CN113189067B - 一种细胞外囊泡的富集和检测方法及装置 - Google Patents

一种细胞外囊泡的富集和检测方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞外囊泡的富集和检测方法及装置。该装置包括：微流控芯片，其上设有凝胶通道和电泳通道，所述电泳通道两端分别与电源正负极连接，所述电泳通道上靠近与所述电源负极连接的一端设有用于注入所述细胞外囊泡的样品池，所述电泳通道内填充电泳缓冲液，所述凝胶通道内注有琼脂糖凝胶；用于电泳的电源；用于检测细胞外囊泡的CCD荧光采集系统。将荧光探针标记的细胞外囊泡注入样品池，在所述电泳通道两端施加电压，电泳时间一定时间，所述的细胞外囊泡迁移至凝胶/缓冲液界面处并富集，用CCD荧光采集系统采集荧光信号及图像，根据荧光强度‑浓度曲线对细胞外囊泡进行定量分析。

Description

一种细胞外囊泡的富集和检测方法及装置
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡检测技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡的富集和检测方法及装置。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是指能够被机体大多数细胞所分泌的囊泡，其中尺寸为30-200nm的称为微小细胞外囊泡(sEVs)，也称外泌体(exosome)，尺寸大于200nm的称为大细胞外囊泡(lEVs)。EVs内含各种复杂RNA和蛋白，广泛存在并分布于各种体液当中。研究表明细胞外囊泡参与细胞通讯，在癌症的转移和发展中发挥重要作用，因此，细胞外囊泡的准确定量在临床检测中具有重要意义。
截至目前已经报道了许多用于细胞外囊泡定量检测的方法，比如传统的纳米粒子跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)和BCA蛋白测定，还有以抗体和适配体为信号转换分子的新型生物传感技术。这些方法已在诸多专利技术(如公开号为CN109112110A、CN112280734A的专利技术等)中成熟应用。但是，NTA仪器价格昂贵，并且需要大量样品，因此无法更广泛应用。BCA分析会由于分离过程中混入的杂质蛋白而导致结果不准确。而抗体的使用会提高实验成本和制备条件。因此，仍然有必要开发更实用和准确的方法来量化衍生自各种样品的细胞外囊泡。
发明内容
针对上述技术问题以及本领域存在的不足之处，本发明提供了一种细胞外囊泡的富集和检测方法及装置。微流控芯片电泳技术并结合尺寸排阻法，对样品中的细胞外囊泡颗粒进行快速的富集和荧光定量分析。
一种细胞外囊泡的富集和检测装置，包括：
微流控芯片，其上设有凝胶通道和电泳通道，所述电泳通道两端分别与电源正负极连接，所述电泳通道上靠近与所述电源负极连接的一端设有用于注入所述细胞外囊泡的样品池，所述电泳通道内填充电泳缓冲液，所述凝胶通道内注有琼脂糖凝胶；
用于电泳的电源；
用于检测细胞外囊泡的CCD荧光采集系统。
本发明的目的是利用微流控电泳把荧光探针标记的细胞外囊泡富集到微通道内，并用CCD荧光采集系统定量分析细胞外囊泡。具体原理如下：本发明设计了具有简单交叉通道的微流控芯片，并且两条通道分别为凝胶和电泳通道。为了便于操作所有通道都向空中开放。在实施细胞外囊泡检测时，首先，将琼脂糖凝胶注入凝胶通道，而电泳通道仅填充电泳缓冲液。之后，将预先荧光探针标记的细胞外囊泡注入样品池中，并使用CCD检测系统记录荧光强度。在电泳通道的两端施加电压时，带负电的细胞外囊泡将会向阳极迁移，但由于琼脂糖凝胶的存在，其无法在短时间内进入凝胶而富集在凝胶/缓冲液的界面。因此，细胞外囊泡的荧光强度也被积累，进而被CCD采集。
所述微流控芯片的材质可选自玻璃、石英、金属、塑料等。
所述微流控芯片具有电泳和凝胶两条通道，电泳通道与凝胶通道交叉。所述电泳通道具有样品池和缓冲溶液池(即储液池)。所述缓冲溶液池设于电泳通道两端。
所述的CCD荧光采集系统可采用本领域已有常用的，包括CCD相机、激发光源和滤光系统。
所述的电源为直流电源。
在一优选例中，所述的细胞外囊泡的富集和检测装置，所述微流控芯片材料为PDMS(聚二甲基硅氧烷)。
在一优选例中，所述的细胞外囊泡的富集和检测装置，所述凝胶通道和电泳通道的深度均为2mm。
在一优选例中，所述的细胞外囊泡的富集和检测装置，所述电泳通道的两端均为储液池，所述储液池为半径为3mm的圆柱形结构。
