CN116732166A - 一种用于检测hla-b*27等位基因的引物组合及检测方法 - Google Patents

一种用于检测hla-b*27等位基因的引物组合及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测HLA‑B*27等位基因的引物组合及检测方法，包括有第一引物对和第二引物对，所述第一引物对由具有SEQ ID No.1所示碱基序列的上游引物，具有SEQ ID No.2所示碱基序列的下游引物组成，所述第二引物对由具有SEQ ID No.3所示碱基序列的上游引物，具有SEQ ID No.4所示碱基序列的下游引物组成。该引物组合特异性好，扩增效率高，能够找出HLA‑B*27基因与其他HLA‑B亚型的差异碱基，在差异序列上通过探针和上下游引物共同作用实现对HLA‑B的精准分型，实现对HLA‑B*27基因的精准扩增。

Description

一种用于检测HLA-B*27等位基因的引物组合及检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种用于检测HLA-B*27等位基因的引物组合及检测方法。
背景技术
强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种以脊柱和骶髂关节及周围大关节附着炎症为主要临床表现的自身免疫性关节炎。AS可致患者出现永久性的关节功能丧失，病变甚至可累及心脏、肺部、眼部等器官，造成患者伤残并导致生活质量严重低下。目前，AS的早期诊断还依据1984年纽约修订的诊断标准，该标准要求AS诊断需要有肯定的关节炎表现并结合影像学检查进行确诊，但AS起病隐匿，早期可无任何临床表现，当存在明确的临床表现时疾病往往已进展至中期，已经造成了不可逆的关节损伤。
早在1973年，人们就已发现HLA-B*27抗原的表达与AS具有高度相关性，在AS患者有超过90％的HLA-B*27抗原表达为阳性，因此通过检验HLA-B*27抗原的表达，结合临床表现及影像学检查可极大地提高诊断AS的阳性预测值，降低误诊率。同时HLA-B*27抗原的阳性表达还与多种疾病的发生相关，在临床上具有很高的检验价值。
而HLA是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体，全世界已发现超过2700多种等位基因，HLA-B族的等位基因也有800多种，并且分布呈区域和种族差异性。在中国人群中，HLA-B等位基因大概有～150种左右，中国汉族主要以HLA-B*2704为主。现阶段，在对HLA-B*27抗原进行检测时，引物的设计上还存在会扩增到其他HLA-B族的基因、与HLA-B07抗原存在交叉反应的缺点，导致检验的准确性不高。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于检测HLA-B*27等位基因的引物组合，该引物组合特异性好，扩增效率高，能够找出HLA-B*27基因与其他HLA-B亚型的差异碱基，在差异序列上通过探针和上下游引物共同作用实现对HLA-B的精准分型，实现对HLA-B*27基因的精准扩增。
本发明的第二目的在于提供一种检测HLA-B*27等位基因的引物组合的检测方法，该方法操作简便，鉴定效率高，且具有很高的敏感性、特异性、准确性以及应用性，适合人群HLA-B*27基因的大范围筛查。
为实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测HLA-B*27等位基因的引物组合，包括有第一引物对和第二引物对，所述第一引物对由具有SEQ ID No.1所示碱基序列的上游引物，具有SEQ IDNo.2所示碱基序列的下游引物组成，所述第二引物对由具有SEQ ID No.3所示碱基序列的上游引物，具有SEQ ID No.4所示碱基序列的下游引物组成。
优选地，还包括有针对内参基因GAPDH设计的内参引物对，所述内参引物对由具有SEQ ID No.5所示碱基序列的上游引物，具有SEQ ID No.6所示碱基序列的下游引物组成。
通过引入PCR反应内参基因保证反应的准确性和真实性，用以排除模板质量、机器故障、试剂稳定性等影响实验结果的因素。
优选地，还包括有与所述第一引物对配套的第一荧光探针，与第二引物对配套的第二荧光探针，与内参引物对配套的第三荧光探针，所述第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针为Taqman-MGB探针，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团包括CY3、CY5、ROX、FAM、VIC、FITC中的一种，且所述第一荧光探针和第二荧光探针分别与所述第三荧光探针选用的荧光报告基团在发光的波长范围内没有交叉。
