CN101016570B - H5亚型禽流感病毒核酸检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
H5亚型禽流感病毒核酸检测方法及其试剂盒，涉及一种病毒。提供一种操作简便、实验可靠性高、可进行实时检测、灵敏度高、特异性好、周期短的H5亚型禽流感病毒核酸检测方法和试剂盒。步骤：1)寻求H5亚型禽流感病毒特有的保守序列作为待测靶基因；2)设计合成一对特异性引物，引物长度为18-30bp；3)根据保守序列设计合成一对Y型双链特异性荧光探针；4)使用步骤2中的一对特异性引物和步骤3中的Y型双链特异性荧光探针及PCR成份组成20μL荧光PCR反应体系的检测溶液，将荧光PCR反应体系的检测溶液装入PCR反应管；5)设置阳性对照模板和阴性对照模板，进行实时荧光PCR反应，获得检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒，尤其是涉及一种采用Y型双链荧光探针技术对H5亚型禽流感病毒进行检测的方法及其试剂盒。
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的禽类全身性或呼吸器官性发病的传染性疾病。根据禽流感病毒的致病性强弱，禽流感可分为高致病性禽流感(HPAI)、低致病性禽流感(LPAI)和无致病性禽流感(NPAI)3种。其中高致病性禽流感已被我国《家畜家禽防疫条例》和国际兽医局动物流行病组织(OIE)规定为A类烈性传染病。
在1997年香港禽流感事件中，禽流感病毒首次突破种间屏障感染人致死，这赋予高致病力毒株全新的公共卫生学意义(参见文献：①Sims LD，Ellis TM，Liu KK，et al.Avianinfluenza in Hong Kong 1997-2002[J].Avian Dis，2003，47(3Suppl)：832-838；②GuanY，Poon LL，Cheung CY，et al.H5N1influenza：a protean pandemic threat[J].ProcNatl Acad Sci U S A，2004，101(21)：8156-8161；③Suarez DL，Perdue ML，Cox N，etal.Comparisons of highly virulent H5N1influenza A viruses isolated from humansand chickens from Hong Kong[J].J Virol，1998，72(8)：6678-6688.)。2003年底，东亚、东南亚禽流感来势凶猛，传播速度快，覆盖面广，疫情对我国大陆迅速形成包围态势(参见文献：①Li KS，Guan Y，Wang J，Smith GJ，et al.Genesi s of a highly pathogenicand potentially pandemic H5N1influenza virus in eastern Asia[J].Nature，2004，430(6996)：209-213；②Perkins LE，Swayne DE.Pathogenicity of a Hong Kong-originH5N1highly pathogenic avian influenza virus for emus，geese，ducks，and pigeons[J].Avian Dis，2002，46(1)：53-63.)。2003年底至2004年初亚洲各国特别是越南和泰国的H5N1感染人事件，更突出地显示了禽流感的公共卫生意义，HPAI对养禽业生产和人类的健康构成了更大的威胁。最近高致病性禽流感在东北亚及我国部分地区暴发流行，使养禽业遭到巨大损失，并危及到人类的健康(参见文献：①Capua I，Alexander DJ.Avianinfluenza and human health[J].Acta Trop，2002，83(1)：1-6；②Yuanji G.Influenzaactivity in China：1998-1999[J].Vaccine，2002，15；20Suppl 2：S28-S35；③BrownH.WHO confirms human-to-human avian flu transmission ???J 」.Lancet，2004，363(9407)：462；④)Mase M，Tsukamoto K，Imada T,et al.Characterization of H5Nl influenza Aviruses i solated during the 2003-2004influenza outbreaks in Japan[J].Virology，2005，332(1)：167-176.)。
