JP2023510681A - 細胞培養システムおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
一部の実施形態では、培養デバイスは培養プレートまたは培養フラスコである。
一実施形態では、複数の取り外し可能なマイクロ流体マイクロウェルは、培養デバイス中で互いに連結する。
一実施形態では、マイクロ流体チャンネルは、複数の細胞インレットを含む。
一実施形態では、中空部のマイクロ流体チャンネルは、互いに流体連絡している。
一実施形態では、細胞は、接着(anchorage)依存性細胞である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞、神経細胞または線維芽細胞である。
一実施形態では、細胞は、最小表面積を有する複数のマイクロ流体マイクロウェルのマイクロ流体チャンネル上の細胞インレットへとロードされる。
一実施形態では、細胞は、30%コンフルエンスの密度でロードされる。
一実施形態では、細胞ロードステップは、未滅菌(unsterile)環境とのいかなる接触もせずに、滅菌条件下で行なわれる。
一実施形態では、方法は、大規模で細胞を自動的に培養することができる。
一実施形態では、方法は、臨床規模の細胞増殖のために用いることができる。
以下の実施例は、例示のために提供されるが、特許請求される発明を限定しない。
細胞培養システム
細胞培養システムは、複数の取り外し可能なマイクロ流体マイクロウェル(4個のマイクロウェルなど)および該マイクロ流体マイクロウェルを保持する培養デバイスを含む。マイクロ流体マイクロウェルを保持する培養デバイスは、細胞培養分野で用いられる公知の培養ディッシュである。本開示の取り外し可能なマイクロ流体マイクロウェルは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)で製造された。レーザー切断技術を用いて、様々なサイズの様々なパターン(円形、三角形、正方形、六角形、または八角形)を、マイクロ流体マイクロウェルの底層につくり出した。細胞ロード導入口のための中央の穴を有する薄いカバープレートを、パターンの上部に固定した。
間葉系幹細胞(MSC)は、ヒト眼窩脂肪幹細胞であり、それらの成長用培地キット(MesenPro)中で維持された。細胞は、製品説明書に従えば、三系統分化能力を有し、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166について陽性であり、かつCD14、CD31、CD45について陰性である。図4に示される通り、本開示の細胞培養システムおよび慣用の(Ctrl)培養フラスコの両方が、CD90、CD105、CD73についての高陽性ならびにCD45、CD34、CD11b、CD19およびHLA-DRについての陰性を有するMSC表現型を維持する。
細胞培養のための六角形形状のマイクロウェル。1000個のMSCを、15cm培養ディッシュの層1パターン(L1)内へと播種した。同じ個数のMSCを、対照(Ctrl)として慣用の15cm培養ディッシュ中に同様に播種した。図4に示される通り、同じ播種細胞数を用いて、細胞培養システムでの総細胞数は、慣用の培養フラスコ中の細胞数を超えていた(A)。同じ初期播種密度(30%コンフルエンス)を用いて、パターン培養でより少ない播種細胞数が得られ、パターン化培養での細胞数の倍率は、5日間の培養後に慣用のフラスコでの倍率を超えていた(B)。
第N継代細胞でのMSCの割合を特性決定するために、フローサイトメトリーアッセイを行なった。培養した細胞を、PBS中の1mM EDTAを用いて回収し、1,500rpmで5分間遠心分離し、1mLのMemsen PRO中に再懸濁した。1×105個の細胞をポリスチレン丸底チューブ(BD Biosciences)に移し、1,500rpmで3分間遠心分離し、モノクローナル抗体(mAb)を含有する100μLのFACSバッファー中に再懸濁した。4℃で20分間のインキュベーション後、1mL FACSバッファーを用いて細胞を洗浄し、300μLのPBS中の1%パラホルムアルデヒド中で固定した。サンプル当たり5万個の細胞を取得し、FACSCanto II機器(BD Biosciences)およびFlow Joを用いて分析した。CDマーカー(CD44、CD73、CD90、CD105、CD11 b、CD19、CD34、CD45、およびHLA-DR;BD Stemflow hMSC分析キット;BD Biosciences, San Jose, CA, USA)の発現。図5に示される通り、パターン培養および慣用の(Ctrl)フラスコ培養の両方が、CD90、CD105、CD73についての高陽性ならびにCD14、CD34、CD11およびHLA-DRについての陰性を有するMSC表現型を維持する。
