JP2003507032A - 細胞材料の凝集 - Google Patents

細胞材料の凝集

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Abstract

(57)【要約】 細胞材料を含有する懸濁媒体から微生物細胞材料を凝集させる方法であって、カチオン性であり、２dl/g以下の固有粘度を有する第一のポリマー材料を懸濁媒体に添加することと、その後又は同時に、カチオン性又は実質的に非イオン性であり、少なくとも４dl/gの固有粘度を有する第二のポリマー材料を懸濁媒体に添加することと、細胞材料を凝集させることとを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、懸濁媒体から細胞材料を凝集させる方法に関する。細胞材料（たと
えば細胞及び／又は細胞破砕物）を含有する液状懸濁媒体から細胞材料を分離す
ることはしばしば望まれる。これを実施する一つの方法は、細胞材料を凝集させ
て、形成した凝集塊を液状懸濁媒体から分離することができるようにする方法で
ある。分離ののち、細胞材料そのものをさらに使用することもできる。あるいは
また、細胞材料を捨て、懸濁媒体の内容物を使用することもできる。
【０００２】 しかし、しばしば細胞材料を分離しなければならない懸濁媒体の中で充分な凝
集性能を与える凝集系を見いだすことは困難であることがわかった。特に、増殖
培地のような複合媒体から細胞材料を分離することがしばしば必要である。ポリ
マーのような標準的凝集剤を使用する凝集はこのような環境では問題あることが
わかった。
【０００３】 Sitkeyらは、Biotechnology Techniques, vol. 6, no. 1, 49-52 (1992)で、
発酵ブロスからの細胞、固形分及びコロイドの取り出しを記載している。分離の
ねらいは、懸濁媒体中に存在する細胞外酵素を回収することである。凝集剤とし
て使用するための１６種のポリマー材料が記載されている。使用される凝集剤の
タイプは、弱カチオン性、中カチオン性、強カチオン性、弱アニオン性、中アニ
オン性及び非イオン性である。しかし、著者によると、２種のポリマーしか効果
的な清澄化を生じさせなかった。それらは、ＢＡＳＦから市販されている中アニ
オン性ポリマーSedipur T1及びSedipur TF5であった。種々のカチオン性及び非
イオン性ポリマーの添加が記載されている。それぞれは、唯一の凝集剤として単
一投入量として添加され、発酵ブロスを清澄化するのには効果がない。
【０００４】 また、Mukhopadhyayらが、Biotechnology Techniques, vol. 4, no. 2, 121-1
26 (1990)で、懸濁媒体に溶解した細胞外酵素を回収するため、懸濁した固体を
発酵ブロスから分離することを試みている。著者は、凝固又は凝集を改善するた
めに種々多様な系を使用している。使用された凝集剤は、氷酢酸、塩化カルシウ
ム、硫酸アルミニウム及びカチオン性ポリアクリルアミドであった。また、これ
らの凝集剤２種以上が懸濁媒体に添加される系が使用されている。特に、著者は
、硫酸アルミニウム及びカチオン性ポリアクリルアミドが２種の凝集剤として使
用される系を記載している。例示された系で使用されるカチオン性ポリアクリル
アミドの量は、０．１、０．３及び０．５g/l（１００、３００及び５００ppm）
であった。使用した硫酸アルミニウムの量は、常に５．０g/l（５０００ppm）で
あった。この系を使用して発酵ブロスの清澄化が達成されたが、著者は、形成し
た凝集塊が高せん断下でより小さな粒子に分解したと述べている。これは沈降を
妨害する。したがって、この系は、発酵ブロスを清澄化することができるが、頑
丈な凝集塊を提供しない。この理由のため、後で上層液から凝集塊を分離するた
めに使用することができる方法が限られる。特に、著者は、たとえ穏やかであっ
ても遠心分離は避けるよう忠告している。
【０００５】 公報ＥＰ−Ａ−４４８，９２６は、酵素の凝集のための系を開示している。細
胞材料、たとえば細胞及び細胞破砕物を機械的手段、たとえば遠心分離によって
懸濁媒体、たとえば発酵ブロスから取り出し、上層液中に残る酵素を、特定の凝
集剤を使用して凝集させている。凝集剤は、マンニッヒアクリルアミドポリマー
とジアリルジメチルアンモニウムハライドポリマーとのブレンドである。記載さ
れた系では、まず機械的手段によって発酵ブロスから細胞材料を取り出して、そ
れが後で化学的に沈殿させられる生成物を汚染しないようにする必要がある。
【０００６】 Weirらは、Biotechnology Techniques, Vol 7, No. 3 (March 1993) pp 199-2
04で、ｐＨ７．９超で中性であると報告されるカチオン性高分子電解質であるキ
トサンを使用する、発酵ブロスからの細胞の凝集を開示している。同著者はまた
、Biotechnology Techniques, Vol 8, No. 2 (February 1994) pp 129-132で、
