KR20020063070A - Ｈｌａ-ｂ27 유전자 검출용 키트 및 그 검출방법 - Google Patents

Ｈｌａ-ｂ27 유전자 검출용 키트 및 그 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간편하고 신속하며 개량된 특이도와 민감도를 갖는 HLA-B27 핵산을 검출하는데 사용되는 키트 및 상기의 키트를 이용하여 HLA-B27 핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이온교환수지를 포함하는 DNA 추출액 및 피시알 마스터혼합액을 포함하는 HLA-B27 검출용 키트 및 상기 키트를 이용한 HLA-B27 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＨＬＡ-Ｂ27 유전자 검출용 키트 및 그 검출방법{Kit for detecting HLA-B27 and detection method thereof}
본 발명은 핵산증폭방법 (Polymerase Chain Reaction: PCR) 을 사용하여 샘플내의 핵산을 검출하는 키트 및 그 키트를 사용한 핵산검출방법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 PCR방법을 사용하여 HLA-B27 유전자를 검출하는 키트 및 그 검출방법에 관한 것이다.
인간 루코사이트 항원(Human Leukocyte Antigen;이하 'HLA'라 함)유전자는 인간의 6번 염색체에 위치하며 사람이 가지고 있는 많은 유전자 중에서 유전적 다형성 (genetic polymorphism)이 가장 높고 각종 면역세포의 표면에 발현되어 인체의 면역반응에 깊이 관여한다. 특히 골수이식이나 장기이식, 유전자 개인식별, 인종연구 및 질병과의 HLA 유전자의 관련성분석 등 임상의과학 분야에서 HLA유전자의 활용이 증가하고 있다. HLA유전자와 질환과의 관련성은 여러 연구에서 보고되고 있는데, 인슐린의존성 당뇨병과 HLA-DQB 유전자, 수면병과 DRB1*1501, DQB1*0602, 강직성 척수염과 HLA-B27유전자 등이 대표적인 예이다.
강직성 척추염이란 류마티스 질환의 일종으로 척추 관절과 엉덩이 쪽 관절에 염증을 일으키는 것이 특징이며, 16세와 35세 사이의 남자들에게 주로 발생한다. 이외에 무릎, 발목, 발가락, 골반, 갈비뼈 등과 같은 다른 관절에도 염증 변화를 일으킬 수 있다. 이 질환의 원인은 아직 정확히 알려져 있지 않지만 강직성 척추염 환자의 90% 정도에서 HLA-B27이라는 유전자를 가지고 있음이 밝혀졌으며, 이 유전자를 가지고 있다는 사실이 반드시 강직성 척추염을 발병한다는 의미는 아니지만, 이 유전자를 가진 사람은 다른 유전자를 가진 사람보다 강직성 척추염이 생길 가능성이 높다.
HLA-B27 유전자형 판별방법으로는 비교적 검사절차가 단순한 혈청학적 방법이 최근까지 세계적으로 널리 이용되어 왔다. 이 방법은 임파구 표면에 있는 HLA분자가 동종 항체와 항원-항체 반응을 일으킬 경우 첨가한 보체에 의해 세포막 손상이 생겨 세포가 사멸하게 되는 것을 원리로 한 미세임파구 독성검사법으로서 항상 신선한 검사혈액이 필요하고 시간이 오래 걸리며, 숙련된 기술이 요구되어 일반 검사실에서 사용하기는 어렵다. 또한 유속세포측정법 (Flowcytometry)으로도 측정이 가능하나, 고가의 장비가 필요하고 검사가격도 높아 널리 이용되지 못하고 있다.
1985년 Saiki가 소량의 특정 DNA단편을 단시간 내에 대량으로 증폭하는 PCR법을 개발한 이래 그 특이성과 감도가 우수함을 인정받게 됨에 따라 각종 유전질환의 진단이나, 병원성세균감염증의 진단 등에 응용하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. PCR을 이용한 HLA-B27 유전자의 분석은 혈액검체의 DNA를 분리하여, HLA-B27 특정 프라이머와 내부 대조군용으로 β-globin에 특이한 프라이머로 동시에 증폭한 후 전기영동을 하여 HLA-B27 유전자의 유무를 판정하는 방법이다. HLA-B27 PCR 진단방법은 민감도가 높고 신속히 검사할 수 있으므로 최근 임상적으로 활용이 증가하고 있다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 간편하고 신속하며 개량된 특이도와 민감도를 갖는 HLA-B27 핵산을 검출하는데 사용되는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 키트를 이용하여 HLA-B27 핵산을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 HLA-B27 PCR 산물(150 bp) 및 β-글로빈 PCR 산물(268 bp)를 확인한 사진.