Taqman-MGB探针同一般的Taqman探针相比提高了分辨率和检测下限，降低背景噪音，从而达到在标本质量不佳的情况下也能保证HLA-B*27的检测准确率和效率的效果。荧光探针的荧光报告基团可根据具体实验室PCR仪可检测的荧光类型进行选择，其中HLA-B*27荧光报告基团优选FAM，内参基因GAPDH荧光报告基团优选VIC。
上述上、下游引物和荧光探针由人工DNA合成仪合成，引物优选采用ULTRAPAGE方法纯化，荧光探针优选采用HPLC法纯化。
本发明的方案在上、下游引物上运用了等位基因特异性PCR技术，探针运用了Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR技术，通过对HLA-B族的所有亚型进行比对，能够找出B*27与其他亚型的差异碱基，通过上、下游引物和探针单独或共同的分型能力可达到对B*27检出的目的。
优选地，还包括有HLA-B*27基因的阳性对照质粒，所述质粒的克隆载体为pUC57，克隆位点为EcoRV，质粒抗性采用氨苄青霉素，插入的基因片段长度为272bp。本发明还提供了HLA-B*27阳性质粒标准品用以构建标准曲线以及阳性对照
本发明还提供了一种检测HLA-B*27等位基因的引物组合的检测方法，包括如下步骤：
从抗凝血样本中提取出DNA作为模板，并检测DNA模板浓度；
分别将阳性对照质粒和所述DNA模板加入反应液中，用所述第一引物对、第二引物对、内参引物对、第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针对阳性对照质粒和所述DNA模板进行实时荧光定量PCR扩增；
扩增结束后使用阳性对照质粒的扩增结果构建标准曲线，使用DNA模板的扩增结果构建扩增曲线，进行结果分析。
优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：
Taq DNA聚合酶具有良好的热稳定性，可在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的催化活性，dNTP是DNA扩增的原料，预混合物中还含有Mg2+，属于Taq DNA聚合酶的辅酶，其浓度直接影响着酶的活性与特异性。预混物的配制在冰上进行。
优选地，所述实时荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火34s并采集荧光信号，60℃延伸34s并采集荧光信号，共40个循环。
随着反应的逐渐进行，酶会逐渐失活，dNTP等原料会逐渐消耗掉，此外有一些非特异产物的扩增也会相应增加。因此虽然随着反应循环数的增加，产物会增多，但循环次数依然不宜过多，因而本发明限定为40个循环，且在退火和延伸阶段采集荧光信号。
优选地，所述DNA模板的浓度要求大于10ng/μl，纯度为OD260nm/OD280nm＝1.7-2.0。
其中，上述结果分析的方法为：
观察标准曲线的扩增效率是否在90％-110％之间，并在此前提下观察扩增曲线中目的基因和内参基因的荧光信号是否形成对数扩增的S型曲线，并结合CT值进行判断：
若内参基因荧光信号呈对数扩增的“S”型曲线且CT值≤35，两个目的基因荧光信号同时呈对数扩增的“S”型曲线且CT值≤35，则代表待检测者HLA-B*27阳性。
若内参基因荧光信号呈对数扩增的“S”型曲线且CT值≤35，两个目的基因结果同时显示无扩增信号或CT值>35，或仅任意一个目的基因结果有扩增信号且CT值≤35，代表待检测者HLA-B*27检测结果阴性。
若内参基因荧光信号未形成对数扩增的“S”型曲线或荧光信号呈对数扩增的“S”型曲线但CT值＞35，无论目的基因荧光信号是否形成对数扩增的“S”型曲线，均无法得出HLA-B*27是否为阳性/阴性的结果，需要重新检测。
优选地，本发明实施例还包括采用上述引物组合的用于检测HLA-B*27等位基因的试剂盒，该试剂盒配制合理，制备简单，结果判断客观准确，能够进行良好的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)上、下游引物上运用了等位基因特异性PCR技术，探针运用了Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR技术，在设计上对HLA-B族的所有亚型进行了严格比对，能够找出B*27与其他亚型的差异碱基，通过上、下游引物和探针单独或共同的分型能力可达到对B*27检出的目的，弥补了现有技术对B07和B*27分辨能力不足的问题，实现对HLA-B*27基因的精准扩增。
