CN1369004A - 细胞材料的絮凝化 - Google Patents
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Abstract
一种从含有细胞材料的悬浮培养基中絮凝化微生物细胞材料的方法,它包括向悬浮培养基中加入一种第一聚合材料,该材料是阳离子的并且特性粘度不超过2dl/g,然后相继或同时向悬浮培养基中加入一种第二聚合材料,该材料是阳离子的或基本上是非离子的并且特性粘度至少是4dl/g,然后将细胞材料絮凝化。
Description
本发明涉及细胞材料从悬浮介质中絮凝化的方法。通常希望将细胞材料(如细胞和/或细胞碎片)从含有细胞材料的液体悬浮培养基中分离出来，一种方法是将细胞材料絮凝化以致于形成的絮凝物可以从液体悬浮培养基中分离出来，分离出来后细胞材料本身仍可以使用。此外可以弃去细胞材料，而使用悬浮培养基中的内含物。
然而已经证实难以找到能够在悬浮介质中给予足够絮凝化作用的絮凝化体系，通常从该悬浮介质中必须分离出细胞材料。特别是经常需要从复杂的介质如生长培养基中分离细胞材料。已经发现使用标准絮凝剂如聚合物进行絮凝化在这些环境中尚有问题。
Sitkey等人在Biotechnology Techniques，6卷，1期，49-52(1992)描述了从发酵肉汤中除去细胞、固体和胶体的方法，分离的目的是回收悬浮培养基中存在的胞外酶。描述了用作絮凝剂的16种聚合物材料。所使用的絮凝剂类型是弱阳离子、中性阳离子、强阳离子、弱阴离子、中性阴离子和非离子的。然而根据作者所述只有两种聚合物能得到有效的澄清，即中性阴离子聚合物Sedipur T1和Sedipur TF5，购于BASF公司。也描述了加入各种阳离子和非离子聚合物，每种都以单一剂量加入作为唯一的絮凝剂，但并没有有效地澄清发酵肉汤。
Mukhopadhyay等人在Biotechnology Techniques，4卷，2期，121-126(1990)也尝试从发酵肉汤中分离出悬浮的固体，其目的是回收溶解在悬浮培养基中的胞外酶。作者采用了多种不同体系以改进凝胶化或絮凝化。所使用的絮凝剂是冰乙酸、氯化钙、硫酸铝和阳离子聚丙烯酰胺。还采用这些体系，其中两种或多种这些试剂均加入到悬浮培养基中。作者特别描述了这种体系，其中硫酸铝和阳离子聚丙烯酰胺被用作两种絮凝剂。在此示范体系中阳离子聚丙烯酰胺的用量为0.1、0.3和0.5g/l(100、300和500ppm)，而硫酸铝的用量通常为5.0g/l(5000ppm)。尽管采用这种体系得到了发酵肉汤的澄清，但作者声明形成的絮凝物在高剪切条件下会分解为较小的颗粒，这就妨碍了沉积。因此这种体系可以澄清发酵肉汤，但不会提供大块的絮凝物。出于此原因，能够在随后用来从上清液中分离絮凝物的方法受到限制。作者特别建议要用更加温和的离心方法。
欧洲公开专利申请EP-A-448926披露了一种用来使酶絮凝化的体系，细胞材料如细胞和细胞碎片通过机械方法如离心从悬浮培养基如发酵肉汤中除去，而留在上清液中的酶用一种特殊的絮凝剂絮凝化。该絮凝剂是Mannich丙烯酰胺聚合物和二烯丙基二甲基卤化铵聚合物的一种共混物。在所述体系中，必须首先通过机械方法从发酵肉汤中除去细胞材料，因为细胞材料会污染以后的化学沉淀产物。
Weir等人在Biotechnology Techniques，7卷，3期，(1993.3)199-204页中公开了使用壳聚糖从发酵肉汤中使细胞絮凝化的方法，壳聚糖是一种阳离子聚电解质，据报道pH为7.9以上时是中性的。相同的作者还在Biotechnology Techniques，8卷，2期，(1994.2)129-132页中描述了在用壳聚糖作为絮凝剂之前使用各种阴离子聚合物作为预处理剂。
