CN101914632B - 一种h9亚型禽流感病毒荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法是采用TaqMan技术，设计一组仅在H9亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针，应用荧光定量检测仪对样品进行检测。该方法灵敏度高、特异性强，操作简单，能大大缩短检测周期，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。

Description

一种H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法。 

(二)发明背景

禽流感是由正粘病毒科禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，根据其血凝素HA和神经氨酸酶NA的抗原性将禽流感病毒分成不同亚型，包括15种特异的HA亚型和9种特异的NA亚型，两者的不同组合形成不同亚型禽流感病毒。根据毒株致病性的不同，禽流感可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感两大类。H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，产蛋家禽感染后，可引起产蛋率下降，软壳蛋、无壳蛋增多，严重的将会停止产蛋。种禽感染后，除上述症状外，还表现出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雏禽出壳困难，出壳后的雏禽弱雏增多。雏禽在一周内死亡率较高，且易感染大肠杆菌，治疗较困难。H9亚型禽流感混合感染其他病原时，可导致发病率和死亡率的大幅度提高，给养殖业带来巨大损失。近年来，H9亚型禽流感病毒感染人的病例也时有发生，因此它也是不容忽视的人兽共患病病原。 

H9亚型禽流感传播快，危害大，因此早期快速诊断就成为预防和控制该病的前提条件。根据其流行特点、临诊表现和病理变化可作出初步诊断，确诊还需要进行实验室诊断，传统的实验室检测方法主要是血清学检测。血清学检测具有精确、敏感的优点，但操作繁琐，耗时较长，约需要一周左右的时间才能确诊。基于分子生物学技术的荧光定量RT-PCR方法，能够快速准确的对样品进行检测，对疾病的早期治疗及疫情的控制提供参考。 

(三)发明内容

本发明建立了灵敏度高、特异性强、操作简单的H9亚型禽流感荧光定量RT-PCR检测方法，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供保障，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。 

本发明的具体步骤是： 

1、引物设计 

参照GenBank中公开发表的H9亚型禽流感病毒HA基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计了特异性引物序列： 

名称        核苷酸序列(5’-3’)                          位置 

H9F-1       ACCAGTGCATGGAGACAATTC                        1484-1504 

H9R-1       CAAATGTTGCATCTGCAAGAC                        1709-1689 

H9F-2       AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACA                    1576-1600 

H9R-2       ATTGGACATGGCCCAGAACA                         1609-1639 

H9-probe    FAM-ACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTG-TAMRA    1686-1667 

2、病毒RNA提取 

①取H9N2亚型禽流感病毒悬液250μL，加入750μLTrizol液，混匀； 

②室温放置5min，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒； 

③取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min； 

④弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，混匀，4℃下7500g离心5min； 

⑤重复④中的操作； 

⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度； 

⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中，放置10min。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置-70℃冰箱。 

3、RT-PCR扩增 

①反转录合成cDNA：反转录反应体系包括：10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl U-12禽流感通用反转录引物(5`-AGCAAAAGCAGG-3`)，Quant Reverse Transcriptase 1μl，5μl已制备的RNA，DEPC水8μl。37℃作用1h，即反转录完成。 

②PCR扩增：PCR总体系为25μl，其中10×Buffer 2.5μl，2.5mM Mg²⁺2μl，2.5mM dNTPs 2μl，上、下游引物(H9F-1和H9R-1)各0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板1μl，余下用灭菌ddH₂O补足。反应条件为：95℃预变性5min，然后94℃30s，45℃30s，72℃ 30s，进行30个循环，最后72℃延伸6min。反应结束后，取5μl PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳。 

4、质粒标准阳性模板的制备 

①确定阳性质粒：PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常 规方法将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，EcoR I和Pst I双酶切鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒。 

②阳性质粒浓度的测定：将质粒提取物用超纯水10×稀释后，在260nm与280nm波长下测定液体中质粒的含量，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数。 

注：每个碱基的平均分子量为660 

5、荧光定量PCR标准曲线绘制 

提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，荧光定量标准品为位于HA基因上1484～1709之间、大小约为226bp的基因片段的质粒。倍比稀释(107～102copies/μL)用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H9F-2和H9R-2)各0.8μl，探针0.8μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超纯水6.6μl。反应条件为：95℃1min；95℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 34s，40个循环。 

