CN106434624A - 一种可控的dna树状分子组装的金纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可控的dna树状分子组装的金纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用DNA树状分子实现了金纳米颗粒的可控组装的方法。并具体公开了基于树状分子“发散法”的合成策略，通过逐步加入“三臂”结构Y形的DNA单体的方法，自组装形成了不同代数的、表面具有离散DNA“粘性末端”的DNA树状分子。同时，本发明申请人还将负载有一条互补DNA单链的金纳米颗粒与这些不同代数DNA树状分子进行杂交，从而合成了数目可控的离散金纳米颗粒聚集结构。本发明所述的技术方案对功能化纳米颗粒的空间定位与精确构建多价纳米材料方面具有很大的潜在应用价值。

Description

一种可控的DNA树状分子组装的金纳米颗粒及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种DNA树状分子及其制备方法，和利用该DNA树状分子结构控制纳米金颗粒自组装的方法。本发明属于纳米生物材料领域，在药物载体，生物检测等方面有潜在的应用。
背景技术
随着纳米技术的发展，纳米粒子自组装成复杂纳米结构已经引起了广泛的研究兴趣。近十几年，金纳米颗粒在纳米光电材料方面得到了巨大的应用，它们中的很多性质，比如表面等离子共振，很大程度上取决于相邻颗粒之间的相互作用。而“自下而上”的自组装策略，在精确排列与调控纳米颗粒之间的距离与几何形状方面，提供了一个相当合适的方法。
理解纳米粒子在纳米尺度不同于单分散的组装行为，如二维层状结构，三维超晶格纳米结构等对于本发明认识其宏观固有的光学，电学和化学特性具有重要意义。这种编程式的DNA独有的特性可以使得本发明更容易的操控这种纳米尺度的结构，而这正是传统方法难以达成的。
此外，在各种自组装方法中，DNA由于其独特的分子识别性质和结构特征，被广泛应用作为纳米颗粒的自组装模板。并且，DNA修饰的纳米金常被作为分子尺、基因和蛋白质检测等领域。使用DNA分子的碱基配对性质对纳米颗粒进行有规律的组装，为纳米自组装材料更好的应用于生物检测和医药领域开辟了新的途径，同时也为本发明更深入理解纳米粒子的自组装性质提供了可靠的基础。
然而，数量可控的纳米颗粒空间聚集体的构建仍然是一个极具挑战性的课题。同时，树枝状分子，一类尺寸均匀的超支化大分子，由于其多价态和纳米尺寸的结构，在调控纳米颗粒自组装方法具有巨大的潜力。但是，大多数树枝状分子的获得需要多步的合成与纯化过程，以及复杂的支链引入步骤。
发明内容
发明概述
为了解决上述问题，本申请发明人惊奇地发现基于DNA精确的分子识别能力，完全通过DNA自组装形成的DNA树状分子，可以在不经过任何纯化步骤的条件下高产率地获得。
基于此，本发明公开了一种利用DNA树状分子调控离散金纳米自组装的简单而有效的方法。并且，基于DNA树状分子球形的结构，其最外层的“粘性末端”可以均匀分布于三维空间中，这也使它们非常适合作为支架结构，从而实现纳米颗粒精确的空间定位。
DNA树状分子具有不同于普通DNA双链或单链的性质，结构简单稳定、容易修饰，因此是理想的用于纳米粒子自组装的材料，本发明使用的方法可以有效地控制纳米颗粒空间聚集体的数量。并且，通过在第一层支链与核心之间引入了多个碱基对的连接链，增加支链之间的空间间隔。该设计策略不仅能延迟某一层支链形成饱和结构的发生时间，也能够改善粘性末端之间的自组装效率，具有较好的创新性和应用潜能。
发明的详细说明
本发明通过Y-形DNA（Y-DNA）一步步自组装的方法，制备得到DNA树状分子。由于Y-DNA具有近似平面的结构（如附图1所示）。