根据流行病学、临床症状、剖检变化及组织病变等可作出初步诊断，但禽流感的症状和病变不是特征性的，很难与鸡新城疫病相区别，而当禽流感仅表现为呼吸道和生殖道症状或病变时，也易与鸡传染性支气管炎等病相混淆(参见文献：①Swayne DE，King DJ.Avianinfluenza and Newcastle disease[J].J Am Vet Med Assoc，2003，222(11)：1534-1540；②Alexander DJ.The epidemiology and control of avian influenza and Newcastle disease[J].J Comp Pathol，1995，112(2)：105-126.)，所以，确诊禽流感必须进行实验室诊断。实验室诊断琼脂扩散法(AGP)是检测禽流感病毒的常规方法(参见文献：①Swayne DE，PerdueML，Garcia M，et al.Pathogenicity and diagnosis of H5N2Mexican avian influenzaviruses in chickens[J].Avian Dis，1997，41(2)：335-346；②林祥梅，赵连增，田国斌，等.间接ELISA、HI及AGP检测鸡血清抗AIV抗体的敏感性比较[J].中国兽医学报，1998，18(5)：454-456.)，优点是简单、方便，不需昂贵的仪器设备；缺点是灵敏度不高，当抗体水平下降到一定程度时，将会呈现阴性反应，或出现假阳性结果(参见文献：①ShaferAL，Katz JB，Eernisse KA.Development and validation of a competitive enzyme-linkedimmunosorbent assay for detection of type A influenza antibodies in avian sera[J].Avian Dis，1998，42(1)：28-34；②Lu H.A longitudinal study of a noveldot-enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian influenza virus[J].Avian Dis，2003，47(2)：361-369；③Jin M，Wang G，Zhang R，et al.Development ofenzyme- linked immunosorbent assay with nucleoprotein as antigen for detection ofantibodies to avian inf
核酸序列分析方法是一种更准确可行的方法，特别是它能从分子水平揭示HPAI病毒甚至潜在的HPAI病毒毒株(参见文献：①Shan S，Ko LS，Collins RA，et al.Comparison ofnucleic acid-based detection of avian influenza H5N1with virus isolation[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，302(2)：377-383；②Lau LT，Banks J，Aherne R，etal.Nucleic acid sequence-based amplification methods to detect avian influenzavirus[J].Biochem Biophys Res Commun，2004，313(2)：336-342.)。随着PCR技术的发展和序列分析技术的改进，使这一方法变得越来越容易、可靠。