CN110283776A - 一种胞外囊泡的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种胞外囊泡的分离方法。本发明提供一种胞外囊泡的分离方法，包括：1)将胞外囊泡样品进行离心处理，以提供上清液；2)将步骤1)所提供的上清液进行电泳透析处理，以提供胞外囊泡液；3)将步骤2)所提供的胞外囊泡液进行超滤处理。由本发明所提供的分离方法制备获得的胞外囊泡，可以保持其完整的结构，在同时可以处理多个样品的同时，制备获得的胞外囊泡具有纯度高、杂蛋白污染少等优势，且几乎可以获得待处理样品中所有的胞外囊泡，具有优良的产率。此外，本发明所提供的方法步骤简单、易于操作，且整个过程中不涉及昂贵的设备，所使用的耗材皆可以反复回收再使用，是一种低廉、高效的处理方法。

Description

一种胞外囊泡的分离方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种胞外囊泡的分离方法。
背景技术
胞外囊泡(exosome)是几乎所有活细胞均能产生和分泌的的膜性囊泡，在疾病的诊断和治疗中具有重要的应用。
胞外囊泡的分离对其下游应用至关重要。在目前胞外囊泡的分离方法主要有以下几种:一、超速离心速度(Théry C et al.Curr Protoc Cell Biol,2006；3:1–29)或者是密度梯度离心(Tauro BJ et al.Methods 2012；56:293–304.)，这种方法被认为是胞外囊泡分离的金标准，但此方法需要配有价格不菲的超高速离心机，因此不易普及。二、聚沉法，此种方法，可以分为两类，一类是将抽提试剂加入到样品中，离心得到胞外囊泡的沉淀(LobbRJ et al.J Extracell Vesicles2015；4:27031)，但这类方法提取的胞外囊泡纯度不高且价格昂贵。另一类方法是将样品加入到柱子中(Bo AN et al.J Extracell Vesicles2014；3:23430)，在通过柱子的过程中，样品中的蛋白质等杂质会进入到柱子中，而粒径较大的胞外囊泡会先从柱子中流出，这样能较快速的得到纯度较高的胞外囊泡。但成本过高限制了这种方法的应用。四、利用价格便宜的聚乙二醇将胞外囊泡沉淀下来(Rider MA etal.Sci Rep 2016；6:23978)，此种方法和商品化的胞外囊泡提取试剂盒原理相类，其优点在于提取成本不高，缺点是提取的胞外囊泡的纯度不高。
因此，目前缺少一个具有成本低、操作简单、纯度高且胞外囊泡结构完整等优点的胞外囊泡分离方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种胞外囊泡的分离方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种胞外囊泡的分离方法，包括：
1)将胞外囊泡样品进行离心处理，以提供上清液；
2)将步骤1)所提供的上清液进行电泳透析处理，以提供胞外囊泡液；
3)将步骤2)所提供的胞外囊泡液进行超滤处理。
在本发明一些实施方式中，所述胞外囊泡样品选自细胞外液、植物汁液中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，所述步骤1)中，离心处理的时间为10～30min，离心处理的转速为10000～15000rpm。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，电泳透析处理中的截留分子量为250～350kDa和/或电泳透析处理中的孔径为25～30nm。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，电泳透析处理中的电场环境为200～400mA电泳透析处理中所使用的透析液为Tris-甘氨酸电泳液。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，将步骤1)所提供的上清液置于透析袋中进行电泳透析处理。
在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，电泳透析处理的时间为1～3h，每隔0.2～0.8h更换电泳液。
