DD217821A1 - Verfahren zur herstellung eines hormonproduzierenden mikrokapselsystems - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hormonproduzierenden Mikrokapselsystems, welches die Immobilisierung von hormonproduzierendem Gewebe unter Erhaltung der Lebensfaehigkeit gewaehrleistet und bei einfacher Durchfuehrbarkeit zu Produkten mit verbesserten Eigenschaften fuehrt. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass man zur Hormonproduktion faehiges lebendes Gewebe oder Gewebeteile, wie z. B. pankreatisches Gewebe, Langerhanssche Inseln, Schilddruesengewebe, Nebennierengewebe oder auch Eierstockgewebe, mit einem geeigneten Kulturmedium vermischt, in dem 0,3 bis 5,0 Ma.-% Natriumcellulosesulfat geloest sind, die Mischung in ein waessriges Faellbad eintropft, das ein geloestes Polykation enthaelt und das ueberschuessige Faellbad von den gebildeten Mikrokapseln abspuelt. Die erhaltenen Produkte produzieren Hormone, wie z. B. Insulin, und koennen zur Behandlung von Stoffwechselerkrankungen, insbesondere des insulinpflichtigen Diabetes mellitus, eingesetzt werden.

Description

Verfahren zur Herstellung eines hormonproduzierendeh Mlkrokapselsystems ^!

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hormonproduzierenden Mikrokapselsystems und kann im Bereich der Medizin Anwendung finden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Behandlung des insulinpflichtigen Diabetes mellitus stellt heutzutage einen Schwerpunkt in der medizinischen Forschung dar. Die zahlreichen bisher vorgeschlagenen Lösungswege reichen von der Gewinnung spezieller Verzögerungsinsuline· bzw« von synthetischem Insulin über die Entwicklung von künstlichen Betazellen bis zur, Transplantation von Langerhanssehen Inseln. '

Die künstlichen Betazellen stellen meßwertabhängig gesteuerte Insulinabgabesysteme dar, die extrakorporal oder nach Implantation zur Anwendung kommen können. Gegenwärtig sind jedoch nur exogen oder endogen programmierbare Insulininfusionssysteme bekannt und zur Anwendung gekommen. Solche technischen Systeme besitzen jedoch eine Reihe von lachteilen, von denen hier nur die notwendige Blutzuckerkontrolle, technische Unzulänglichkeiten.und die zeitlich begrenzte Einsatzfähigkeit genannt seien. Inseltransplantationen sind bisher nur vereinzelt beschrieben worden. Schwierigkeiten ergeben sich hier insbesondere durch Immunreaktionen des Organismus mit konsekutiver Zerstörung des Transplantates.

Eine neuartige Lösung.für ein insulinproduzierendes System wird in der DE-OS 3 012 233 vorgeschlagen, welches wesentliche lachteile der bekannten Möglichkeiten nicht mehr aufweist. Dieses System besteht z_e B. aus Langerhansschen Inseln, die in einer Alginatlösung dispergiert und mit einer semipermeablen Membran umhüllt sind. Die Inseln sind über einen längeren Zeitraum lebensfähig und produzieren Insulin, welches glucoseabhängig über die Kapselmembran ständig abgegeben wird. Das Verfahren zur Herstellung solcher Langerhansschen Inseln enthaltender Mikrokapseln besteht darin, daß man die I_nseln in einer ITatriumalginatlösung suspendiert, die Suspension zu Tröpfchen verformt, die Tröpfchen durch Eintragen in eine Calciumsalzlösung geliert und durch Vernetzen der Oberflächenschichten mit aminogruppenhaltigen Polymeren eine semipermeable Membran erzeugt. Damit auch ein unbehinderter Stofftransport stattfinden kann, erfolgt in einem weiteren Verfahrensschritt eine Wiederverflüssigung des Gelkernes durch Austausch der Calciumionen gegen physiologisch verträgliche Ionen· Abgesehen davon, daß dieses Verfahren sehr aufwendig und umständlich ist» weist es verschiedene Nachteile auf, die vor allem darin bestehen, daß bei der notwendigen Gelbildung