(2)本发明的检测方法适用范围广，具有很高的敏感性、特异性、准确性以及应用性，可替代FCM法，大大节约检测成本；敏感度高于FCM法，适合人群HLA-B*27基因的大范围筛查。
(3)本发明的检测方法迎合临床具体工作情况和要求，方法简便快速，只需一步PCR反应，无需纯化和预处理可直接上机检测，通量高，结果清晰容易判断。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1为本发明实施例所提供的扩增曲线图；
图2为本发明实施例所提供的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
引物和探针的设计：
第一引物对HLA-B*27：
上游引物：5’-GAGCCCCGCTTCATCACC-3’；
下游引物：5’-CCCGCGGCTCCTCTCT-3’；
第二引物对HLA-B*27：
上游引物：5’-CCGGGAGACACAGATCTG-3’；
下游引物：5’-TCTGGTTGTAGTAGCGGAGC-3’；
内参引物对hsa-GAPDH：
上游引物：5’-CTGCCCTTTGAGTTTGATGATG-3’；
下游引物：5’-CAGTCTGGGCACAAGCTTTG-3’；
第一荧光探针MGB-B*27P1：
5’荧光基团-ACGACACGCTGTTC-3’NFQ淬灭基团；
第二荧光探针MGB-B*27P2：
5’荧光基团-GGCACAGACTGACC-3’NFQ淬灭基团；
第三荧光探针MGB-hsa-GAPDH：
5’荧光基团-CAGCAAGCATTCCT-3’NFQ淬灭基团。
其中，第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针的荧光报告基团选自CY3、CY5、ROX、FAM、VIC、FITC中的一种，所述第一荧光探针和第二荧光探针分别与所述第三荧光探针选用的荧光报告基团在发光的波长范围内没有交叉。
上述引物以及探针由人工DNA合成仪合成，可由多种方式纯化，引物优选采用ULTRAPAGE方法纯化，荧光探针优选采用HPLC法纯化。
实施例2
实时荧光定量PCR反应液：
1)反应体系：
2)dNTP与Taq酶预混物选用Probe PCR Mix(2X)，包含：
ExTaq DNA Polymerase 1.25U/25μl
Buffer 2×conc.
dNTP Mixture 2×conc.；各0.4mM
Mg2+ 4mM
实施例3
实时荧光定量PCR检测HLA-B*27等位基因的方法：
1、准备DNA
1)从待检测者抽取抗凝血样本；
2)从抗凝血样本中获取DNA作为模板；
3)检测DNA模板浓度，要求浓度大于10ng/μl，纯度为OD260nm/OD280nm＝1.7-2.0。
2、准备HLA-B*27基因的阳性对照质粒
质粒的克隆载体为pUC57，克隆位点为EcoRV，质粒抗性采用氨苄青霉素，插入的基因片段长度为272bp。
3、上机检测
分别将阳性对照质粒和DNA模板加入实施例3制备的反应液中，用第一引物对、第二引物对、内参引物对、第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针对阳性对照质粒和DNA模板进行实时荧光定量PCR扩增。
其中，扩增反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火34s并采集荧光信号，60℃延伸34s并采集荧光信号，共40个循环。
实施例4
结果分析
1)使用DNA模板的扩增结果构建扩增曲线，如图1所示；
2)使用阳性对照质粒的扩增结果构建标准曲线，如图2所示；
3)观察标准曲线的扩增效率是否在90％-110％之间，并在此前提下观察扩增曲线中目的基因和内参基因的荧光信号是否形成对数扩增的S型曲线，并结合CT值进行判断：
若内参基因荧光信号呈对数扩增的“S”型曲线且CT值≤35，两个目的基因荧光信号同时呈对数扩增的“S”型曲线且CT值≤35，则代表待检测者HLA-B*27阳性。
若内参基因荧光信号呈对数扩增的“S”型曲线且CT值≤35，两个目的基因结果同时显示无扩增信号或CT值>35，或仅任意一个目的基因结果有扩增信号且CT值≤35，代表待检测者HLA-B*27检测结果阴性。