도 2는 본 발명 키트의 특이도를 나타낸 사진. 도 2에서 레인 1는 Phage 174 DNA/HaeIII 분자량 마커, 레인 2는 음성 대조군, 레인 3는 HLA B-27, 레인 4는 HLA B-40, 레인 5는 HLA B-41, 레인 6는 HLA B-42, 레인 7은 HLA-B44, 레인 8은 HLA B-38, 레인 9는 HLA B-35를 나타낸다.
도 3은 본 발명 키트의 민감도를 나타낸 사진. 도 3에서 레인 1은 Phage 174 DNA/HaeIII 분자량 마커, 레인 2는 1 ng, 레인 3은 100 pg, 레인 4는 10 pg, 레인 5는 1 pg, 레인 6은 100 fg, 레인 7은 10 fg, 레인 8은 1 fg, 레인 9는 0.1 fg의 DNA를 나타낸다.
도 4는 타사의 키트와 본 발명 키트를 비교한 사진. M은 사이즈 마커, 1에서 4레인은 본 발명의 키트이고, 5에서 8레인은 타사의 키트를 사용한 것.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 이온교환수지를 포함하는 DNA 추출액 및 피시알 마스터혼합액을 포함하는 HLA-B27 검출용 키트를 제공한다.
상기 이온교환수지는 약산성 이온교환수지가 바람직하고, Chelex 100 레진이 더욱 바람직하다. 또 피시알 마스터혼합액은 증류수, 완충액, dNTP, HLA-B27와 β-글로빈의 프라이머 및TaqDNA 중합효소와 우라실 DNA 글리코시레이즈의 혼합효소액 및 크레졸을 을 포함하고 있으며, 상기 HLA-B27 프라이머 세트는 서열목록 1 및 2에 기재된 염기서열을 갖는 것이 바람직하고, 상기 β-글로빈 프라이머 세트는 서열목록 3 및 4에 기재된 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.
또 본 발명은 샘플에 상기의 DNA 추출시약 및 피시알 마스터 혼합액을 처리한 후 피시알을 수행하는 단계 및 HLA-B27의 존재를 젤을 통하여 확인하는 단계를 포함하는 HLA-B27를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 프라이머선택 부위는 HLA B27 엑손 2 유전자 영역이고, 특이 프라이머의 염기배열은 표 1과 같다.
[표 1] HLA-B27 특이 프라이머 염기배열
프라이머 염 기 배 열
HLA B27 Sense GCTAC GTGGA CGACA CGCT
Antisense CTCGG TCAGT CTGTG CCTT
β-글로빈 Sense GAAGA GCCAA GGACA GGTAC
Antisense CAACT TCATC CACGT TCACC
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예: 키트 구성성분의 제조
1) PCR 마스터 혼합액의 제조
HLA-B27 PCR 1차용액 15.0 ㎕ 당 효소액-1을 0.5 ㎕씩 혼합하여 1 차 PCR 마스터혼합액을 제조하고, 1 검체당 15.5 ㎕을 사용한다. 제조 방법은 증류수 10.8 ㎕, 10배 완충액 2.0 ㎕ (15 mM MgCl2,200 mM (NH4)2SO4,725 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.1% Tween 20), 2 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dUTP) 1.0 ㎕, 10 pmol 프라이머 1.0 ㎕, 10 mg/ml cresol red 0.2 ㎕를 혼합하여 만들었다.
2) DNA 추출액의 제조
DNA 추출액은 5% Chelex 100 Resin (Bio-Rad)을 사용한다. DNA 추출액 제조방법은 멸균 3차증류수 950 ㎕에 Chelex 100 Resin 50 ㎎을 혼합한 후 멸균 3차증류수 넣어 1 ㎖로 만들었다.
3) 효소액-1의 제조
5 UTaqDNA polymerase 0.1 ㎕, 1U Uracil DNA glycosylase(UDG) 0.1 ㎕,Taq희석 버퍼 0.3 ㎕를 섞어서 만들었다.TaqDNA polymerase 희석 버퍼는 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 % Tween 20, 0.5 % NP40, 50 % Glycerol을 섞어서 제조하였다.