凝集剤としてのキトサンの使用の前に、前処理としての種々のアニオン性ポリマ
ーの使用を記載している。
【０００７】 カチオン性高分子電解質による液状培地中の微生物細胞の凝集が、その培地か
らの細胞の分離を促進することは公知である。培地が、培地の成分として及び／
又は細胞によって産生される高濃度のアニオン性高分子電解質を含む場合、高分
子量カチオン性凝集剤の添加が凝集塊を生成する。これらの凝集塊は、濃縮した
凝集剤と、アニオン性及びカチオン性ポリマー（高分子塩）から形成される高分
子電解質複合体及び／又は凝集塊を処理器具に付着させるアニオン性及びカチオ
ン性ポリマーの沈殿物との混合物で汚染される。高濃度のアニオン性高分子電解
質を含有する細菌培地に低分子量カチオン性ポリマー凝集剤を添加する代替手法
は、十分な凝集を達成しようとするならば、アニオン性及びカチオン性ポリマー
複合体及び／又は沈殿物の形成のため、高いポリマー投入量を要する。そのうえ
、低分子量カチオン性ポリマー凝集剤を使用して生成される凝集塊は、高分子量
ポリマーを使用して生成される凝集塊よりも相当に弱いことがわかった。せん断
下、低分子量カチオン性ポリマー凝集剤を使用して生成された凝集塊から細胞が
放出され、これが分離効率の低下をもたらす。
【０００８】 懸濁媒体、たとえば発酵ブロスから細胞を分離するための効率的な系を提供す
ることができることが望ましいであろう。また、凝集後に多様な分離方法を使用
することができ、分離方法及び必要ならばその後の使用に耐えるのに充分に頑丈
な凝集塊を提供することができることが望ましいであろう。
【０００９】 本発明にしたがって、細胞材料を含有する懸濁媒体から細胞材料を凝集させる
方法であって、カチオン性であり、２dl/g以下の固有粘度を有する第一のポリマ
ー材料を懸濁媒体に添加することと、その後又は同時に、カチオン性又は実質的
に非イオン性であり、少なくとも４dl/gの固有粘度を有する第二のカチオン性ポ
リマー材料を懸濁媒体に添加することと、細胞材料を凝集させることとを含む方
法を提供する。
【００１０】 細胞材料を凝集させるための前記第一及び第二のポリマー材料の使用が、過剰
なポリマー投入量を要することなく高せん断下での分離に適した頑丈な凝集塊の
生成をもたらすことがわかった。特に、高レベルのアニオン性高分子電解質を含
有する微生物ブロスを２dl/g以下の固有粘度のカチオン性ポリマーで前処理し、
続いて、少なくとも４dl/gの固有粘度を有するポリマー凝集剤で前処理すること
により、粘着性の濃縮ポリマーを含有しない頑丈な凝集塊を製造することがわか
った。合計ポリマー投入量は、少なくとも４dl/gの固有粘度を有するポリマーだ
けを使用する公知の方法よりも多いが、２dl/g以下の固有粘度を有するポリマー
だけを使用する公知の方法よりも少ない。
【００１１】 また、驚くことに、２種のポリマーを実質的に同時に、又はブレンドとして添
加する場合、本発明の２ポリマー系の合計ポリマー投入量を最大３０％減らすこ
とができることがわかった。同様に驚くことは、少なくとも４dl/gの固有粘度を
有するポリマーと、２dl/g以下の固有粘度を有するポリマーとの、同時又はブレ
ンドとしての添加が粘着性の凝集塊を生成しないという発見である。
【００１２】 したがって、本発明は、凝集塊を破壊することなく種々の分離方法を使用させ
るための融通性を提供する。
【００１３】 本発明では、懸濁媒体から細胞材料を凝集させる。細胞材料とは、細胞、細胞
破砕物、胞子及び／又は生物学的粒状物、特に細胞及び／又は細胞破砕物をいう
。酵素又はポリマーのような細胞産生物のみの凝集は含まない。
【００１４】 本発明は、種々の微生物から細胞材料を凝集させるために使用することができ
る。したがって、本発明は、懸濁媒体中のいかなる微生物細胞材料をも凝集させ
るゆえに価値がある。これらは、懸濁媒体中の細菌、たとえばBacillus subtili
s（枯草菌）を含む。
【００１５】 懸濁媒体中の細胞材料の濃度は、普通は少なくとも０．５g（乾燥重量）/l、
しばしば少なくとも２又は３g/lであり、１００又は１５０g/lに達することもあ
る。
【００１６】 懸濁媒体はしばしば増殖培地であり、細胞材料を発酵ブロスから凝集させるよ
うになっている。これは、複合培地であり、標準増殖培地成分、たとえばデンプ
ン（たとえばジャガイモデンプン）、コーン粉、コーンフラワー、コーン浸漬液
、大豆フラワー、トウモロコシグルテン、酵母抽出物、糖蜜蒸留物、魚粉、ペプ
トン及び他の市販の溶解物を含有する。懸濁媒体のｐＨは重要ではないが、普通
は３〜１０、しばしば４〜９、たとえば６〜８である。増殖培地は、増殖培地の
成分の一部として又は増殖する細胞の産物として、高レベルのアニオン性材料、
たとえばアニオン性高分子電解質を含有することが多い。そのような培地からの
細胞材料の凝集が特に困難であることがわかったため、本発明はそのような培地
で特に用途がある。
