DE69633444T2

DE69633444T2 - Zusammensetzungen aus rekonstituierten kollagenfasersegmenten und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69633444T2
Application number: DE69633444T
Authority: DE
Inventors: M. Robert CARR; F. John CAVALLARO; M. Lisa BRYANT; W. David DONOVAN; D. Paul KEMP
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: BR9609393A; JPH11508782A; EP0831882A1; AU6382196A; PT831882E; WO1996040216A1; ATE276757T1; JP3647465B2; EP0831882B1; AU722322B2; US5997896A; EP0831882A4; ES2229277T3; DE69633444D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft injizierbare Kollagenzusammensetzungen, welche Kollagenfasersegmente enthalten sowie Verfahren zur Herstellung solcher Kollagenfasersegmente, zum Beispiel injizierbare Kollagenzusammensetzungen zur Gewebsvermehrung und Wirkstofffreisetzung.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Kollagen ist das Hauptstrukturprotein im Körper und macht etwa ein Drittel der gesamten Körperproteine aus. Es umfasst das meiste organische Material von Haut, Sehnen, Knochen und Zähnen und kommt als faserförmige Inklusionen in den meisten anderen Körperstrukturen vor. Einige der Eigenschaften von Kollagen sind seine hohe Zugfestigkeit, seine Ionenaustauschfähigkeit, teilweise aufgrund der Bindung von Elektrolyten, Metaboliten und Arzneimitteln, seine geringe Antigenität aufgrund der Maskierung potentiell antigener Determinanten durch die Helixstruktur und seine geringe Dehnbarkeit, Semipermeabilität und Löslichkeit. Weiters ist Kollagen eine natürliche Substanz für die Zelladhäsion. Diese Eigenschaften und viele mehr machen dieses Protein zur Herstellung medizinischer Produkte wie die Herstellung implantierbarer Prothesen, als Zellwachstumssubstrate und zur Erzeugung zellulärer und azellulärer Gewebsäquivalente geeignet.
Kollagenzusammensetzungen werden normalerweise durch Dispersion, Digestion oder Lösung aus Haut oder Sehnen hergestellt. Die Dispersion beinhaltet das mechanische Abscheren des Gewebes zur Herstellung einer Kollagenfasersuspension. Die Digestion beinhaltet die Enzymdegradation von nichthelikalen Telopeptidabschnitten des Kollagenmoleküls, was in einer Atelopeptidkollagenlösung resultiert. Die Lösung beinhaltet die Abspaltung saurer labiler Vernetzungen in neu gebildeten Kollagenfasern, was in einer Lösung von Kollagenmonomeren und -polymeren resultiert. Zu den Verfahren zählen die Säure- oder Enzymextraktion. Die Enzymextraktion wird in vielen Fällen bevorzugt, da ihre Methoden einen höheren Ertrag und ein Kollagen höherer Reinheit erzielen. Die Enzymextraktion hat jedoch den Nachteil, dass teilweise zersetztes Kollagen erzeugt wird, d. h. die Extraktionsenzyme spalten das Kollagenmolekül an den nichthelikalen Endregionen ab, welche die intermolekularen Vernetzungen enthalten.
Injizierbare Formulierungen wurde in der Technik als Gewebeauffüllzusammensetzungen verwendet, insbesondere in der Urologie und plastischen Chirurgie. US-Patentschrift Nr. 3,949,073, Daniels et al., offenbart ein injizierbares Kollagen in wässriger Form zusammengesetzt aus enzymextrahiertem Kollagen. Das beim Extrahierungsprozess verwendete Enzym ist Pepsin, wodurch ein Atelopeptidkollagen erzeugt wird. Die Konzentration des Endproduktes liegt bei etwa 20 mg/ml, aber der Zusammensetzung kann allerdings auch unlösliche Kollagenfibrillen zugesetzt sein. Bei der Implantation in einen Patienten verringert sich jedoch die Volumenpersistenz des Implantats, teilweise aufgrund der Absorption des wässrigen Trägers durch den Körper, und teilweise aufgrund der geringen Kollagenkonzentration. Nachfolgeinjektionen an dieser Stelle sind üblicherweise notwendig.
Volumenpersistenz und Formpersistenz sind beim injizierten Kollagenimplantat erwünscht. In der Zeit nach der Injektion von in der Technik bekannten Kollagenzusammensetzungen verringert sich das Volumen aufgrund der Absorption der flüssigen Komponente der Zusammensetzung durch den Körper. Höhere Kollagenkonzentrationen unterstützen die Aufrechterhaltung der Volumenpersistenz, verringern aber gleichzeitig die Spritzbarkeit und das Eindringungsvermögen der Zusammensetzung.
US-Patentschrift Nr. 4,642,117, Nguyen et al., offenbart ein injizierbares Kollagenmaterial zusammengesetzt aus rekonstituierten, mechanisch abgescherten Atelopeptidkollagenfasern. Die Kollagenfasern werden mittels eines steifen Siebgewebes mechanisch abgeschert, um die Größe der größeren Fasern auf etwa 50–150 Mikronen zu verringern. Die offenbarte Zusammensetzung besitzt eine abschließende Konzentration von etwa 35–65 mg/ml, jedoch wurde festgestellt, dass Extrudierbarkeit und Eindringungsvermögen schlecht sind. US-Patentschrift Nr. 4,582,640, Smestad, beschreibt eine ähnliche Zusammensetzung, welche Gluteraldehyd-vernetzt ist. In klinischen Tests fand man allerdings heraus, dass die Spritzbarkeit der Zusammensetzung auch schwierig war, besonders bei intradermalen Injektionen. US-Patentschrift Nr. 4,803,075, Wallace et al., offenbart eine ähnliche injizierbare Zusammensetzung unter Zugabe eines biokompatiblen flüssigen Schmiermittels zur Überwindung des Problems der Spritzbarkeit und des Eindringungsvermögens.
Genauso wie die Volumenpersistenz, ist die Formpersistenz der in der Technik bekannten injizierbaren Kollagenzusammensetzungen erwünscht. Beim Injizieren neigt das Kollagen dazu, durch das Gewebe zu migrieren; daher würde, wenn eine spezifische oder lokale Vermehrung oder Quellung erforderlich ist, eine solche Migration nachträgliche Injektionen erfordern.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine injizierbare Kollagenzusammensetzung in der Form von rekonstituierten Kollagenfasersegmenten, Verfahren zur Herstellung von Kollagenfasersegmenten und deren Verwendung als eine injizierbare Kollagenzusammensetzung, welche die Nachteile in der Technik bekannter injizierbarer Kollagenzusammensetzungen überwindet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bietet injizierbare Kollagenzusammensetzungen, welche Kollagenfasersegmente aufweisen sowie Verfahren zur Herstellung solcher Kollagenfasersegmente, wie in den Patentansprüchen definiert.