4) 기 타
양성대조액으로는 HLA-B27 양성인 DNA를 사용하였고, 미네랄 오일은 시판되고 있는 것(sigma)을 사용하였다.
실험예 1: 본 키트를 통한 HLA-B27의 검출
본 실험에 사용한 검체는 항응고제(EDTA)처리한 혈액을 사용하였다.
(1) DNA의 추출
1) EDTA처리한 혈액 30 ㎕와 멸균 3차 증류수 600 ㎕를 잘 혼합하여 상온에 30분간 방치한 후 10000-12000 rpm로 2-3분간 원심분리후 상등액을 제거한 후, 1X PBS 500 ㎕를 넣고 washing 후 침전물을 약 20-30 ㎕ 남기고 상등액을 제거한 다음 DNA 추출 버퍼 100 ㎕를 넣고 잘 섞은 후 100℃에서 10분간 가열하였다. 다시 10,000-12,000 rpm으로 원심 분리하여 resin을 침전시킨 후 상층액 4.5 ㎕를 PCR 반응에 이용하였다.
(2) PCR 마스터혼합액 제조 및 PCR 반응조건
HLA-B27 PCR 용액 15.0 ㎕와 PCR 효소액 5 ㎕의 비율로 혼합, 필요한 PCR 마스터 혼합액을 제조한 후(표 2 참조), HLA-B27 PCR 마스터 혼합액을 15.5 ㎕를 각 PCR tube에 분주하고 추출한 DNA 4.5 ㎕를 피펫팅하여 잘 섞은 다음, 이때부터 양성 대조군도 검사를 함께 시작하였다. PCR 반응 시 증발을 막아주는 장치가 없는 PCR기계를 사용할 경우, 본 키트에 포함된 미네랄 오일을 한 두방울 정도 넣은 후 PCR 반응을 시작한다. PCR 반응 조건은 표 3과 같다.
[표 2] HLA-B27 PCR 마스터 혼합액 (Unit: ㎕)
Solution 샘플 1 샘플 3 샘플 5
HLA-B27 PCR mixture 15.0 45.0 75.0
PCR Enzyme 0.5 1.5 2.5
Total 15.5 46.5 77.5
[표 3] HLA-B27 PCR 조건
온도 / 시간 싸이클
95℃ / 5 min 1 cycle
94℃ / 45 sec65℃ / 45 sec72℃ / 45 sec 30 cycles
72℃ / 5 min 1 cycle
(3) PCR 결과 확인
2% Agarose gel(0.5 ㎍ ethidium bromide/㎖)을 준비하고, PCR products에 6X gel loading dye 4 ㎕를 넣어 혼합한 후 5 ㎕를 준비된 gel에 로딩하여 100-150 volt에서 전기영동하였다. UV transilluminator에서 HLA-B27 PCR product(150 bp) 및 β-globin PCR product (268 bp)를 확인하였다(도 1 참조).
[표 4] PCR결과에 대한 분석
Size 양 성 양 성 음 성 재 검
268 bp + - + -
150 bp + + - -
(*두 개의 유전자 중 아무것도 증폭되지 않은 검체는 DNA추출부터 다시 시작하여 재검을 한다.)
실험예 2: 본 발명의 HLA B-27 PCR 키트의 효과에 대한 실험
(1) 특이도
본 발명의 HLA B-27 PCR 키트는 HLA B-27 유전자에서만 PCR 양성반응을 나타낸다. 본 실험에서는 키트의 특이도를 보기 위하여 HLA B-27 유전자와 다른 HLA-B 유전자로 PCR을 실시하였다. 모든 유전자는 DNA 1 ng을 이용하였고, 실험방법은 실험예 1에 준하여 실험하였고, 그 결과는 도 2에 사진으로 나타내었다. 도 2에서레인 1는 Phage 174 DNA/HaeIII 분자량 마커, 레인 2는 음성 대조군, 레인 3는 HLA B-27, 레인 4는 HLA B-40, 레인 5는 HLA B-41, 레인 6는 HLA B-42, 레인 7은 HLA-B44, 레인 8은 HLA B-38, 레인 9는 HLA B-35를 나타낸다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, HLA B-27유전자의 DNA에서만 PCR 양성을 나타내었고 다른 HLA-B 유전자에서는 반응이 일어나지 않았다(도 2 참조).