在一个是实施例中，通过选择每一层间DNA双螺旋的长度大约为3.75个螺旋或20-40，优选为39个碱基对，可以构建得到三维的DNA支架结构。
在另一个实施例中，为了尽可能地消除多枝侧链所造成的可能的位阻效应，本发明在第一层支链与核心之间引入了10-100个碱基对的连接链，以增加支链之间的空间间隔。
优选的，使用60个碱基对或约5.75个螺旋。
在本发明中由于每一个Y-DNA都具有“三臂”的结构，最外层支链的数目能够可控地增加到某个值。进一步将修饰有单条DNA链的金纳米颗粒，通过与DNA树状分子表面的“粘性末端”的互补杂交，从而以DNA树状分子作为支架实现纳米颗粒的有序空间排列。
在本发明的一个实施例中，为了获得不同代数的DNA树状分子，等量的寡聚核苷酸链（比如，Yna、Ynb、Ync）被混合到一起形成树状分子单体（Yn，第n代的Y-DNA）。Y-DNA臂上的13个或23个碱基的“粘性末端”（如附图1所示）可以在室温下形成稳定的自组装结构
更优选的，本发明把第n代DNA树状分子命名为Gn，通过逐步将Yn加入到Gn-1（n≥1）中，利用粘性末端之间的杂交互补配对，可以合成得到不同代数的DNA树状分子（参见附图2a）。
在本发明中加入到Gn-1上的所使用的每一层上的Yn彼此之间都是不同的，本发明是通过“A-B-C-D-E”的组装策略、自组装形成了一系列的DNA树状分子。这样的自组装策略能够产生最高质量纯度的DNA树状分子。因此，每一代Gn之间表面的“粘性末端”，无论是13或23个碱基的序列，在本发明的实验中彼此是不相同的，这样的设计策略可以防止不同层的“粘性末端”之间的非特异性交联。
具体而言，本发明涉及一种DNA树状分子的制备方法，包括如下步骤：在磷酸缓冲溶液混合等量的三条DNA序列，得到混合液；将上述混合液加热，反应后冷却；获得具有三臂结构的Y型DNA，使用Y’0表示；在上述Y’0的三臂每一臂DNA的5’到3’端分别引入m个碱基连接链，获得核心区DNA，使用Y0表示，优选的，核心区DNA 为“”型DNA；使用上述方法，获得Y’0，在Y’0的三臂每一臂DNA的5’到3’端分别引入n个碱基连接链，获得第一代DNA，使用Y1表示，优选的第一代DNA为“”型DNA；将Y0与Y1进行混合，利用粘性末端之间的杂交互补配对，自组装形成稳定的DNA树状分子，使用G0表示。其中，m或n选自10-100之间的正整数。
本发明的一个优选实施例中涉及一种DNA树状分子的制备方法，步骤包括，使用上述方法，获得Y’0，在Y’0的三臂每一臂DNA的5’到3’端分别引入i个碱基的连接链，获得第二代“”型DNA，使用Y2表示；将Y2与步骤⑥获得的G0进行混合，利用Y2与G0 DNA粘性末端之间的杂交互补配对，自组装形成稳定的DNA树状分子，使用G1表示。其中，m、n或i选自10-100之间的正整数。
本发明的另一个优选实施例中涉及一种DNA树状分子的制备方法，步骤还包括：使用上述方法获得Yx和Gx-1，将Yx与Gx-1进行混合，Yx与Gx-1的DNA粘性末端进行杂交互补配对，获得DNA树状分子Gx；其中，加入到Gx-1上的所使用的Yx与之前每一层上使用的“”型DNA彼此之间不同；并且，X为大于2的正整数。
优选的，本发明的另一个优选实施例中涉及一种DNA树状分子的制备方法，其中，步骤①中使用的磷酸缓冲溶液的pH为7.5- 8.5，所述三条DNA序列的终浓度均为20 mM；和/或步骤②中使用的加热温度为60-100℃，反应后冷却的条件为以每分钟1℃的速率冷却到4℃；和/或步骤③中所述的Y-DNA具有近似平面的结构，优选的，使得每一层间DNA双螺旋的长度大约为30-45个碱基对；和/或在Y’0的三臂每一臂DNA的5’到3’端分别引入碱基的数量为10-30个碱基；优选的，在每一臂的DNA上添加13个或23个碱基的粘性末端。
