を、対照線のリガンドとしてはヤギ抗-マウス免疫グロブリン（ＧｏａｔａｎｔＩ-ＭｏｕｓｅＩｇＧ）を分注し、その後に乾燥させた。

＜Ｂ．コンジュゲートパッド（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｐａｄ）の製作＞
コロイド状金ナノ粒子（ｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）と抗Ｉ-ｈＣＧ抗体（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔＩ-ｈＣＧ）とが接合された第１コンジュゲート溶液を準備し、コロイド状金ナノ粒子と抗-βｃｆｈＣＧ抗体（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔＩ-βｃｆｈＣＧ）とが接合された第２コンジュゲート溶液を準備した。また、コロイド状金ナノ粒子とマウス免疫グロブリン（ＭｏｕｓｅＩｇＧ）とが結合された第３コンジュゲート溶液を準備した。前記第１コンジュゲート溶液、第２コンジュゲート溶液及び第３コンジュゲート溶液を、前処理されたコンジュゲートパッドに分注し、完全に乾燥させた後、適切な大きさに切断して準備した。

＜Ｃ．検体パッド（ｓａｍｐｌｅｐａｄ）の製作＞
緩衝剤及び保存剤が含まれている検体パッド前処理溶液に、検体パッドを十分に浸し、完全に乾燥させた後、適切な大きさに切断して準備した。

＜Ｄ. 吸湿パッド（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅｐａｄ）の製作＞
乾燥している状態の吸湿パッドを適切な大きさに切断して準備した。

＜Ｅ．免疫クロマトグラフィーストリップの製作＞
前記各過程を通じて準備したメンブレン、コンジュゲートパッド、検体パッド及び吸湿パッドを図１に示す構造の通りに組み立てる。

即ち、検体パッドをコンジュゲートパッドの一端と重なるように付着し、検出パッドの一端を前記コンジュゲートパッドの他端と重なるように付着し、検出パッドの他端と吸湿パッドの一端を互いに重なるように付着した。

図１において、それぞれの図面符号の意味するところは、以下の通りである。

１：検体パッド部（Ｓａｍｐｌｅｐａｄ）
２：コンジュゲートパッド部（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｐａｄ）
３：ニトロセルロースメンブレン（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｍｅｍｂｒａｎｅ）
４：吸湿パッド（ＡｂｓｏｒｂｅｎｔＰａｄ）
５：Ｉ-ｈＣＧ抗体が固定された第１検出ライン
６：βｃｆｈＣＧ抗体が固定された第２検出ライン
７：ヤギ抗-マウス免疫グロブリンが固定された対照ライン

＜Ｆ．デバイスの組み立て＞
製造された妊娠診断用免疫クロマトグラフィーストリップを、プラスチックの下部デバイスにおけるストリップ固定位置に入れた後、検体投入口と結果確認窓とがある上部デバイスに嵌め込んでから組み立てる。

（実施例２:Ｉ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧの濃度による免疫クロマトグラフィーストリップの分析）
Ｉ-ｈＣＧとβｃｆｈＣＧ標準物質を非妊娠の尿にスパイキングし、混合された標準試料を製造して試験を行った。製造された標準試料溶液をデバイス検体投入口に１００μＬずつ分注して展開させ、３分以降から最大１０分までの結果を確認した。製造された標準試料溶液のＩ-ｈＣＧとβｃｆｈＣＧの濃度は、以下の通りである（表１）。

図３に示すように、検体内のＩ-ｈＣＧの濃度が増加するほど検出ラインのゴールド粒子の信号強度は次第に増加し、Ｉ-ｈＣＧの濃度１、０００ｍＩＵ／ｍＬを有する実験群３で最も強い強度を示したが、Ｉ-ｈＣＧ濃度２１２，０００ｍＩＵ／ｍＬ及び８００，０００ｍＩＵ／ｍＬである実験群４及び５では、フック現象によりＩ-ｈＣＧを検知する第１検出ラインがはっきりしていないか、検知されなかった。しかし、βｃｆｈＣＧを検知する第２検出ラインの場合、検体内のＩ-ｈＣＧ濃度が増加してフック現象が発生するのと関係なく、βｃｆｈＣＧを検知することができた（図３）。

（実施例３：高濃度のβｃｆｈＣＧによる偽陰性の評価）
βｃｆｈＣＧによる干渉現象による偽陰性の評価のために、韓国における同業他社の３つの製品と、本発明の免疫装置とを比較評価したのであり、評価方式はＮｅｒｅｎｚｅｔａｌ.のスクリーニングを参照した（Ｎｅｒｅｎｚｅｔａｌ.，Ｃｌｉｎｉｃａｌｃｈｅｍ，２０１４，Ｖｏｌ. ６０:４，６６７-６７４）

非妊娠の尿にＩ-ｈＣＧ０.５ｐｍｏｌ／ｍＬ（約２００ｍＩＵ／ｍＬ）を混合した試料、非妊娠の尿にβｃｆｈＣＧ５０ｐｍｏｌ／ｍＬを混合した試料、非妊娠の尿にＩ-ｈＣＧ０.５ｐｍｏｌ／ｍＬ、及び、βｃｆｈＣＧ５００ｐｍｏｌ／ｍＬを混合した試料を使用して肉眼で判定した。