(2) 민감도
HLA B-27 DNA를 순수분리하여 1 ng농도의 PCR 혼합액을 만들고, 이것을 10 배씩 계대희석하여 0.1 fg의 농도까지 만든 후, 본 키트를 이용하여 PCR을 실시하고 민감도를 측정하였다. 실험방법은 실험예 1에 준하여 실험하였고, 결과는 도 3에 사진으로 나타내었다. 도 3에서 레인 1은 Phage 174 DNA/HaeIII 분자량 마커, 레인 2는 1 ng, 레인 3은 100 pg, 레인 4는 10 pg, 레인 5는 1 pg, 레인 6은 100 fg, 레인 7은 10 fg, 레인 8은 1 fg, 레인 9는 0.1 fg의 DNA를 나타낸다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 10 pg의 HLA B-27 DNA 튜브까지 PCR 양성을 나타내었다(도 3 참조).
(3) 재현성
HLA B-27 PCR 양성 대조군 5개와 음성 대조군 5개로 본 발명의 HLA B27 PCR 키트를 이용하여 일내재현성 (Within-Day)과 일간재현성 (Between-Day)실험을 하였다. 방법은 5 일간 두 연구원이 각 1회씩 PCR을 실시하였다. 실험방법은 실험예 1에 준하여 실험하였고, 결과를 표 5에 나타내었다. 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, PCR 양성 대조군과 음성 대조군 모두에서 100%의 재현성을 나타내었다.
[표 5] HLA-B27 PCR 재현성 실험결과
1 일 2 일 3 일 4 일 5 일
Positive 대조군 1 1회실험 (A) 양성 양성 양성 양성 양성
2회실험 (B) 양성 양성 양성 양성 양성
Positive 대조군 2 1회실험 (A) 양성 양성 양성 양성 양성
2회실험 (B) 양성 양성 양성 양성 양성
Positive 대조군 3 1회실험 (A) 양성 양성 양성 양성 양성
2회실험 (B) 양성 양성 양성 양성 양성
Positive 대조군 4 1회실험 (A) 양성 양성 양성 양성 양성
2회실험 (B) 양성 양성 양성 양성 양성
Positive 대조군 5 1회실험 (A) 양성 양성 양성 양성 양성
2회실험 (B) 양성 양성 양성 양성 양성
Negative 대조군 1 1회실험 (A) 음성 음성 음성 음성 음성
2회실험 (B) 음성 음성 음성 음성 음성
Negative 대조군 2 1회실험 (A) 음성 음성 음성 음성 음성
2회실험 (B) 음성 음성 음성 음성 음성
Negative 대조군 3 1회실험 (A) 음성 음성 음성 음성 음성
2회실험 (B) 음성 음성 음성 음성 음성
Negative 대조군 4 1회실험 (A) 음성 음성 음성 음성 음성
2회실험 (B) 음성 음성 음성 음성 음성
Negative 대조군 5 1회실험 (A) 음성 음성 음성 음성 음성
2회실험 (B) 음성 음성 음성 음성 음성
(4) 임상적유용성 검사
본 발명의 HLA-B27 PCR 키트의 임상적 유용성을 보기 위하여 HLA-B27 혈청검사 키트 (Bio Test Co., Germany)로 비교하여 실험하였다. 검체는 혈청을 사용하였으며, HLA-B27 혈청검사방법에서 양성으로 나온 22 검체와 음성으로 판명된 18 검체로 실시하였다.
실험방법은 본 발명의 키트는 실험예 1에 준하여 실험하였고, HLA B27 혈청학검사는 그 키트 설명서에 준하여 실험하였다. HLA B27 혈청학적 검사방법을 기술하면, 키트의 시험 웰에 HLA B27항체가 코팅되어 있어. 여기에 환자의 혈청을 가하고 보체를 넣은 후 에오진이라는 염색액을 넣는다. 만약 검체에 HLA B27 항원이 존재하면 세포독성반응이 일어나 에오진 염색액이 스며들어 붉게 나타나며, 음성인 경우는 염색액이 물들지 않는다. 이것을 현미경으로 관찰하는 방법이다.