此外，本发明还涉及一种利用DNA树状分子结构控制纳米金颗粒自组装的方法，包括4个步骤，具体为，第一步，使用权利要求1-4所述的方法获得DNA树状分子；第二步，合成修饰有单条DNA链的金纳米颗粒；第三步，将上述DNA树状分子和修饰有单条DNA链的金纳米颗粒进行混合，修饰有单条DNA链的金纳米颗粒与DNA树状分子表面的“粘性末端”的互补杂交，进行自组装；第四步，获得以DNA树状分子作为支架的纳米颗粒。
再者，本发明还涉及一种利用制备获得的DNA树状分子结构控制纳米金颗粒自组装的方法，本发明人惊奇地发现，使用本发明所述方法获得以DNA树状分子作为支架的纳米颗粒的数量为可控；优选的，使用权利要求1-4所述的方法获得DNA树状分子，将获得的DNA树状分子表示为Ga，最终获得的产物中DNA树状分子支架上的纳米颗粒个数为：3×2a个，其中，a为自然数。
优选的，本发明还涉及另外一种利用DNA树状分子结构控制纳米金颗粒自组装的方法，其中，第二步中使用的合成修饰有单条DNA链的金纳米颗粒的方法为：将表面由BSPP（二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐）稳定的金纳米颗粒与硫辛酸修饰的DNA按照1:1的摩尔比例混合；之后通过凝胶电泳的方法纯化得到所述的修饰有单条DNA链的金纳米颗粒。
更优选的，上述方法中所述的单条DNA链为较短序列的硫辛酸DNA，该较短序列的硫辛酸DNA单修饰的金纳米颗粒制备方法包括以下4个步骤，i．合成一条较长的DNA链作为辅助链，与硫辛酸修饰的DNA链进行杂交后对其进行延长，获得金纳米颗粒-DNA杂化结构；ii．将上述金纳米颗粒-DNA杂化结构进一步通过凝胶电泳的方法进行分离纯化，获得DNA单修饰的金纳米颗粒；iii．将辅助链去除；iv．最终获得具有较短序列的硫辛酸DNA单修饰的金纳米颗粒。
同时，本发明还公开了使用上述方法制备获得了相关产品。并且，上述产品在用于制备药物载体以及生物检测相关试剂或试剂盒中具有广泛的应用价值。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1 以DNA树状分子作为支架，实现金纳米颗粒可控空间排布的自组装策略示意图；
图2 （a）构建DNA树状分子的自组装策略；（b）G0-G4的琼脂糖凝胶电泳的表征结果；（c）G1-G4动态光散射的粒径分布表征；（d）G4的原子力显微成像的结果；
图3 Y-DNA熔点的测定曲线。熔点测定过程是通过记录260 nm的吸光度随温度的变化获得的相应曲线，每种Y-DNA的浓度均为1.3 μΜ；
图4 DNA树状分子G4的熔点测定曲线；
图5硫辛酸修饰的DNA单功能化的金纳米颗粒的制备过程。（a）利用琼脂糖凝胶电泳将金纳米颗粒-DNA杂化体分离成相应的离散条带结构；（b）获得短链寡聚核苷酸链单功能化的金纳米颗粒方法的示意图；
图6 DNA单功能化的金纳米颗粒分别与（a）G0，（b）G1，（c）G2，（d）G3的组装结果的透射电子显微镜（TEM）的表征；
图7 G3调控的金纳米颗粒组装体的TEM的表征；
图8 G4调控的金纳米颗粒组装体的TEM的表征。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司购得：所有的DNA链（PAGE纯化）是购买自Invitrogen生物科技公司（北京，中国）。硫辛酸购买自Alfa公司。二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐（BSPP）购买自Sigma公司。其他化学药品均为试剂纯或更高纯度，购买后未经纯化直接使用。实验过程中所用水为Millipore Milli-Q纯化后的水（电阻率>18 MΩ.cm）。