脂肪形成のために、第1または第2継代での1.9×104個の細胞を、24ウェルプレートにプレーティングし、1mL Memsen PRO中で培養した。続いて、細胞が100%コンフルエントになったら、培地を、1mLの完全STEMPRO脂肪形成分化培地(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)に切り替えた。週2回の培地交換を伴って3週間、脂肪形成培地中で細胞を維持した。脂肪形成培養物を、RTにて1時間、10%ホルマリン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)中で固定し、新鮮なオイルレッドO溶液(ストック:イソプロパノール中0.3%、3部のストックを2部の水に混合し、0.2mフィルターを通してろ過した;Sigma-Aldrich)を用いてRTにて1時間染色した。続いて、洗浄液が透明になるまで、細胞を水で洗浄した。光学顕微鏡を用いて細胞を可視化し、撮影した。脂肪形成性分化を定量化するために、RTにて10分間、100%イソプロパノール(Sigma-Aldrich)を添加することにより、オイルレッドO染色を溶出させた。490nmでの吸光度を、3回反復で読み取った。骨形成のために、1×104個の細胞を24ウェルプレートにプレーティングし、1mL Memsen PRO中で培養した。細胞が50~70%コンフルエントになったら、1mLの完全STEMPRO骨形成分化培地(Invitrogen)を用いて培地を置き換えた。週2回の培地交換を伴って3週間、骨形成性培地中で細胞を維持した。骨形成培養物を、4℃にて1時間、1mLの氷冷70%エタノール(Sigma-Aldrich)中で固定し、RTにて10分間、蒸留水中の4mMアリザリンレッドS(水酸化アンモニウムを用いてpHを4.2に調整した;Sigma-Aldrich)を用いて染色した。過剰な色素を除去し、水で4回洗浄した。光学顕微鏡を用いて細胞を撮影した。骨形成性分化を定量化するために、400mLの10%(vol/vol)酢酸を各ウェルに添加し、振盪しながら30分間インキュベートした。セルスクレイパーを用いて細胞を穏やかにかき取り、10%(vol/vol)酢酸(Sigma-Aldrich)と共に1.5mL微量遠沈管へと移した。パラフィルムを用いてチューブを密封し、30秒間しっかりとボルテックスにかけ、85℃まで10分間加熱し、続いて氷に5分間移した。20,000gで15分間の遠心分離後、上清を新しい1.5mL微量遠沈管に移した。10%(vol/vol)水酸化アンモニウム(Sigma-Aldrich)を用いて、pHを4.1~4.5に調整した。415nmでの吸光度を、3回反復で読み取った。軟骨形成のために、1.65×105個の細胞を15mLコニカルチューブに入れ、1500rpmで5分間遠心分離した。ペレットを、0.5mLの完全STEMPRO軟骨形成分化培地(Invitrogen)中で1週間培養した。サイズ分析のための定規と共に、ペレットの写真を撮った。ペレットを、4%パラホルムアルデヒド中で最大2日間固定し、続いて1mLの30%スクロース中に4℃で1日間置いた。凍結切片(10μm)をスライドに載せ、トルイジンブルーO(Sigma-Aldrich)を用いて染色した。光学顕微鏡を用いて写真を撮った。軟骨形成性分化を定量化するために、4%パラホルムアルデヒドを用いて15分間、ペレットを固定し、1×PBSを用いて2回洗浄し、トルイジンブルーOを用いて15分間染色した。1×PBSを用いて細胞を再度洗浄し、未結合の色素を除去した。1%SDSを用いて色素を抽出し、595nmでの吸光度を3回反復で読み取った。図6に示される通り、パターン内で培養されたMSCを、続いて、分化のために刺激した。パターン化培養および慣用の(Ctrl)フラスコ培養の両方が、MSCの三系統分化能力を維持した。細胞は、(A) 骨形成誘導の21日後にアルカリホスファターゼおよびアリザリンレッド、(B) 脂肪形成誘導の21日後にオイルレッドO、および(C) 軟骨形成誘導の6日後にアルシアンブルーを用いて、それぞれ陽性に染色された。
製造業者のプロトコールに従って、分離試薬(培養培地からのエクソソーム単離キット;Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて、エクソソームを培養培地から単離した。細胞を、10%のエクソソーム不含FBSを含有するMesenPro(System Biosciences)を用いて、1×106細胞/ディッシュの濃度で、10cmディッシュへと播種した。48時間のインキュベーション後、エクソソーム抽出のために馴化培地を回収した。培養培地を2,000×gで30分間遠心分離し、細胞および残渣を除去した。続いて、上清を220nmフィルターに通し、新しいチューブに移し、試薬を添加した。インキュベーション後、サンプルを10,000×gで1時間遠心分離し、上清を廃棄した。エクソソームはチューブの底にペレット化され、ペレットを、蛍光イメージングのためにリン酸緩衝生理食塩液(PBS)中に再懸濁した。
自己分泌および傍分泌関連遺伝子の発現を、QPCRを用いて検出した。SDF-1(F:5'-GCCAAAAAGGACTTTCCGCT-3'(配列番号1)、R:5'-GCCCGATCCCAGATCAATGT-3'(配列番号2))。
Claims (24)