已知在液体培养基中用阳离子聚电解质对微生物细胞进行絮凝化会协助从培养基中分离细胞。当培养基含有高浓度的阴离子聚电解质作为培养基的成分和/或由细胞产生的成分时，加入高分子量阳离子絮凝剂会产生絮凝物。这些絮凝物将会被浓缩的絮凝剂和聚电解质络合物的混合物污染，此络合物由一种阴离子和阳离子聚合物(聚合盐)和/或一种阴离子和阳离子聚合物的沉淀物形成，从而导致絮凝物粘在加工设备上。一种替代的方法是向含有高浓度阴离子聚电解质的细菌培养基中加入低分子量阳离子聚合物絮凝剂，如果要想达到足够的絮凝化，由于形成了阴离子和阳离子聚合物络合物和/或沉淀物，则该方法需要较高的聚合物剂量。此外已经发现使用低分子量阳离子聚合物絮凝剂所产生的絮凝物明显弱于用高分子量聚合物所产生的絮凝物。在剪切作用下细胞从使用低分子量阳离子聚合物絮凝剂所产生的絮凝物中释放出来，并由此导致分离效率的下降。
希望能够提供一种有效的体系以将细胞材料从悬浮培养基如发酵肉汤中分离出来。还希望能够在絮凝化之后使用多种分离方法，并且希望能够提供足以经受各种分离方法的絮凝物块，且如果需要能够提供后续的使用方法。
根据本发明，申请人提供了一种将细胞材料从含有细胞材料的悬浮培养基中絮凝化的方法，该方法包括向悬浮培养基中加入一种第一聚合材料，该材料是阳离子的并且特性粘度不超过2dl/g，之后或同时向悬浮培养基中加入一种第二阳离子聚合材料，该材料是阳离子的或基本上是非离子的，并且特性粘度至少是4dl/g，然后将细胞材料絮凝化。
我们发现使用给定的第一和第二聚合材料以将细胞材料絮凝化会导致产生适用于高剪切作用下分离的絮凝物块，而不需要过多的聚合物剂量。特别是我们发现通过用特性粘度不超过2dl/g的阳离子聚合物来预处理含有大量阴离子聚电解质的微生物肉汤，然后再使用特性粘度至少是4dl/g的聚合物絮凝剂，会产生不含粘结浓缩聚合物的絮凝物块。总的聚合物剂量高于单独使用特性粘度至少是4dl/g的聚合物的已知方法，但低于单独使用特性粘度不超过2dl/g的聚合物的已知方法。
令人惊讶的是，我们还发现当两种聚合物基本上同时加入或以共混物加入时，本发明的两种聚合物体系的总聚合物剂量可以减少高达30％。同样令人惊讶的是发现特性粘度至少是4dl/g的聚合物和特性粘度不超过2dl/g的聚合物同时加入或者以共混物加入不会产生粘性的絮凝物。
因此本发明提供了可灵活使用的多种类型分离方法，且不会破坏絮凝物。
在本发明中细胞材料从悬浮培养基中絮凝化出来。至于细胞材料，我们是指细胞、细胞碎片孢子和/或生物微粒，特别是细胞和/或细胞碎片。絮凝化不只包括细胞产物如酶或聚合物。
本发明可以用来将各种微生物细胞材料絮凝化。因此本发明对于将悬浮培养基中的任何微生物细胞材料絮凝化而言是有价值的。它们包括悬浮介质中的细菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
悬浮培养基中细胞材料的浓度通常至少是0.5g(干重)/l，通常至少2或3g/l，并且可以最高达100或150g/l。
悬浮培养基通常是一种生长培养基，因此细胞材料可从发酵肉汤中絮凝化。这是一种复杂的培养基，它含有标准的生长培养基成分如淀粉(例如马铃薯淀粉)、玉米粉、玉米面、玉米浸出液、大豆粉、玉米麸、酵母提取物、糖浆蒸馏物、鱼粉、蛋白胨以及其它市售的溶解产物。悬浮培养基的pH值并非很严格，而通常可以是3-10，优选4-9，例如6-8。
生长培养基倾向于含有大量阴离子材料如阴离子聚电解质，它或者是作为生长培养基的部分成分或者作为生长细胞的产物。本发明特别适用于这种介质，因为已经证实细胞材料从其中絮凝化出来特别困难。