PCR技术的应用也成为诊断学上的一项重大突破，但由于传统的PCR检测易污染、假阳性率高等原因而在检测领域受到了限制(参见文献：①Suarez DL，Spackman E，Senne DA，et al.The effect of variousdisinfectants on detection of avian influenza virus by real time RT-PCR[J].AvianDis，2003，47(3Suppl)：1091-1095；②Morris T，Robertson B，Gallagher M.Rapid reversetranscription-PCR detection of hepatitis C virus RNA in serum bv using the TaqManfluorogenic detection system[J].J Clin Microbiol.1996，34(12)：2933-2936.)。为了克服传统PCR的上述缺点，发挥该技术早期、快速诊断的优点，近年来，发展了多种将传统PCR技术与其他技术结合起来的新型PCR技术，最成功的有PCR与ELlSA相结合的PCR—ELISA技术(参见文献：①Munch M，Nielsen LP，Handberg KJ，et al.Detection andsubtyping(H5and H7)of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCRand PCR-ELISA[J].Arch Virol，2001，146(1)：87-97；②Puppe W，Weigl JA，Aron G，et al.Evaluation of a multiplex reverse transcriptase PCR ELISA for the detectionof nine respiratory tract pathogens[J].J Clin Virol，2004,30(2)：165-174.)和PCR与荧光检测相结合的实时荧光PCR技术(参见文献：①Heid C A，Stevens J，Livak JK，et al.Real time quantitative PCR[J].Genome Res，1996，6(10)：986-994；②SaundersNA.Real-time PCR[J].Methods Mol Biol，2004，266∶191-211.)。它们不仅克服了传统PCR的缺点，而且具有简单、易操作，结果直观、可靠、重复性好、特异性强、定量准确等优点。其中荧光PCR技术可以实时、在线检测PCR扩增过程而无需对PCR扩增产物进行后处理，从而彻底克服了传统PCR技术易污染的缺点，因而成为检测领域中越来越重要的一种检测手段。
发明内容
本发明旨在针对现有的禽流感病毒H5亚型检测方法所存在的鉴定慢、灵敏度低、特异性差和难以适应流行时快速诊断等问题，提供一种操作简便、实验可靠性高、可进行实时检测、灵敏度高、特异性好、周期短的H5亚型禽流感病毒核酸检测方法。
本发明的另一目的是提供一种用于上述检测方法的试剂盒。
本发明采用的技术方案是应用新型的Y型荧光探针技术，针对高致病力禽流感H5亚型HA基因保守的裂解位点设计用于实时荧光PCR检测的Y型荧光探针和检测引物。
本发明所述的H5亚型禽流感病毒核酸检测方法包括以下步骤：
1)寻求H5亚型禽流感病毒特有的保守序列作为待测靶基因，保守序列为：
catt ccacaacata caccctctca ccatcgggga gtgccccaaa tatgtgaaat caaacagatt
agtccttgcg actggactca gaaatacccc tcaaagagag agaagaagaa aaaagagagg actatttgga
gctatagcag gttttataga gggaggatgg cagggaatgg tagatggttg；
2)设计合成一对H5亚型禽流感病毒特异性引物，引物长度在18-30bp之间，一对H5亚型禽流感病毒特异引物序列为：
上游引物：5＇-CAT TCC ACA ACA TAC ACC C-3’19bp Tm＝50.7℃，
下游引物：5＇-CAA CCA TCT ACC ATT CCC T-3’19bp Tm＝51.7℃：
3)根据保守序列设计合成一对Y型双链特异性荧光探针，具体要求如下：
