MX2014009295A - Metodo mejorado para la produccion de macroperlas. - Google Patents

Metodo mejorado para la produccion de macroperlas.

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MX2014009295A
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Abstract

La invención se relaciona con un método mejorado para producir perlas de agarosa, recubiertas de agarosa que contienen células. El método, que de preferencia, es automatizado, involucra colocar las perlas producidas en una muestra de aceite mineral a un gradiente de temperatura, de manera que la temperatura cae conforme la perla se mueve a través del aceite. De preferencia, se emplean una "herramienta de trompeta" y una "herramienta de pajilla" en el método.

Description

MÉTODO MEJORADO PARA LA PRODUCCIÓN DE MACROPERLAS Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos de América No. 61/592,949, presentada el 21 de enero de 2012, incorporada aquí como referencia en su totalidad.
Campo de la Invención Esta invención se relaciona con métodos mejorados para producir una composición de materia que comprende células secretoras, en particular, atrapadas en una perla permeable o en otra estructura, que entonces se recubre con agarosa. La perla puede comprender o consistir de agarosa. La agarosa Litex es especialmente preferida para las perlas.
Antecedentes de la Invención La producción de composiciones de materia que contienen células viables, atrapadas en medios permeables es considerada muy importante en varios campos, tal como la terapia de diabetes, el tratamiento de cáncer y el mantenimiento de células madre. Con respecto a esto, favor de consultar por ejemplo, la Re-expedición 40,555; las Patentes de Estados Unidos de América No. 7,838,291; No. 6,818,230; No. 6,808,705; No. 6,303,151; No. 6,224,912; No. 5,888,497 y No. 5,643,569, y la Solicitud de Patente Publicada 2007/0071732, todas ellas incorporadas aquí como referencia en su totalidad.
Los procesos para producir estas composiciones de materia, referidas después como "encapsulados" son esencialmente los mismos, sin considerar el tipo de célula usada. Después del aislamiento o de asegurar las células de interés, éstas quedan suspendidas en una solución acuosa de un agente, tal como agarosa, colágeno o combinaciones de los mismos o se colocan en un material tal como una esponja de gelatina. Cuando se usan las soluciones acuosas, se forman las perlas semi-sólidas que contienen las células de interés al colocar la suspensión en un aceite mineral. Cuando se usa la esponja de gelatina, el producto, que contiene las células se enrolla en una esfera después de lo cual se le vacía agarosa para formar la perla.
Las perlas entonces entran en contacto con una solución de agarosa, por ejemplo, en una cuchara de Teflón. Las perlas se enrollan en la mezcla para formar lo que se refiere aquí como macroperlas recubiertas de agarosa en la técnica citada como se menciona antes.
Las enseñanzas iniciales se muestran por ejemplo, en RE 40,555 y la Patente de Estados Unidos de América No. 5,888,497, que enseñan el encapsulado de células secretoras, tal como insulina que produce isletas y células de cáncer, que han sido continuadas con mejoras incluyendo el encapsulado de células madre, como se muestra en la Patente de Estados Unidos de América No. 7,838,291 y a través de la mejora en los materiales usados, como se puede observar por ejemplo, en la Solicitud de Patente Publicada 2007/0071732, sin embargo, existe la necesidad continua de metodología para hacer estos materiales útiles.
Una mejora que es muy conveniente en este campo, es la capacidad de automatizar un proceso manual.
Durante el curso de automatizar el proceso de producción, los inventores han desarrollado herramientas especiales, que facilitan el proceso de producción. Además, se ha encontrado que al terminar el proceso al colocar las macroperlas en un recipiente de aceite mineral a un gradiente de temperatura, se pueden producir macroperlas con una forma y texturas más uniformes de lo que antes era posible.
A continuación se muestra la forma en la que se puede alcanzar estos objetivos.
Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra el suministro automatizado de células y agarosa dentro de un ensamble de múltiples pozos que contiene aceite mineral.
Las Figuras 2a-2b presentan diferentes vistas de una modalidad preferida de la "herramienta de trompeta" de la invención.
La Figura 3 muestra una segunda modalidad de la herramienta de trompeta.
Las Figuras 4a y 4b muestran diferentes modalidades de la herramienta de pajilla de la invención.
La Figura 5 ilustra un resumen del proceso de la invención.
La Figura 6 muestra un dispositivo usado para mantener el gradiente de temperatura durante la operación de la invención.