琼脂糖凝胶电泳所用的缓冲液位0.5 × TBE，电压为5 V/cm。纯化DNA单功能化的金纳米颗粒所用的凝胶浓度为3%；表征DNA树状分子所用的凝胶电泳浓度为0.5%。
透射电子显微镜为FEI T20型号，操作电压为200 kV。制样方法为：将金纳米颗粒样品滴加到铜网后、空气中干燥12小时的方法进行制样。
动态光散射（DLS）使用配备有多角度动态接收器和He-Ne激光光源（λ=632.8 nm）的光散射仪进行测量。
原子力显微镜（AFM）使用的是VeecoMultiMode 8扫描探针显微镜。将DNA组装结构滴加到云母表面上以后，在缓冲溶液中通过敲击模式进行成像。
紫外光谱使用的是配置有程序控温装置的Varian Cary 100分光光度仪。
实施例1构建DNA树状分子所使用的DNA序列
设计构建DNA树状分子所使用的DNA序列（参见表1），通过Invitrogen生物科技公司进行购买。
表1构建DNA树状分子所使用的DNA序列
实施例2 制备DNA单功能化的金纳米颗粒所使用的DNA序列
设计制备DNA单功能化的金纳米颗粒所使用的DNA序列（参见表2），通过Invitrogen生物科技公司进行购买。
表2制备DNA单功能化的金纳米颗粒所使用的DNA序列
实施例3 Y-形DNA（Y-DNA）的制备方法
将等量的三条DNA序列（Yna, Ynb和Ync）在磷酸缓冲溶液(100 mMNaCl, 50 mM磷酸钠,pH 8.0)中混合到一起，使每条DNA链的终浓度均为20 mM。然后将混合物加热到95℃保持5分钟后，以每分钟1℃的速率冷却到4℃，最终获得Y-DNA组装结构。
通过紫外光谱对Y-DNA的热稳定性进行了测定(如图3所示)。实验结果表明，所有的Y-DNA的熔点（Tm）都高于60℃，这也意味着这些DNA树状分子的单体在室温下是稳定的。
实施例4 DNA树状分子的制备方法
一个典型的实验过程是：将3×2n-1摩尔比例的Yn与1摩尔比例的Gn-1(n ≥ 1) 在磷酸缓冲溶液中混合均匀后，在室温下放置1小时后制备得到Gn。所有制备得到的DNA树状分子都通过琼脂糖凝胶电泳与动态光散射的方法对其进行了表征确认。通过紫外光谱对G4进行的热稳定性的试验表明，G4的熔点大约为65℃（如图4所示）。
实施例5 以DNA树状分子作为支架，实现金纳米颗粒可控空间排布的自组装策略
组装策略如图1所示，通过Y-形DNA（Y-DNA）一步步自组装的方法，制备得到DNA树状分子。优选的，Y-DNA具有近似平面的结构，通过选择每一层间DNA双螺旋的长度大约为3.75个螺旋（39个碱基对），可以构建得到三维的DNA支架结构。
值得注意的是，为了尽可能地消除多枝侧链所造成的可能的位阻效应，本发明在第一层支链与核心之间引入了60个碱基对的连接链（约5.75个螺旋），以增加支链之间的空间间隔。该设计策略不仅能延迟某一层支链形成饱和结构的发生时间，也能够改善粘性末端之间的自组装效率。由于每一个Y-DNA都具有“三臂”的结构，最外层支链的数目能够可控地增加到某个值。进一步将修饰有单条DNA链的金纳米颗粒，通过与DNA树状分子表面的“粘性末端”的互补杂交，从而以DNA树状分子作为支架实现纳米颗粒的有序空间排列。