a.Y型双链特异性荧光探针的长度为18～30bp，退火温度为50～70℃；
b.标记荧光剂的链与保守序列完全匹配，另一条链标记淬灭剂；
c.两条链的3’端为了防止引发扩增反应需要封闭；
d.两条链的一个末端存在碱基完全不匹配，不匹配的碱基长度为2～10bp；
4)使用步骤2中的一对特异性引物和步骤3中的Y型双链特异性荧光探针及PCR成份组成20μL荧光PCR反应体系的检测溶液，将荧光PCR反应体系的检测溶液装入PCR反应管，每一PCR反应管中的成份包括1.5～4.0mM MgCl2，0.1～3mM dNTPs，1～3U Taq酶，0.2～0.5U反转录酶，上下游引物各为0.2～0.6μM，2μl 10×PCR缓冲液，荧光剂标记探针0.05～0.3μM，粹灭剂标记探针0.06～0.36μM；
5)设置阳性对照模板和阴性对照模板，进行实时荧光PCR反应，获得检测结果，阳性对照模板为包含保守序列的MS2噬菌体，阴性对照模板为灭菌后的无离子水，实时荧光PCR反应的条件为42℃反转录15～30min，94℃预变性3～8min后进入循环，循环程序为94℃变性15～30s，51℃退火15～30s，72℃延伸15～30s，共进行35～45个循环，每次循环在退火阶段采集荧光数据。
在步骤1中，保守序列的长度最好在100-250bp。
在步骤2中，H5亚型禽流感病毒特异性引物的反应浓度最好为0.4μM。
在步骤3中，所述的Y型双链荧光探针，与靶基因完全匹配链的5’端用荧光剂标记，3’端磷酸化封闭；所述的另一条链的3’端用Dabcyl粹灭剂封闭，与荧光剂标记的链有5个碱基不互补：所述的一对Y型双链特异性荧光探针序列最好为：
与保守序列完全互补链：
FAM-5＇-CCT CTC TTT TTT CTT CTT CTC TCT C-3＇-phosphorylation，
不完全互补链：
5＇-CTC TCA GAA GAA GAA AAA AGA GAG G-3＇-Dabcyl。
在步骤4中，在每个反应管的荧光PCR反应体系的检测溶液中MgCl2的最佳浓度为3.75mM，dNTPs的最佳浓度为0.2mM，Taq酶最佳用量为1.8U。，反转录酶的最佳用量为0.3U。
在步骤5中，实时荧光PCR反应的最优条件为42℃反转录20min使样品RNA反转录为cDNA，94℃预变性3min后进入循环，循环程序为94℃变性15s，51℃退火20s，72℃延伸20s，共进行40个循环，每次循环在退火阶段采集荧光数据。
应用本发明所述的H5亚型禽流感病毒核酸检测方法进行H5亚型禽流感病毒的Y型双链探针核酸检测的试剂盒设有盒体、垫体和盒盖，垫体设于盒体内，垫体上设有至少可分别隔离放置5个离心管的凹槽，5个离心管分别装有Taq酶、反转录酶、阴性对照模板、阳性对照模板和荧光PCR反应体系的检测溶液，荧光PCR反应体系的检测溶液包括MgCl2、dNTPs、10×PCR缓冲液、引物、探针。
试剂盒中的荧光PCR反应体系的检测溶液最好保存于-20℃冰箱。
与现有的禽流感病毒H5亚型检测方法相比，本发明具有以下突出的优点：
1)方便快捷：应用荧光探针技术和实时监控技术，PCR反应时间可以控制在30～35min，并且省去了凝胶电泳观测PCR结果的繁琐步骤，使得从获得材料(主要指禽肉或血液)到得到检测结果可以在2h内完成。
2)灵敏度高：反应具有很高的灵敏性，在实时荧光PCR反应中可以检测出浓度为0.342×10-4μg/μL的病毒RNA。
3)特异性好：应用特异的上下游引物扩增目的片断，再通过高度特异的Y型双链探针进行实时检测，可以证明所检测的禽流感病毒是否为H5亚型禽流感病毒。
附图说明
图1为本发明实施例的试剂盒结构示意图。
图2为本发明实施例的Y型荧光探针对H5亚型禽流感病毒的实时荧光PCR检测结果。在图2中，横坐标为循环数Cycle Number，纵坐标为荧光强度Fluorescence，曲线A、B、C分别对应于阳性对照、H5亚型禽流感病毒和空白对照。
图3为本发明实施例的Y型荧光探针对H5和H9亚型禽流感病毒的实时荧光PCR检测结果。在图3中，横坐标为循环数Cycle Number，纵坐标为荧光强度Fluorescence，曲线A、B、C分别对应于H5亚型禽流感病毒、阳性对照和H9亚型禽流感病毒。