La Figura 7 ¡lustra los niveles de producción de insulina a partir de las perlas hechas con diferentes concentraciones y tipos de agarosa.
Descripción Detallada de la Invención Se hace referencia a las Patentes de Estados Unidos de América antes citadas, todas ellas describen metodologías manuales para producir macroperlas, que contienen diferente tipos de células, tales como células secretoras, como se define aquí. La invención descrita modifica estos métodos al reemplazar el paso final de poner en contacto las perlas de agarosa, recubiertas de agarosa con aceite mineral en una cuchara o en una superficie de Teflón, con un recipiente que contiene aceite mineral a un gradiente de temperatura, como se describe a continuación.
Las macroperlas, tal como se describe en estas patentes también pueden hacerse en forma robótica o automatizada. A continuación se describe un enfoque correspondiente.
En una modalidad, como se ilustra en la Figura 1, un despachador robótico, tal como un arreglo de pipetas, despacha células secretoras dentro de una placa de múltiples pozos, tal como una placa de 96 pozos estándar La agarosa fundida entonces se añade en los pozos. Las células y la agarosa fundida entonces se transfieren, por ejemplo, a través de un medio automatizado, tal como un ensamble de múltiples pipetas, al medio que contiene el aceite mineral, tal como contenedores de múltiples pozos o de un solo pozo, tal como las placas de 96 pozos para formar las perlas.
Las perlas entonces se remueven de los pozos, de preferencia, con el uso de la llamada "herramienta de trompeta", ilustrada en las Figuras 2a-c y 3. La herramienta de trompeta como es elaborada, está diseñada para no interrumpir la superficie de la perla.
En otra modalidad, se proporciona un medio de salida en el fondo del pozo, por donde se pueden escapar las perlas del pozo y se pueden usar en los siguientes pasos. En otra modalidad, las perlas que resultan del proceso antes descrito, pueden transferirse a la parte superior del aceite mineral a través de un medio automatizado, tal como una plataforma móvil y también se remueven del medio que contiene el aceite mineral por medio de sistemas automatizados.
Después de la captura por la herramienta de trompeta o del paso a través del medio de salida y la remoción de cualquier aceite mineral adherente por medio de enjuagar con una solución apropiada, tal como una solución salina balanceada, las perlas se colocan en pozos que contienen agarosa nueva, calentada. Después de esto, las perlas se remueven juntas con la agarosa caliente, de preferencia, con la llamada "herramienta de pajilla", como se muestra en la Figuras 4a y 4b con el uso de una succión moderada, y se suministran en recipientes que contienen aceite mineral a un gradiente de temperatura controlado.
El recipiente que contiene el aceite mineral puede ser por ejemplo, un tubo de ensaye, un matraz, un vaso de precipitados o cualquier otro objeto que sea apropiado, aunque se prefieren los tubos de ensaye y los matraces de varios tamaños. El material usado para fabricar estos contenedores, es decir, los tubos de ensaye, los matraces, etc., también puede variar. Se prefiere especialmente el vidrio, aunque se pueden usar otros materiales, tales como los recubiertos con una sustancia para proporcionar una capa hidrofílica.
El gradiente de temperatura en el recipiente se puede mantener con cualquier método conocido en la técnica. Una clave es que la temperatura del aceite mineral debe ser más alta en la parte superior del recipiente que en el fondo del mismo. La temperatura y cantidad del gradiente varía con base por ejemplo, en la longitud del recipiente, el tipo de célula encapsulada, el tipo de agarosa usada y demás. Los factores que son importantes para ajustar estos valores incluyen, por ejemplo, temperaturas a las cuales las células encapsuladas son viables, las temperaturas a las cuales la agarosa utilizada se va a solidificar y demás. La temperatura el inicio del gradiente de preferencia es de 20°C a 80°C, con más preferencia, de 20°C a 50°C e incluso con más preferencia, de 20°C a 40°C. En forma ideal, la temperatura de inicio es de aproximadamente 20°C aproximadamente a 25°C. La temperatura en el fondo del recipiente también puede variar de por ejemplo, 0°C a -10°C, con más preferencia de 0°C a -8°C y con preferencia superlativa de 0°C aproximadamente a -2°C. El diferencial total entre la temperaturas más alta y la más baja de preferencia es de 20°C a 50°C, con más preferencia, de aproximadamente 20°C a 30°C.
Las cantidades, que son parte de esta solicitud, se detallarán en la siguiente descripción.