在本发明的方法中，第一和第二聚合材料加入到含有细胞材料的悬浮培养基中。这两种聚合材料可以相继地加入到悬浮培养基中，即先加入第一阳离子聚合材料，然后加入第二阳离子聚合材料。当采用相继加入时，优选在第二阳离子聚合材料加入之前将第一阳离子聚合材料混入悬浮培养基中。
优选基本上同时将第一和第二阳离子聚合材料加入到悬浮培养基中。它们可以在不超过30秒的时间间隔内同时分别加入。基本上不会将一种聚合材料在加入另一种之前混到悬浮培养基中。
它们优选作为预形成的共混物加入，我们发现同时加入，特别是以预形成的共混物，与相继(即不同时)加入两种聚合材料相比特别有利。事实上与相继加入相比，同时加入可以减少这两种聚合材料的剂量，而且性能仍然保持。
聚合材料可以任意适当的方式加入到悬浮培养基中。适当的加入方式包括粉末，但优选水性溶液。例如，如果第一和第二阳离子聚合材料分别加入，则优选以水溶液形式加入，其浓度至少是0.05％w/v，且通常不超过1.0％w/v。水溶液中的适当浓度约为0.1％w/v，但也可以是很高的浓度，例如高于8.0％w/v，且在某些情况下可以最高至50.0％w/v。
加到悬浮培养基中的活性第一阳离子聚合材料的用量可以是不超过1000ppm，优选不超过500ppm，基于悬浮培养基的总重量(包括细胞材料和添加聚合物)。通常它不超过300或200ppm。用量低至150ppm及以下时可以得到良好的结果，而用量低至120ppm时甚至可以得到最佳的结果。通常用量至少为50ppm，优选至少100ppm。但是如果要絮凝较高的生物量浓度，那么就可能需要非常高的剂量，例如最高至4000ppm。类似地，对于特性粘度至少是4dl/g的聚合物而言，可能需要比以上范例更高的剂量。
加到悬浮培养基中的活性第二聚合材料的用量通常是不超过500ppm，优选不超过250ppm。它通常低于100或80ppm，且在用量为50ppm或以下时甚至可以得到最佳结果。通常用量为至少25ppm。
第一和第二聚合材料的这些用量适用于分别加入(相继或同时)，并且适用于以预形成的共混物形式使用这两种聚合材料。但是同时加入，特别是以预形成的共混物，允许使用比相继加入更少的用量。
在预形成的共混物中，第一和第二聚合材料的比例(活性聚合物，重量)第一∶第二聚合材料优选40∶60到95∶5，该比例更优选为50∶50到90∶10，最优选60∶40到80∶20。已经用第一∶第二聚合材料的比例为65∶35到75∶25，特别是大约70∶30的共混物得到了特别好的结果。
加入到悬浮培养基中的活性聚合物共混物的总量通常低于1000ppm，优选低于500ppm。它可以低于300或250ppm，且在用量为低于200ppm时已经得到良好的结果。用量低至170ppm时甚至可以得到最佳结果。加到悬浮培养基中的活性聚合物总量通常至少是50ppm，优选至少100ppm。
当第一和第二聚合材料以共混物加入时，可采用任意适当的方式，例如粉末或优选水性溶液。聚合物在水溶液中的总浓度通常至少是0.05％w/v，且通常不超过1％w/v。
我们还设计了一种新型方法以预测悬浮培养基和细胞材料的任意具体组合，其中每类聚合物的剂量将给出最佳性能，该方法如下：
1.悬浮培养基取样。通过机械方法，如间歇离心将细胞材料从悬浮培养基样品中分离出来，以提供分离的细胞材料和用过的悬浮培养基。
2.第一聚合材料加入用过的悬浮培养基中，并且混合良好的样品在600nm处测量的吸光度增加。吸光度增加最大时的第一聚合材料用量标作剂量1。
3.分离出来的细胞材料重新悬浮在等体积的盐溶液中，离子强度和pH值与用过的悬浮培养基相同。
4.然后将第二聚合材料逐步加入到重新悬浮后的细胞材料中，并且如下文中所述观察到混浊度(以样品在600nm处测量的吸光度测定)降低。混浊度降低最大时的第二聚合材料剂量标作剂量2。
5.然后将第一和第二聚合材料按剂量1∶剂量2的比例使用以使细胞材料从全部悬浮培养基中絮凝化。