图4为本发明实施例Y型荧光探针检测H5亚型禽流感病毒RNA的标准曲线。在图4中，横坐标为H5亚型禽流感病毒的浓度Concentration，纵坐标为循环数CT，回归曲线y＝-3.543x+24.276，相关系数为R2＝0.99684。
具体实施方式
实施例1：
1)寻求H5亚型禽流感病毒特有的保守序列作为待测靶基因，保守序列的长度在100-250bp，保守序列为：
catt ccacaacata caccctctca ccatcgggga gtgccccaaa tatgtgaaat caaacagatt
agtccttgcg actggactca gaaatacccc tcaaagagag agaagaagaa aaaagagagg actatttgga
gctatagcag gttttataga gggaggatgg cagggaatgg tagatggttg。
2)设计合成一对H5亚型禽流感病毒特异性引物，引物长度在18～30bp之间，退火温度为50～60℃，一对H5亚型禽流感病毒特异引物序列为：
上游引物：5＇-CAT TCC ACA ACA TAC ACC C-3’19bp Tm＝50.7℃，
下游引物：5＇-CAA CCA TCT ACC ATT CCC T-3’19bp Tm＝51.7℃：
H5亚型禽流感病毒特异性引物的最佳反应浓度为0.4μM。
3)根据保守序列设计合成一对Y型双链特异性荧光探针，具体要求如下：
a.Y型双链特异性荧光探针的长度为18～30bp，退火温度为50～70℃；
b.标记荧光剂的链与保守序列完全匹配，另一条链标记淬灭剂；
c.两条链的3’端为了防止引发扩增反应需要封闭；
d.两条链的一个末端存在碱基完全不匹配，不匹配的碱基长度为2～10bp；
所述的Y型双链荧光探针，与靶基因完全匹配链的5’端用荧光剂标记，3’端磷酸化封闭；所述的另一条链的3’端用Dabcy1粹灭剂封闭，与荧光剂标记的链有5个碱基不互补：所述的一对Y型双链特异性荧光探针序列最好为：
与保守序列完全互补链：
FAM-5＇-CCT CTC TTT TTT CTT CTT CTC TCT C-3＇-phosphorylat i on，
不完全互补链：
5＇-CTC TCA GAA GAA GAA AAA AGA GAG G-3＇-Dabcy1。
4)使用步骤2中的一对特异性引物和步骤3中的Y型双链特异性荧光探针及PCR成份组成20μL荧光PCR反应体系的检测溶液，将荧光PCR反应体系的检测溶液装入PCR反应管，每一PCR反应管中的成份包括1.5～4.0mM MgCl2，0.1～3mM dNTPs，1～3U Taq酶，0.2～0.5U反转录酶，上下游引物各为0.2～0.6μM，2μ110×PCR缓冲液，荧光剂标记探针0.05～0.3μM，粹灭剂标记探针0.06～0.36μM。
5)设置阳性对照模板和阴性对照模板，进行实时荧光PCR反应，获得检测结果，阳性对照模板为包含保守序列的MS2噬菌体，阴性对照模板为灭菌后的无离子水，实时荧光PCR反应的条件为42℃反转录15～30min，94℃预变性3～8min后进入循环，循环程序为94℃变性15～30s，51℃退火15～30s，72℃延伸15～30s，共进行35～45个循环，每次循环在退火阶段采集荧光数据。
实施例2：
与实施例1类似，其区别在于在步骤4)中，在每个反应管的荧光PCR反应体系的检测溶液中MgC12的最佳浓度为3.75mM，dNTPs的最佳浓度为0.2mM，Taq酶最佳用量为1.8U。，反转录酶的最佳用量为0.3U。在步骤5)中，实时荧光PCR反应的最优条件为42℃反转录20min使样品RNA反转录为cDNA，94℃预变性3min后进入循环，循环程序为94℃变性15s，51℃退火20s，72℃延伸20s，共进行40个循环，每次循环在退火阶段采集荧光数据。
实施例3：
与实施例1类似，其区别在于Y型荧光探针对H5亚型禽流感病毒的实时荧光PCR检测，取1μl样品加入到检测试剂盒的检测溶液中，终体积为20μl。实时荧光PCR的反应程序：42℃反转录20min，94℃预变性3min后进入循环，循环程序为94℃变性15s，51℃退火20s，72℃延伸20s，共进行40个循环，每次循环在退火阶段采集荧光数据。(参见图2)
实施例4：
与实施例1类似，其区别在于Y型荧光探针对H9亚型禽流感病毒，H5亚型禽流感病毒的检测，分别取H9亚型禽流感病毒，H5亚型禽流感病毒样品各1μl加入检测溶液按照实施程序的方法进行实时荧光PCR反应，荧光强度有升起，代表了阳性结果.(参见图3)