Die vorliegende Erfindung bietet injizierbare Kollagenzusammensetzungen mit verbesserten Eigenschaften gegenüber in der Technik bekannten injizierbaren Kollagenzusammensetzungen. Bevorzugte injizierbare Kollagenzusammensetzungen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, besitzen eine hohe Kollagenkonzentration. Die injizierbaren Zusammensetzungen sind von Nutzen bei Gewebsvermehrung, Gewebsreparatur und Wirkstofffreisetzung. Sie besitzen außerdem verbesserte Eigenschaften für die Bio-Rekonstruktion gegenüber anderen bekannten Zusammensetzungen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Verwendung bei Verfahren zur Herstellung rekonstituierter Kollagenfasersegmente.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Kollagen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann man aus jeder geeigneten Quelle, normalerweise Haut und Sehnen, gewinnen. Viele Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Kollagen, die normalerweise Säure- oder Enzymextraktion beinhalten, sind dem Fachmann bekannt und können zur Herstellung von Kollagen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Mittels Säureextraktionsverfahren gewonnenes Kollagen ist mehr bevorzugt gegenüber Enzymextraktionsverfahren, da die nichthelikalen Telopeptidregionen im Kollagenmolekül erhalten bleiben, wenn Säureextraktionsverfahren zum Einsatz kommen. Eine bevorzugte Kollagenzusammensetzung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist säureextrahiertes Rindersehnenkollagen, offenbart in US-Patentschrift Nr. 5,106,949.
Kollagenlösungen welche Kollagen zur Herstellung von Kollagenfadensegmenten durch die hierin beschriebenen Verfahren aufweisen, besitzen im Allgemeinen eine Konzentration von bevorzugt zumindest etwa 1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml, mehr bevorzugt von etwa 4 mg/ml bis etwa 6 mg/ml, am meisten bevorzugt 4,5 bis 5,5 mg/ml und einen pH-Wert von etwa 2 bis 4. Ein bevorzugtes Lösemittel für das Kollagen ist verdünnte Essigsäure mit etwa 0,05 bis 0,1%, mehr bevorzugt mit etwa 0,05%. Weitere verdünnte Säurelösemittel, die zum Einsatz kommen können, sind Salzsäure, Zitronensäure und Ameisensäure. Die Kollagenlösung kann gegebenenfalls Substanzen wie Pharmazeutika, Wachstumsfaktoren, Hormone, andere extrazelluläre Matrixkomponenten, andere Kollagenarten oder genetisches Material, wie Vektoren oder andere genetische Konstrukte oder Antisense-Oligonukleotide oder ähnliches in der Lösung aufweisen. Werden in der Kollagenlösung mit diesen Substanzen Kollagenfasersegmente gebildet, kommt es zum Einschluss dieser Substanzen in die Segmente.
Bei einem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Kollagenfasersegmente durch ein Verfahren hergestellt, welches Folgendes umfasst: diskontinuierliche Extrusion einer Kollagen-aufweisenden Lösung in ein Neutralisierungs- und/oder Dehydrierungsmittel, welches manchmal als „Koagulationsmittel" bezeichnet wird, wobei das Mittel in der Lage ist, die Kollagenlösung zu neutralisieren und/oder zu dehydrieren, um Kollagenfasersegmente zu bilden, sowie das Sammeln der gebildeten Kollagenfasersegmente.
Das Dehydrierungsmittel sollte eine Lösung sein, die das Wasser aus der Kollagenlösung entfernt, damit das Kollagen konzentriert wird. Bei der Konzentrierung verfestigt sich das Kollagen. Ein bevorzugtes Dehydrierungsbad umfasst ein Dehydrierungsmittel mit einem höheren osmotischen Druck als dem der Kollagenlösung, bevorzugt höher als etwa 500 mOsm und einem pH-Wert von etwa 5 bis 10, bevorzugt mit einem pH-Wert von etwa 7 bis 9. Zu weiteren bevorzugten Dehydrierungsmitteln zählen wasserlösliche biokompatible Polymere wie DEXTRAN^® und Polyethylenglykol (PEG). Salzlösungen wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) sind bevorzugt, wobei das Phosphat mit einer Konzentration von etwa 0,001 bis etwa 0,02 M und einer Salzkonzentration von etwa 0,07 bis etwa 0,3 M vorliegt. Weitere bevorzugte Dehydrierungsmittel sind Isopropylalkohol und Azeton. In der bevorzugten Ausführungsform wird 20 Gew./Vol%. Polyethylenglykol, MW 8000 (PEG-8000) in Phosphatpuffer verwendet.
Die Kollagenlösung wird in kleinen Mengen aus dem Behälter, in dem es sich befindet, abgegeben. Die Mittel zum Abgeben können manuell mittels einer Spritze oder automatisch gesteuert mittels einer Pumpe, welche an einer Spritze oder Patrone angebracht ist, welche die Kollagenlösung enthält, hergestellt werden.
Bei weiteren bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren der Herstellung von Kollagenfasersegmenten ferner das Spülen der gebildeten Fasersegmente in einem Puffer zur Entfernung von verbleibendem Dehydrierungs/Neutralisierungsmittel.
Es kann außerdem erwünscht sein die Kollagenfasersegmente zu vernetzen. Das Vernetzen stabilisiert die Kollagenfasern und reguliert die Biorekonstruktion des Kollagens durch Zellen, wenn es in einen Patienten implantiert wird. Obwohl die Vernetzung ohne das Spülen der Kollagenfasersegmente erfolgen kann, werden die Kollagenfasersegmente in bevorzugten Ausführungsformen vor der Vernetzung gespült.
Wie hierin verwendet hat der Begriff Kollagenfasersegmente daher die zugedachte Bedeutung von verarbeitetem Kollagen, hergestellt aus Kollagenlösungen, so dass es als ein Fasersegment rekonstituiert ist.
Lediglich zum Zweck der Veranschaulichung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung und nicht zum Zweck deren Einschränkung werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung durch die Herstellung von Kollagenfasersegmenten mit Hilfe der in 1 gezeigten Vorrichtung veranschaulicht.
1 weist eine Druckluftquelle 1, die mit einer Speicherpatrone 2 verbunden ist, Hochdruckschläuche 3, ein Abgabeventil 4 und eine Nadel 7 auf, die durch den Schlauch 8 hindurch eingeführt ist. Die Druckluftquelle 1 ist außerdem mit einer Pneumatik-Steuerung 5 verbunden und diese über einen Schlauch 6 mit dem Abgabeventil 4. Das Neutralisierungs- und Dehydrierungsbad 9 ist mit einer Schlauchradpumpe 12 und über einen Schlauch 8 mit einem Kolben 11 mit Ablass an seinem Boden, welcher einen Netzbeutel 10 enthält, verbunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Kollagen mit 5 mg/ml in 0,05% Essigsäure enthaltende Patrone 2 durch die durch eine regulierte Luftdruckquelle 1 bereitgestellte Druckluft konstantem Druck ausgesetzt. Das Kollagen wird über einen Hochdruckschlauch 3 aus dem Abgabeventil 4 freigesetzt. Das Ventil 4 ist über einen Schlauch 6 mit einer Pneumatik-Steuerung 5 verbunden, welche wiederholte Luftimpulse an das Ventil 4 gibt. Das Ventil 4 ist mit einer Nadel 7 mit stumpfer Spitze ausgerüstet, welche durch die Wand des Schlauches 8 gestochen ist, so dass sich die Spitze in der Mitte des Hohlraumes befindet. Der Schlauch 8 bildet ein umlaufendes Neutralisierungs- und/oder Dehydrierungsbad 9, welches durch Einsatz der Schlauchradpumpe 12 mit einer Geschwindigkeit von etwa 520 ml/min zirkuliert wird. Das Umlaufbad 9 dient der Neutralisierung und Dehydrierung der Kollagenlösung zur Bildung von Kollagenfasersegmenten. Im Kreislauf befindet sich stromabwärts der Abgabenadel 7 ein Kolben 11 mit einem porösen Beutel 10, der im Verlauf des Umlaufbades innerhalb des Kolbens 11 am Ende des Schlauches befestigt ist. Der Kreislauf führt weiter vom Ablass am Boden des Kolbens zur Schlauchradpumpe 12, welche das Zirkulieren des Bades erzeugt, und dann zurück zur Abgabenadel 7.