【００１７】 本発明の方法では、第一及び第二のポリマー材料を、細胞材料を含有する懸濁
媒体に添加する。２種のポリマー材料は、順次に懸濁媒体に添加することができ
る。すなわち、第一のカチオン性ポリマー材料を添加したのち、第二のカチオン
性ポリマー材料を添加する。順次添加を使用する場合、第一のカチオン性ポリマ
ー材料を懸濁媒体に混入したのち、第二のカチオン性ポリマー材料を添加するこ
とが好ましい。
【００１８】 第一及び第二のカチオン性ポリマー材料は、実質的に同時に懸濁媒体に添加す
ることが好ましい。これらの材料は、３０秒以下の間隔で同時に単独で添加する
ことができる。一方のポリマー材料を懸濁媒体へ混合することは、他方の添加の
前には実質的に実施しない。
【００１９】 好ましくは、両材料は、予備形成（プレフォーム）したブレンドとして添加す
る。特にプレフォームブレンドとしての同時添加は、２種のポリマー材料を順次
（すなわち、同時ではない）に添加する場合に比べて特に有利である。実際、順
次添加の場合に比べ、両ポリマー材料の投入量は減らすことができ、性能は維持
することができる。
【００２０】 ポリマー材料は、いかなる適当な形態で懸濁媒体に添加してもよい。適当な添
加形態は粉末を含むが、水性溶液が好ましい。たとえば、第一及び第二のカチオ
ン性ポリマー材料を別々に添加するならば、それぞれは、少なくとも０．０５%w
/v、しばしば１．０%w/v以下の濃度の水溶液として添加することが好ましい。水
性溶液中の適当な濃度は約０．１%w/vであるが、ずっと高めの濃度、たとえば８
．０%w/vを超え、場合によっては５０．０%w/vに達する濃度であることもできる
。
【００２１】 懸濁媒体に添加される第一の活性カチオン性ポリマー材料の量は、懸濁媒体の
総重量（細胞材料及び添加したポリマーを含む）に基づいて、１０００ppm以下
、好ましくは５００ppm以下であることができる。しばしば、３００又は２００p
pm以下である。１５０ppmの低さの量でも良好な結果を得ることができ、１２０p
pmの低さの量でさえ、最高の結果を得ることができる。量は、一般には少なくと
も５０ppm、しばしば少なくとも１００ppmである。しかし、高いバイオマス濃度
を凝集させる場合、はるかに高めの量、たとえば４０００ppmに達する量が必要
になることもありうる。同様に、少なくとも４dl/gの固有粘度を有するポリマー
の場合でも、上記で挙げた投入量よりも高い投入量が必要になることもありうる
。
【００２２】 懸濁媒体に添加される第二の活性ポリマー材料の量は、一般に５００ppm以下
、好ましくは２５０ppm以下である。しばしば、１００又は８０ppm未満であり、
５０ppm以下の量でさえ、最高の結果を得ることができる。一般に、量は少なく
とも２５ppmである。
【００２３】 第一及び第二のポリマー材料のこれらの量は、別々の添加（順次又は同時）に
適し、プレフォームブレンドとしての２種のポリマー材料の使用に適している。
しかし、特にプレフォームブレンドとしての同時添加が、順次添加よりも少ない
量の使用を可能にする。
【００２４】 プレフォームブレンドでは、第一のポリマー材料と第二のポリマー材料との比
（活性ポリマー、重量比）は、好ましくは４０：６０〜９５：５（第一のポリマ
ー材料：第二のポリマー材料）である。より好ましくは、比は、５０：５０〜９
０：１０であり、もっとも好ましくは、６０：４０〜８０：２０である。特に良
好な結果が、第一のポリマー材料と第二のポリマー材料との比が６５：３５〜７
５：２５、特に約７０：３０であるブレンドによって得られた。
【００２５】 懸濁媒体に添加される活性ポリマーブレンドの合計量は、一般には１０００pp
m未満、しばしば５００ppm未満である。３００又は２５０ppm未満であることも
でき、２００ppm未満の量でさえ、良好な結果が得られた。１７０ppmの低さの量
でさえ、最高の結果を達成することができる。懸濁媒体に添加される活性ポリマ
ーの合計量は、一般には少なくとも５０ppm、好ましくは少なくとも１００ppmで
ある。
【００２６】 第一及び第二のポリマー材料をブレンドとして添加する場合、これは、いかな
る適当な形態、たとえば粉末又は好ましくは水性溶液であってもよい。水性溶液
中のポリマーの総濃度は、一般には少なくとも０．０５%w/vであり、通常は１%w
/v以下である。
【００２７】 また、懸濁媒体と細胞材料との特定の組み合わせに関して、各ポリマータイプ
のどの投入量が最高の性能を与えるのかを予測するための新規な方法を発明した
。方法は次のとおりである。
【００２８】 １．懸濁媒体のサンプルを採取する。懸濁媒体のサンプルから機械的手段、たと
えばバッチ遠心分離によって細胞材料を分離して、分離した細胞材料及び消費さ
れた懸濁媒体を得る。
【００２９】 ２．第一のポリマー材料を消費された懸濁媒体に添加し、充分に混合したサンプ
ルの吸光度の増大を６００nmで計測する。吸光度の最大の増大を生じさせる第一
のポリマー材料の量を投入量１として記録する。