在一优选例中，所述的细胞外囊泡的富集和检测装置，所述样品池为半径为4mm的圆柱形结构。
在一优选例中，所述的细胞外囊泡的富集和检测装置，所述凝胶通道的宽度为1mm。
在一优选例中，所述的细胞外囊泡的富集和检测装置，所述电泳通道的宽度为0.6mm。
本发明还提供了一种细胞外囊泡的富集和检测方法，采用所述的细胞外囊泡的富集和检测装置，所述细胞外囊泡的富集和检测方法包括：将荧光探针标记的细胞外囊泡注入样品池，在所述电泳通道两端施加电压，电泳时间一定时间，所述的细胞外囊泡迁移至凝胶/缓冲液界面处并富集，用CCD荧光采集系统采集荧光信号及图像，根据荧光强度-浓度曲线对细胞外囊泡进行定量分析。
所述的细胞外囊泡尺寸为30-500nm。
所述的细胞外囊泡经过荧光探针标记，再进行荧光检测。荧光探针可选自磷脂膜染料、荧光标记核酸适配体等。在一优选例中，采用低毒性和强荧光的PKH67染料，PKH67染料本身具有的长亲脂性烃链，在进入细胞膜之后发出稳定的绿色荧光，半衰期为10-12天。
所述凝胶通道里填充琼脂糖凝胶，其浓度为1-10％。
所述电泳通道两端施加电压大小为10V-10kV。
所述的细胞外囊泡的富集和检测方法，所述细胞外囊泡的浓度为102-108个/μL。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明构建了具有简单交叉通道的微流控芯片，通过电泳的方式把荧光探针标记的细胞外囊泡富集在琼脂糖凝胶界面，只需5min即可实现细胞外囊泡的定量，操作和仪器设备简单，无需昂贵的抗体，有望在细胞外囊泡的临床检测中发挥一定的作用。
附图说明
图1为本发明的微流控芯片结构示意以及细胞外囊泡快速富集和检测原理图，图中：1-凝胶通道，2-储液池，3-样品池，4-电泳，5-电源，6-凝胶/缓冲液界面，7-电泳通道，8-PKH67染料染色的细胞外囊泡；
图2为实施例细胞外囊泡表征示意图，其中左图为TEM电镜照片，比例尺200nm，中图为NTA检测结果图，右图为WB结果图；
图3为本发明PDMS微流控芯片的芯片阳膜结构示意图；
图4为实施例实验组(细胞外囊泡)和空白组(PBS)在电泳5min后在凝胶/缓冲液界面处所采集的荧光信号示意图(虚线代表界面)；
图5为实施例实验组(细胞外囊泡)和空白组(PBS)在不同电泳时间点所采集的荧光信号示意图；
图6为实施例不同浓度细胞外囊泡的荧光信号与线性检测图；
图7为本发明方法与NTA方法的对比图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中采用的细胞外囊泡为细胞外泌体。
本实施例的细胞外囊泡的富集和检测装置，包括：
用于富集PKH67染料染色的细胞外囊泡的PDMS微流控芯片，如图1所示，其上设有相互交叉的凝胶通道1和电泳通道7，电泳通道7两端为储液池2，分别与电源5正负极连接，电泳通道7上靠近与电源5负极连接的储液池2设有用于注入PKH67染料染色的细胞外囊泡8的样品池3，电泳通道7内填充0.1×TAE缓冲液，凝胶通道1内注有3％的琼脂糖；
用于检测采集凝胶/缓冲液界面6处的荧光强度的CCD荧光采集系统。
在实施细胞外囊泡检测时，首先，将3％的琼脂糖注入凝胶通道，而电泳通道仅填充0.1×TAE缓冲液。之后，将预先用PKH67染料染色的细胞外囊泡注入样品池中，并使用CCD检测系统记录荧光强度。如图1所示，在电泳通道7的两端施加电压时，PKH67染色的细胞外囊泡8将会向阳极迁移，即电泳4，但由于3％琼脂糖的存在，其无法在短时间内进入凝胶而富集在凝胶/缓冲液界面6。因此，细胞外囊泡的荧光强度也被积累，进而被CCD采集。
1、细胞外囊泡的提取和表征
采用经典的超速离心法提取A375细胞系上清细胞外囊泡，并采用透射电子显微镜(TEM)，NTA，蛋白质免疫印迹(WB)对细胞外囊泡结构和浓度进行表征。如图2所示，TEM成像显示囊泡为经典的茶托形状，且NTA结果表明其粒径分布于30-200nm，与文献报道基本一致。WB中TSG101与CD81的条带也证明超离得到的沉淀确为细胞外囊泡。
2、微流控芯片的制造
先用CAD作图并用3D打印得到芯片阳膜(如图3所示)。凝胶和电泳通道的高度均为2mm，为了便于操作所有通道都向空中开放，其中电泳通道7由两端的储液池2(半径为3mm)，中间的样品池3(半径为4mm)和0.6mm宽的微通道构成；凝胶通道1由仅为1mm宽的微通道构成。制造PDMS芯片时采用道康宁184型号试剂，按照说明书把A、B组分按15g:1.5g(10:1)比重混合均匀，真空脱气30min后倒入阳膜，待其室温自然凝固时，脱模即可得PDMS微流控芯片。