- (i) 1個以上の取り外し可能なマイクロ流体マイクロウェル、および(ii) 該マイクロ流体マイクロウェルを保持する培養デバイス、を備える細胞培養システムであって、各マイクロ流体マイクロウェルが、区画化され、かつ該マイクロ流体マイクロウェル全体にわたって底部を有しないマイクロ流体チャンネルを含む、1つまたは複数の中空部を有し、該マイクロ流体チャンネルは1箇所以上の細胞インレットを含む、上記細胞培養システム。
- (i) 複数の取り外し可能なマイクロ流体マイクロウェル、および(ii) 該マイクロ流体マイクロウェルを保持する培養デバイス、を備える請求項1に記載の細胞培養システムであって、各マイクロ流体マイクロウェルが、区画化され、かつ該マイクロ流体マイクロウェル全体にわたって底部を有しないマイクロ流体チャンネルを含む、1つまたは複数の中空部を有し、該マイクロ流体マイクロウェルの該マイクロ流体チャンネルの表面積は徐々に拡大し;最小表面積を有する該複数のマイクロ流体マイクロウェルの該マイクロ流体チャンネルと比較して、該複数のマイクロ流体マイクロウェルの該マイクロ流体チャンネルの表面積は、2n、3nまたは4nのサイズ増加を示し、nは該複数のマイクロ流体マイクロウェルの個数よりも1小さい整数であり;かつ該マイクロ流体チャンネルは1箇所以上の細胞インレットを含む、上記細胞培養システム。
- 前記培養デバイスが培養プレートまたは培養フラスコである、請求項1または2に記載の細胞培養システム。
- 前記中空部が、円形または3~8個の角を有する多角形のパターンになっている、請求項1または2に記載の細胞培養システム。
- 前記中空部が、三角形、四角形、五角形、六角形、八角形または九角形のパターンになっている、請求項1または2に記載の細胞培養システム。
- 前記中空部が、六角形のパターンになっている、請求項1または2に記載の細胞培養システム。
- 少なくとも3個の取り外し可能なマイクロ流体マイクロウェルを備える、請求項1または2に記載の細胞培養システム。
- 少なくとも5個の取り外し可能なマイクロ流体マイクロウェルを備える、請求項1または2に記載の細胞培養システム。
- 3~15個の取り外し可能なマイクロ流体マイクロウェルを備える、請求項1または2に記載の細胞培養システム。
- 前記複数の取り外し可能なマイクロ流体マイクロウェルが、前記培養デバイス中で互いに連結する、請求項1または2に記載の細胞培養システム。
- 前記マイクロ流体チャンネルが、複数の細胞インレットを含む、請求項1または2に記載の細胞培養システム。
- 前記中空部の前記マイクロ流体チャンネルが、互いに流体連絡している、請求項1または2に記載の細胞培養システム。
- (1) 請求項1または2に記載の細胞培養システムの取り外し可能なマイクロ流体マイクロウェルの前記マイクロ流体チャンネル上の前記細胞インレットへと細胞をロードするステップ、および(ii) 細胞の増殖のために好適な条件下で該細胞を培養するステップ、を含む、細胞を培養するための方法。
- 前記細胞が接着(anchorage)依存性細胞である、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞が、幹細胞、神経細胞または線維芽細胞である、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞が、最小表面積を有する前記複数のマイクロ流体マイクロウェルの前記マイクロ流体チャンネル上の前記細胞インレットへとロードされる、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞が、30%コンフルエンスの密度でロードされる、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞が、前記培養デバイスが傾斜または遠心分離される状況下で前記マイクロ流体チャンネル上の前記細胞インレットへとロードされる、請求項13に記載の方法。
- 傾斜角が、三角形および六角形において120度、240度もしくは360度であるか、または四角形および八角形において90度、180度、270度、360度である、請求項13に記載の方法。
- 細胞が50%超のコンフルエンスに達するときに、先行するマイクロ流体マイクロウェルが取り外され、かつ後続のマイクロ流体マイクロウェルが請求項1または2に記載の前記細胞培養システムの前記培養デバイス中へと追加される、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞ロードステップが、未滅菌(unsterile)環境とのいかなる接触もせずに、滅菌条件下で行なわれる、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞ロードステップが、未滅菌環境とのいかなる接触もせずに、滅菌条件下で行なわれる、請求項13に記載の方法。
- 大規模で細胞を自動的に培養することができる、請求項13に記載の方法。
- 臨床規模の細胞増殖のために用いることができる、請求項13に記載の方法。
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