das sehr empfindliche biologische Material mit mehrwertigen Metallionen in Kontakt kommt, was zu einer Beeinträchtigung der Lebens- und Punktionsfähigkeit der Inseln füh-· ren kann. Außerdem wird durch die Gelbildung der Transport verschiedener Stoffe, die für die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Inseln notwendig sind, stark eingeschränkt. Auch die Wiederverflüssigung des Gels durch Ionenaustausch stellt einen Eingriff in das gesamte System dar und kann zu Schädigungen führen. Nach dem beschriebenen Verfahren erhält man Kapseln, deren Wandung nur sehr dünn und gegenüber-äußeren mechanischen Einflüssen recht empfindlich ist. Die Gefahr einer Schädigung der Membran ist daher bei den vielen Verfahrensschritten und bei der anschließenden Handhabung der Kapseln sehr groß· Schließlich ist auch noch die Beständigkeit der beschriebenen Membranen, insbesondere bei Verwendung von Polylysin als Vernetzungsmittel, im Organismus recht gering. Die Kapselung anderer hormonproduzierender Gewebe oder ; ' Gewebeteile wurde, außer von Leberzellensuspensionen, nicht beschrieben.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein vereinfachtes und verbessertes Verfahren zur Herstellung eines hormonproduzierenden Mikrokapselsystems, bei dem verschiedene Paktoren, die bei den bekannten Verfahren zu einer möglichen Schädigung oder Beeinträchtigung der Punktionsfähigkeit des hormonproduzierenden Systems führen können, ausgeschlossen und gleichzeitig die Eigenschaften der semipermeablen Kapselmembran, insbesondere deren mechanische und chemische Stabilitäti verbessert werden.

Darlegung dea Wesens der Erfindung

- Aufgabenstellung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Einkapseln von hormonproduzierendem Gewebe oder Gewebeteilen, wie z, -Bo. von lebensfähigem pankreatischem Gewebe, Langerhansschen Inseln oder anderem lebensfähigem Drüsengewebe, zu erarbeiten, bei dem die hormonproduzierenden biologischen Materialien lebensfähig bleiben, die Kapselwand eine mechanisch und chemisch stabile semipermeable Membran darstellt, die die für die Erhaltung der Hormonproduktion notwendigen Substanzen hindurchläßt, jedoch Bakterien, Lymphozyten und immunochemische Abwehrreaktionen auslösende Proteine zurückhält, und die Kapseln sofort einen flüssigen Kern besitzen, der eine praktisch ungehinderte Stoffwechcselfunktion des lebenden biologischen Materials ermöglicht,

- Merkmale der Erfindung

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man pankreatisches Gewebe, Langerhanssehe Inseln bzw. ein anderes Drüsengewebe, das ohne Gefäßanschluß lebensfähig bleibt und mittels Diffusion ernährt werden kann, einem Kulturmedium zusetzt, das neben allen für die Lebens- und Punktionsfähigkeit des biologischen Materials erforderlichen Stoffe zusätzlich 0,3 bis 5,0 Masse-% Uatriumeellulosesulfat in gelöster "Form enthält, und die Mischung in ein Fällbad eintropft, das einen entgegengesetzt geladenen löslichen Polyelektrolyten (Polykation) enthält. Durch gegenseitige Ausfällung der beiden Polyelektrolytkomponenten bildet sich an der Oberfläche der Tropfen sofort eine dünne, jedoch mechanisch relativ stabile semipermeable Membran, die als Kapselwand den aus dem lebenden biologischen Material, Kulturmedium und gelöstem Cellulosesulfat bestehenden flüssigen Kern umschließt.