La Figura 1 muestra la forma en que las células y la agarosa se suministran dentro de los pozos de las placas. Después de remover el aceite mineral a través de por ejemplo, lavado o aspiración o a través de un medio de salida antes descrito, la "herramienta de trompeta" referida antes y como se muestra en las Figuras 2a-2c y 3 se inserta dentro del pozo, para remover las perlas con la células atrapadas. La herramienta de trompeta tiene una fuente de vacío acoplada por un extremo, lo cual no interrumpe la superficie de la perla para asi , facilitar su remoción .
La perla consiste de una capa de agarosa y las células se deposita n a través de la llamada "herramienta de trompeta" dentro de un pozo nuevo, lleno con agarosa caliente que sirve como la segunda capa o recubrimiento de agarosa. La perla se remueve junto con la agarosa templada, de preferencia, con el uso de una "herram ienta de pajilla", tal como la mostrada en las Figuras 4a y 4b, de preferencia, con la ayuda de una succión moderada y la perla se coloca en el recipiente que contiene el aceite mineral a un gradiente de temperatura. El gradiente de temperatura puede mantenerse por ejemplo, por el dispositivo mostrado en la Figura 5, pero las personas experimentadas en la técnica podrán contemplar otras opciones. Cuando la macroperla ha atravesado el recipiente y ha alcanzado el fondo, se puede usar una forma alargada de la herramienta de trompeta , con succión para remover las macroperlas para lavarlas en el medio como se menciona antes, se puede emplear un medio de salida para remover la perla. En este punto, las macroperlas ya están listas para su uso, aunque en diferentes situaciones puede ser preferible permitir que las células proliferen y/o maduren dentro de las perlas hasta que haya un suficiente número o hasta que se exprese un producto específico por las células. Este tiempo puede variar por ejemplo, de una semana a varios meses.
Con referencia ahora a las Figuras de la invención reclamada , las Figuras 21 a , 2b, 2c y 3 muestran diferentes vistas de dispositivos de conform idad con la invención , de la llamada "herramienta de trompeta" : Con referencia a la Figura 2a, se muestra la herramienta 40 de trompeta. La descripción de la herramienta como una "herramienta de trompeta" se origina por la similitud de una sección 41 cónica negativa con una trompeta. Por un extremo, se proporciona un segmento 41 cónico negativo, con el borde 42 acoplado con el extremo 41 cónico. El extremo 41 cónico se conecta con una sección 43 longitudinal hueca que está adaptada para el paso de un fluido a través de la misma, como el aire.
Como se muestra en la Figura 2a, la sección 43 longitudinal hueco corre a lo largo de todo el dispositivo. Se puede observar un medio 44 de collar colocado aproximadamente a 2/3 a ¾ de la longitud de la herramienta de trompeta, con relación al extremo cónico negativo. El medio 44 de collarín, así como otras características aquí descritas, son artefactos del proceso de producción y no afectan el funcionamiento del dispositivo.
Sin embargo, el medio 44 de collarín marca el punto en donde el medio longitudinal expande su circunferencia. La porción del dispositivo representada en el 45 corresponde a un extremo de acoplamiento, que durante la operación, se conecta la herramienta con una fuente de fluido, por ejemplo, el aire, como el vacío. La abertura 46 de conexión tiene la circunferencia más ancha de cualquier parte del dispositivo y actúa para completar la conexión, por ejemplo, con el medio de vacío. Las estructuras internas, tales como las descritas en la Figura 2c, son provistas para facilitar el acoplamiento del medio de vacío. Estas estructuras pueden variar, por ejemplo, con base en el aparato a ser usado.
Se puede observar que el medio 47 de borde en el dispositivo, así como una serie de proyecciones 48a, b y c separadas uniformemente, todas ellas con el medio 44 de collarín, son artefactos de producción, sin embargo, estas proyecciones también sirven para ayudar a sostener las herramientas asociadas en su lugar, por ejemplo, en un anaquel de despacho.
El interior del dispositivo se puede observar en las Figuras 2b y 2c, en donde se puede observar que el dispositivo es hueco a lo largo de su longitud. La vista del segmento cónico negativo en la Figura 2c muestra con mayor detalle la forma en que se ahusa hasta un punto en donde la circunferencia es un poco menor que el objeto con el cual se acoplará, por ejemplo, una perla.