实施例5：
与实施例1类似，其区别在于Y型荧光探针对不同浓度梯度H5亚型禽流感病毒RNA的检测，将已知浓度的阳性样品按10-1，10-2，10-3，10-4，10-5等梯度稀释，分别取各个梯度的样品1μl加入检测溶液按照实施程序的方法进行实时荧光PCR反应，不同梯度的样品的荧光强度在不同的循环数升起。由此可以判断试剂盒的灵敏度。0.342×10-1μg/μL到0.342×10-5μg/μL做梯度检测，可以从浓度为0.342×10-4μg/μL的样品中取1μ1即可检测出阳性。(参见图4)
实施例6
如图1所示，所述的H5亚型禽流感病毒核酸检测方法进行H5亚型禽流感病毒的Y型双链探针核酸检测的试剂盒设有设有盒体8、垫体7和盒盖6，垫体7设于盒体8内，垫体7上设有至少可分别隔离放置5个离心管1～5的凹槽，5个离心管1～5分别装有Taq酶、反转录酶、阴性对照模板、阳性对照模板和荧光PCR反应体系的检测溶液，荧光PCR反应体系的检测溶液包括MgCl2、dNTPs、10×PCR缓冲液、引物、探针。
序列表
H5亚型禽流感病毒特有的保守序列作为待测靶基因，最佳序列如下：
catt ccacaacata caccctctca ccatcgggga gtgccccaaa tatgtgaaat caaacagatt
agtccttgcg actggactca gaaatacccc tcaaagagag agaagaagaa aaaagagagg actatttgga
gctatagcag gttttataga gggaggatgg cagggaatgg tagatggttg
设计合成一对5亚型禽流感病毒特异性引物，引物序列为：
上游引物：5＇-CAT TCC ACA ACA TAC ACC C-3’19bp Tm＝50.7℃，
下游引物：5＇-CAA CCA TCT ACC ATT CCC T-3’19bp Tm＝51.7℃：
一对Y型双链特异性荧光探针序列最好为：
与保守序列完全互补链：
FAM-5＇-CCT CTC TTT TTT CTT CTT CTC TCT C-3＇-phosphorylation，
不完全互补链：
5＇-CTC TCA GAA GAA GAA AAA AGA GAG G-3＇-Dabcy1。
Claims (1)
1.H5亚型禽流感病毒的Y型双链探针核酸检测的试剂盒，其特征在于设有盒体、垫体和盒盖，垫体设于盒体内，垫体上设有至少可分别隔离放置5个离心管的凹槽，5个离心管分别装有Taq酶、反转录酶、阴性对照模板、阳性对照模板和荧光PCR反应体系的检测溶液，荧光PCR反应体系的检测溶液包括MgCl2、dNTPs、10×PCR缓冲液、引物、探针；
所述阳性对照模板为包含保守序列的MS2噬菌体，所述保守序列为：
catt ccacaacata caccctctca ccatcgggga gtgccccaaa tatgtgaaat caaacagattagtccttgcg actggactca gaaatacccc tcaaagagag agaagaagaa aaaagagagg actatttggagctatagcag gttttataga gggaggatgg cagggaatgg tagatggttg；
所述阴性对照模板为灭菌后的无离子水；
所述荧光PCR反应体系的检测溶液包括MgCl2、dNTPs、10×PCR缓冲液、引物、探针；
所述引物为一对H5亚型禽流感病毒特异性引物，引物长度在18～30bp之间，一对H5亚型禽流感病毒特异引物序列为：
上游引物：5′-CAT TCC ACA ACA TAC ACC C-3’19bp Tm＝50.7℃，
下游引物：5′-CAA CCA TCT ACC ATT CCC T-3’19bp Tm＝51.7℃；
所述探针是根据保守序列设计合成的一对Y型双链特异性荧光探针，具体要求如下：
a.Y型双链特异性荧光探针的长度为18～30bp，退火温度为50～70℃；
b.标记荧光剂的链与保守序列完全匹配，另一条链标记淬灭剂；
c.两条链的3’端为了防止引发扩增反应需要封闭；
d.两条链的一个末端存在碱基完全不匹配，不匹配的碱基长度为2～10bp。
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