在本发明一些实施方式中，所述步骤3)中，超滤处理的截留分子量为100～200kDa，超滤处理的转速为3000～4000rpm，超滤处理的时间为5～15min。
本发明另一方面提供一种胞外囊泡，由所述的胞外囊泡的分离方法制备获得。
在本发明一些实施方式中，所述胞外囊泡粒径为50～200nm，且保持完整的结构。
附图说明
图1显示为本发明实施例1透射电子显微镜(TEM)示意图。
图2显示为本发明实施例1粒径分析(Nanosight)示意图。
图3显示为本发明实施例1蛋白分析(Western blot)示意图。
图4显示为本发明实施例2透射电子显微镜(TEM)示意图。
图5显示为本发明实施例2粒径分析(Nanosight)示意图。
图6显示为本发明实施例2蛋白分析(Western blot)示意图。
图7显示为本发明实施例3透射电子显微镜(TEM)示意图。
图8显示为本发明实施例3粒径分析(Nanosight)示意图。
图9显示为本发明实施例3蛋白分析(Western blot)示意图。
图10显示为本发明实施例4透射电子显微镜(TEM)示意图。
图11显示为本发明实施例4粒径分析(Nanosight)示意图。
图12显示为本发明实施例4蛋白分析(Western blot)示意图。
图13显示为本发明实施例5透射电子显微镜(TEM)示意图。
图14显示为本发明实施例5粒径分析(Nanosight)示意图。
图15显示为本发明实施例5蛋白分析(Western blot)示意图。
图16显示为本发明实施例6透射电子显微镜(TEM)示意图。
图17显示为本发明实施例6粒径分析(Nanosight)示意图。
图18显示为本发明实施例7透射电子显微镜(TEM)示意图。
图19显示为本发明实施例7粒径分析(Nanosight)示意图。
具体实施方式
本发明发明人经过大量实践研究，提供了一种新的胞外囊泡的分离方法，所述分离方法通过离心、电泳透析、超滤等步骤，能够在更短的时间内分离获得纯度更高的胞外囊泡，且胞外囊泡的结构依然完整，实现了高纯度的胞外囊泡分离，具有良好的产业化前景，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种胞外囊泡的分离方法，包括：
1)将胞外囊泡样品进行离心处理，以提供上清液；
2)将步骤1)所提供的上清液进行电泳透析处理，以提供胞外囊泡液；
3)将步骤2)所提供的浓缩液进行超滤处理。
本发明所提供的胞外囊泡的分离方法中，所述待处理的胞外囊泡样品可以是各种含有胞外囊泡的介质，例如，通常可以是细胞外液、植物汁液等。所述细胞外液可以是血浆、排泄物(例如，尿液等)、分泌物(例如，乳汁、唾液等)、或者细胞培养液等，所述植物汁液则通常可以是植物细胞的细胞液等。
本发明所提供的胞外囊泡的分离方法中，可以包括：将胞外囊泡样品进行离心处理，以提供上清液，所述离心处理通常指利用离心力分离混合物的处理方法。所述离心处理的时间可以为10～30min、10～15min、15～20min、20～25min、或25～30min，离心处理的转速可以为10000～15000rpm、10000～11000rpm、11000～12000rpm、12000～13000rpm、13000～14000rpm、或14000～15000rpm，将胞外囊泡样品中的细胞、细胞碎片等去除。
本发明所提供的胞外囊泡的分离方法中，还可以包括：将离心处理所提供的上清液进行电泳透析处理，以提供胞外囊泡液，所述电泳透析处理通常指将待处理样品置于一定的电场环境中，从而可以驱动带电物质发生移动，并进一步通过透析膜两边物质浓度差所带来的扩散效果，对混合物进行分离的处理方法。电泳透析处理中的截留分子量可以为250～350kDa、250～270kDa、270～290kDa、290～310kDa、310～330kDa、或330～350kDa，电泳透析处理中透析膜的孔径可以为25～30nm、25～26nm、26～27nm、27～28nm、28～29nm、或29～30nm，电泳透析处理中的电场环境可以为200～400mA、200～250mA、250～300mA、300～350mA、或350～400mA。