Durante la operación, el dispositivo 40 está conectado a través de un extremo 46 de conexión con por ejemplo, un medio de bomba de vacío y está colocado en forma vertical sobre el objeto a ser removido, tal como la perla. El medio de bomba de vacío (no mostrado) remueve el aire dentro de la herramienta y permite la captura de la perla, por ejemplo, al controlar la fuerza de succión creada por el vacío, la configuración del extremo 41 cónico negativo permite la remoción de la perla, tal como una perla de agarosa semi-suave, desde una posición y el movimiento entre sí, tal como una solución de un recubrimiento de agarosa. En este punto, la presión de vacío se cambia por ejemplo, al proporciona aire en un medio 45 longitudinal, que actúa para expulsar la perla dentro de la solución de agarosa desde el extremo 41 cónico sin cambios en la configuración de la perla.
La Figura 3 muestra otra modalidad del dispositivo de las Figuras 2a-2c. Este dispositivo, preparado a través de diferentes medios de producción diferentes a la modalidades de las Figuras 2a-2c, presenta un medio de lomo a lo largo de la sección 43 -longitudinal. También, se debe hacer notar que existen variaciones en el medio de collarín, asi como en los medios 47 y 48a-c de lomo. El extremo 41 cónico negativo y su borde, así como el extremo 45 de acoplamiento y la abertura de conexión, sin embargo, funcionan en la misma forma que las estructuras comparables de las Figuras 2a-2c.
Las Figuras 4a y 4b ilustran modalidades de un dispositivo conocido como la "herramienta de pajilla". Con referencia ahora a la Figura 4a, se muestra una herramienta 50 de pajilla. La herramienta presenta una geometría esencialmente cilindrica a lo largo del eje 51 longitudinal hueco, un extremo 52 de acoplamiento y un extremo 53 receptor.
La herramienta de pajilla incluye un espacio 54 rebajado, que se extiende a lo largo del eje 51 longitudinal, que se abre en el extremo 53 receptor.
El espacio 54 receptor se extiende a lo largo del eje longitudinal y se une con una sección 55 de canal que puede tener un menor diámetro que el espacio receptor. Esta sección 55 de canal une el medio 52 de conexión y la combinación de "52", "54" y "55" para formar un canal de trabajo que acepta cambios en la presión del fluido, tal como el aire u otro gas. Durante la operación, el medio 52 de conexión está acoplado con un dispositivo con un dispositivo con la capacidad de cambiar la presión del fluido en la herramienta de pajilla , tal como la bomba de aire. La herramienta de pajilla entonces se coloca sobre el objeto, tal como la perla y luego del cambio en presión , la perla se remueve de la herramienta de pajilla. Se debe hacer notar que el diámetro de la abertura en el extremo 53 receptor es suficientemente grande para capturar el objeto, por ejemplo , la perla y para permitir que la perla se mueva en forma vertical en la cavidad longitudinal de la herramienta . Una vez que la perla se mueve hacia la ubicación deseada , un segundo cambio en la presión provoca que la perla se caiga y permite volver a usar la herramienta de pajilla.
Las Fig uras 4a y 4b difieren en que las configuraciones del medio 52 de conexión son diferentes, sin embargo, la diferencia en las configuraciones resulta de los procesos de producción y no afecta la operación del dispositivo.
En cada dispositivo, las l íneas quebradas indican la adaptación de una herramienta de pajilla para recibir un medio de conexión de vacío de opción . Se i lustra un núcleo 56 rebajado que tiene la capacidad de aceptar el medio de conexión, tal como una junta tórica expansible. También una característica del dispositivo es un medio 57 para impedir el avance de la pipeta. Este "anaquel de pipeta" detiene el paso de la pipeta u otro medio de suministro para el fluido, por ejemplo, el aire.
Los siguientes ejemplos deben considerarse ejemplificativos, pero no limitativo , de la invención como se describe aquí .
EJEMPLO 1 La agarosa en polvo (Litex LSB-LV) se disolvió con un medio esencial mínimo a una concentración de 0.8% o 4.5% (w/v) y se esteriliza en el autoclave a 121°C por 20 minutos. Esto produjo soluciones fundidas viscosas. Las soluciones de agarosa entonces se enfriaron y se mantuvieron a 51-53°C o 61-63°C, respectivamente.
Un total de 150,000 células (de cáncer renal) se añadieron en el pozo, después de lo cual se añadieron 0.25 mi de una solución de 0.8% de agarosa para formar una suspensión, y esta suspensión de células/agarosa entonces se suministró dentro de aceite mineral a temperatura ambiente en un recipiente de plástico, o dentro de una placa de plástico de pozo 96 profundo previamente lleno con aceite mineral a temperatura ambiente.