3、可行性验证
电泳芯片准备：取步骤2所得的芯片，将3％的琼脂糖注入凝胶通道，电泳通道仅填充0.1×TAE缓冲液。
PKH67预染细胞外囊泡准备：取2μL细胞外囊泡母液或PBS(作为空白对照)溶于123μL Diluent C，接着取1μL PKH67母液溶于124μLDiluent C，混合上述溶液避光室温孵育4分钟。
电泳检测细胞外囊泡：取100μL预染细胞外囊泡注入样品池，并在两端施加40V的电压，采集不同时间后凝胶/缓冲液界面的荧光信号。
结果如图4、图5所示，在细胞外囊泡存在的情况下，界面处的荧光信号远高于PBS对照组，这是因为在进入脂质之前PKH6染料的荧光强度较弱，而当其长烃链插入细胞外囊泡磷脂双分子层后可发出强荧光。但在电泳5min之后，PBS对照组也出现了微弱的荧光，这可能归因于PKH67染料形成大颗粒并在凝胶/缓冲液界面聚集。为了避免PKH67染料导致检测体系背景的升高，本发明优选采集电泳5min时的荧光强度来实现细胞外囊泡的定量。
4、不同浓度细胞外囊泡的检测
取不同浓度的细胞外囊泡按照步骤3中的方法进行微流控芯片电泳，并采集5min时凝胶/缓冲液界面处的荧光强度，最后用Image J软件分析不同浓度时荧光强度的灰度值，以F-F0(实验组-对照组)为纵坐标对细胞外囊泡浓度作图，如图6所示，随着细胞外囊泡的浓度增加，荧光强度不断增强，在其浓度为6.40×104-1.60×107个/μL时呈现良好的线性关系。
5、与NTA的对比
为了评估本发明所提出的方法的准确性，选取人血清样品细胞外囊泡为研究对象来比较本发明的方法与NTA的结果是否一致。取500μL血清样品，根据Wako公司MagCaptureTM细胞外囊泡提取试剂盒的操作步骤提取血清细胞外囊泡，之后分别采用NTA和本发明所提出的方法(按照本实施例参数条件)对其进行定量，结果如图7所示，所提细胞外囊泡数量级为107个/μL，且NTA与本发明结果几乎一致，证明了本发明的准确性。
可见，本发明构建了具有简单交叉通道的PDMS微流控芯片，通过电泳的方式把PKH67预染的细胞外囊泡富集在琼脂糖凝胶界面，只需5min即可实现细胞外囊泡的定量，操作和仪器设备简单，无需昂贵的抗体，有望在细胞外囊泡的临床检测中发挥一定的作用。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种细胞外囊泡的富集和检测方法，其特征在于，采用细胞外囊泡的富集和检测装置，所述装置包括：
微流控芯片，其上设有交叉的凝胶通道和电泳通道，所述电泳通道两端分别与电源正负极连接，所述电泳通道上靠近与所述电源负极连接的一端设有用于注入所述细胞外囊泡的样品池，所述电泳通道内填充电泳缓冲液，所述凝胶通道内注有3％琼脂糖凝胶；
用于电泳的电源；
用于检测采集凝胶/缓冲液界面处的荧光强度的CCD荧光采集系统；
所述方法结合微流控芯片电泳技术和尺寸排阻法，包括：将PKH67染料标记的细胞外囊泡注入样品池，在所述电泳通道两端施加电压40V，电泳时间5min，所述的细胞外囊泡迁移至凝胶/缓冲液界面处并富集，用CCD荧光采集系统采集荧光信号及图像，根据荧光强度-浓度曲线对细胞外囊泡进行定量分析；
所述的细胞外囊泡尺寸为30-500nm；
所述细胞外囊泡的浓度为6.40×104-1.60×107个/μL，该范围内随着细胞外囊泡的浓度增加，荧光强度不断增强，呈现良好的线性关系。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的富集和检测方法，其特征在于，所述微流控芯片的材质选自玻璃、石英、金属、塑料。
3.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的富集和检测方法，其特征在于，所述电泳通道具有缓冲溶液池。
4.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的富集和检测方法，其特征在于，所述的CCD荧光采集系统，包括CCD相机、激发光源和滤光系统。
5.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的富集和检测方法，其特征在于，所述的电源为直流电源。
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