【００３０】 ３．分離した細胞材料を、消費された懸濁媒体と同じ量、イオン強度及びｐＨを
有する塩水に再び懸濁させる。
【００３１】 ４．次に、再懸濁させた細胞材料に第二のポリマー材料を徐々に添加し、濁り度
の減少を、以下に記載するように観察される６００nmで計測されるサンプルの吸
光度として計測する。濁り度の最大の減少を生じさせる第二のポリマー材料の量
を投入量２として記録する。
【００３２】 ５．第一及び第二のポリマー材料を投入量１と投入量２との比で使用して、全懸
濁媒体から細胞材料を凝集させる。
【００３３】 上記方法は、第一のポリマー材料と第二のポリマー材料との最適比の近似値を
与える。しかし、実際には、ブレンド形態にあるポリマーの絶対投入量は低めに
なる。加えて、最適なブレンド比は、低分子量画分がより高くなることがある点
で、試験方法とはわずかな程度に異なることがある。
【００３４】 第一のポリマー材料は、２dl/g以下の固有粘度を有する。本明細書では、固有
粘度（ＩＶ）は、懸垂したレベル粘度計により、ｐＨ７に緩衝した１Ｎ塩化ナト
リウム溶液中２５℃で計測される。好ましくは、（ＩＶ）は１．５dl/g以下であ
る。好ましくは、少なくとも０．５dl/gである。１dl/g以下に達することもある
。
【００３５】 ポリマー材料はカチオン性である。それは、好ましくは合成ポリマー材料であ
り、一般に、エチレン性不飽和モノマー又はモノマーブレンドの重合によって製
造される。
【００３６】 好ましくは、第一のカチオン性ポリマー材料は、比較的高い電荷密度を有する
。特に、少なくとも４meq/g、普通は少なくとも５meq/gの理論上のカチオン電荷
密度を有する。通常、理論上のカチオン電荷密度は約２５meq/g以下である。本
明細書では、理論上のカチオン電荷密度とは、ポリマーを形成するために使用さ
れるモノマー組成物から計算によって得られる電荷密度である。
【００３７】 好ましくは、ポリマーは、少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０
重量％がカチオン性であるモノマーから形成される。カチオン性モノマー含量は
、好ましくは少なくとも９０重量％であり、１００重量％であることもできる。
【００３８】 適当なカチオン性モノマーは、ジアリルジアルキルアンモニウムハライド、た
とえばジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＡＤＭＡＣ）を含む。これと
少量（普通は３０重量％未満、好ましくは１０重量％未満）の（メタ）アクリル
アミドとのコポリマーを使用することができるが、ホモポリマーが好ましい。ジ
アルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート第四級塩又は酸付加塩のホモポリ
マー、ならびに場合によっては第四級又は酸付加塩としてのジアルキルアミノア
ルキル（メタ）アクリルアミドのホモポリマー、ならびにこれらと少量（一般に
は３０重量％未満、好ましくは１０重量％未満）の（メタ）アクリルアミドとの
コポリマーを使用することもできる。他の適当な第一のカチオン性ポリマー材料
は、ポリエチレンイミン、ポリアミン、エピクロロヒドリンジアミン縮合物、ジ
シアンジアミドポリマー及び他の従来の低分子量カチオン性凝固剤ポリマーを含
む。ポリＤＡＤＭＡＣが好ましい。
【００３９】 第二のポリマー材料は、少なくとも６dl/gの固有粘度を有する。好ましくは、
（ＩＶ）は、８〜１５dl/g又は８〜２０dl/gであるか、それよりも高い。
【００４０】 この材料は、カチオン性であってもよいし、実質的に非イオン性であってもよ
い。好ましくはカチオン性である。第二のポリマー材料は、カチオン性であるな
らば、一般に比較的低いカチオン電荷密度の材料である。好ましくは、理論上の
カチオン電荷密度は、４meq/g、しばしば約３又は２meq/gのオーダーであるが、
約０．１meq/g又は約０．５meq/gの低さであることもできる。
【００４１】 第二のポリマー材料は、好ましくは合成ポリマー、特に、エチレン性不飽和モ
ノマー又はモノマーブレンドの重合によって形成される合成ポリマーである。第
二のポリマー材料がカチオン性である場合、ブレンド中のカチオン性モノマーの
量は、普通は少なくとも２又は３重量％である。５０重量％に達することもでき
るが、一般には２０重量％以下である。
【００４２】 好ましいカチオン性モノマーは、酸付加塩又は好ましくは第四級塩としてのジ
アルキルアミノアルキル（メタ）アクリレートである。好ましくは酸付加塩又は
第四級塩としてのジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミドを使用する
こともできるが、好ましくは、ポリマーは、マンニッヒアクリルアミドポリマー
ではない。アルキル基はそれぞれ炭素原子１〜４個を含むことができ、アミノア
ルキル基は炭素原子１〜８個を含むことができる。特に好ましいものはジアルキ
ルアミノエチル（メタ）アクリレートである。