La célula RENCA que contiene las macroperlas de agarosa formadas como perlas redondas son superficies lisas y células distribuidas uniformemente. El aceite mineral entonces se aspiró de las macroperlas y las macroperlas se lavaron con un medio de cultivo de célula RPMI.
El recubrimiento para la macroperlas usó la solución a 4.5% w/v. la agarosa para el recubrimiento fue del mismo tipo que la usada para las perlas, sin embargo, se debe hacer notar que puede cambiar.
Para llevar a cabo el modo manual para preparar las perlas, las perlas preparadas como antes se enrollaron en una cuchara de plástico que contenia 1.0 mi de 4.5% de agarosa, que se ha mantenido a 61-63°C, después de lo cual, se dejaron caer dentro del aceite mineral a temperatura ambiente.
En el método de la invención, el material de recubrimiento se mantuvo a 61-63°C y fue transferido a una placa de 24 pozos. La "herramienta de trompeta" mostrada en la Figuras 2a y antes descrita, entonces se usó para remover la perlas del aceite mineral a temperatura ambiente y para colocarlas dentro de una segunda solución de agarosa de recubrimiento, después de lavar las perlas para remover el aceite mineral. Una herramienta de pajilla, ilustrada en la Figura 4a, se usó junto con succión moderada para remover las perlas junto con 0.5 mi de agarosa en un recipiente que contenía aceite mineral a un gradiente de temperatura.
Las macroperlas se suministraron de la herramienta de pajilla en la parte superior del gradiente de aceite mineral, que se mantuvo a temperaturas variables, como se describe abajo. Conforme la macroperla desciende a través del aceite mineral, el recubrimiento solidificado en la perla forma una esfera. La temperatura del aceite mineral descendió de la parte superior a la parte inferior del recipiente, a una baja temperatura en el fondo, como se describe después. Las macroperlas de agarosa/agarosa entonces se remueven del recipiente con el uso de la herramienta de trompeta de la Figura 2a y después se lavan en el medio. Las macroperlas resultantes están listas para el cultivo de tejido rutinario.
EJEMPLO 2 Se usó una serie de experimentos diferentes, con el uso de gradiente de temperatura antes descrito.
Después de que las perlas se recuperaron y lavaron, como se describe antes, se probaron para su actividad metabólica. Esta evaluación se llevó a cabo con el uso de un ensayo MTT estándar que es bien conocido en la técnica. La actividad metabólica se determinó en el día =0 para las células no encapsuladas y a 7 después de la producción de los encapsulados. Los resultados se muestran a continuación.
Los resultados indican que mientras las células encapsuladas sobreviven sin considerar la temperatura de inicio cuando se dejan caer dentro del gradiente, la actividad metabólica fue inversamente proporcional a la temperatura a la cual inició el gradiente, es decir, entre más alta la temperatura, menor será la actividad metabólica resultante.
EJEMPLO 3 Dada la temperatura de inicio óptima del gradiente de aceite mineral de aproximadamente 25°C y la temperatura final de aproximadamente a -2°C, se usó en un grupo de experimentos para determinar la actividad metabólica y la capacidad inhibidora de tumor.
La actividad metabólica se determinó en la misma forma antes descrita.
La actividad inhibidora de tumor se determinó al sembrar células RENCA dentro de placas de 6 pozos (15,000 células/pozo) en 4 mi de un medio de cultivo fresco o la misma cantidad de medio de cultivo tomado de los cultivos de los encapsulados, después de 5 días de cultivo. Las células RENCA libres se cultivaron en el medio por 5 días a 37°C y a una atmósfera de 5% de C02 Las células RENCA entonces se fijaron con metanol, se entintaron con 0.33% (w/v) de rojo neutro y se determinó su absorbancia a 540 nm, con el uso de 630 nm como una longitud de onda de referencia. La inhibición se define como la diferencia en porcentaje en Abs5 onm-630nm entre el medio tratado y fresco.
Los siguientes resultados presentan los datos de actividad metabólica. El término "célula libre" se refiere a las células RENCA que no fueron tratadas con agarosa, mientras "primer recubrimiento" se refiere a perlas no recubiertas.
En la siguiente tabla, se determina la capacidad inhibidora de Los resultados indican que las perlas de agarosa producidas de conformidad con la invención son equivalentes en todos los aspectos para producir perlas en forma manual.