所述电泳透析处理中所使用的缓冲液可以是各种适用于透析的缓冲液，例如，电泳透析处理中所使用的透析液可以是包括但不限于Tris-甘氨酸缓冲液。在本发明一优选实施例中，可以将离心处理所提供的上清液置于透析袋中进行电泳透析处理，所述透析袋的体积通常与上清液的体积相匹配，透析通常需要保持一段时间，且需要每隔一段时间更换电泳液(即，透析液)，并适时变换电泳方向，从而防止电泳过程中胞外囊泡的破裂和胞外囊泡堵塞透析袋，保证更佳的分离效果，例如，电泳透析处理的时间为1～3h、1～1.5h、1.5～2h、2～2.5h、或2.5～3h，每隔0.2～0.8h更换电泳液，每隔0.2～0.8h变换电泳方向。
本发明所提供的胞外囊泡的分离方法中，还可以包括：将电泳透析处理所提供的浓缩液进行超滤处理，所述超滤处理通常指以压力为推动力的一种膜分离方法。所述超滤处理中，超滤处理的截留分子量可以为100～200kDa、100～120kDa、120～140kDa、140～160kDa、160～180kDa、或180～200kDa，超滤处理的转速可以为3000～4000rpm、3000～3200rpm、3200～3400rpm、3400～3600rpm、3600～3800rpm、或3800～4000rpm，超滤处理的时间可以为5～15min、5～8min、8～12min、或12～15min，得到浓缩后的胞外囊泡。
本发明第二方面提供一种胞外囊泡，由本发明第一方面所提供的胞外囊泡的分离方法制备获得，所述胞外囊泡粒径主要集中在50～200nm左右，且可以保持其完整的结构。
如上所述，由本发明所提供的分离方法制备获得的胞外囊泡，可以保持其完整的结构，在同时可以处理多个样品的同时，制备获得的胞外囊泡具有纯度高、杂蛋白污染少等优势，且几乎可以获得待处理样品中所有的胞外囊泡，具有优良的产率。此外，本发明所提供的方法步骤简单、易于操作，且整个过程中不涉及昂贵的设备，所使用的耗材皆可以反复回收再使用，是一种低廉、高效的处理方法。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
各实施例中所使用的材料具体如下：
透析袋：5ml(Spectrum Labs；131450)。
电泳液为甘氨酸和Tris的水溶液，其中甘氨酸浓度为7.2g/L，Tris浓度为1.5g/L。
超滤管：15ml(Millipore；UFC910096)
PBS：NaCl 8.0g/L,KCl 0.2g/L,Na2HPO4 0.7g/L,KH2PO4 0.2g/L
实施例1
1)将新鲜获取的6ml尿液进行离心，离心条件为10000rpm，10min，沉淀即是尿液中的细胞及杂质，去除沉淀，取上清液5ml。
2)取步骤1)中获得的上清液5mL加入到300kDa的透析袋中。电泳液为甘氨酸和Tris的水溶液，在300mA(天能，EPS600)电泳条件下电泳2小时，每0.5小时更换电泳液并改变电泳方向。
3)将步骤2)中透析获得的尿液胞外囊泡液(即透析袋中的溶液)5ml加入100kDa的超滤管中，3500rpm超滤10min用于对样品进行进一步浓缩，以提供浓缩尿液胞外囊泡。
使用透射电子显微镜(TEM)对获得的尿液胞外囊泡进行表征，具体表征结果如图1所示：分离得到的尿液胞外囊泡，具有结构完整的典型杯盘状结构，背景干净，杂质少。
使用Nanosight对获得的尿液胞外囊泡进行粒径分析，具体表征结果如图2所示。结果显示分离得到的尿液胞外囊泡粒径主要集中在150nm左右。
使用Western blot对获得的尿液胞外囊泡的特征蛋白进行分析，如图3所示。结果表明与相同蛋白浓度的尿液相比，尿液胞外囊泡高表达胞外囊泡特征分子CD63,TSG101和CD81。
实施例2
1)将新鲜获取的6ml唾液进行离心，离心条件为10000rpm，10min，沉淀即是唾液中的细胞及杂质，去除沉淀，取上清液5ml。
2)取步骤1)中获得的上清液5mL加入到300kDa的透析袋中。电泳液为甘氨酸和Tris的水溶液，在300mA(天能，EPS 600)电泳条件下电泳2小时，每0.5小时更换电泳液并改变电泳方向。