以上方法给出了一个第一和第二聚合材料的最佳比例近似值。但实际上共混物形式中聚合物的绝对剂量较低。此外最佳混合比例可以根据测试方法作程度较小的改变，其中低分子量部分可以更多一些。
第一聚合材料的特性粘度不超过2dl/g，在本说明书中，特性粘度(IV)用气承液柱粘度计在25℃下，缓冲到pH为7的1N氯化钠溶液中测量。优选IV不超过1.5dl/g，优选其至少为0.5dl/g，它最高可至1dl/g或以下。
聚合材料是阳离子的，它优选是一种合成聚合材料，并且通常由烯键式不饱和单体或单体混合物聚合而成。
优选第一阳离子聚合材料具有相对较高的电荷密度，特别是其理论阳离子电荷密度至少是4meq/g，通常至少5meq/g。理论阳离子电荷密度通常不超过约25meq/g。在本说明书中，理论阳离子电荷密度是由用来形成聚合物的单体组成计算得到的电荷密度。
优选聚合物由至少60重量％、优选至少70重量％是阳离子的单体形成，阳离子单体含量优选至少90重量％并且可以是100重量％。
适当的阳离子单体包括二烯丙基二烷基卤化铵，例如二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)。它与少量(通常低于30重量％，且优选低于10重量％)(甲基)丙烯酰胺的共聚物也可以使用，尽管均聚物才是优选的。二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酸季盐或酸加成盐的均聚物以及二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酰胺，任选地以季盐或酸加成盐的均聚物，以及这些化合物和少量(通常低于30重量％，且优选低于10重量％)(甲基)丙烯酰胺的共聚物也可以使用。其它合适的第一阳离子聚合材料包括聚乙烯亚胺、聚胺、表氯醇二胺的缩聚产物、双氰胺的聚合物和其它传统的低分子量阳离子凝结聚合物。优选聚二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)。
第二聚合材料的特性粘度至少是6dl/g。优选IV是8-15dl/g或8-20dl/g或更高。
此材料可以是阳离子的或基本上是非离子的。优选它是阳离子的。如果是阳离子的，那么通常第二聚合材料的阳离子电荷密度相对较低。优选理论阳离子电荷密度在4meq/g的量级，通常约3或2meq/g。但它可以低至约0.1meq/g，或甚至约0.5meq/g。
第二聚合材料优选是一种合成聚合物，特别是由烯键式不饱和单体或单体混合物聚合而成。当第二聚合材料是阳离子的时，混合物中阳离子单体的含量通常至少是2或3重量％。它可以最高至50重量％，但通常不超过20重量％。
优选的阳离子单体是酸加成物形式的二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酸盐，或者优选其季盐。也可以使用二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酰胺，优选以酸加成物或季盐形式，但优选该聚合物不是Mannich丙烯酰胺聚合物。每个烷基基团可以含有1-4个碳原子，而氨基烷基基团可含有1-8个碳原子。特别优选的是二烷基氨基乙基(甲基)丙烯酸盐。
这些单体通常与非离子单体如甲基丙烯酰胺或优选丙烯酰胺共聚。第二阳离子聚合材料可以是一种两性聚合物，因其包含较少量的阴离子单体，如丙烯酸或其它烯键式不饱和羧酸单体。
此外第二聚合材料可以是基本上非离子的，并且离子单体含量可以低于3重量％(基于单体混合物的重量)。例如它可以由100％的丙烯酰胺，任选地与发生少量水解而形成的低于3重量％、通常低于1或2重量％的丙烯酸来形成。其它非离子单体包括甲基丙烯酰胺。