本发明的有益效果主要体现在： 

(1)灵敏度高：通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为100copies/reaction。 

(2)特异性强：除H9亚型的毒株均能检测到阳性的荧光信号外，而其他亚型流感病毒H1、H3、H5、H7等均为阴性，新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒均为阴性。 

(3)重复性好：选择不同浓度的4个质粒标准品进行荧光定量PCR检测，每个标准品在同一反应条件下重复3次作为同一批次内重复试验，然后在另一时间再重复一次作为不同批次间重复试验，通过计算得出，批次内变异系数的mean±S.D.为0.82±0.64％，批次间变异系数的mean±S.D.为1.15±0.17％。 

说明书附图： 

图1是H9亚型禽流感病毒荧光定量PCR标准品扩增曲线 

图2是H9亚型禽流感病毒荧光定量PCR标准曲线 

具体实施方式：

参照GenBank中公开发表的H9亚型禽流感病毒HA基因序列，设计了特异性引物序列： 

名称        核苷酸序列(5’-3’) 

H9F-1       ACCAGTGCATGGAGACAATTC 

H9R-1       CAAATGTTGCATCTGCAAGAC 

H9F-2       AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACA 

H9R-2       ATTGGACATGGCCCAGAACA 

H9-probe    FAM-ACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTG-TAMRA 

实施例一：以已知H9N2亚型禽流感病毒为检测材料，并以超纯水为阴性对照。 

1、H9N2亚型禽流感病毒RNA提取 

①取H9N2亚型禽流感病毒悬液250μL，加入750μLTrizol液，混匀； 

②室温放置5min，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒； 

③取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min； 

④弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，混匀，4℃下7500g离心5min； 

⑤重复④中的操作； 

⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度； 

⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中，放置10min。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置-70℃冰箱。 

2、反转录合成cDNA 

反转录反应体系包括：10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl U-12禽流感通用反转录引物(5`-AGCAAAAGCAGG-3`)，Quant Reverse Transcriptase 1μl，5μl已制备的RNA，DEPC水8μl。37℃作用1h，即反转录完成。 

3、荧光定量PCR检测 

取上述反转录获得的cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，同时制定标准曲线，反应体系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H9F-2和H9R-2)各0.8μl，探针0.8μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超纯水6.6μl。反应条件为：95℃ 1min；95℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 34s，40个循环。最后根据标准曲线分析被检材料中的病毒核酸量(copies)。 

结果说明本方法能有效地检测H9亚型禽流感病毒核酸量。 

实施例二：待检病料(病禽咽喉拭子和泄殖腔拭子)中H9亚型禽流感病毒的荧光定量PCR检测。 

1、样品制备： 

病禽咽喉拭子和泄殖腔拭子品在混合器上充分混合后，用灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，编号备用。 

2、病毒RNA提取 

①取上述液体250μL，加入750μLTrizol液，混匀； 

②室温放置5min，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒； 

③取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min； 

④弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，混匀，4℃下7500g离心5min； 

⑤重复④中的操作； 

⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度； 

⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中，放置10min。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置-70℃冰箱。 

3、反转录合成cDNA 

反转录反应体系包括：10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl U-12禽流感通用反转录引物(5`-AGCAAAAGCAGG-3`)，Quant Reverse Transcriptase 1μl，5μl已制备的RNA，DEPC水8μl。37℃作用1h，即反转录完成。 

4、荧光定量PCR检测 

取上述反转录获得的cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，同时制定标准曲线，反应体系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H9F-2和H9R-2)各0.8μl，探针0.8μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超纯水6.6μl。反应条件为：95℃ 1min；95℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 34s，40个循环。最后根据标准曲线分析被检材料中的病毒核酸量(copies)。 

结果说明本方法能敏感地检测病料中H9亚型禽流感病毒核酸量。 

Claims (1)

1.一种用于H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测的特异性寡核苷酸组，其特征在于所述寡核苷酸组包括引物和探针，所述引物和探针序列如下：

H9F-1：ACCAGTGCATGGAGACAATTC；

H9R-1：CAAATGTTGCATCTGCAAGAC；

H9F-2：AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACA；

H9R-2：ATTGGACATGGCCCAGAACA；

H9-probe：FAM-ACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTG-TAMRA。

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