CN102605100B

CN102605100B - 环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物、检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102605100B
Application number: CN201210040491.3A
Authority: CN
Inventors: 张琳; 张秀美; 胡北侠; 杨少华; 颜世敢
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Qinhuangdao Kai Kai Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2012-02-22
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2032-02-22
Also published as: CN102605100A

Abstract

本发明涉及禽传染性支气管炎病毒检测技术领域，环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物，共包括外侧引物对、内侧引物对和环形引物对三对特异性引物，如序列表中所示，三对引物摩尔比为1:8:4。禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液，环介导等温扩增反应液中含有三对特异性引物。检测方法，用检测试剂盒对来自发病禽类动物的样品总RNA进行环介导等温扩增反应，反应条件为：59-65℃、30-75分钟。本发明的检测试剂盒，特异性和敏感性高，快速，可检测出1个拷贝的RNA。

Description

环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物、检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及禽传染性支气管炎病毒检测技术领域，特别涉及环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物，还涉及一种禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒，还涉及所述禽传染性支气管炎病毒的检测方法。

背景技术

禽传染性支气管炎又称鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis，IB），是由禽传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起的急性、高度接触性的呼吸道和泌尿生殖道疾病。该病的特征是以幼鸡器官罗音、咳嗽、呼吸困难等呼吸道症状为主；产蛋鸡则通常发生产蛋量和蛋的品质下降，输卵管受到永久性损伤而丧失产蛋能力。发生肾型传染性支气管炎的病鸡还常表现拉淀粉糊样粪便，肾脏苍白、肿大，肾小管和输尿管内有大量白色的尿酸盐沉积。禽传染性支气管炎病毒的血清型众多，交叉保护力低，引起的临床病多样，给养禽业造成巨大的经济损失。

禽传染性支气管炎病毒诊断方法有很多, 主要有免疫琼脂扩散（AGP）试验、酶联免疫吸附(ELISA)试验、免疫印迹（IBT）、聚合酶链式反应(PCR)以及实时荧光定量(real-time PCR)等。但上述方法存在试验周期较长、操作繁琐、受检测材料限制、对实验仪器及检测人员的技术要求高等不同缺点, 因此不适合在基层实验室应用。

江苏省家禽科学研究所于2010年1月8日申请了名称为“基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法”，申请号为“201010017295.5”的中国发明专利申请，公开了使用三对特异性引物即内引物、外引物和环引物对鸡传染性支气管炎病毒进行检测的技术，但此申请并未提及检测灵敏度及特异性的问题，因此，我们无从知晓其公开的试剂盒及方法的灵敏度及特异性，因此此专利申请的技术方案其实并没有实践意义。

发明内容

为了解决以上现有技术中尚无有实际检测意义的环介导等温检测禽传染性支气管炎病毒的方法的技术，本发明提供了特异性和灵敏度好的环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物。

本发明的另一个目的是提供一种快速、准确检测禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒。本发明还提供了一种禽传染性支气管炎病毒的检测方法。

本发明是通过以下措施实现的：

一种环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)禽传染性支气管炎病毒的引物，共包括外侧引物对、内侧引物对和环形引物对三对特异性引物，三对引物对能与禽传染性支气管炎病毒（GeneBank Accession Number AF470626）中5a-5b（见序列表中序列1）基因结合，序列如下：

外侧引物对：

上游引物F3：5’-TTAGATTTAGTTTATAGGTTGG-3’, 见序列表中序列2，

下游引物B3： 5’-CCTTACCGCTTGCCATGA-3’, 见序列表中序列3，

内侧引物对:

上游引物FIP：

5’-AACACAATCTAATCCTTCTCTCATTTTGTATGAATAATAGTAAAGATAATCC-3’, 见序列表中序列4，

下游引物BIP：

5’-TACTTTCTTAACAAAGCAGGACATTTTCACAAGTTTTCCCTTGGAATA-3’, 见序列表中序列5，

环形引物对:

上游引物LF：5’-CTTTTCTTGCTATTGCTCC-3’, 见序列表中序列6，

下游引物LB： 5’-CAGAGCCTTGTCCCGCGT-3’，见序列表中序列7，

外侧引物对、内侧引物对、环形引物对的摩尔比为1:8:4。

引物识别的八个区域位于近年所有禽传染性支气管炎病毒5a-5b基因的保守区，所以引物能够识别所有的禽传染性支气管炎病毒5a-5b基因。本发明提供的禽传染性支气管炎病毒检测试剂盒在使用过程中，所述的外侧引物对、内侧引物对和环形引物对作为一个整体使用，使用时应尽量避免引物二聚体的形成。

一种禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液，环介导等温扩增反应液中含有上述三对特异性引物。

所述的检测试剂盒，每24μL环介导等温扩增反应液中含有外侧引物对上游引物和下游引物各5pmol，内侧引物对上游引物和下游引物各40pmol，环形引物对上游引物和下游引物各20pmol。

所述的检测试剂盒，每24μL环介导等温扩增反应液中还含有Tris-HCl 20mM、KCl 10mM、(NH₄)₂SO₄10mM、MgSO₄ 4-16mM、Tween20 0.1%、钙黄绿素0.05 mM、MnCl₂ 0.6mM、AMV反转录酶 0.2U、甜菜碱 0.8M、脱氧核苷酸dNTPs 1.4mM、Bst聚合酶8U。

所述的检测试剂盒，每24μL环介导等温扩增反应液中还含有Tris-HCl 20mM、KCl 10mM、(NH₄)₂SO₄10mM、MgSO₄ 8mM、Tween20 0.1%、钙黄绿素0.05 mM、MnCl₂ 0.6mM、AMV反转录酶 0.2U、甜菜碱 0.8M、脱氧核苷酸dNTPs 1.4mM、Bst聚合酶8U。

所述的检测试剂盒，所述的检测试剂盒中还包括荧光显色剂。

所述的检测试剂盒，荧光显色剂为钙黄绿素和MnCl₂。

一种禽传染性支气管炎病毒的检测方法，是用所述的禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒对来自发病禽类动物的样品总RNA进行环介导等温扩增反应，确定发病禽类动物中是否携带禽传染性支气管炎病毒。所述环介导等温扩增反应条件为：59-65℃、30-75分钟。所述试剂盒还包括环介导等温扩增试剂、阳性对照、阴性对照；所述阳性对照为禽传染性支气管炎病毒RNA。

所述的检测方法，还包括将进行完环介导等温扩增反应的样本在80℃条件下反应2分钟。

应用本发明提供的试剂盒检测禽传染性支气管炎病毒，可以通过直接检视判断样本是否含有禽传染性支气管炎病毒。直接检视方法为：

装有阳性对照的反应管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的反应管仍为棕黄色无荧光液体。如果装有待检样品的反应管有亮绿色可见荧光，则说明待检样品中禽传染性支气管炎病毒检测结果为阳性。如果装有待检样品的反应管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中禽传染性支气管炎病毒检测结果为阴性。

本发明提供的禽传染性支气管炎病毒检测试剂盒检测原理如下：

所述的引物组与所述的禽传染性支气管炎病毒AF470626序列5a-5b基因8个特定结合区域结合，见表1。

表1 引物组与所述的禽传染性支气管炎病毒AF470626序列5a-5b基因结合区域

上述引物组在AMV反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下可完成对模板RNA的扩增。扩增过程分为三个阶段，具体如下：

（1）反转录阶段

在AMV反转录酶的作用下，样本RNA被反转录成cDNA。

（2）循环起始阶段

一端内侧引物先于模板结合并启动DNA合成。相同一端的外侧引物随后与模板结合启动DNA合成，并发生链置换释放出含有内侧引物序列的DNA单链。该单链DNA作为模板先后与另一端的内侧引物和外侧引物结合，启动DNA合成合并发生链置换，最后形成一个初始的茎环DNA。

（3）反应循环阶段

内侧引物与初始茎环DNA结合，启动链置换DNA合成，可产生另一个初始茎环DNA和一个新的两倍长度的茎环DNA。这些茎环DNA可作为模板继续与内侧引物结合启动链置换DNA合成，并且每次合成均可使茎环DNA的茎长度成倍增长。

进入循环阶段后，会产生许多分子大小不同的茎环DNA，这些茎环DNA还可以作为模板与环形引物结合，启动更多的DNA合成并发生链置换。最后经过一个小时的等温扩增，目的基因可累计10⁹拷贝。