第二聚合材料，特别是当其为阳离子的时，可以是完全可溶于水的材料或者它也可以是已交联聚合物的形式。该聚合物可以用少量交联剂来制备，例如在欧洲专利EP-A-202780中所述。此类型聚合物优选含有一个20-80％的离子部分(如EP-A-202780中所述)。该聚合物优选是一种线型聚合物。
在本方法中第一和第二聚合材料被加入到悬浮培养基中，然后将细胞材料絮凝。优选絮凝化在搅拌下进行，通常这是一种连续混合。
当加入两种聚合材料后，通常随后将悬浮液沉降约5-30分钟，一般10-20分钟。通过观察由细胞材料絮凝物形成的固体界面并观察在直径12mm的标准12ml试管中此界面移动1cm所用的时间来测量沉降速率。在优选的方法中此沉降速率至少是3，优选至少8cm/min，并且在特别优选的方法中它至少是10cm/min。
絮凝化的效力根据混浊度的减少百分数来测定(％RT)。此％RT是悬浮培养基在絮凝化之后的吸光度(600nm)与絮凝化之前的吸光度相比的减少值，由此
％RT＝((A1-A2)×100)/A1
其中A1＝悬浮培养基在絮凝化之前于600nm处的吸光度，A2＝悬浮培养基在加入第一和第二聚合材料并沉降15分钟之后于600nm处的吸光度。
在本方法中％RT可以非常高，例如至少90％或95％，并且甚至可以是至少98％或者基本上是100％。
在本发明中我们计算了活性聚合物的最小有效剂量(MED)。MED是产生90％RT的聚合物最低活性剂量(第一和第二聚合材料的总量，单独地或作为共混物)。在本发明中MED可以低至200ppm或以下，甚至低至170ppm或以下。
本发明的一个优点是所形成絮凝物的结块。在本发明中我们根据絮凝物强度指数(FSI)测量了絮凝物的强度，FSI值代表絮凝物在高剪切作用下的强度。经过15分钟沉降后形成的絮凝物经受高剪切作用，在此定义为在标准12ml试管中的5ml悬浮液上施加30秒涡流混合的剪切作用，此混合是在miximatic(Jencons)混合机的最高设定值下进行的。然后将经过剪切作用后的絮凝物沉降15分钟，测量沉降后悬浮液的％RT，由此
絮凝物强度指数＝100-(％RTA-％RTB)
其中％RTA＝絮凝化后的％RT
且％RTB＝剪切作用后的％RT
％RT通常是相对于未絮凝化的悬浮培养基的混浊度来计算。
优选FSI为至少90％，优选至少95％，并且甚至可以高达至少98％。
评价絮凝物强度的另一种方法是测量剪切测试后的沉降速率。剪切作用后的沉降速率优选至少2，优选至少3cm/min，并且通常至少5cm/min。
然后将絮凝化后的细胞材料从澄清的悬浮培养基中分离出来。适当的分离方法包括离心(间歇式)、半连续或连续过滤，例如真空过滤、以及任何其它已知的分离方法。
本发明的一个优点是提高了絮凝物强度，从而使得可以使用多种不同的分离方法，包括那些使絮凝物经受机械搅拌和/或剪切作用以及对于较弱的絮凝物会导致絮凝物破裂的方法。
分离出来之后，絮凝化的细胞材料可以用于许多工艺中，例如作为催化剂。上清液中的内含物也可以用在许多工艺中。如果需要，上清液中存在的酶可以从上清液中絮凝化出来。
接下来本发明将会通过下列实施例加以说明。
实施例
在这些实施例中，絮凝化效力以如上所述测量的％RT来表示，最小有效剂量如上所述测量，沉降速率和絮凝物强度指数也如上所述进行测量。使用下列聚合物：
聚合物1，聚二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)，IV约为1dl/g。
聚合物2，67重量％丙烯酰胺和33重量％阳离子单体(用氯代甲烷季铵化的二甲基氨基乙基甲基丙烯酸盐)的共聚物，IV约为11dl/g。