βｃｆｈＣＧ５０ｐｍｏｌ／ｍＬの試料を処理する場合と、Ｉ-ｈＣＧ０.５ｐｍｏｌ／ｍＬ及びβｃｆｈＣＧ５００ｐｍｏｌ／ｍＬの混合試料を処理する場合、他社製品では、バンドが発色されなかったり、非常に薄く発色する偽陰性が確認されたが、これは実際の試料における偽陰性判定の可能性を内包する。しかし、本発明による免疫装置（ＡＤＴｅｃｈ）は、前記いずれの試料を処理する場合にも、バンドが発色して妊娠と診断し、偽陰性の問題を解決した（図４）。

（実施例４：比較実験）
一般に用いられてきた妊娠検査薬の検出領域は、１つの検出ラインと対照ラインとからなり、２本のラインが発現する場合に妊娠と診断する。従って、高農度のＩ-ｈＣＧによるフック現象による偽陰性が発生するか、妊娠初期のβｃｆｈＣＧの干渉効果によって偽陰性に診断される可能性がある。反面、本発明の免疫ストリップは、βｃｆｈＣＧを検知するラインが存在して、高濃度のＩ-ｈＣＧによるフック現象又は妊娠初期（ＬＭＰ２週以降）から増加するβｃｆｈＣＧにより干渉現象が発生しても、βｃｆｈＣＧを別途の検出ラインで検知して妊娠と判定可能であるので、初期及び後期の妊娠で発生する偽陰性の問題を解決した（図５）。

また、本発明による妊娠診断装置と、Ｃ＆Ｄ社製の妊娠診断キット（比較例１）とを比較実験した。比較例１の場合、高濃度のβｃｆｈＣＧの処理時に、１つの検出ラインで陽性反応が現れた。これは比較例１がβｃｆｈＣＧの干渉によるＨｏｏｋ効果を示さないことを立証するが、高濃度のＩ-ｈＣＧ（約３、０００ＩＵ／ｍＬ）をβｃｆｈＣＧと共に処理したとき、１つの検出ライン上では相互干渉現象を示し、偽陰性が発生した。これに対し、Ｉ-ｈＣＧ、βｃｆｈＣＧ検出ラインを分離したことに特徴がある本発明では、高濃度のＩ-ｈＣＧにより相互干渉現象を受けず、βｃｆｈＣＧ検出ラインが発色して陽性と判定可能であった（表２及び図６）。

Claims

１）分析しようとする被検試料を収容する検体領域と、
２）前記検体領域と連動しており、探針物質-標識が接合された抗Ｉ-ｈＣＧ抗体、及び、探針物質-標識が接合された抗βｃｆｈＣＧ抗体を含むコンジュゲート領域と、
３）前記検体領域に繋がっており、抗Ｉ-ｈＣＧ抗体が固定された第１検出ライン、抗βｃｆｈＣＧ抗体が固定された第２検出ライン、及び、対照ラインを含む、前記コンジュゲート領域と連動する信号検出領域と、
４）信号検出反応が終了した被検試料を吸収する、前記信号検出領域のダウンストリームに位置する吸収領域と、
を含む妊娠診断用免疫装置。
前記２）の探針物質は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍｄｏｔ）ナノ粒子、カーボンナノ粒子、ラテックスビーズ／蛍光ナノ粒子、セルロースナノ粒子、磁気ナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマービーズ（ｐｏｌｙｍｅｒｂｅａｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、発光物質（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）、色素（ｄｙｅ）及びタンパク質で構成された群より選択された１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の妊娠診断用免疫装置。
前記２）の探針物質は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍｄｏｔ）ナノ粒子、カーボンナノ粒子、ラテックスビーズ／蛍光ナノ粒子、セルロースナノ粒子、磁気ナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマービーズ（ｐｏｌｙｍｅｒｂｅａｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、発光物質（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）、色素（ｄｙｅ）及びタンパク質で構成された群より選択された１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の妊娠診断用免疫装置。
前記４）の吸収領域は、多孔性支持体の空隙（ｐｏｒｅ）に分散されているか、または、多孔性支持体の繊維糸に吸着又はコーティングされている吸収剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の妊娠診断用免疫装置。
１）対照ライン及び第１検出ラインに、
２）対照ライン及び第２検出ラインに、または、
３）対照ライン、第１検出ライン及び第２検出ラインに、
発色線が現れたとき、妊娠であると判定することを特徴とする請求項１に記載の妊娠診断用免疫装置。
１）被検試料を請求項１〜５の何れか一項に記載の免疫装置に適用して、試料内のＩ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧは、探針物質-標識が接合された抗Ｉ-ｈＣＧ抗体、及び、探針物質-標識が接合された抗βｃｆｈＣＧ抗体と反応する段階と、
２）第１検出ライン及び第２検出ラインにより、試料内のＩ-ｈＣＧ及びβｃｆｈＣＧの反応を確認する段階であって、Ｉ-ｈＣＧ、βｃｆｈＣＧは、それぞれの検出ラインでサンドイッチ複合体の存在により発生する信号によって検知される段階と、
３）対照ライン及び第１検出ラインに発色線が現れたか、対照ライン及び第２検出ラインに発色線が現れたか、または、対照ライン、第１検出ライン及び第２検出ラインに発色線が現れたとき、妊娠であると判定する段階と、
を含む妊娠診断に必要な情報を提供する方法。