Das Kollagen, welches sich unter Druck in der Speicherpatrone 2 befindet, wird vom Abgabeventil 4 durch die Nadel 7 in das Umlaufbad 9 freigesetzt, und zwar schrittweise, wenn Luft in Impulsen von der Steuerung 5 an das Abgabeventil 4 abgegeben wird. Die Geschwindigkeit des zirkulierenden Bades 9 wird so geregelt, dass das freigesetzte Kollagen in ein in etwa zylindrisches Segment gezogen wird. Wird die Kollagenfreisetzung gestoppt, werden die Segmente von der Nadelspitze 7 abgeschert und vom Umlaufbad 9 in den Kolben 11 transportiert, der den porösen Beutel 10 enthält. Während das Bad 9 durch den Beutel zum Ablass am Boden des Kolbens 11 und zurück in den Kreislauf strömt, werden die Segmente in dem porösen Beutel zurückgehalten.
Bevorzugte Materialien für die beschriebene Vorrichtung sind kompatibel mit der Kollagenfaserbildung, den gewünschten Eigenschaften der Kollagenfaser und den bei der Kollagenfaserbildung verwendeten Materialien. In einigen Fällen muss die Vorrichtung in der Lage sein, einer Sterilisierung standzuhalten. Zur Herstellung von Kollagenfasersegmenten können auch Modifikationen an Vorrichtung und Verfahren erfolgen.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Abgabesteuerung durch stufenweise direkte Aufbringung von Druck auf den Spritzenkolben ausgeübt. In wieder einer anderen Ausführungsform fehlt der Spritzenkolben und die Steuerung erfolgt durch das direkte Aufbringen von Luftimpulsen auf die Kollagenlösung in der Spritzenpatrone. Die Ventilsteuerung wird jedoch bevorzugt, da sie Kontinuität und die Regulierung der Abgabe der Lösung zulässt. Weitere Mittel der Steuerung der Freisetzung kleiner Mengen Kollagenlösung können vom Fachmann eingesetzt werden.
Von dem Schlauch, der, wenn kein Ventil verwendet wird, von der Patrone, oder vom Ventil weg führt, wird ein kurzer Kanal zum Einführen der abgegebenen Kollagenlösung in ein Dehydrierungsbad daran befestigt. Der Kanal sollte zumindest eine Öffnung aufweisen und ist bevorzugt eine Nadel mit stumpfer Spitze oder von ähnlicher Form. Die Stärke der Nadel oder Öffnung liegt bevorzugt zwischen Stärke 12 bis 30, bevorzugter Stärke 14 bis 21. Die Form der Öffnung kann rund, länglich oder eine beliebige andere Form sein. Eine Öffnung mit länglicher Form erzeugt streifenförmige Kollagenfasersegmente. Die Öffnung wird bevorzugt in das Dehydrierungsbad getaucht, kann sich aber auch in dem Bereich über dem Bad befinden, so dass die Lösung in das Bad tropft. Ist die Öffnung eingetaucht, lässt sich die Form der gebildeten Kollagenfasersegmente leichter steuern. Weitere in der Technik bekannte Mittel der Zufuhr der Kollagenlösung zum Dehydrierungsbad können eingesetzt werden. Modifikationen der Vorrichtung und des Verfahrens können vom Fachmann vorgenommen werden, um effektiv zum gleichen Ergebnis zu gelangen.
Das Dehydrierungsbad 9 sollte bezogen auf die Abgabeöffnung 7 in Bewegung sein. Die Geschwindigkeit des Dehydrierungsbades in Bezug auf die Fliessgeschwindigkeit der Kollagenlösung, die von der Öffnung freigesetzt wird, bestimmt die Form der gebildeten Kollagenfasersegmente. Langsamere Bäder bilden Segmente, die kugel- oder kommaförmig sind. Bei ähnlichen Fließgeschwindigkeiten wird eine im Allgemeinen zylindrische Form gebildet. Schnellere Badgeschwindigkeiten bilden längliche Fasern mit konischen Enden. Die Geschwindigkeit des Bades kann entsprechend der erwünschten Faserform angepasst werden.
Das Dehydrierungsbad der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt ein geschlossener Kreislauf zur Aufrechterhaltung der Produktsterilität. NEOPRENE-Schläuche der Größe 17 werden verwendet, es können jedoch auch andere Schläuche verwendet werden. Ein offenes Bad könnte durch den Austausch der Schläuche mit Durchgängen oder anderen Kanälen zum Leiten von Flüssigkeiten ausgetauscht werden.
Der Sammelfilter sollte Öffnungen aufweisen, die klein genug sind, damit die Kollagenfasersegmente nicht hindurchgelangen, jedoch groß genug, dass der Durchfluss des Bades möglich ist. Es wird ein Nylonnetzbeutel mit Öffnungen von 250 μm befestigt an den Schläuchen und innerhalb des Kolbens befindlich verwendet; es ist jedoch auch ein Austausch mit jedem beliebigen Sammelbehälter mit einem Filter und einem Ablass möglich.
Das Bad wird durch Verwendung einer Schlauchradpumpe, welche sich stromaufwärts der Abgabenadel befindet, zirkuliert. Es kann jedes beliebige Pumpmittel eingesetzt werden, bevorzugt eines, welches die Sterilität des Systems aufrechterhält.
Kollagenfasersegmente die in dem Beutel gesammelt wurden, werden nach dem Entfernen aus dem Kolben gespült, bevorzugt mit aufbereitetem Wasser oder mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Das Spülen entfernt verbleibende Neutralisierungs- und /oder Dehydrierungsmittel, welche sich möglicherweise noch auf dem Material befinden.
Die Art der Kollagenfasersegmente hängt von den folgenden Variablen ab: die Kollagenkonzentration, die Öffnung durch die das Kollagen extrudiert wird, die Geschwindigkeit mit der das Kollagen extrudiert wird, das Volumen der mit jedem Impuls extrudierten Kollagenlösung und die Zirkulationsgeschwindigkeit des Bades. Die maximale Kollagenkonzentration in einem feuchten Faden beträgt etwa 325 mg/ml. Die Kollagenkonzentrationsspanne des Endproduktes hängt ab vom Volumenverhältnis der Kollagenfasersegmente und der umgebenden Flüssigkeit. Durch eine Veränderung der obengenannten Variablen wurden Kollagenfasersegmente zwischen 0,05 bis 2,5 mm Durchmesser und mindestens 2 mm Länge hergestellt. Außerdem konnten durch mechanische Homogenisierung der Fäden gestutzte Segmente hergestellt werden. Der Fachmann wäre in der Lage, die Parameter zur Herstellung von Kollagenfasersegmenten mit anderen Maßen zu verändern.