Überraschend hierbei ist, daß - obwohl bekanntlich starke Polyelektrolyte, wie z.B. Cellulosesulfat, zur Denaturierung von Proteinen führen - keine Schädigung des lebenden biologischen Materials zu verzeichnen ist und dieses seine Biofunktionen (Insulinbiosynthese, Insulinsekretion, Proteinsynthese) in vollem Umfang ausübt. Wesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren ist die chemische Natur des Natriumcellulosesulfats. Besonders bewährt haben sich Produkte mit Substitutionsgraden von 0,3 bis 0,8. Offensichtlich muß der Substitutionsgrad des Cellulosesulfats möglichst gering sein, um Schädigungen des lebenden biologischen Materials auszuschließen, aber hoch genug sein, um eine gute Wasserlöslichkeit zu gewährleisten. Andererseits ist ein gewisser Mindestpolymerisationsgrad erforderlich, damit eine spontane Membranbildung mit dem Polykation erfolgt und die Membran auch eine ausreichende mechanische Festigkeit aufweist. Er sollte nicht unter 200 liegen, das entspricht einer relativen Molekülmasse von ca. 40000. Als Polykationen können verschiedene hochmolekulare Produkte mit kationischen Gruppen,-insbesondere jedoch quartären Ammoniumgruppen, (wie z» B, PoIydimethy1-diallylammoniumchlorid oder Polyvinylbenzyltrimethylammohiumchlorid) verwendet werden· Auch hier sollte der PoIymerisationsgrad nicht.zu niedrig und die relative Molekülmasse y 10000 sein. Zur Herstellung des Fällbades kann man von destilliertem Wasser, isotonischer oder physiologischer Kochsalzlösung ausgehen. Vorteilhafterweise verwendet man jedoch, wie für das Cellulosesulfat, Gewebekulturmedium als lösungsmittel.

Die Konzentration an Polykation im Fällbad kann zwischen 0,1 und 5 Masse-% variiert werden, beträgt vorzugsweise jedoch 0,5 bis 2,0 %-,. Die Kapselungsbedingungen entsprechen bezüglich pH-Wert und Temperatur den für die genannten lebenden biologischen Materialien üblichen Kultivierungs-. bedingungen. Da die Kapselwand sehr rasch gebildet wird,

können die Kapseln praktisch unmittelbar nach dem Eintropfen in die Pällbad-Lösung wieder abgetrennt werden. Zur Erzielung einer definierten Wandstärke, einer relativ hohen mechanischen Festigkeit und reproduzierbaren* Permeationseigenschaften bel&ßt man die Kapseln jedoch noch 10 s bis 120 min, vorzugsweise 5 bis 30 min im Fällbad, so daß die Wandstärke einen bestimmten Grenzwert erreicht» In Abhängigkeit von der Technik der Tropfenbildung läßt sich die Größe der Mikrokapseln;von 100 bis 5000 /Um einstellen.

Anschließend werden die gebildeten Kapseln vom Fällbad ab~ getrennt, z. B. mit isotonischer Kochsalz- oder Pufferlösung und/oder mit Kulturmedium gewaschen und in Kulturmedium aufbewahrt. Bei Verwendung der genannten Polyelektrolyte stellt die unter den angegebenen Bedingungen gebildete Kapselwand eine mechanisch stabile Membran dar, die für Makromoleküle mit relativen Molekülmassen > 50000 undurchlässig ist, so daß s. B. Immunoglobuline nicht ins Innere der Kapseln eindringen und zu Schädigungen des gekapselten Materials führen¹ können.

Andererseits können Sauerstoff, Aminosäuren, Nährstoffe sowie Glucose die Kapselmembran passieren, und auch die Freisetzung von Insulin und Glukagon ist gewährleistet. Die erfindungsgemäß hergestellten Mikrokapseln stellen damit ein hormonproduzierendes System dar, das in einfacher .Weise in den Organismus implantiert werden kann und zur Behandlung des Diabetes mellitus geeignet ist. Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des Verfahrens..

Ausführungsbeispiele

1. langerhanssche Inseln werden aus dem Pankreas einer Ratte isoliert und mit einem Kulturmedium (TOM-I99), das 2 % Natriumcellulosesulfat (Substitutionsgrad 0,4, relative Molekülmasse ca. 80000) enthält, vermischt. Anschließend werden 1 ml der Mischung, die ca. 500 Langerhanssche Inseln enthält, in ein Fällbad getropft, das durch Auflösen von 1 g Polydimethyldiallylammoniumchlorid (relative Molekülmasse ca, 40000) in 100 ml Gewebekulturmedium erhalten wurde. Unmittelbar nach dem Eintropfen überziehen sich die Tropfen mit einer dünnen durchsichtigen Haut. Die gebildeten Mikrokapseln werden noch 15 min bei 37 ⁰C im Fällbad belassen, danach durch Dekantieren vom Fällbad abgetrennt und mehrmals mit Gewebekulturmedium gewaschen. Die erhaltenen Kapseln v/eisen einen Durchmesser von 2 bis 4 mm auf und lassen sich auf Grund der guten mechanischen Festigkeit in einfacher Weise und ohne Zerstörung handhaben« Bei der anschließenden Kultivierung in Gegenwart von Glucose wird Insulin produziert und leicht verzögert an das Medium außerhalb der Kapsel abgegeben. Die produzierte und abgegebene Insulinmenge entspricht nach 3 Wochen mindestens der, die unter vergleichbaren Bedingungen von nichtgekapselten Inseln erzeugt wird.