【００４３】 これらのモノマーは普通、非イオン性モノマー、たとえばメタクリルアミド又
は好ましくはアクリルアミドとで共重合される。第二のカチオン性ポリマー材料
は、より少量のアニオン性ポリマー、たとえばアクリル酸又は他のエチレン性不
飽和カルボン酸モノマーの包含により、両性ポリマーであることができる。
【００４４】 あるいはまた、第二のポリマー材料は、実質的に非イオン性であってもよいし
、３重量％未満（モノマーブレンドの重量に基づいて）のイオン性モノマーを含
有するものでもよい。これは、たとえば、１００％アクリルアミドから、場合に
よっては３重量％未満、普通は１又は２重量％未満のアクリル酸を形成するため
の少量の加水分解によって形成することができる。他の非イオン性モノマーはメ
タクリルアミドを含む。
【００４５】 第二のポリマー材料は、特にカチオン性である場合、完全に水溶性の材料であ
ることもできるし、架橋されたポリマーの形態にあることもできる。ポリマーは
、たとえばＥＰ−Ａ−２０２，７８０に記載されているように、少量の架橋剤を
使用して製造することができる。このタイプの好ましいポリマーは、２０〜８０
％のイオンリゲインを有する（ＥＰ−Ａ−２０２，７８０で定義するとおり）。
好ましくは、ポリマーは線状ポリマーである。
【００４６】 この方法では、第一及び第二のポリマー材料を懸濁媒体に添加し、細胞材料を
凝集させる。好ましくは、凝集は、攪拌しながら起こさせる。しばしば、これは
混合の継続である。
【００４７】 両ポリマー材料を添加したならば、一般に、懸濁媒体を約５〜３０分間、通常
は１０〜２０分間、沈降させる。
【００４８】 沈降速度は、細胞材料の凝集塊によって形成される固形界面を観察し、この界
面が直径１２mmの標準１２ml試験管の中で１cm移動するのに要する時間を観測す
ることによって計測される。好ましい方法では、沈降速度は少なくとも３、好ま
しくは少なくとも８cm/minであり、特に好ましい方法では、少なくとも１０cm/m
inである。
【００４９】 凝集の有効性は、濁り度の減少率（％ＲＴ）に換算して計測される。％ＲＴは
、凝集前の吸光度と比較した凝集後の懸濁媒体の吸光度（６００nm）の減少であ
る。よって、 ％ＲＴ＝（（Ａ1−Ａ2）×１００）／Ａ1 ただし、Ａ1＝凝集前の懸濁媒体の６００nmでの吸光度であり、 Ａ2＝第一及び第二のポリマー材料を添加し、１５分間沈降させた後の懸濁媒
体の６００nmでの吸光度である。
【００５０】 この方法では、％ＲＴは、非常に高く、たとえば少なくとも９０又は９５％に
なることができ、少なくとも９８％又は実質的に１００％にさえなることができ
る。
【００５１】 本発明では、活性ポリマーの最小有効量（ＭＥＤ）を計算する。ＭＥＤは、９
０％ＲＴを生成するポリマー（別々又はブレンドとしての第一及び第二のポリマ
ー材料の合計）の最低活性投入量である。本発明では、ＭＥＤは、２００ppm以
下であることができ、１７０ppm以下でさえあることができる。
【００５２】 本発明の一つの利点は、形成される凝集塊の頑丈さにある。本発明では、凝集
塊強さ指数（ＦＳＩ）に換算して凝集塊の強さを計測する。この値は、高せん断
下の凝集塊の強さを表す。１５分の沈降ののち形成する凝集塊を高せん断に付す
。これは、本明細書では、Miximatic（Jencons）ミキサの最高設定で生じる３０
秒のうず混合の間に、標準の１２ml試験管中の懸濁媒体５mlに加わるせん断と定
義する。次に、せん断された凝集塊を１５分間沈降させ、沈降した懸濁媒体の％
ＲＴを計測する。よって、 凝集塊強さ指数＝１００−（％ＲＴA−％ＲＴB） ただし、％ＲＴA＝凝集後の％ＲＴ ％ＲＴB＝せん断後の％ＲＴ
【００５３】 ％ＲＴは、常に、非凝集状態の懸濁媒体の濁り度に対して計算される。
【００５４】 好ましくは、ＦＳＩは、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％であ
り、少なくとも９８％の高さでさえあることもできる。
【００５５】 凝集塊の強さを評価するもう一つの方法は、せん断試験後の沈降速度を計測す
る方法である。好ましくは、せん断後の沈降速度は、少なくとも２、好ましくは
少なくとも３cm/minであり、しばしば少なくとも５cm/minである。
【００５６】 そして、凝集した細胞材料を清澄化した懸濁媒体から分離する。適当な分離方
法は、遠心分離（バッチ）、半連続、連続ろ過、たとえば真空ろ過及び他の公知
の分離方法を含む。
【００５７】 本発明の一つの利点は、凝集塊を機械的攪拌及び／又はせん断に付し、比較的
弱い凝集塊の場合には凝集塊の破壊につながると予想されるものをはじめとする
種々多様な分離方法の使用を可能にする改善された凝集塊強さである。
【００５８】 分離ののち、凝集した細胞材料は、種々の方法で、たとえば触媒として使用す
ることができる。上層液の内容物もまた、種々の方法で使用することができる。
望むならば、上層液中に存在する酵素を上層液から凝集させてもよい。
【００５９】 次に、以下の例によって本発明を説明する。