Die Kollagenfasersegmente werden dann gegebenenfalls mit einem Vernetzungsmittel vernetzt. Zu Kollagenvernetzungsmitteln zählen Gluteraldehyd, Formaldehyd, Carbodiimide, Hexamethylendiisocyanat, Bisimidate, Glyoxal, Polyglycerolpolyglycidylether, Adipylchlorid, Dehydrothermal, UV-Strahlung und Zuckerbindung. Kollagen vernetzt auch auf natürliche Weise, wenn es bei Raumtemperatur stehen gelassen wird. Die Vernetzungsmittel sollen jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt sein, da auch andere dem Fachmann bekannte Vernetzungsmittel und Verfahren eingesetzt werden können. Vernetzungsmittel sollten so ausgewählt werden, dass ein biokompatibles Material hergestellt wird, welches durch Wirtszellen rekonstruiert werden kann. Ein bevorzugtes Vernetzungsmittel ist 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodümide-Hydrochlorid (EDC). Die Vernetzungslösung mit EDC und Wasser kann auch Azeton enthalten.
Die Kollagenfasersegmente können auch in einer verdünnten Peressigsäurelösung mit einem neutralen pH-Wert sterilisiert werden. Verfahren zum Sterilisieren von Kollagen sind in der US-Seriennummer 08/177,618, jetzt US-Patentschrift Nr. 5,460,962 beschrieben.
Die Kollagenfasersegmente können auch mit Agenzien wie Pharmazeutika, Wachstumsfaktoren, Hormonen, anderen extrazellulären Matrixkomponenten oder Genmaterial überzogen werden. Die Beschichtung des Mittels kann durch Eintauchen oder chemische Bindung erreicht werden. Die Zellen können auf den Segmenten gezüchtet werden, da Kollagen ein natürliches Substrat für die Zellbindung ist.
Die Kollagenfasersegmente, die als injizierbare Zusammensetzung verwendet werden sollen, werden in eine Spritze gefüllt. Injizierbare Präparate wurden mit bis zu 200 mg/ml Kollagen in isotonischer Kochsalzlösung hergestellt. Weitere biokompatible Trägerstoffe können vom Fachmann im Austausch für die isotonische Kochsalzlösung verwendet werden.
Die Kollagenfasersegmente können für chirurgische Verfahren bei der Implantation in einen Patienten eingesetzt werden. Indikationen für ein Kollagenimplantat sind Gewebsvermehrung, Gewebereparatur oder Wirkstofffreisetzung. Kollagenimplantate werden für die Erhöhung der Gewebsmasse des Schließmuskels, wie z. B. des Harnschließmuskels, oder für kosmetische Chirurgie verwendet. Die Gewebsreparatur wird erreicht, indem die Zusammensetzung in einem Gewebsbereich bereitgestellt wird, der krank oder verwundet ist bzw. entfernt wurde. Wirkstoffe werden abgegeben, um die Gewebsreparatur zu verbessern oder als therapeutisches Mittel, wenn sie der Zusammensetzung hinzugefügt werden. Der Einschluss von Zellen in die Kollagenfasersegmente bietet ein Mittel zur Abgabe von Zellen zum Repopulieren eines geschädigten oder kranken Gewebsbereiches oder zur Bereitstellung zellsynthetisierter Produkte an die umgebenden Gewebe.
Die Abgabe des Implantats kann manuell durch Einbringung einer Menge der Kollagenfasersegmentzusammensetzung zwischen Geweben erfolgen, oder zum Überbrücken eines Spaltes oder Defektes in einem einzelnen Gewebe. Ein bevorzugtes Mittel der Abgabe ist durch die Injektion unter Verwendung einer Spritze. Die Konzentration von Kollagen in der Zusammensetzung hängt von der Indikation ab. Das Hinzufügen weiterer Komponenten und weitere Abschlussbehandlungen für die Kollagenfaserzusammensetzung können die Konzentration der Endzusammensetzung verändern.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren zur Herstellung von Kollagenfasersegmenten, erfolgt ein kontrolliertes Mischen einer Kollagenlösung mit Koagulationsmittel. Das kontrollierte Mischen wurde durch die Verwendung einer Rotationsschwingplattform, eines Rührankers an einem magnetischen Rührwerk oder eines Küchenmixers erreicht. Weitere Mittel zum kontrollierten Mischen einer Volumenflüssigkeit sind dem Fachmann bekannt und können bestimmt werden. Beim bevorzugten Verfahren wird ein Gerät, welches einem typischen Küchenmixer ähnelt, mit einigen Modifikationen an Geschwindigkeitsregler und Messern verwendet. Die Modifikationen des Geschwindigkeitsreglers ermöglichen es, dass das Mischen mit Geschwindigkeiten erfolgen kann, die mit der Standardvorrichtung nicht möglich sind. Die Messer des Mixers werden mit Schläuchen überzogen, um die Kanten des Mixerschneidmessers abzurunden und so das Zerschneiden der gebildeten Kollagenfasersegmente während des kontrollierten Mischens zu verhindern. Alternativ dazu könnten die Schneidmesser mit Mixschaufeln oder anderen dem Fachmann bekannten Mitteln ausgetauscht werden, um die gewünschten Kräfte zu erzeugen.
Der Kammer des Mixers wird ein bestimmtes Volumen des Dehydrierungs- und/oder Neutralisierungsmittels hinzugefügt. Der Mixer wird dann aktiviert, um das Mittel mit der gewünschten Geschwindigkeit zu mixen. Kollagenlösung mit bevorzugt mindestens 1 mg/ml in verdünnter Essigsäure wird dann in das Mischmittel geschüttet. Das Kollagen und das Mittel werden dann für eine bestimmte Zeit gemischt, die ausreichend ist, dass die Kollagenlösung durch Dehydrierung und/oder Neutralisierung koaguliert und so Kollagenfasersegmente gebildet werden. Nach der Bildung wird der Mixer abgeschaltet und die Mischung wird für eine gewisse Zeit stehen gelassen, damit sich die Kollagenfasersegmente setzen können. Zur Entfernung der Fasersegmente aus dem Mittel wird die Mischung zentrifugiert oder gefiltert. Bei der Zentrifugierung wird die Mischung in Zentrifugiergläser abgegossen, so dass die Fasersegmente ein Pellet bilden und das Mittel, der Überstand, wird abgegossen. Das bevorzugte Spülen der Fasersegmente erfolgt, wiederum durch Einsatz des Zentrifugierverfahrens, durch erneute Suspension der Fasersegmente in Wasser oder gepufferter Kochsalzlösung und erneutes Zentrifugieren zur Pelletbildung der Fasersegmente. Der Spülschritt kann je nach Notwendigkeit wiederholt werden. Anschließende Vernetzungsschritte mit einem Vernetzungsmittel können auch mittels des Zentrifugierverfahrens durchgeführt werden. Es erfolgt eine erneute Suspension in Vernetzungsmittel, bevorzugt EDC in Wasser und Azeton, um das Vernetzungsmittel mit den Kollagenfasersegmenten in Kontakt zu bringen. Nach Durchführung der Vernetzungsreaktion wird bevorzugt der Spülschritt wiederholt, um überschüssiges Vernetzungsreagens und Reaktionsnebenprodukte zu entfernen. Weitere Mittel zur Entfernung von Dehydrierungsmittel, Spülung und Vernetzung der Kollagenfasersegmente können von einem Fachmann bestimmt werden. Nach der Herstellung der Kollagenfasersegmente können diese nach dem Zentrifugierschritt auf eine spritzbare und eindringfähige Konzentration verdünnt werden.