Durch Zerstörung der in vitro kultivierten Kapseln konnte die Vitalität und Funktionalität der Inseln nachgewiesen werden.

2. Analog Beispiel 1 wurden GewebeStückchen des fötalen Pankreas gekapselt und in die Bauchhöhle implantiert. Es wurde festgestellt, daß die Piasmaglucοse auch über einen Zeitraum von 4 Wochen hinaus gesenkt wird, bei dem ungekapseltes allogenes oder xenogenes Gewebe infolge immunologischer Resektion zerstört wird.

Analog Beispiel 1 wurden Gewebeschnitte der Schilddrüse gekapselt, wobei die Konzentration an Natrium« cellulosesulfat im Kulturmedium'0,5 % betrugt. Bei der anschließenden Kultivierung konnte die Produktion und Abgabe von Thyroxin an das Kulturmedium nachgewiesen werden»

Analog Beispiel 1 wurden Gewebeschnitte der Nebenniere gekapselt, wobei der Substitutionsgrad des Natriumcellulosesulfats 0,8 betrug. Bei der anschließenden Kultivierung konnte die Vitalität und Funktionalität ges Gewebes nachgewiesen werden·

Analog Beispiel 1 wurden Gewebeschnitte der Eierstöcke gekapselt, wobei als Fällbad eine isotonische Kochsalzlösung, die 0,5 % Polyvinylbenzyltrimethylamrnoniumchlorid enthielt, verwendet wurde. Bei der anschließenden Kultivierung konnte die Vitalität und Funktionalität des Gewebes nachgewiesen werden.

Claims (6)

1. Erfindungsanspruch

   1· Verfahren zur Herstellung eines hormonproduzierenden Mikrokapselsystems, gekennzeichnet dadurch,daß man zur Hormonproduktion fähiges lebendes Gewebe oder zur Hormonproduktion fähige lebende Gewebeteile mit einem zur Erhaltung der Lebensfähigkeit geeigneten Kulturmedium vermischt, in dem 0,3 biß 5,0 Masse-% Natriumcellulosesulfat gelöst sind, die Mischung vorzugsweise in Form kugelförmiger Teilchen in ein wäßriges Fällbad einträgt, das ein gelöstes Polykation enthält, welches mit _: dem Cellulosesulfat eine semipermeable Symplex-Membran bildet, und das überschüssige Fällbad abspült. o
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dad'urch, daß das zur Hormonproduktion fähige lebende Gewebe pankreatisch.es Gewebe ist bzw. die zur Hormonproduktion fähigen lebenden Gewebeteile pankreatische Gewebeteile sind»
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die pankreatisehen Gewebeteile Langerhanssche Inseln j sind. . : \
4. 4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das zur Hormonproduktion fähige lebende Gewebe Schilddrüsengewebe ist.

   β Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das zur Hormonproduktion fähige lebende Gewebe Uebennierengewebe ist. ,
5. 6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das zur Hormonproduktion fähige lebende Gewebe Eierstoekgewebe ist.
6. 7.'.ιVerfahren nach Punkt 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß das Uatriumcellulosesulfat einen Substitutionsgrad von 0,3 bis 0,8 und eine relative Molekülmasse > 40000 aufweist* ; .

   8, Verfahren nach Punkt 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß das Polykation Polydimethyldiallylammoniumchlorid oder Polyvinylbenzyitrimethylammoniumchlorid ist und seine relative Molekülmasse y 10000 beträgt·

   9« Verfahren nach Punkt 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß das Fällbad eine isotonische wäßrige Kochsalzlösung,-Pufferlösung oder Kulturmedium ist,.in dem 0,1 bis 5,0 Masse-^ des Polykations gelöst sind·

   10«, Verfahren nach Punkt 1 bis 9» gekennzeichnet dadurch₉ daß zum Abspülen des überschüssigen Pällbades physiologische Kochsalzlösung, Pufferlörmng und/oder Kulturmedium verwendet werden·