本发明的有益效果：

应用本发明提供的禽传染性支气管炎病毒的检测方法对禽传染性支气管炎病毒进行检测，快速，特异性和敏感性高，可检测出1个拷贝的RNA，与传统PCR检测方法相比，应用本发明提供的禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒检测，不需要昂贵的仪器，只需普通水浴锅即可，且检测结果可通过肉眼观察荧光，操作简单，观察方便，可应用于基层现场进行的临床兽医学和食品中携带禽传染性支气管炎病毒的检测。

附图说明

图1 为实施例1扩增结果的凝胶电泳谱图，

其中：M: Marker Ⅲ, 1: 0mM Mg²⁺, 2: 4mM Mg²⁺, 3: 8mM Mg²⁺, 4: 12mM Mg²⁺, 5: 16mM Mg²⁺。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明有关内容。下列实例中未注明的具体试验方法，通常按照分子克隆实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商提供的条件。

本发明提供的检测方法可包括如下步骤:

(1)RNA的提取

本发明提供的检测方法可用于检测各种脏器、分泌物中的禽传染性支气管炎病毒，如鼻咽分泌物、肺脏、肾脏、粪便等。不同来源的总RNA提取可参考相应资料，或使用相应RNA提取试剂盒。

(2)环介导的等温扩增

①在装有24μL的LAMP反应液的反应管中加入1μL模板RNA;

②于水浴锅或金属恒温加热器上59-65℃放置30-75分钟，取出。

在步骤②完成后，取出前，还可以再调水浴锅温度到80℃反应2分钟，目的是能够终止反应，以便长期保存反应结果。

(3)结果判定

可以通过直接检视判断样本是否含有禽传染性支气管炎病毒。

装有阳性对照的反应管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的反应管仍为棕黄色无荧光液体。如果装有待检测样品的反应管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中禽传染性支气管炎病毒检测结果为阴性;如果装有待检测样品的检样管有亮绿色可见荧光，则说明样品中禽传染性支气管炎病毒检测结果为阳性。

实施例1：LAMP反应液中MgSO₄浓度的影响

一、引物的合成

人工合成以下3对引物，

外侧引物对：

上游引物F3：5’-TTAGATTTAGTTTATAGGTTGG-3’,

下游引物B3： 5’-CCTTACCGCTTGCCATGA-3’,

内侧引物对:

上游引物FIP：

5’-AACACAATCTAATCCTTCTCTCATTTTGTATGAATAATAGTAAAGATAATCC-3’,

下游引物BIP：

5’-TACTTTCTTAACAAAGCAGGACATTTTCACAAGTTTTCCCTTGGAATA-3’,

环形引物对:

上游引物LF：5’-CTTTTCTTGCTATTGCTCC-3’,

下游引物LB： 5’-CAGAGCCTTGTCCCGCGT-3’，

二、配制LAMP反应液

每24μL LAMP反应液，含有以下组分：20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM (NH₄)₂SO₄、4-16mM MgSO₄、0.1% Tween20、0.05 mM钙黄绿素、0.6mM MnCl₂、0.2U AMV反转录酶、0.8M甜菜碱、1.4mM脱氧核苷酸dNTPs、8U Bst聚合酶、5pmol上游外侧引物（F3）、5pmol下游外侧引物（B3）、40pmol上游内侧引物（FIP）、40pmol下游内侧引物（BIP）、20pmol上游环形引物、20pmol下游环形引物。

三、试剂盒的组装

该试剂盒由以下物质组成：步骤二配制的LAMP反应液、禽传染性支气管炎病毒RNA(阳性对照) (ARV /S1133株)、灭菌双蒸水(阴性对照)、反应管。

反应中Mg²⁺浓度是影响扩增效率的重要因素。Mg²⁺浓度越低，反应特异性越强，但扩增效率降低；Mg²⁺浓度越高，反应的效率增高，但特异性减弱。分别配制MgSO₄浓度分别为4mM、8 mM 、12 mM和16 mM的LAMP反应液，于水浴锅或金属恒温加热器上63℃放置60分钟，取出，进行凝胶电泳测试，结果见图1，实施例结果表明，LAMP反应体系中MgSO₄浓度为8mM时最为合适，所以检测试剂盒中MgSO₄浓度优选8mM。