Kollagenfasersegmente hergestellt durch das Verfahren des kontrollierten Mischens einer Kollagenlösung mit Koagulationsmittel besitzen eine Länge zwischen etwa 0,001 mm bis etwa 20 mm, bevorzugter zwischen 0,1 bis 2,0 mm Länge. Bei Kollagenfasersegmenten, die mittels des kontrollierten Mischungsverfahrens hergestellt wurden, neigen Segmente mit einer Länge von über 1 mm zu einer verzweigten oder gabelförmigen Struktur.
Eine weitere Ausführungsform zur Herstellung von Kollagenfasersegmenten ist eine, bei welcher Kollagenfäden geschnitten oder homogenisiert werden. Injizierbare Kollagenzusammensetzungen werden auch aus homogenisierten Kollagenfäden hergestellt. Verfahren zur Herstellung von Kollagenfäden sind in US-Patentschrift Nr. 5,378,469 offenbart. Eine Lösung von 5 mg/ml säureextrahiertem Rindersehnenkollagen wird in ein Neutralisierungs- und/oder Dehydrierungsmittel mit einem höheren osmotischen Druck als dem der Kollagenlösung und einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 extrudiert, und das Neutralisierungs- und/oder Dehydrierungsmittel wird unter Bedingungen gehalten, welche die Kollagenfadenbildung ermöglichen. Die Fäden können gegebenenfalls vernetzt werden. Die Fäden werden dann in ein Kulturröhrchen übertragen und gereinigtes Wasser zum befeuchten der Fäden hinzugefügt. Es wird ein Gewebshomogenisator verwendet, um die Fäden in kleine Kollagenfasersegmente zu zerkleinern. Die Mischung wird in einen Trichter mit einem Filter gegeben, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Die so gebildeten Kollagenfasersegmente können durch Übertragung in eine Spritze als injizierbare Zusammensetzung verwendet werden. Weitere Verfahren des Zerkleinerns und Zerschneidens von Fäden in Kollagenfasersegmente können eingesetzt werden, zum Beispiel Schneiden oder Häckseln.
Die folgenden Beispiele dienen der besseren Aufklärung der Praxis der vorliegenden Erfindung und sind in keiner Weise als Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung zu interpretieren. Der Fachmann wird erkennen, dass verschiedene Modifikationen an den hierin beschriebenen Verfahren vorgenommen werden können, ohne dadurch von Sinn und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung von Kollagenfasersegmenten durch das Impulsextrusionsverfahren mittels eines Abgabeventils
Eine Patrone mit Kollagen mit 5 mg/ml in 0,05% Essigsäure wurde mittels Druckluft mit 20 psi (138 kPa), bereitgestellt durch eine regulierte Druckluftquelle, konstantem Druck ausgesetzt. Es wurde ein Schlauch angeschlossen, damit Kollagen in ein EFD 752 Abgabeventil (EFD, E. Providence, RI) fließen konnte. An dem Ventil wurde außerdem ein Schlauch angeschlossen, der zu einem EFD 900-Pneumatik-Controller mit einem Schalter führte; auch dieser wurde mit Luft unter konstantem Druck von 80 psi (552 kPa) versorgt, wodurch wiederholte Luftimpulse an das Ventil gegeben wurden. Das Ventil wurde mit einer Nadel der Größe 21 mit stumpfer Spitze ausgestattet, welche die Wand des NEOPRENE-Schlauches der Größe 17 durchstach, mit der Nadelspitze etwa mittig innerhalb des Hohlraumes des Schlauches. Der Schlauch bildete einen Kreislauf von 20 Gew.-/Vol.-% Polyethylenglykol MW 8000 (PEG-8000) in Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,6 Gew./Vol.-%, welches durch den Einsatz einer Schlauchradpumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa 200 ml/min. zirkuliert wurde. Das PEG-Bad diente dem Neutralisieren und Dehydrieren der Kollagenlösung zur Bildung von Kollagenfasersegmenten. In dem Kreislauf war, stromabwärts der Abgabenadel, ein Vakuumkolben mit einem Stopfen an seiner Öffnung angeschlossen, sowie ein Schlauch durch den Stopfen hindurch mit einem porösen 250 Mikronen Nylonbeutel, welcher innerhalb des Kolbens am Ende des Schlauches befestigt war. Der Kreislauf führte weiter vom Ablass am Boden des Kolbens zu einer Schlauchradpumpe, die das Strömens des Bades erzeugte, und zurück zur Abgabenadel.
Die unter Druck stehende Kollagenlösung wurde über die Nadel stufenweise aus dem Abgabeventil in das Umlaufbad abgegeben, wenn eine bestimmte Luftmenge in Impulsen aus dem Abgabegerät freigesetzt wurde. Die Geschwindigkeit des fließenden Bades wurde so reguliert, dass das freigesetzte Kollagen in ein in etwa zylindrisches Segment gezogen wurde. Nach dem Stopp der Kollagenfreisetzung wurden die Segmente von der Ventilspitze abgeschert und durch das Umlaufbad zum Kolben mit dem porösen Beutel transportiert. Die Segmente wurden durch den porösen Beutel zurückgehalten, während das PEG-Bad durch den Beutel hindurch zum Boden des Kolbens zum Ablass und in den Kreislauf zurück strömte. Hatte sich in dem Beutel eine gewissen Anzahl an Kollagenfasersegmenten angesammelt, wurde der Beutel aus dem Kolben entfernt.
Beispiel 2: Herstellung von Kollagenfasersegmenten durch das Impulsextrusionsverfahren
Ein alternativer Vorrichtungsaufbau wurde verwendet, um Kollagenfasersegmente mittels des Impulsextrusionsverfahrens herzustellen.
Ein EFD 900-Pneumatik-Steuer- und -Abgabesystem wurde mit Luft unter konstantem Druck bei 50 psi (345 kPa), bereitgestellt durch eine regulierte Druckluftquelle, versorgt. Das Steuer- und Abgabesystem stellte über einen Schlauch wiederholte Luftimpulse an eine 30 cc Spritzenpatrone mit säureextrahiertem Kollagen mit 5 mg/ml in 0,05% Essigsäure zur Verfügung. Von der Patrone aus verlief ein Schlauch, an dessen Ende eine Nadel der Größe 30 mit stumpfer Spitze angebracht war, welche die Wand des NEOPRENE-Schlauches der Größe 17 durchstach, mit der Nadelspitze etwa mittig darin. Der Schlauch bildete einen Kreislauf von 20 Gew.-/Vol.-% Polyethylenglykol MW 8000 (PEG-8000) in Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,6 (w/v), welches durch den Einsatz einer Schlauchradpumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa 520 ml/min. zirkuliert wurde. Das PEG-Bad diente dem Neutralisieren und Dehydrieren der Kollagenlösung zur Bildung von Kollagenfasersegmenten. In dem Kreislauf war, stromabwärts der Abgabenadel, ein Vakuumkolben mit einem Stopfen an seiner Öffnung angeschlossen, sowie ein Schlauch durch den Stopfen hindurch mit einem porösen 250 Mikronen Nylonbeutel, welcher innerhalb des Kolbens am Ende des Schlauches befestigt war. Der Kreislauf führte weiter vom Ablass am Boden des Kolbens zu einer Schlauchradpumpe, welche das Strömens des Bades erzeugte, und zurück zur Abgabenadel.