在实验中按如下方法进行絮凝化，除非另有说明。使用生物量浓度为2.7g(干重)/l的枯草芽孢杆菌(B subtilis)悬浮液，等份的培养基(4ml)置于12ml的试管中，然后在用涡流混合机高强度搅拌期间将每种絮凝剂聚合物或共混物加入，搅拌约5秒以确保充分混合。
每种聚合物或共混物以0.1％(w/v)的水溶液形式加入到培养基中，除非另有说明。
实施例1
在此实施例中，测试聚合物1和聚合物2的各种共混物以找到这两种聚合物在上述枯草芽孢杆菌(B subtilis)悬浮液中的最佳比例。
聚合物1∶聚合物2的比例为40∶60、50∶50、60∶40、65∶35和70∶30的共混物如上所述进行测试。按70∶30混合会得到最好的沉淀物，它们完全是颗粒。按65∶35混合也会得到足够的沉淀物，其中一些是颗粒一些是纤维物质。对于在悬浮液中的这些聚合物而言，40∶60、50∶50和60∶40的共混物不是最佳的，会得到相当多的“纤维”沉淀物。
实施例2
进一步测试在实施例1中被发现是最佳的70∶30共混物。单独是聚合物1的MED值、单独是聚合物2的MED值、以及聚合物1和聚合物2的70∶30共混物的MED值均已测出。
观察沉淀物的性质，以及加入共混物后的沉降速率。
絮凝化之后的％RT也如上所述进行计算。如上所述，絮凝物经受高剪切作用以得到絮凝物强度指数。高剪切作用后再次测定沉降速率。结果列于表1：
表1
| 聚合物 | MED/ppm | 沉淀物说明 | 沉降速率(cm3/min) | 高剪切作用后的沉降速率(cm3/min) | 絮凝物强度(FSI) |
| 2 | 130 | 纤维 | 17.6 | 5.3 | 99 |
| 1 | 229 | 颗粒 | 1.8 | 0.3 | 86 |
| 共混物 | 166 | 颗粒 | 10.6 | 5.3 | 99 |
从这些结果可以看出尽管单独使用聚合物1会得到颗粒沉淀，但沉降速率降低，且絮凝物强度也降低，如低FSI值和高剪切作用后的低沉降速率所证实的那样。单独使用聚合物2会得到良好的沉降速率和絮凝物强度，但会得到纤维状沉淀物。而使用共混物则会得到颗粒沉淀物和良好的沉降速率以及絮凝物强度，同时也注意到其MED要比聚合物1的MED低，而比聚合物2的MED略高。
实施例3
在本实验中进行测试以得到每种第一和第二阳离子材料的最佳用量。
在营养肉汤培养基中生长到浓度为4g/l的枯草芽孢杆菌(Bsubtilis)样品在3000g下离心15分钟。然后回收上清液，并将离心下来的细胞重新悬浮在等体积的盐水溶液中(0.85％[w/w]氯化钠)。
聚合物1的最佳用量通过将聚合物1的溶液连续地加入到上清液中直至600nm处的吸光度达到最大而得到，所需剂量为140ppm。
聚合物2的最佳剂量通过将不同剂量加入到枯草芽孢杆菌(Bsubtilis)悬浮液在盐溶液的悬浮液中直至观察到100％的RT而得到，其所需剂量为50ppm。
然后如上所述，用140ppm聚合物1和50ppm聚合物2的共混物来使枯草芽孢杆菌(B subtilis)絮凝化，沉降15分钟后的％RT为100％。
下列实施例中，在250cm3的烧杯中用Lightnin A200叶轮搅拌器(直径4.7cm)搅拌将100cm3液体进行絮凝化，然后在100cm3测量圆筒中测量沉降速率，时间间隔为絮凝化后的枯草芽孢杆菌(Bsubtilis)浆线移动50mm。
聚合物3是一种市售的阳离子聚合物[活性组成：40％丙烯酰胺和60％阳离子单体(氯代甲烷季铵化的二甲基氨基乙基甲基丙烯酸盐)]，其特性粘度约为12dl/g。
聚合物4是一种市售的阳离子聚合物[活性组成：20％丙烯酰胺和80％如聚合物3中的单体]，其特性粘度为4dl/g，优选经过剪切作用之后(如欧洲专利0202780B中所述)。
聚合物1以及3或4单独地或以共混物形式加入到培养基中，分别以1％和0.2％(w/v)的水溶液，除非另有说明。