3)将步骤2)中透析获得的唾液胞外囊泡液(即透析袋中的溶液)5ml加入100kDa的超滤管中，3500rpm超滤10min用于对样品进行进一步浓缩，以提供浓缩的唾液胞外囊泡。
使用透射电子显微镜(TEM)对获得的唾液胞外囊泡进行表征，具体表征结果如图4所示：分离得到的唾液胞外囊泡，具有结构完整的典型杯盘状结构，背景干净，杂质少。
使用Nanosight对获得的唾液胞外囊泡进行粒径分析，具体表征结果如图5所示。结果显示分离得到的唾液胞外囊泡粒径主要集中在138nm。
使用Western blot对获得的唾液胞外囊泡的特征蛋白进行分析，如图6所示。结果表明与相同蛋白浓度的唾液相比，唾液胞外囊泡高表达胞外囊泡特征分子CD63和CD81。
实施例3
1)将新鲜获取的血液离心4000rpm 10min获得血清，再通过10000rpm离心15min去除沉淀，获得血清上清液。
2)将步骤1)中获得的血清上清液0.4ml，采用电泳液稀释到5ml。
3)取步骤2)中获得的稀释液5mL加入到300kDa的透析袋中。电泳液为甘氨酸和Tris的水溶液，在300mA(天能，EPS600)电泳条件下电泳2.5小时，每0.5小时更换电泳液并改变电泳方向。
4)将步骤3)中透析获得的血清胞外囊泡液(即透析袋中的溶液)5ml加入100kDa的超滤管中，3500rpm超滤10min用于对样品进行进一步浓缩，以提供浓缩的血清胞外囊泡。
使用透射电子显微镜(TEM)对获得的血清胞外囊泡进行表征，具体表征结果如图7所示：分离得到的血清胞外囊泡，具有结构完整的典型杯盘状结构，背景干净，杂质少。
使用Nanosight对获得的血清胞外囊泡进行粒径分析，具体表征结果如图8所示。结果显示分离得到的血清胞外囊泡粒径主要集中在147nm。
使用Western blot对获得的血清胞外囊泡的特征蛋白进行分析，如图9所示。结果表明与相同蛋白浓度的血清相比，血清胞外囊泡高表达胞外囊泡特征分子CD63和TSG101。
实施例4
1)将3×106种在10cm培养皿(Corning；430167)口腔鳞癌细胞WSU-HN6培养48小时后，收集细胞培养上清液6ml进行离心，离心条件为10000rpm，10min，沉淀即是细胞培养上清液中的细胞及杂质，去除沉淀，取上清液5ml。
2)取步骤1)中获得的上清液5mL加入到300kDa的透析袋中。电泳液为甘氨酸和Tris的水溶液，在300mA(天能，EPS 600)电泳条件下电泳2.5小时，每0.5小时更换电泳液并改变电泳方向。
3)将步骤2)中透析获得的细胞上清胞外囊泡液(即透析袋中的溶液)5ml加入100kDa的超滤管中，3500rpm超滤10min用于对样品进行进一步浓缩，以提供浓缩的WSU-HN6细胞胞外囊泡。
使用透射电子显微镜(TEM)对获得的WSU-HN6细胞胞外囊泡进行表征，具体表征结果如图10所示：分离得到的细胞上清液胞外囊泡，具有结构完整的典型杯盘状结构，背景干净，杂质少。
使用Nanosight对获得的细胞上清液胞外囊泡进行粒径分析，具体表征结果如图11所示。结果显示分离得到的细胞上清胞外囊泡粒径主要集中在158nm。
使用Western blot对获得的细胞上清胞外囊泡的特征蛋白进行分析，如图12所示。结果表明与相同蛋白浓度的细胞上清相比，细胞上清胞外囊泡高表达胞外囊泡特征分子CD63和CD81。
实施例5
1)将市售新鲜脱脂牛奶(光明)使用0.1％乙酸处理1min后进行离心，离心条件为15000rpm，30min，去除沉淀上清液5ml。
2)取步骤1)中获得的上清液5mL加入到300kDa的透析袋中。电泳液为甘氨酸和Tris的水溶液，在300mA(天能，EPS600)电泳条件下电泳2.5小时，每0.5小时更换电泳液并改变电泳方向。
3)将步骤2)中透析获得的牛奶胞外囊泡液(即透析袋中的溶液)5ml加入100kDa的超滤管中，3500rpm超滤10min用于对样品进行进一步浓缩，以提供浓缩的牛奶胞外囊泡。
使用透射电子显微镜(TEM)对获得的牛奶胞外囊泡进行表征，具体表征结果如图13所示：分离得到的牛奶胞外囊泡，具有结构完整的典型杯盘状结构，背景干净，杂质少。