Die Patrone mit Kollagenlösung erhielt Druckluftimpulse, um das Kollagen stufenweise aus der Patrone und durch die Nadel heraus in das Umlaufdehydrierungsbad zu treiben. Die Geschwindigkeit des fließenden Bades wurde so reguliert, dass das freigesetzte Kollagen in ein in etwa zylindrisches Segment gezogen wurde. Nach dem Stopp der Kollagenfreisetzung wurden die Segmente von der Nadelspitze abgeschert und durch das Umlaufbad zum Kolben mit dem porösen Beutel transportiert. Die Segmente wurden durch den porösen Beutel zurückgehalten, während das PEG-Bad durch den Beutel hindurch zum Boden des Kolbens zum Ablass und in den Kreislauf zurück strömte. Hatte sich in dem Beutel eine gewissen Anzahl an Kollagenfasersegmenten angesammelt, wurde der Beutel aus dem Kolben entfernt.
Beispiel 3: Herstellung von Kollagenfasersegmenten durch das Impulsextrusionsverfahren in andere Dehydrierungszusammensetzungen
Unter Verwendung des Vorrichtungsaufbaus aus Beispiel 2 wurden Kollagenfasersegmente gebildet, und zwar mittels des Impulsextrusionsverfahrens in andere Zusammensetzungen mit Eigenschaften, welche die Kollagenfaserbildung ermöglichen.
In verschiedenen Versuchen wurde das PEG-8000-Dehydrierungsbad entweder durch Isopropanol oder Azeton ersetzt. Die Kollagenfasersegmente wurden mit dem Verfahren aus Beispiel 2 gebildet und wurden in dem porösen Beutel gesammelt, während entweder das Isopropanol- oder das Azetonbad durch den Beutel zum Boden des Kolbens zum Ablass und zurück in den Kreislauf strömte. Hatte sich in dem Beutel eine gewissen Anzahl an Kollagenfasersegmenten angesammelt, wurde der Beutel aus dem Kolben entfernt.
Beispiel 4: Herstellung einer injizierbaren Kollagenzusammensetzung aus Kollagenfasersegmenten hergestellt mittels des Impulsextrusionsverfahrens
Für die vorklinische Bewertung wurde eine Reihe von Zusammensetzungen mit Kollagen hergestellt, um die Biorekonstruktion des Kollagens zu untersuchen. Entweder wurde die Kollagenlösung, die zur Herstellung der Kollagenfasersegmente verwendet worden war, variiert, oder die gebildeten Kollagenfasersegmente wurden nach der Bildung weiter behandelt.
Zusammensetzung 1 war eine Zusammensetzung aus Kollagenfasersegmenten, hergestellt durch das Verfahren aus Beispiel 2 mit 5 mg/ml säureextrahiertem Rindersehnenkollagen. Die Kollagenfasersegmente wurden in gereinigtem Wasser gespült.
Zusammensetzung 2 war eine Zusammensetzung aus vernetzten Kollagenfasersegmenten. Die Kollagenfasersegmente wurden mittels der Vorrichtung und des Verfahrens aus Beispiel 2 mit 5 mg/ml säureextrahiertem Rindersehnenkollagen hergestellt. Nach dem Spülen des Sammelbeutels mit den Fasersegmenten mit gereinigtem Wasser wurden die Fasersegmente durch Eintauchen des Beutels in 5 mM EDC in Wasser für 4 Stunden vernetzt.
Zusammensetzung 3 war eine Zusammensetzung, bei der die Kollagenfasersegmente aus teilweise hitzedenaturiertem Kollagen hergestellt wurden. Vor dem Befüllen der Patrone wurde 5 mg/ml säureextrahiertes Rindersehnenkollagen durch Erhitzen bei 50°C für 30 Minuten denaturiert. Denaturiertes Kollagen wurde mit 5 mg/ml nicht denaturiertem säureextrahiertem Rindersehnenkollagen im Verhältnis 1 : 1 gemischt, um eine teilweise denaturierte Kollagenmischung zu erzeugen. Teilweise denaturierte Kollagenfasersegmente wurden mittels der Vorrichtung und des Verfahrens aus Beispiel 2 hergestellt. Die Kollagenfasersegmente wurden mit gereinigtem Wasser gespült.
Zusammensetzung 4 war eine Zusammensetzung aus Kollagenfasersegmenten hergestellt aus enzymextrahiertem Kollagen. Pepsinextrahiertes Kollagen mit 6,7 mg/ml (Pentapharm, Basel, Schweiz) wurde als Kollagenlösung verwendet, aus der gemäß dem Verfahren aus Beispiel 2 Kollagenfasersegmente gebildet wurden.
Zusammensetzung 5 war eine Zusammensetzung aus Kollagenfasersegmenten hergestellt aus humanem Kollagen erzeugt aus kultivierten Zellen. Das Verfahren der Gewinnung von Kollagen aus kultivierten Zellen ist in US-Seriennummer 08/240,516 beschrieben. Das humane Kollagen mit 5 mg/ml wurde als Kollagenlösung verwendet, aus der gemäß dem Verfahren aus Beispiel 2 Kollagenfasersegmente gebildet wurden.
Die Zusammensetzungen 1, 2 und 3 wurden sterilisiert, indem die Beutel mit den Kollagenfasersegmenten für sechzehn Stunden in neutralisierte 0,1% Peressigsäure in phosphatgepufferte Kochsalzlösung gelegt und abschließend in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült wurden. Die Kollagenkonzentrationen der Zusammensetzungen wurden bestimmt. Die Endkonzentration von Zusammensetzung 1 betrug 69,4 mg/ml. Die Endkonzentration von Zusammensetzung 2 betrug 88,8 mg/ml. Die Endkonzentration von Zusammensetzung 3 betrug 88,1 mg/ml.
Beispiel 5: Herstellung einer injizierbaren Kollagenzusammensetzung aus Kollagenfasersegmenten durch Homogenisierung
Zusammensetzung 6 wurde mit 5 mg/ml säureextrahiertem Rindersehnenkollagen aus Kollagenfäden hergestellt. Verfahren zur Herstellung von Kollagenfäden sind in US-Patentschrift 5,378,469 offenbart. Eine bestimmte Menge trockener, alters- vernetzter Fäden mit einem Gewicht von 1,0 g wurde mit einer Schere in kleine Stücke geschnitten. Die Fäden wurden in ein Kulturröhrchen gegeben und 10 ml gereinigtes Wasser wurden zum Anfeuchten der Fäden hinzugegeben. Ein Gewebshomogenisator wurde für zwei Minuten bei hoher Geschwindigkeit verwendet, um die Fäden zu einer breiigen Konsistenz mit einer Konzentration von etwa 150 mg/ml zu zerkleinern. Die Mischung wurde in einen Trichter mit einem Filter gegeben, um für etwa 10 Minuten überschüssiges Wasser zu entfernen, und wurde dann bei 4°C gelagert.