以下实施例及灵敏度、特异性检测中使用的LAMP反应液中MgSO₄浓度均为8mM。

实施例2

取两只鸡，1只确诊为禽传染性支气管炎病毒感染的病鸡，1只健康鸡。用泄殖腔棉拭子分别对2只鸡进行采样。采用实施例1制备的检测试剂盒对样本进行检测。

一、提取RNA

分别收集泄殖腔棉拭子，用0.2mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液在离心管中反复冲洗棉拭子，取出棉签后，5000rpm离心1min，取上清，得到2只鸡的检测液。

提取RNA的操作是现有的技术，现只列举其中一种具体操作，如下，但并不仅仅限于此种操作：

在离心管中加入250μL检测液和750μL TRIzol Reagent，剧烈振荡，冰浴5min；加氯仿200μL，冰浴5min；12000rpm，4℃条件下离心10min，取水相,于另一离心管中；加入异丙醇500μL（-20℃预冷），-20℃下孵育10min；12000rpm，4℃条件下离心10min，弃上清；向沉淀中加入1mL 75%乙醇（0.1％DEPC水配制）进行洗涤；12000rpm，4℃条件下离心5min，再重复洗涤后，弃上清；将沉淀室温晾干10min，用0.1%DEPC水将沉淀溶解，并在55-60℃下孵育10min，所制备RNA应立即进行检测或贮存于-80℃备检。

二、环介导等温扩增

在3支装有24 μL的LAMP反应液的反应管中各加入1μL步骤一得到病鸡的RNA样品，作为检测组1；在3支装有24 μL的LAMP反应液的反应管中各加入1μL步骤一得到健康鸡的RNA样本，作为检测组2；在3支装有24 μL的LAMP反应液的反应管中各加入1μL阳性对照，作为阳性对照组；在3支装有24μL的LAMP反应液的反应管中各加入1μL灭菌双蒸水，作为阴性对照组。

上述反应管同时在水浴锅上59℃放置75分钟，取出。

三、检视

装有阳性对照的反应管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的反应管仍为棕黄色无荧光液体。健康鸡检测组的三个反应管均为棕黄色，病鸡检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。

实施例3

一、提取RNA

同实施例2的步骤一。

二、环介导等温扩增

上述反应管同时在水浴锅上65℃放置60分钟，取出。

三、检视

实施例4

一、提取RNA

同实施例2的步骤一。

二、环介导等温扩增

上述反应管同时在水浴锅上63℃放置45分钟，取出。

三、检视

实施例5

一、提取RNA

同实施例2的步骤一。

二、环介导等温扩增

在3支装有24 μL的LAMP反应液的反应管中各加入1μL步骤一得到病鸡的RNA样品，作为检测组1；在3支装有24 μL的LAMP反应液的反应管中各加入1μL步骤一得到健康鸡的RNA样本，作为检测组2；在3支装有24 μL的LAMP反应液的反应管中各加入1μL阳性对照，作为阳性对照组；在3支装有24 μL的LAMP反应液的反应管中各加入1μL灭菌双蒸水，作为阴性对照组。

上述反应管同时在水浴锅上65℃放置30分钟，取出。

三、检视

检测灵敏度及特异性评价

一、灵敏度

制备10¹⁰ 拷贝/μL、10⁹拷贝/μL、10⁸拷贝/μL、10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL、10⁰拷贝/μL含禽传染性支气管炎病毒5a-5b基因的质粒样本。采用实施例1制备的检测试剂盒对质粒样本进行检测。

1、质粒的制备

提取禽传染性支气管炎病毒的RNA，反转录得到DNA，应用RT-PCR方法扩增得到此毒株的5a-5b基因片段。再与T载体连接后即得到含5a-5b基因的质粒，一个质粒分子对应一个拷贝的5a-5b基因。将质粒转入感受态细胞，在合适的条件下培养感受态细胞，质粒可随着感受态细胞的繁殖而复制。最后从感受态细胞中提取纯化5a-5b基因质粒。