使用Nanosight对获得的牛奶胞外囊泡进行粒径分析，具体表征结果如图14所示。结果显示分离得到的牛奶胞外囊泡粒径主要集中在66nm。
使用Western blot对获得的牛奶胞外囊泡的特征蛋白进行分析，如图15所示。结果表明与相同蛋白浓度的牛奶相比，牛奶胞外囊泡高表达胞外囊泡特征分子CD63，TSG101和CD81。
实施例6
1)将新鲜获取的柠檬汁进行离心，离心条件为10000rpm，10min，沉淀即是柠檬汁中的细胞及杂质，去除沉淀，取上清液5ml。
2)取步骤1)中获得的上清液5mL加入到300kDa的透析袋中。电泳液为甘氨酸和Tris的水溶液，在300mA(天能，EPS600)电泳条件下电泳3小时，每0.5小时更换电泳液并改变电泳方向。
3)将步骤2)中透析获得的柠檬胞外囊泡液(即透析袋中的溶液)5ml加入100kDa的超滤管中，3500rpm超滤10min用于对样品进行进一步浓缩，以提供浓缩的柠檬胞外囊泡。
使用透射电子显微镜(TEM)对获得的柠檬胞外囊泡进行表征，具体表征结果如图16所示：分离得到的柠檬胞外囊泡，具有结构完整的典型杯盘状结构，背景干净，杂质少。
使用Nanosight对获得的柠檬胞外囊泡进行粒径分析，具体表征结果如图17所示。结果显示分离得到的柠檬胞外囊泡粒径主要集中在75nm和176nm。
实施例7
1)将新鲜获取的苦瓜汁进行离心，离心条件为10000rpm，10min，沉淀即是苦瓜汁中的细胞及杂质，去除沉淀，取上清液5ml。
2)取步骤1)中获得的上清液5mL加入到300kDa的透析袋中。电泳液为甘氨酸和Tris的水溶液，在300mA(天能，EPS600)电泳条件下电泳3小时，每0.5小时更换电泳液并改变电泳方向。
3)将步骤2)中透析获得的苦瓜胞外囊泡液(即透析袋中的溶液)5ml加入100kDa的超滤管中，3500rpm超滤10min用于对样品进行进一步浓缩，以提供浓缩的苦瓜胞外囊泡。
使用透射电子显微镜(TEM)对获得的苦瓜胞外囊泡进行表征，具体表征结果如图18所示：分离得到的苦瓜胞外囊泡，具有结构完整的典型杯盘状结构，背景干净，杂质少。
使用Nanosight对获得的苦瓜胞外囊泡进行粒径分析，具体表征结果如图19所示。结果显示分离得到的苦瓜胞外囊泡粒径主要集中在123nm和158nm。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种胞外囊泡的分离方法，包括：
1)将胞外囊泡样品进行离心处理，以提供上清液；
2)将步骤1)所提供的上清液进行电泳透析处理，以提供胞外囊泡液；
3)将步骤2)所提供的胞外囊泡液进行超滤处理。
2.如权利要求1所述的胞外囊泡的分离方法，其特征在于，所述胞外囊泡样品选自细胞外液、植物汁液中的一种或多种的组合。
3.如权利要求1所述的胞外囊泡的分离方法，其特征在于，所述步骤1)中，离心处理的时间为10～30min，离心处理的转速为10000～15000rpm。
4.如权利要求1所述的胞外囊泡的分离方法，其特征在于，所述步骤2)中，电泳透析处理中的截留分子量为250～350kDa和/或电泳透析处理中的孔径为25～30nm。
5.如权利要求1所述的胞外囊泡的分离方法，其特征在于，所述步骤2)中，电泳透析处理中的电场环境为200～400mA电泳透析处理中所使用的透析液为Tris-甘氨酸电泳液。
6.如权利要求1所述的胞外囊泡的分离方法，其特征在于，所述步骤2)中，将步骤1)所提供的上清液置于透析袋中进行电泳透析处理。
7.如权利要求1所述的胞外囊泡的分离方法，其特征在于，所述步骤2)中，电泳透析处理的时间为1～3h，每隔0.2～0.8h更换电泳液。
8.如权利要求1所述的胞外囊泡的分离方法，其特征在于，所述步骤3)中，超滤处理的截留分子量为100～200kDa，超滤处理的转速为3000～4000rpm，超滤处理的时间为5～15min。
9.一种胞外囊泡，由权利要求1～8任一权利要求所述的胞外囊泡的分离方法制备获得。
10.如权利要求9所述的胞外囊泡，其特征在于，所述胞外囊泡粒径为50～200nm，且保持完整的结构。
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