若内参基因荧光信号未形成对数扩增的“S”型曲线或荧光信号呈对数扩增的“S”型曲线但CT值＞35，无论目的基因荧光信号是否形成对数扩增的“S”型曲线，均无法得出HLA-B*27是否为阳性/阴性的结果，需要重新检测。
实验例1
HLA-B*27抗原的枸橼酸钠抗凝血标本100份，其中结果为阳性和阴性标本各50份。选用临床流式细胞术和本发明方案分别进行检测，检测操作步骤及结果判读均如实施例3-4所述。所使用的PCR仪器为：ABIQuantStudioTM DX。
临床流式细胞术检测与本技术方案检测结果如下：
将检测结果进行卡方检验，结果如下表所示：
a.使用的二项式分布。
进行Kappa一致性检验，对称度量表如下：
a.不假定零假设；
b.使用渐进标准误差假定零假设。
Kappa一致性检验通常Kappa系数值衡量一致性水平。Kappa系数取值在0～1之间，通常情况下：Kappa<0.2则说明一致性程度较差；0.2～0.4之间说明一致性程度一般；0.4～0.6之间说明一致性程度中等；0.6～0.8之间说明一致性程度较强；0.8～1.0之间说明一致性程度很强。
通过上述性能验证可以看出，本发明的检测方法与临床流式细胞术检测HLA-B*27抗原结果无统计学差异，且Kappa＝0.940，这表明本发明的检测结果具有很高的一致性，具有可以稳定实施，检测准确度高的特点。
最后，可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测HLA-B*27等位基因的引物组合，其特征在于，包括有第一引物对和第二引物对，所述第一引物对由具有SEQ ID No.1所示碱基序列的上游引物，具有SEQ IDNo.2所示碱基序列的下游引物组成，所述第二引物对由具有SEQ ID No.3所示碱基序列的上游引物，具有SEQ ID No.4所示碱基序列的下游引物组成。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，还包括有针对内参基因GAPDH设计的内参引物对，所述内参引物对由具有SEQ ID No.5所示碱基序列的上游引物，具有SEQ IDNo.6所示碱基序列的下游引物组成。
3.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，还包括有与所述第一引物对配套的第一荧光探针，与第二引物对配套的第二荧光探针，与内参引物对配套的第三荧光探针，所述第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针为Taqman-MGB探针，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的引物组合，其特征在于，所述荧光报告基团包括CY3、CY5、ROX、FAM、VIC、FITC中的一种，且所述第一荧光探针和第二荧光探针分别与所述第三荧光探针选用的荧光报告基团在发光的波长范围内没有交叉。
5.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，还包括有HLA-B*27基因的阳性对照质粒，所述质粒的克隆载体为pUC57，克隆位点为EcoRV，质粒抗性采用氨苄青霉素，插入的基因片段长度为272bp。
6.一种检测HLA-B*27等位基因的引物组合的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
从抗凝血样本中提取出DNA作为模板，并检测DNA模板浓度；
分别将阳性对照质粒和所述DNA模板加入反应液中，用所述第一引物对、第二引物对、内参引物对、第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针对阳性对照质粒和所述DNA模板进行实时荧光定量PCR扩增；
扩增结束后使用阳性对照质粒的扩增结果构建标准曲线，使用DNA模板的扩增结果构建扩增曲线，进行结果分析。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火34s并采集荧光信号，60℃延伸34s并采集荧光信号，共40个循环。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述DNA模板的浓度要求大于10ng/μl，纯度为OD260nm/OD280nm＝1.7-2.0。
10.一种包括权利要求1-5任一项的所述引物组合的试剂盒。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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