得到的质粒可通过分光光度计法测定并计算拷贝数浓度。用双蒸水将质粒稀释到所需要的浓度，即10¹⁰ 拷贝/μL、10⁹拷贝/μL、10⁸拷贝/μL、10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL、10⁰拷贝/μL。检测时加入各浓度质粒1μL。 (可参考《分子克隆试验指南》第三版，所需要的试剂和仪器均为市面可购买的。)

2、禽传染性支气管炎病毒检测试剂盒的应用

分别对上述各浓度的质粒样本进行检测，检测步骤如下：

(1)环介导等温扩增

取步骤一得到10¹⁰ 拷贝/μL、10⁹拷贝/μL、10⁸拷贝/μL、10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL、10⁰拷贝/μL的质粒样本各1μL，分别加至3支检样管中，每管再加入 24μL的LAMP反应液，分别作为检测组1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。用相同体积的灭菌双蒸水代替质粒样本同法制备阴性对照，另取3支阳性对照，加入24μL的LAMP反应液。

上述检样管同时在水浴锅上63℃放置60分钟，调水浴锅温度到80℃反应2min，取出。

(2)直接检视

结果表明，阳性对照组的三个反应管均有亮绿色可见荧光，阴性对照组的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。检测组1的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组2的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组3的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组4的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组5的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组6的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组7的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组8的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组9的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组10的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组11的三个反应管均有亮绿色可见荧光，阴性对照的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。

可见，本发明的禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒可检测出1个拷贝/μL的RNA，检测灵敏度很高，可以对禽传染性支气管炎病毒进行精确的检测。

二、特异性

提取禽传染性支气管炎病毒RNA样本，并以新城疫病毒La Sota株（Newcastle Disease Virus, NDV)、H9N2亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)、禽呼肠孤病毒（Avian reovirus, ARV）、传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV）、减蛋综合症病毒（Egg Drop Syndrome Virus，EDS）、大肠埃希菌(E.coli )为对照病原，采用实施例1制备的检测试剂盒对禽传染性支气管炎病毒RNA样本和对照病原核酸进行特异性检测。

1、核酸的提取

(1)提取RNA

提取禽传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽呼肠孤病毒的RNA，步骤同实施例2的步骤一。

（2）提取DNA

提取传染性喉气管炎病毒、减蛋综合症病毒和大肠埃希菌的DNA。取3种病原液体培养物进行核酸DNA的提取，步骤如下：

取500μL培养液加入25μL10％的SDS和10μL 20mg/mL的蛋白酶K，震荡均匀；56℃条件下水浴2小时；加入200μL Tris饱和酚，混匀后12000rpm离心10min；取上层水相，加入100μL Tris饱和酚和100μL 氯仿，混匀，12000rpm离心10min；将上层水相转移到新的离心管中，加入200μL 氯仿，振荡， 12000rpm离心10min；转移上层水相到一新的离心管，加入等体积的异丙醇，-20℃冰冻10分钟后12000rpm离心10min；弃上清，加入500μL 70%乙醇， 12000rpm离心2min；弃上清，室温放置30min后加入50μL水溶解DNA。

2、分别对上述病原样本核酸进行检测，检测步骤如下：

(1)环介导等温扩增

取步骤一得到的H9N2亚型禽流感病毒、新城疫病毒、禽呼肠孤病毒、禽传染性支气管炎病毒的RNA和传染性喉气管炎病毒、减蛋综合症病毒、大肠埃希菌的DNA各1μL，分别加至3支检样管中，每管再加入 24μL的LAMP反应液（传染性喉气管炎病毒、减蛋综合症病毒、大肠埃希菌DNA的检测管则用水代替其中的AMV），分别作为检测组1、2、3、4、5、6、7。用相同体积的灭菌双蒸水代替核酸样本同法制备阴性对照，另取3支阳性对照，加入24μL的LAMP反应液。

上述检样管同时在水浴锅上65℃放置60分钟，调水浴锅温度到80℃反应2min，取出。

(2)直接检视

结果表明，阳性对照组的三个反应管均有亮绿色可见荧光，阴性对照组的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。检测组1的三个反应管均为棕黄色无荧光液体，检测组2的三个反应管均为棕黄色无荧光液体，检测组3的三个反应管均为棕黄色无荧光液体，检测组4的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组5的三个反应管均为棕黄色无荧光液体，检测组6的三个反应管均为棕黄色无荧光液体，检测组7的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。