결과는 표 6에 나타내었다. 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 두 가지 방법으로 검사를 실시하였을 때 일치하지 않은 경우는 3 예로써, PCR에서 양성이 나오고 혈청학 검사법으로 음성이 나온 1 예와 PCR에서 음성이 나오고 혈청학 검사법으로 양성이 나온 2 예였다. 이 검체로 염기배열을 조사하였을 때 PCR검사의 결과와 동일한 결과를 나타내었다. HLA B27 유전자는 HLA B40, 41 등 다른 HLA-B 유전자와 염기배열이 매우 유사하여, 상동성이 높으므로 혈청학적 검사법으로 할 때는 정확한 구분이 어렵다. 따라서 정확한 HLA B27검사를 위해서는 혈청학적 법보다 PCR을 이용한 유전자진단법이 유용함을 알 수 있다.
[표 6] 임상학적 유용성 실험에 대한 결과
HLA B27 혈청학검사
+ -
본 발명의HLA B27PCR + 20 A B 1
- 2 C D 17
+/-
Total 22 18
표 6에서
1) 일치도 (Agreement)는= 92.5%이고,
2) 민감도 (Sensitivity)는= 90.9%,
3) 특이도 (Specificity)는= 94.4 %,
4) Positive predictive value는= 95.2 %,
5) Negative predictive value는=89.5 %이다.
(5) 타사 제품과의 비교
PCR을 이용한 키트는 다른 제품이 나온 것이 없으므로 타사의 혈청학적 검사 키트와 비교한 결과를 표 7에 나타내었다.
[표 7] 타사와의 비교
내 용 본 발명의 HLA B27 PCR 키트 타사 HLA B27 Serology 키트
민감도 10 pg (10-11g) DNA까지 측정이 가능함 민감도에 대한 뚜렷한 언급이 없음
검사방법 PCR검사는 검체내의 HLA B27유전자의 DNA로 유전자형을 검출하는 것이므로 매우 특이적이고 민감도가 높으며, 결과판정이 매우 용이하다. 혈청학적 검사방법은 장기간 숙련된 기술이 필요하고 검사의 재현성이 낮으며, 검사결과의 판정이 주관적이다.
실험 시간 DNA추출시간 : 10분1차 PCR반응시간 : 1시간 30분전기영동시간 : 20분총 소요시간 2 시간 세포 분리시간 : 1시간반응시간 : 2시간판독시간 : 20분총 소요시간 : 3시간 20분
전기영동염색시약 PCR 마스터혼합액에 cresol red를 넣어 전기영동시 별도로 loading dye를 넣을 필요가 없음 전기영동할 때마다 염색시약을 넣어야 하는 번거로움이 있음
검체의 안정성 검체의 DNA를 분리해 놓을 경우 냉장온도에서 수년간 안정하므로 항시 재검사를 실시할 수 있다. 실온에서 수시간, 냉장에서 1일 정도의 안정성이 보장되나 그 이상이 되면 세포의 신선도가 떨어져 검사를 실시할 수 없다.
상기와 같은 구성을 갖는 본 발명의 키트는 피시알 마스터혼합액에 크레졸레드를 넣어 피시알산물을 전기영동할 때 염색시약을 넣지 않아도 되는 장점이 있으며, DNA 추출시약과 DNA추출의 정확성을 확인하기 위한 베타글로빈 대조군이 키트 내에 포함되어 있어 매우 편리하다. 또한 타 검출키트에 비해 경제성이 높을 뿐 아니라, 50% 이상 향상된 신속성과 10pg의 뛰어난 민감도 및 정확성를 가지고 있어서 HLA B-27유전자의 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (4)

  1. a) 약산성이온교환수지를 포함하는 DNA 추출액; 및
    b) 증류수, 완충액, dNTP, HLA-B27와 β-글로빈의 프라이머 및TaqDNA 중합효소와 우라실 DNA 글리코시레이즈의 혼합효소액, 크레졸 레드를 포함하는 피시알 마스터혼합액을 포함하는 HLA-B27 검출용 키트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 HLA-B27 프라이머 세트는 서열목록 1 및 2에 기재된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 HLA-B27 검출용 키트.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 β-글로빈 프라이머 세트는 서열목록 3 및 4에 기재된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 HLA-B27 검출용 키트.
  4. a) 샘플에 제 1항의 DNA 추출시약 및 피시알 마스터 혼합액을 처리한 후 피시알을 수행하는 단계; 및
    b) HLA-B27의 존재를 젤을 통하여 확인하는 단계를 포함하는 HLA-B27의 검출방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103255209A (zh) * 2013-03-27 2013-08-21 天津市秀鹏生物技术开发有限公司 用于检测人类白细胞hla-b27抗原基因的引物组及试剂盒

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