为了获得不同代数的DNA树状分子，等量的寡聚核苷酸链（比如，Yna、Ynb、Ync）被混合到一起形成树状分子单体（Yn，第n代的Y-DNA）。Y-DNA臂上的13个或23个碱基的“粘性末端”（如图1所示）可以在室温下形成稳定的自组装结构。本发明把第n代DNA树状分子命名为Gn，通过逐步将Yn加入到Gn-1（n≥1）中，利用粘性末端之间的杂交互补配对，可以合成得到不同代数的DNA树状分子（如图2a所示）。
在这里，加入到Gn-1上的所使用的每一层上的Yn彼此之间都是不同的，每一代Gn之间表面的“粘性末端”，无论是13或23个碱基的序列，在本发明的实验中彼此是不相同的，这样的设计策略可以防止不同层的“粘性末端”之间的非特异性交联。自组装得到的DNA树状分子本发明进一步通过琼脂糖凝胶电泳和动态光散射（DLS）等技术对它们的结构特征进行了表征。如图2b所示，不同代数的DNA树状分子即使在不经任何纯化的条件下也能获得高纯度的产品，并且在琼脂糖凝胶电泳中表现出了单一的条带。由于越大的结构在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率越低，因此高代数的DNA树状分子表现出较小的迁移率。在这里尺寸效应（而非电荷效应）在琼脂糖凝胶电泳中占了主导效应。因此在凝胶电泳的表征结果中，Gn+1的迁移率表现出比Gn的较小的迁移率。动态光散射的测量结果（如图2c所示）表明，树状分子的水合半径从G1时的约12 nm增加到G4时的约28 nm，这一结果与凝胶电泳的结果相一致。本发明进一步通过原子力显微镜（AFM）对第四代DNA树状分子（G4）的结构进行了确认。首先将G4样品滴加到云母表面上，然后在缓冲溶液中通过原子力显微镜的敲击模式进行成像。成像的结果显示出G4具有超支化的树状纳米结构（如图2d所示）。
实施例6硫辛酸修饰的DNA的合成方法
3’端-硫辛酸修饰的单链DNA是通过文献的方法进行合成与纯化的。简言之，3’-氨基修饰的DNA(cYn)与硫辛酸酯在醋酸-三乙胺缓冲溶液（TEAA）中以大于200:1的摩尔比例混合后，将其在室温下放置10小时，目标产物（硫辛酸修饰的DNA，LA-cYn）通过反相-HPLC的方法纯化得到。（洗脱流动相：ACN/TEAA, 20:1→ACN/TEAA, 4:1）
实施例7硫辛酸修饰的DNA单功能化的金纳米颗粒的制备过程
如上所述的纳米尺度的与大小可控的多枝DNA树枝分子结构，进一步利用其表面的已知序列的“粘性末端”，可以将其作为支架用来调控金纳米颗粒的空间排列。这里本发明所采用的金纳米颗粒，表面仅负载有单条DNA链（标记为“DNA单功能化的金纳米颗粒”）。因为这种单功能化的金纳米颗粒可以避免在自组装过程中的非特异性的交联，从而有效地提高自组装的精确度。本发明通过将表面由BSPP（二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐）稳定的金纳米颗粒与硫辛酸修饰的DNA按照1:1的摩尔比例混合后，再通过凝胶电泳的方法纯化得到DNA单功能化的金纳米颗粒（如图5所示）。利用琼脂糖凝胶电泳的方法分离得到DNA单功能化的金纳米颗粒，一般需要足够长的单链DNA（对于5 nm金颗粒通常需要大于50个碱基）才能达到理想的分离效果。这里本发明所用的与DNA树状分子表面进行杂交所需的硫辛酸修饰的DNA为13个或23个碱基，相对于上述要求来说明显是太短了。为了解决这一问题，本发明利用一条较长的DNA链（EXT-Yn）作为辅助链，与硫辛酸修饰的DNA链（LA-cYn）进行杂交后对其进行延长。如图5a所示，将所获得的金纳米颗粒-DNA杂化结构进一步通过凝胶电泳的方法对其进行分离纯化。再将DNA单修饰的金纳米颗粒从相应条带中分离出来以后，辅助链（EXT-Yn）是通过与其完全互补的序列链（cEXT-Yn）进行杂交后加以去除的（如图5b所示）。最终获得具有较短序列的硫辛酸DNA单修饰的金纳米颗粒。