EJEMPLO 4 Las perlas se produjeron de conformidad con la invención como se describe antes y el método manual está representado por medio de la técnica previa citada. Después de un período de 7 meses, se seleccionaron 10 perlas, en forma aleatoria para determinar sus diámetros. Los resultados, presentados en la siguiente tabla, muestran que las perlas producidas de conformidad con la invención tienen un diámetro más consistente y por lo tanto, un recubrimiento más consistente.
También, luego de la examinación, se encontró que el proceso de la invención resultó en contaminación celular reducida. Para elaborarlo, se ha encontrado que cuando se preparan perlas de conformidad con el método manual de la técnica previa, existe el problema con células que no quedan completamente encapsuladas. Cuando las células son células cancerígenas, placas o formas de colonias tumorosas y las perlas en el cultivo entonces deben desecharse debido a la contaminación.
Después de un período de 8 meses, se formaron 56 lotes de perlas, cada lote contenía un número de cultivos de caja de Petri. Por lo menos un cultivo fue contaminado en cada lote. Por el contrario, se prepararon 62 lotes en el mismo período con el uso del método de la invención. Solamente 12 de los 62 lotes mostró cierto tipo de contaminación.
EJEMPLO 5 El siguiente ejemplo detalla la producción de tres grupos diferentes de islotes con contenido de perlas de agarosa, recubiertas con agarosa.
Las islotes se prepararon de animales de dos años de edad y con un historial de múltiples paridades.
La pancreasis de los animales se perfundió con una proteasa de colagenasa/neutral (ya sea Colagenasa P a 1.0 g/L o Liberasa MTF/Termosilina a 7.5 U/g páncreas) y 0.001 g/L Dnasa o 2.5 mg/solución de pulmozima de páncreas, preparados en una Solución Salina Balanceada Hanks (GBSS) o en una Solución de Depósito de Purificación de Almacenamiento en Frío.
Después de la cuantificación, las islotes se separaron en 2000 alícuotas IEQ, antes de volver a ser suspendidas en una solución de 0.5 mi de uno de 1.5% Seakem Gold ("SG" de aquí en adelante, 0.8% SG o 0.8% de Litex ("L¡" de aquí en adelante). Una "IEQ" como se utiliza aquí significa un islote que tiene un diámetro de 150 pm. Por lo tanto, un islote con un diámetro de 300 pm es 2 IEQ, mientras uno con un diámetro de 75 pm es .5 IEQ. La agarosa de Litex posee las siguientes propiedades: una resistencia al gel > 1000 g/cm2 a 1.5% de gel de 5.8 a 8.7 cP cuando se usa una solución de 1.5%, una temperatura de gelificación de 40-43°C para una solución de 1.5%, un valor EEO (electro endosmosis) de 0.06 a 0.12 y un contenido de sulfato de < o.3°%. Las soluciones se prepararon en un medio esencial mínimo más 25 nM HEPES.
Las suspensiones fueron expulsadas por debajo de la superficie de un aceite mineral esterilizado, para producir cuatro perlas esféricas de 0.125 mi, de aproximadamente 5-6 mm de diámetro, cada una con un contenido de 500 IEQ.
Estas perlas de agarosa no recubiertas se cultivaron a 37°C en una atmósfera humidificada de C02 al 5%. Después de 5 a 7 días, se aplicó un segundo recubrimiento de 5% de agarosa SG, lo que produjo perlas de agarosa que contenían islotes recubiertas de agarosa, con un diámetro final de 8-9 mm.
Estas perlas se cultivaron a 37°C en una atmósfera al 5% de C02, humidificada hasta que se usaron en los siguientes ejemplos. Se colocaron en un medio de cultivo (11 nM de glucosa, complementada con 2.5% de suero porcino inactivo de calor y 1% de antibiótico/antimícótico).
El medio de cultivo se cambió cada semana y las muestras del medio se analizaron, 24 horas después del cambio, cada semana para los ensayos descritos después.
EJEMPLO 6 Como se hace notar en el ejemplo anterior, las muestras del medio de cultivo se tomaron de las muestras y se analizaron para el contenido de insulina, con el uso de insulina porcina ELISA disponible a la venta. Los resultados se ilustran en la Figura 6. Se debe observar que las islotes encapsuladas en 0.8% de Li funcionaron mejor, ambas islotes encapsuladas en 0.8% de SG y 1.5% SG con respecto a la producción de insulina.
EJEMPLO 7 Los experimentos in vitro antes presentados se ampliaron a experimentos en vivo, como se describe aquí.
Se empleó un adulto (ratas de 8 semanas) en estos experimentos.