【００６０】 例 これらの例では、凝集の有効性は、上記のようにして計測される％ＲＴとして
表す。最小有効投入量は、上記のようにして計測する。沈降速度及び凝集塊強さ
指数もまた、上記で論じたようにして計測する。使用したポリマーは以下のとお
りであった。
【００６１】 ポリマー１ ポリＤＡＤＭＡＣ、（ＩＶ）約１dl/g ポリマー２ アクリルアミド６７重量％とカチオン性モノマー（塩化メチルで第
四級化したジメチルアミノエチルメタクリレート）３３重量％とのコポリマー、
（ＩＶ）約１１dl/g
【００６２】 実験では、別段指定しない限り、以下のようにして凝集を実施する。バイオマ
ス濃度２．７g（乾燥重量）/lのBacillus subtilisの懸濁媒体を使用した。媒体
のアリコート（４ml）を１２ml試験管に入れ、うずミキサ上で約５秒間、強烈に
攪拌して徹底的な混合を確実にする間に、各凝集剤ポリマー又はブレンドを添加
した。
【００６３】 別段指定しない限り、各ポリマー又はブレンドは、０．１％（w/v）水溶液と
して媒体に添加した。
【００６４】 例１ この例では、上記B. subtilis懸濁媒体に対してポリマー１とポリマー２との
種々のブレンドを試験して、これら２種のポリマーの最適比を見いだした。ポリ
マー１：ポリマー２の比が４０：６０、５０：５０、６０：４０、６５：３５及
び７０：３０であるブレンドを上記のように試験した。７０：３０の混合物が、
全体的に粒状である最良の沈殿物を生じさせた。６５：３５ブレンドもまた、一
部が粒状であり、一部が繊維質である適切な沈殿物を生じさせた。これらのポリ
マーの場合、この懸濁媒体中、４０：６０、５０：５０及び６０：４０のブレン
ドは最適ではなく、むしろ「繊維質」の沈殿物を生じさせた。
【００６５】 例２ 例１で最適であることがわかった７０：３０ブレンドをさらに試験した。ポリ
マー１のみ、ポリマー２のみ及びポリマー１とポリマー２との７０：３０ブレン
ドのＭＥＤ値を見いだした。
【００６６】 ブレンドの添加後の沈降速度と同様、沈殿物の性質を観察した。
【００６７】 また、凝集後の％ＲＴを上記のようにして計算した。上記で論じたようにして
、凝集塊を高せん断に付して凝集塊強さ指数を得た。高せん断ののち、沈降速度
を再び測定した。結果を以下の表１に示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】 これらの結果から、ポリマー１だけでも粒状の沈殿物を生じさせるが、低いＦ
ＳＩ及び低い高せん断後の沈降速度によって実証されるように、沈降速度が低く
、凝集塊強さも同様に低かったことが見てとれる。ポリマー２だけでも良好な沈
降速度及び凝集塊強さが得られたが、沈殿物が繊維質であった。ブレンドは、粒
状の沈殿物ならびに良好な沈降速度及び凝集塊強さを与えた。また、ＭＥＤは、
ポリマー１のＭＥＤよりも低く、かつポリマー２のＭＥＤよりも有意には高くな
いことが注目される。
【００７０】 例３ この実験では、試験を使用して第一及び第二のカチオン性材料それぞれの最適
量を得た。
【００７１】 栄養ブロス培地中４g/lの濃度まで増殖させたB. subtilisのサンプルを３００
０ｇで１５分間遠心分離した。次に、上層液を回収し、遠心分離した細胞を同じ
量の塩水（０．８５％（w/w）塩化ナトリウム）に再び懸濁させた。
【００７２】 ６００nmでの吸光度が極大値に達するまで、ポリマー１の溶液を連続的に上層
液に添加することにより、ポリマー１の最適量を得た。要した投入量は１４０pp
mであった。
【００７３】 １００％ＲＴが観察されるまで、異なる投入量を塩水中B. subtilisの懸濁媒
体に添加することにより、ポリマー２の最適投入量を得た。これに要した投入量
は５０ppmであった。
【００７４】 次に、１４０ppmポリマー１と５０ppmポリマー２とのブレンドを使用して、上
記のようにB. subtilisを凝集させた。１５分の沈降後の％ＲＴは１００％であ
った。
【００７５】 以下の例では、Lightnin A200インペラ（直径４．７cm）で攪拌される２５０c
m3ビーカ中で、１００cm3アリコートに対して凝集を実施したのち、１００cm3メ
スシリンダ中で、凝集したB. subtilis泥線が５０mm移動するための時間を計時
することによって沈降速度を計測した。
【００７６】 ポリマー３は、固有粘度が約１２dl/gである市販のカチオン性ポリマー〔活性
組成：アクリルアミド４０％及びカチオン性モノマー（塩化メチルで第四級化さ
れたジメチル−アミノエチルメタクリレート）６０％〕であった。
【００７７】 ポリマー４は、好ましくはせん断後で４dl/gの固有粘度を有する市販のカチオ
ン性ポリマー（活性組成：アクリルアミド２０％及びポリマー３と同様のモノマ
ー８０％）であった（欧州特許０２０２７８０Ｂに記載）。
【００７８】 別段記載しない限り、単独又はブレンド状態のポリマー１及び３又は４は、そ
れぞれ１％及び０．２％（w/v）水溶液として媒体に添加した。