实施例8DNA单功能化的金纳米颗粒的制备方法
首先，硫辛酸修饰的DNA(cYn-LA)通过与辅助链(EXT-Yn)杂交后对其长度进行延长。然后将这些部分互补的DNA加入到BSPP稳定的5 nm金颗粒中，将该混合物在室温下放置2小时后，从琼脂糖凝胶电泳中分离得到DNA-金颗粒偶合的目标产物。最后，其中的辅助链(EXT-Yn)通过与其完全互补的序列链（cEXT-Yn）杂交后将其置换下来。
实施例9DNA树状分子调控金纳米颗粒可控空间排列的表征
在成功获得树状DNA支架结构与DNA单功能化的金纳米颗粒以后，接下来本发明开始测试利用这些支架结构调控产生空间可控的纳米颗粒聚集体。将具有“三臂”结构的、每条臂上均含有“粘性末端”的G0与具有相应互补序列DNA单功能化的金纳米颗粒按照一定比例混合以后，通过透射电子显微镜（TEM）的表征结果表明（如图6a所示），形成了金纳米颗粒三聚体的结构。由于Y-DNA构象的自由度，金纳米颗粒形成的三角形结构具有角度可变性，从而使其没有表现出完美的等边三角形的排列结构。与之相似，通过G1与相应互补DNA单功能化的金纳米颗粒混合后，可以获得金纳米颗粒六聚体的结构（如图6b所示）；将G2与DNA单功能化的金颗粒杂交后，能够生成含有12个纳米颗粒的复合体（如图6c所示）。据本发明人所知，利用如此简单直接的方法精确调控12个纳米颗粒的空间排布的研究还未曾被报道过。虽然随着DNA树状分子代数的增加，该组装策略可行性变得有所降低。比如本发明发现将G3和G4分别与相应DNA单功能化的金纳米颗粒杂化后，预期的自组装结果没形成。TEM的表征结果表明，产生了22个或更少的纳米颗粒的聚集结构（图6d，图7和图8）。对这一实验现象的原因可能是，随着树状分子代数的增加，DNA结构变得更加松软，树状分子表面的粘性末端也变得更加拥挤，这种立体位阻效应和电子排斥效应同时阻碍了位点特异性的组装过程的发生，但是并不妨碍本发明的前述调控金纳米颗粒组装过程的进行。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种DNA树状分子的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
①在磷酸缓冲溶液混合等量的三条DNA序列，得到混合液；
②将上述混合液加热，反应后冷却；
③获得具有三臂结构的Y型DNA，使用Y’0表示；
④分别在上述Y’0的三臂每一臂DNA中的一条单链的5’到3’端引入m个碱基的连接链，获得核心区DNA，所述核心区DNA具有三臂，并且每一臂由DNA双链和与其连接的具有m个碱基的DNA单链组成，该核心区 DNA使用Y0表示，优选的，所述核心区 DNA 为“ ”型DNA；
⑤使用步骤①-③所述的方法，获得Y’0，分别在Y’0的三臂每一臂DNA中的一条单链的5’到3’端引入n个碱基的连接链，获得第一代 DNA，所述第一代DNA具有三臂，并且每一臂由DNA双链和与其连接的具有n个碱基的DNA单链组成，该第一代DNA使用Y1表示，优选的，所述第一代 DNA为“ ”型DNA；
⑥将Y0与Y1进行混合，利用粘性末端之间的杂交互补配对，自组装形成稳定的DNA树状分子，使用G1表示；
其中，m或n选自10-100之间的正整数。
2.一种如权利要求1所述的DNA树状分子的制备方法，其特征在于所述步骤还包括：
⑦使用步骤①-③所述的方法，获得Y’0，在Y’0的三臂每一臂DNA的5’到3’端分别引入i个碱基的连接链，获得第二代DNA，所述第二代DNA具有三臂，并且每一臂由DNA双链和与其连接的具有i个碱基的DNA单链组成，该第二代 DNA使用Y2表示，优选的，所述第二代 DNA为“ ”型DNA；