Los animales se dividieron en grupos de controles de "solamente insulina" o receptores de perla. Todos los animales recibieron 65 mg/kg de estreptozotocina a través de inyección de vena de cola para inducir la diabetes.
La presencia de diabetes se confirmó al analizar sangre de los animales sujetos para los niveles de glucosa sin ayunar. Se tomó un nivel sobre los 400 mg/dL de glucosa por 3 días consecutivos para indicar la presencia de diabetes. Cualquier animal que no exhibió diabetes en 2 semanas recibió una segunda dosis de estreptozotocina, después de lo cual los animales se hicieron diabéticos.
Los animales seleccionados para recibir implantes recibieron las perlas de conformidad con Gazda, et.al., Cell Transplant 16:609-620 (2007), incorporado aquí como referencia en su totalidad. Para elaborarlo, se anestesiaron animales viejos de 12-13 semanas con el uso de isoflurano. Después de una incisión en la línea media a lo largo de la cavidad peritoneal, se colocaron las perlas.
El número de perlas colocadas en cada animal varió, dependiendo de la dosis más alta de insulina suministrada a! animal particular en un período de 3 días antes del implante, se dividió por la producción de insulina promedio por macroperla (con base en la insulina producida por las perlas por un período de 4 semanas antes de la implantación). Los ratones recibieron la cantidad de perlas necesarias para proporcionar la dosis exacta de insulina que recibieron antes de la implantación (1x) o 1.7x de esa dosis. Los animales macho y hembra recibieron perlas ¡guales a 1x, pero solamente los machos recibieron 1.7x, en parte debido a que los ratones macho pesan más que los ratones hembra.
No se observaron diferencias significativas en los requerimientos de insulina pre-implantada con respecto a los diferentes tipos de implante (1.5% SG, 0.8% SG, 0.8% Li); sin embargo, se requirieron más macroperlas para las perlas de 1.5% SG y se requirieron menos para 0.8% de Li.
Después de la implantación, los animales se mantuvieron por 90 días, con glucosa en sangre y peso corporal monitoreados en forma regular.
Los ratones hembra (todos en el grupo 1x) mostraron una normalización sostenida, inmediata de los niveles de glucosa en sangre comparados con ratones que recibieron controles de insulina. Los ratones macho en el grupo 1x, exhibieron una mejora inmediata, pero temporal en la regulación de glucosa en sangre, lo que los regresó a niveles de pre-implante por aproximadamente 30 dias después del implante.
EJEMPLO 8 Se llevaron a cabo estudios en macroperlas después de que los animales receptores se sacrificaron y se examinaron para su integridad estructural y capacidad funcional.
Los exámenes mostraron que solamente dos de las 1540 macroperlas recuperadas mostraron daño estructural.
Los ejemplos anteriores describen varias características de la invención, que se relacionan con células secretoras que contienen macroperlas de agarosa, recubiertas con agarosa, en donde la agarosa usada para las macroperlas tuvieron las propiedades de la agarosa Litex, como se establece antes.
Como se establece aquí, el término "macroperla" se refiere a una estructura que es esencialmente esférica, con un diámetro de aproximadamente 4 aproximadamente a 10-12 mm de diámetro, con más preferencia, de aproximadamente 6 aproximadamente a 8 mm de diámetro. La segunda capa de agarosa de preferencia, es de aproximadamente 0.05 aproximadamente 5 mm de espesor, con más preferencia, de aproximadamente 0.5 mm aproximadamente a 5 mm de espesor, incluso con más preferencia, de aproximadamente 1.0 mm aproximadamente a 3 mm y con más preferencia, de aproximadamente 1.0 mm aproximadamente a 2.0 mm de espesor. La segunda capa de agarosa por ejemplo, puede ser la misma agarosa usada para hacer la perla, aunque no necesariamente.
Las "macroperlas" se usaron como una estructura preferida, sin embargo, cualquier estructura sólida de agarosa, que encapsula células secretoras, y de preferencia, recubierta con una segunda capa de agarosa, son características de la invención.
Las células secretoras pueden variar. Cualquier célula u organelo que produzca un producto secretor, deseable se puede encapsular. Las islotes, las células de cáncer y las células madre son ejemplos de los tipos de materiales que se pueden usar. Cada perla puede contener un número variable de organelos celulares, para islotes por ejemplo, de aproximadamente 50 aproximadamente a 5000 equivalentes de islotes (de aquí en adelante "IEQ"), con más preferencia, de aproximadamente 100 aproximadamente a 2500 IEQ, incluso con más preferencia, de aproximadamente 250 aproximadamente a 1000 y con más preferencia, de aproximadamente 4745 aproximadamente a 550 IEQ. Aproximadamente 500 IEQ son más preferidas.