Zusammensetzung 7 wurde mit 5 mg/ml säureextrahiertem Rindersehnenkollagen aus Kollagenfäden hergestellt, wiederum durch das in US-Patentschrift Nr. 5,378,469 offenbarte Verfahren. Eine bestimmte Menge trockener Fäden mit einem Gewicht von 1,0 g wurde mit einer Rasierklinge in kleine Stücke geschnitten. Die Fäden wurden in ein Kulturröhrchen gegeben und 10 ml gereinigtes Wasser wurden zum Anfeuchten der Fäden hinzugegeben. Die Mischung wurde in einen Trichter mit einem Filter gegeben, um für etwa 10 Minuten überschüssiges Wasser zu entfernen, und wurde dann bei 4°C gelagert.
Beispiel 6: Einfügen von TGFβ in Kollagenfasersegmente
Die Verwendung von Kollagenfasersegmenten für die Wirkstofffreisetzung wurde untersucht. In Kollagenfasersegmente wurde radioaktiv markiertes [I¹²⁵] TGFβ (Collaborative Research) mittels zweier Verfahren eingefügt: durch Oberflächenbeschichtung der gebildeten Kollagenfasersegmente mit [I¹²⁵] TGFβ, oder durch Bildung der Kollagenfasersegmente mit darin eingeschlossenem [I¹²⁵] TGFβ.
Die Kollagenfasersegmente wurden mittels des Verfahrens aus Beispiel 2 hergestellt. Insgesamt wurden 10 ml Kollagenlösung mit 5 mg/ml in 0,05% Essigsäure verwendet. Der Beutel mit den Kollagenfasersegmenten wurde aus dem Kolben entfernt. Zur Oberflächenbeschichtung der Kollagenfasersegmente wurden die Kollagenfasersegmente aus dem Beutel entfernt und dann über Nacht bei 4°C in 0,8 μCi [I¹²⁵] TGFβ getaucht.
Die Kollagenfasersegmente wurden auch mit darin eingeschlossenem [I¹²⁵] TGFβ gebildet. Zu 10 ml Kollagenlösung mit 5 mg/ml in 0,05% Essigsäure wurden 0,8 μCi [I¹²⁵] TGFβ hinzugefügt und gemischt. Die Kollagenfasersegmente wurden wiederum mittels des Verfahrens aus Beispiel 2 gebildet.
Es wurden Elutionsstudien von [I¹²⁵] TGFβ auf etwa 100 mg Aliquoten durchgeführt, und zwar in dreifacher Ausführung für die beiden Behandlungen. Jede Aliquote von Kollagenfadensegmenten wurde in 5 mg/ml 4% Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) getaucht und bei 37°C auf einer Schüttelplattform gemischt. Die Radioaktivität des BSA/PBS wurde bei Zeitpunkten zwischen 2 bis 500 Stunden gemessen.
Die Ergebnisse der Elutionsstudie zeigen, dass Kollagenfasersegmente beschichtet mit [I¹²⁵] TGFβ den radioaktiv markierten Wachstumsfaktor schneller eluieren als Kollagenfasersegmente gebildet mit darin eingeschlossenem [I¹²⁵] TGFβ.
Beispiel 7: Vorklinische Studie der injizierbaren Kollagenzusammensetzung aus Kollagenfasersegmenten mittels des Impulsextrusionsverfahrens
Es wurde ein Tiermodel verwendet, um die Sicherheit und Effizienz der injizierbaren Zusammensetzungen nachzuweisen. Aufgrund der großen Oberfläche der Ohren wurden weiße Neuseeland-Kaninchen als Tiermodel für die subkutane Injektion der Zusammensetzungen gewählt. In der Studie wurden elf Kaninchen verwendet.
Die Zusammensetzungen 1, 2 und 3, wie in Beispiel 4 hergestellt, wurden aseptisch in eine Reihe von 3 cc Spritzen mit 0,5 ml der Zusammensetzung pro Spritze gefüllt. Zum Vergleich wurde auch CONTIGEN (Bard, Billerica, MA), eine afibrilläre Suspension aus pepsinextrahiertem gluteraldehydvernetztem Rinderhautkollagen mit 35 mg/ml verwendet.
Alle Kaninchen wurden mit einem Muster schwarzer Punkte tätowiert, um die Injektionsstellen zu verzeichnen und Kontrollpunkte für das Ohrenwachstum und die Persistenz der injizierten Zusammensetzung bereitzustellen. Vor der Tätowierung wurden alle Tiere mit 20 cc Acepromazin (Schein) anästhesiert. Die Tätowierungen konnten 26 Tage vor den Kollageninjektionen abheilen, um sicherzustellen, dass jede mögliche Entzündung aufgrund der Tätowierungen abgeklungen war.
Alle Kollageninjektionen wurden mittels aseptischer Verfahren durchgeführt. Alle Tiere wurden vor der Injektion mit 0,3 ml 100 mg/ml Xylazin (Miles) und 3,0 ml 100 mg/ml Ketamin (Fort Dodge) anästhesiert. Als Implantate erhielten die Tiere 0,5 ml der Zusammensetzungen subkutan durch eine 1-Zoll 18-G-Nadel.
Die Tätowierungspunktmessungen erfolgten an Tag 0, 2, 4, 7, 10, 14, 21 und danach für die Dauer der Studie alle sieben Tage. Alle Tätowierungspunkte wurden mit einem Mikrometer gemessen und die Ergebnisse in Millimetern verzeichnet. Die Kaninchen wurden nach 6 Wochen bzw. 12 Wochen mit 0,3 ml 100 mg/ml Xylazin (Miles) und 3,0 ml 100 mg/ml Ketamin (Fort Dodge), sowie 5 cc 1,5 M KCl (Sigma) getötet. Im Anschluss an die Tötung wurden alle Ohren seziert, um überschüssige Haut um das Implantat herum freizulegen, und wurden für 24 Stunden vor der histologischen Verarbeitung in Formalin fixiert.
Die Zusammensetzungen 1, 2 und 3 verblieben an der Injektionsstelle, während sich CONTIGEN bei der Injektion über das Gewebe ausbreitete.
Beispiel 8: Kollagenfasersegmente hergestellt durch kontrolliertes Mischen der Kollagenlösung mit Koagulationsmittel
Durch kontrolliertes Mischen einer Kollagenlösung mit Koagulationsmittel wurde eine Suspension aus Kollagenfasersegmenten hergestellt. Kontrolliertes Mischen wurde durch die Verwendung eines Küchenmixers (Oster), modifiziert mit einem Spannungscontroller (Variac) erreicht. Der Spannungscontroller ließ das Erreichen variabler Geschwindigkeiten zu, welche mit den von der Vorrichtung angebotenen Standardgeschwindigkeiten nicht möglich waren. Die Messer des Mixers wurden jeweils durch Umhüllung der Länge der Messer mit einem Neoprenschlauch modifiziert.