可见，本发明的禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒对新城疫病毒La Sota株（Newcastle Disease Virus, NDV)、H9N2亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)、禽呼肠孤病毒（Avian reovirus, ARV）、传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV）、减蛋综合症病毒（Egg Drop Syndrome Virus，EDS）、大肠埃希菌(E.coli )均无扩增，具有很好的特异性，可以对禽传染性支气管炎病毒进行准确检测。

<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>环介导等温扩增禽传染性支气管炎病毒的引物、禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒及检测方法

<160>7

<210>1

<211>443

<212>DNA

<213>禽传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus，IBV）

<220>

<223>

<440>1

atgaaatggc tgactagttt tggaagagca gttatttcat gttataaagc cctattatta 60

actcaattaa gagtgttaga taggttaatt ttaggtcacg gaccaaaacg cgttttaacg 120

tgtagtaggc gagtgctttt gtttcagtta gatttagttt ataggttggc gtttacgccc 180

acccaatcgc tggtatgaat aatagtaaag ataatccttt tcgcggagca atagcaagaa 240

aagcgcgaat ttatctgaga gaaggattag attgtgttta ctttcttaac aaagcaggac 300

aagcagagcc ttgtcccgcg tgtacctctc tagtattcca agggaaaact tgtgaggaac 360

atatatataa taataacctt ttgtcatggc aagcggtaag gcaactggaa agacagacgc 420

cccagcgcca gtcatcaaac tag 443

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<440>2

TTAGATTTAG TTTATAGGTT GG 22

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<440>3

CCTTACCGCT TGCCATGA 18

<210>4

<211>52

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<440>4

AACACAATCT AATCCTTCTC TCATTTTGTA TGAATAATAG TAAAGATAAT CC 52

<210>5

<211>49

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<440>5

TACTTTCTTA ACAAAGCAGG ACATTTTTCA CAAGTTTTCC CTTGGAATA 49

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<440>6

CTTTTCTTGC TATTGCTCC 19

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<440>7

CAGAGCCTTG TCCCGCGT 18

Claims

1.一种禽传染性支气管炎病毒的检测试剂盒，其特征在于包括环介导等温扩增反应液，环介导等温扩增反应液中含有三对特异性引物，引物序列如下：

外侧引物对：

上游引物F3：5’-TTAGATTTAGTTTATAGGTTGG-3’,

下游引物B3： 5’-CCTTACCGCTTGCCATGA-3’,

内侧引物对:

上游引物FIP：

5’-AACACAATCTAATCCTTCTCTCATTTTGTATGAATAATAGTAAAGATAATCC-3’,

下游引物BIP：

5’-TACTTTCTTAACAAAGCAGGACATTTTCACAAGTTTTCCCTTGGAATA-3’,

环形引物对:

上游引物LF：5’-CTTTTCTTGCTATTGCTCC-3’,

下游引物LB： 5’-CAGAGCCTTGTCCCGCGT-3’，

外侧引物对、内侧引物对、环形引物对的摩尔比为1:8:4；

每24μL环介导等温扩增反应液中含有外侧引物对上游引物和下游引物各5pmol，内侧引物对上游引物和下游引物各40pmol，环形引物对上游引物和下游引物各20pmol。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于每24μL环介导等温扩增反应液中还含有Tris-HCl 20mM、KCl 10mM、(NH₄)₂SO₄10mM、MgSO₄ 4-16mM、Tween20 0.1%、钙黄绿素0.05 mM、MnCl₂ 0.6mM、AMV反转录酶 0.2U、甜菜碱 0.8M、脱氧核苷酸dNTPs 1.4mM、Bst聚合酶8U。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，特征在于每24μL环介导等温扩增反应液中还含有Tris-HCl 20mM、KCl 10mM、(NH₄)₂SO₄10mM、MgSO₄ 8mM、Tween20 0.1%、钙黄绿素0.05 mM、MnCl₂ 0.6mM、AMV反转录酶 0.2U、甜菜碱 0.8M、脱氧核苷酸dNTPs 1.4mM、Bst聚合酶8U。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，特征在于所述的检测试剂盒中还包括荧光显色剂。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，特征在于荧光显色剂为钙黄绿素和MnCl₂。