También una característica de la invención es un método mejorado para producir macroperlas, sin considerar la agarosa usada. Las células se mezclan con agarosa, y después se forman en una suspensión que a su vez, se usa para formar la perla. La perla, por ejemplo, una macroperla, después se recubre con agarosa, después de lo cual la perla recubierta resultante se suministra dentro de una muestra de aceite mineral a un gradiente de temperatura, de modo que la perla hace contacto con el aceite mineral a una temperatura más alta y cae en el aceite a una temperatura más baja. Las perlas pueden contener cualquier tipo de célula deseada, tal como sin limitar, células secretoras, células cancerígenas, islotes, células madre, tal como células madre pluripotentes y demás.
En modalidades particularmente preferidas, las herramientas de "trompeta" y de "pajilla" como se describen aquí, se usan para remover las perlas no recubiertas y recubíertas, respectivamente.
El gradiente de temperatura del aceite mineral puede variar. De preferencia, el gradiente es de 20°C a 50°C, es decir, la diferencia entre las temperaturas más alta y más baja caen dentro de este intervalo. Con más preferencia, la diferencia es de 20°C a 35°C.
La temperatura más alta del aceite puede variar, pero está de preferencia, entre 20°C y 30°C, con más preferencia entre 20°C y 35°C. en forma similar, la temperatura más baja puede variar y va desde 0°C a -8°C, y con más preferencia, de 0°C a -2°C.
Otros aspectos de la invención serán evidentes para las personas experimentadas en la técnica, y no necesitan describirse más.
Los términos y expresiones aquí empleados se usan como términos de descripción y no de limitación y no se tiene la intención de usar términos y expresiones para excluir equivalentes de las características mostradas o porciones de las mismas, ya que se puede reconocer que son posibles modificaciones dentro del alcance de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir una composición de material que comprende una muestra de células en una perla que contiene agarosa, en donde la perla está recubierta con agarosa, que comprende: (a) mezclar una primera muestra de agarosa con las células para formar una suspensión; (b) formar una perla de la suspensión; (c) recubrir la perla con una segunda solución de agarosa; y (d) suministrar la perla recubierta dentro de una muestra de aceite mineral, en donde la muestra de aceite mineral se mantiene a un gradiente de temperatura para que la perla se mueva del aceite mineral a una temperatura más alta a un aceite mineral con una temperatura más baja.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células son células secretoras.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células son células cancerígenas.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células son células madre cancerígenas.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células son células de islote.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células con células madre.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde las células son células madre de embrión.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células son células pluripotentes.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, que también comprende remover la perla de la suspensión con una herramienta de trompeta antes de recubrir la perla con una segunda solución de agarosa.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, que también comprende remover la perla del aceite mineral con una herramienta de trompeta.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el gradiente de temperatura es de aproximadamente 20°C aproximadamente a 50°C, con la temperatura más alta al inicio del gradiente.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde la temperatura más alta varia de aproximadamente 20°C aproximadamente a 35°C.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la temperatura más alta es de aproximadamente 20°C aproximadamente a 30°C y la temperatura más baja es de aproximadamente 0°C aproximadamente a -8°C.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la temperatura más alta es de aproximadamente 20°C aproximadamente a 25°C y la temperatura más baja es de aproximadamente 0°C aproximadamente a -2°C.
15. Un aparato útil para transportar un objeto desde un punto a otro que comprende una construcción de una pieza que tiene un eje longitudinal hueco, el eje longitudinal hueco tiene en un extremo, una superficie cónica negativa que une el eje longitudinal hueco y por un segundo extremo, un medio adaptado para unir un medio de vacío, el medio en el segundo extremo tiene un mayor diámetro que el de ambos, el eje longitudinal y el medio cónico negativo.
16. Un aparato útil para transportar un objeto desde un punto a otro que comprende una construcción de una pieza que tiene un eje longitudinal hueco y dos extremos, un primer extremo del cual está adaptado para la conexión con el medio de vacío y un segundo extremo adaptado para recibir el objeto a ser transportado, el aparato también comprende un medio interno adaptado para recibir un medio de conexión para una fuente de fluido y un medio para impedir el dispositivo de suministro usado para transportar el fluido.
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