Ein 400 ml Volumen einer 8000 MW Polyethylenglykol (PEG-8000) Lösung (20% PEG-8000 in Phosphatpuffer, pH-Wert 7,6 – 7,8) wurde der Mixerkammer zugefügt und der Mixer wurde angeschaltet, um einen Dehydrierungsmittelwirbel zu erzeugen. Dann wurde ein 200 ml Volumen Kollagen mit einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,05% Essigsäure zur Mixerkammer hinzugefügt, wobei das Hinzufügen nach etwa 10 Sekunden abgeschlossen war. Die Mischung wurde für etwa 60–70 Sekunden gemixt, dann gestoppt, und die Mischung wurde für etwa 4 bis 5 Minuten stehen gelassen. Die Mischung wurde dann in eine Zentrifugenglas übertragen und bei etwa 1000 × g für etwa 4 bis 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden abgegossen und entsorgt. Jedes der Gläser wurde dann mit gereinigtem Wasser gefüllt, kurz geschüttelt und nochmals für etwa 4 bis 5 Minuten zentrifugiert. Die Pellets wurden dann vereinigt und der Spülschritt mit gereinigtem Wasser wiederholt. Die Überstände wurden dann entsorgt und es wurde ein Volumen an PBS hinzugefügt, um die Pelletsegmente in die gewünschte Konzentration zu suspendieren.
Beispiel 9: Vorklinische Studie injizierbarer Kollagenzusammensetzungen von Kollagenfasersegmenten hergestellt durch kontrolliertes Mischen der Kollagenlösung mit Koagulationsmittel
Es wurde ein Tiermodel verwendet, um die Sicherheit und Effizienz injizierbarer Zusammensetzungen hergestellt mittels des Verfahrens aus Beispiel 8 nachzuweisen. Aufgrund der großen Oberfläche der Ohren wurden weiße Neuseeland-Kaninchen als Tiermodel für die subkutane Injektion der Zusammensetzungen ausgewählt. In der Studie wurden zehn Kaninchen verwendet.
Nicht vernetzte Zusammensetzungen von 33,3, 55,1 und 58,6 mg/ml und eine 5 mM EDC-vernetzte Zusammensetzung von 58,6 mg/ml wurde aseptisch in eine Reihe 3 cc Spritzen mit 0,5 ml der Zusammensetzung pro Spritze gefüllt.
Alle Kollageninjektionen wurden mittels eines aseptischen Verfahrens durchgeführt. Alle Tiere wurden auf Grundlage ihres Körpergewichtes vor der Kollageninjektion mit 10 mg/kg 100 mg/ml Xylazin (Miles), 40 mg/kg 100 mg/ml Ketamin (Fort Dodge) und 0,4 mg/kg Acepromazinmaleat (Henry Schein) anästhesiert. Als Implantate erhielten die Tiere 0,5 ml der Zusammensetzungen subkutan durch eine 1-Zoll Nadel der Größe 20.
Die Messungen erfolgten an Tag 0, 1, 7, 21 und danach für die Dauer der Studie alle 21 Tage. Die Injektionsstärken wurden mit einem Dickemesser gemessen, und die Injektionsbreiten wurden mit einer Schieblehre gemessen. Die Kaninchen wurden nach 6 Wochen bzw. 12 Wochen mit 0,3 ml 100 mg/ml Xylazin (Miles) und 3,0 ml 100 mg/ml Ketamin (Fort Dodge), sowie 2 ml/kg Körpergewicht 1,5 M KCl (Sigma) getötet. Im Anschluss an die Tötung wurden alle Ohren seziert, um überschüssige Haut um das Implantat herum freizulegen, und wurden für 72 Stunden vor der histologischen Verarbeitung in Formalin fixiert. Alle getesteten Zusammensetzungen verblieben an der Injektionsstelle.

Claims

Injizierbare Kollagenzusammensetzung, die rekonstituierte, nicht vernetzte Kollagenfasersegmente enthält, welche aus saurem, extrahiertem Kollagen mit Telopeptiden in einem biokompatiblen Träger hergestellt werden, wobei die Kollagenkonzentration in der Zusammensetzung bis zu 200 mg/ml betragen kann.
Injizierbare Kollagenzusammensetzung, die rekonstituierte vernetzte Kollagenfasersegmente enthält, welche aus saurem, extrahiertem Kollagen mit Telopeptiden in einem biokompatiblen Träger hergestellt werden, wobei die Kollagenkonzentration in der Zusammensetzung bis zu 200 mg/ml betragen kann, dadurch gekennzeichnet, dass die Kollagenfasersegmente mit Hilfe von Glutaraldehyd, Formaldehyd, einem Carbodiimid, Hexamethylendiisocyanat, einem Bisimidat, Glyoxal, Polyglycerolpolygycidylether, Adipylchlorid, einer dehydrothermalen Methode, UV-Strahlung oder einer zuckerbindenden Vernetzung vernetzt werden.
Injizierbare Kollagenzusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Vernetzungsmittel ein Carbodiimid, vorzugsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC), ist.
Injizierbare Kollagenzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kollagenfasersegmente mit Mitteln beschichtet sind, die aus der folgenden Gruppe gewählt werden: Pharmazeutika, Wachstumsfaktoren, Hormone, extrazelluläre Matrixkomponenten, genetisches Material und Zellen.
Injizierbare Kollagenzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kollagenzusammensetzung Mittel enthält, welche aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden: Pharmazeutika, Wachstumsfaktoren, Hormone, extrazelluläre Matrixkomponenten, genetisches Material und Zellen.
Injizierbare Kollagenzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der biokompatible Träger ein isotonisches Medium ist.
Injizierbare Kollagenzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die rekonstituierten Kollagenfasersegmente teilweise denaturiert sind.
Verfahren zur Herstellung der rekonstituierten Kollagenfasersegmente nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Verfahren das Zerkleinern der rekonstituierten Kollagenfäden enthält.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Zerkleinern durch Homogenisieren der rekonstituierten Kollagenfäden erreicht wird.
Verfahren zur Herstellung von rekonstituierten Kollagenfasersegmenten, wobei das Verfahren die Extrusion einer Kollagen enthaltenden Lösung in ein rezirkulierendes Bad umfasst, das ein Mittel zum Dehydrieren und/oder Neutralisieren des vorerwähnten Kollagens enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die Extrusion diskontinuierlich erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Dehydrierungs- und/oder Neutralisierungsmittel Polyethylenglykollösung, Azeton, Isopropanol oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, das weiterhin den Schritt der Regelung des Stromes des rezirkulierenden Bades in der Form enthält, dass das freigesetzte Kollagen in ein annähernd zylindrisches Segment gezogen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, das weiterhin den Schritt der Vernetzung der Fasern enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, das weiterhin den Schritt der Beschichtung der Fasern mit einem Mittel enthält, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird: Pharmazeutika, Wachstumsfaktoren, Hormone, extrazelluläre Matrixkomponenten, genetisches Material und Zellen.