【００７９】 例４ この例では、まず、ポリマー１の投入量を、２リットルのバッフル付きしん盪
フラスコ中３０℃で、１３g/l栄養ブロス（Oxoid）の中で１６時間増殖させたB
subtilisの４．７６g/l懸濁媒体に添加した。使用したポリマー１の最初の投入
量は２１０ppmであり、それは、消費された媒体の処理だけで最大沈殿を生じさ
せることがわかった量である。第二の実験では、使用したポリマー１の投入量は
、第一の実験での投入量を有意に超える２９０ppmであった。次に、２種のポリ
マーで処理した懸濁媒体をアリコートに分け、等分した懸濁媒体（２１０及び２
９０ppmで処理）それぞれに、異なる投入量のポリマー３又はポリマー４を、ポ
リマー３又は４のＭＥＤが観察される（９５％ＲＴ）まで添加した。結果を表２
に示す。
【００８０】
【表２】
【００８１】 結果は、ポリマー１のより高い投入量が、必要なポリマー３又は４の最小有効
投入量の減少をもたらすことを示す。
【００８２】 例５ ポリマー１とポリマー３との６５：３５の比率のブレンド及びポリマー１とポ
リマー４との６０：４０の比率のブレンドにより、消費された栄養ブロス（Oxoi
d）中４．７６g（乾燥細胞）/lの濃度のB subtilisの凝集を実施した。
【００８３】 ２種のブレンドそれぞれの最小有効投入量を表３に示す。
【００８４】
【表３】
【００８５】 同じB subtilis懸濁媒体を凝集させるために、ポリマーを順次に使用する場合
（たとえば、例４の表２のポリマー１の投入量とポリマー３の投入量とを順次に
添加）と、ブレンドとして使用する場合とでポリマーの合計投入量を比較すると
、驚くことに、合計ポリマー投入量が大幅に減ることがわかる。
【００８６】 例６ 表４は、ポリマー単独の添加、ポリマー１ののちポリマー３又は４の順次添加
及びポリマー１とポリマー３又は４とのブレンドの添加によって生成した凝集塊
の凝集塊沈降特性及びせん断安定性を示す。
【００８７】 例４及び５と同様、凝集させる懸濁媒体は、消費された栄養ブロス中４．７６
g/l（乾燥細胞）の濃度のB subtilisであった。各方法によって生成された凝集
塊のせん断安定性を試験するため、凝集した懸濁媒体（１００cm3）を、２５０c
m3ビーカ中、Tritonミキサを使用して９０秒間せん断した（攪拌速度３００rpm
、羽根直径６．２cm、羽根幅０．５cm）。
【００８８】
【表４】
【００８９】 ポリマー１単独での使用は、沈降速度が遅い微粒状凝集塊懸濁媒体を提供し、
生成された凝集塊は、せん断後の％ＲＴの減少によって実証されるように、不十
分なせん断安定性を示した。ポリマー１及びポリマー３又は４を順次に添加する
使用は、高せん断を受けるとサイズが減少する（沈降速度によって計測）が、侵
食はしない（高いＦＳＩによって実証）、急速に沈降する大きな凝集塊を生じさ
せた。ポリマーブレンドは、大幅に減少させた合計ポリマー投入量でせん断安定
性である、高い沈降速度を示す凝集塊を提供した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:125 Ｃ１２Ｒ 1:125） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヒューズ，ジョナサン イギリス国 ウェスト ヨークシャー エ イチディー６ ３イーダブリュ ブリッグ ハウス ラストリック スカレイ ロード 22 (72)発明者 ウィアー，スティーブン イギリス国 ウェスト ヨークシャー エ イチディー２ １エスエル ハッダースフ ィールド ブラッドレイ セント トーマ ス ガーデンズ 29 (72)発明者 モラン，ポール イギリス国 ウェスト ヨークシャー エ ルエス29 ０ティーディー イルクレイ アディンガム ジョナサン ガース ８ Ｆターム(参考） 2G045 BB10 CB21 FA11 GC10 4B063 QA20 QQ05 QQ61 QQ91 QR74 QX01 4B065 AA01X AA19X AA57X AA83X AA86X AA87X AA95X BD50 CA27 CA46 CA54 4D015 BA05 BA06 BA09 BA12 BA19 BB08 BB09 BB17 CA20 DB03 DB05 DB07 DB15 DB19 DB24 DB25 DC02 DC06 DC07 EA03 EA04 EA06 EA32 EA35 EA39 FA01 FA19

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞材料を含有する懸濁媒体から微生物細胞材料を凝集させ
    る方法であって、カチオン性であり、２dl/g以下の固有粘度を有する第一のポリ
    マー材料を懸濁媒体に添加することと、その後又は同時に、カチオン性又は実質
    的に非イオン性であり、少なくとも４dl/gの固有粘度を有する第二のポリマー材
    料を前記懸濁媒体に添加することと、細胞材料を凝集させることとを含む方法。