⑧将Y2与步骤⑥获得的G1进行混合，利用Y2与G1DNA粘性末端之间的杂交互补配对，自组装形成稳定的DNA树状分子，使用G2表示；
其中，m、n或i选自10-100之间的正整数。
3.一种如上述任一项权利要求所述的DNA树状分子的制备方法，其特征在于所述步骤还包括：使用权利要求1中所述方法获得Yx
和Gx-1，将Yx与Gx-1进行混合，Yx与Gx-1的DNA粘性末端进行杂交互补配对，获得DNA树状分子Gx；
其中，
加入到Gx-1上的所使用的Yx与之前每一层上使用的“ ”型DNA彼此之间不同；
并且，
X为大于等于1的正整数。
4.一种如上述任一项权利要求所述的DNA树状分子的制备方法，其特征在于：
步骤①中使用的磷酸缓冲溶液的pH为7.5- 8.5，所述三条DNA序列的终浓度均为20mM；和/或
步骤②中使用的加热温度为60-100℃，反应后冷却的条件为以每分钟1℃的速率冷却到4℃；和/或
步骤③中所述的Y-DNA具有近似平面的结构，优选的，使得每一层间DNA双螺旋的长度大约为30-45个碱基对；和/或
在Y’0的三臂每一臂DNA的5’到3’端分别引入碱基的数量为10-30个碱基；优选的，在每一臂的DNA上添加13个或23个碱基的粘性末端；和/或
在所述Y0、Y1、Y2或Yx的三臂的每一臂DNA的碱基数量为30-70个碱基，其中，所述每一臂DNA由DNA双链和与其连接的DNA单链组成；优选的，三臂的每一臂DNA的碱基的数量为60个碱基。
5.一种利用DNA树状分子结构控制纳米金颗粒自组装的方法，其特征在于：
第一步，使用权利要求1-4所述的方法获得DNA树状分子；
第二步，合成修饰有单条DNA链的金纳米颗粒；
第三步，将上述DNA树状分子和修饰有单条DNA链的金纳米颗粒进行混合，修饰有单条DNA链的金纳米颗粒与DNA树状分子表面的“粘性末端”的互补杂交，进行自组装；
第四步，获得以DNA树状分子作为支架的纳米颗粒。
6.一种如上述任一项权利要求所述的利用DNA树状分子结构控制纳米金颗粒自组装的方法，其特征在于：获得以DNA树状分子作为支架的纳米颗粒的数量为可控；优选的，使用权利要求1-4所述的方法获得DNA树状分子，将获得的DNA树状分子表示为Ga，最终获得的产物中DNA树状分子支架上的纳米颗粒个数为：3×2a个，其中，a为自然数。
7.一种如上述任一项权利要求所述的利用DNA树状分子结构控制纳米金颗粒自组装的方法，其特征在于：第二步中使用的合成修饰有单条DNA链的金纳米颗粒的方法为：
将表面由二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐（BSPP）稳定的金纳米颗粒与硫辛酸修饰的DNA按照1:1的摩尔比例混合；之后通过凝胶电泳的方法纯化得到所述的修饰有单条DNA链的金纳米颗粒。
8.一种如上述权利要求7所述的利用DNA树状分子结构控制纳米金颗粒自组装的方法，其特征在于：所述的单条DNA链为较短序列的硫辛酸修饰的DNA，该较短序列的硫辛酸DNA单修饰的金纳米颗粒制备方法为：
i．合成一条较长的DNA链作为辅助链，与硫辛酸修饰的DNA链进行杂交后对其进行延长，获得金纳米颗粒-DNA杂化结构；
ii．将上述金纳米颗粒-DNA杂化结构进一步通过凝胶电泳的方法进行分离纯化，获得DNA单修饰的金纳米颗粒；
iii．将辅助链去除；
iv．最终获得具有较短序列的硫辛酸DNA单修饰的金纳米颗粒。
9.使用上述任一项权利要求所述的方法制备获得的产品。
10.如权利要求9所述的产品在制备药物载体以及生物检测相关试剂或试剂盒中的应用。
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