  2. 【請求項２】 前記第一のポリマー材料が少なくとも５meq/gの理論上のカ
    チオン電荷密度を有する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記第二のポリマー材料がカチオン性である、請求項１又は
    ２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記第二のポリマー材料が４meq/g以下の理論上のカチオン
    電荷密度を有する、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記第二のポリマー材料が、第四級又は酸付加塩としてのジ
    アルキルアミノアルキル（メタ）アクリレートモノマーと、非イオン性エチレン
    性不飽和モノマーとのコポリマーであり、好ましくは、アクリルアミドと、塩化
    メチルで第四級化されたジメチルアミノエチルアクリレートとのコポリマーであ
    る、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記第一及び第二のポリマー材料を同時に前記懸濁媒体に添
    加する、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記第一及び第二のポリマー材料をプレフォームブレンドと
    して前記懸濁媒体に添加する、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記第二のポリマー材料の活性投入量が、前記懸濁媒体の重
    量に基づいて、５００ppm以下、好ましくは２５０ppm以下である、請求項１〜７
    のいずれか記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記第一のポリマー材料の活性投入量が、前記懸濁媒体の重
    量に基づいて、１０００ppm以下、好ましくは５００ppm以下である、請求項１〜
    ８のいずれか記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記第一及び第二のポリマー材料をプレフォームブレンド
    として前記懸濁媒体に添加し、前記ブレンドの活性投入量が、前記懸濁媒体の重
    量に基づいて、５００ppm以下、好ましくは２５０ppm以下である、請求項１〜９
    のいずれか記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記第一及び第二のポリマー材料を、第一のポリマー材料
    ：第二のポリマー材料の比６０：４０〜８０：２０、好ましくは６５：３５〜７
    ５：２５で前記懸濁媒体に添加する、請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記第一のポリマー材料が、ポリＤＡＤＭＡＣであり、前
    記第二のポリマー材料が、アクリルアミドと、塩化メチルで第四級化されたジメ
    チルアミノエチルアクリレートとのコポリマーである、請求項１０記載の方法。
  13. 【請求項１３】 凝集した細胞材料を前記懸濁媒体から分離し、触媒として
    使用する、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
  14. 【請求項１４】 懸濁した細胞材料を含有する媒体に添加するための２種の
    凝固剤の投入量を評価する試験法であって、 ｉ）懸濁媒体のサンプルを採取し、前記サンプルから機械的手段によって細胞
    材料を分離して、分離した細胞材料及び消費された懸濁媒体を得ることと、 ii）第一のポリマー材料を消費された懸濁媒体に添加し、吸光度を増大させる
    ことと、 iii）懸濁媒体のさらなるサンプル及び異なる量の第一のポリマー材料で処理
    を繰り返し、吸光度における最大の増大を生じさせる第一のポリマー材料の量を
    投入量１として記録することと、 iv）分離した細胞材料を、消費された懸濁媒体と同じ量、イオン強度及びｐＨ
    を有する塩水に再び懸濁させることと、 ｖ）再び懸濁させた細胞材料に第二のポリマー材料を添加し、濁り度の減少を
    生じさせることと、 vi）異なる量の第二のポリマー材料でステップiv）を繰り返し、濁り度の最大
    減少を生じさせる量を投入量２として記録することと、 を含む方法。
  15. 【請求項１５】 前記第一のポリマー材料が請求項１で定義したとおりであ
    り、前記第二のポリマー材料が請求項１で定義したとおりであり、続いて前記投
    入量を請求項１の処理に使用する、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記後続処理が請求項２〜１３記載の特徴のいずれかを有
    する、請求項１５記載の方法。
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