实施例4
在本实施例中，首先将一个剂量的聚合物1加入4.76g/l的枯草芽孢杆菌(B subtilis)悬浮液中，B subtilis在2升带挡板摇瓶中的13g/l营养肉汤(Oxoid)里于30℃下生长16小时。所用的聚合物1第一剂量为210ppm，在单独处理用过的培养基时发现该剂量会导致最大量的沉淀。在第二个实验中所使用的聚合物1剂量为290ppm，该剂量明显过量于在第一个实验中的剂量。聚合物处理过的这两种悬浮液然后被分为等份，向每个等份的悬浮液中(210ppm和290ppm处理)加入不同剂量的聚合物3或聚合物4，直至观察到聚合物3或4的MED(95％RT)。结果列于表2：
表2：聚合物的相继加入
| 聚合物1剂量(ppm) | 210 | 290 |
| 聚合物1剂量(mg/g/干细胞) | 44 | 60.9 |
| 聚合物3MED(ppm) | 175 | 148 |
| 聚合物3MED(mg/g/干细胞) | 36.8 | 31.1 |
| 聚合物4MED(ppm) | 250 | 200 |
| 聚合物4MED(mg/g/干细胞) | 52.5 | 42.0 |
结果表明聚合物1的较高剂量会导致所需聚合物3或4的最小有效剂量减少。
实施例5
用聚合物1和聚合物3以65∶35比例的共混物以及聚合物1和聚合物4以60∶40比例的共混物将在用过的营养肉汤中(Oxoid)浓度为4.76g(干细胞)/l的枯草芽孢杆菌(B subtilis)进行絮凝化。
这两种共混物中每种的最小有效剂量列于表3中。
表3
| 聚合物共混物 | MED(ppm) | MED(mg/g[干细胞]) |
| 聚合物1∶聚合物365∶35 | 290 | 60.9 |
| 聚合物1∶聚合物460∶40 | 414 | 87.0 |
比较用来使相同的枯草芽孢杆菌(B subtilis)悬浮液絮凝化的聚合物总剂量(采用相继加入聚合物，例如实施例4的表2中聚合物1和聚合物3相继加入的剂量之和)，令人惊讶的是共混物形式表现出聚合物总剂量大大减少。
实施例6
表4表示出絮凝物的沉降性能以及由下列方法产生的絮凝物的剪切稳定性：只加入聚合物1、加入聚合物1后接着加入聚合物3或4、以及将聚合物1和聚合物3或4混合加入。
在实施例4和5中，要被絮凝化的悬浮液是用过的营养肉汤中的枯草芽孢杆菌(B subtilis)，其浓度为4.76g/l(干细胞)。为了测试由每种方法产生的絮凝物的剪切稳定性，絮凝后的悬浮液(100cm3)在250cm3烧杯中用Triton混合器剪切混合90秒(搅拌速度：300rpm，叶片直径：6.2cm，叶片宽度：0.5cm)。
表4：沉降速率
| MED(ppm) | MED(mg/g) | ％RT | 沉降速率(cm/min) | 剪切作用后的沉降速率(cm/min) | 剪切作用后的％RT | |
| 聚合物1 | 700 | 147 | 96.5 | 2.1 | 0.8 | 86.4 |
| 聚合物1+聚合物3 | 210+221＝431 | 44.1+46.4＝90.5 | 95.7 | 29.5 | 22.7 | 98.2 |
| 聚合物1+聚合物4 | 210+280＝490 | 44.1+58.8＝102.9 | 96.8 | 49.1 | 12.3 | 98.1 |
| 聚合物1/聚合物3＝65/35 | 320 | 67.2 | 95.7 | 14.4 | 8.4 | 93.3 |
| 聚合物1/聚合物4＝65/35 | 430 | 90.3 | 96.7 | 18.5 | 3.9 | 92.8 |
单独使用聚合物1会提供一种颗粒细小的低沉降速率絮凝物悬浮液，并且由此产生的絮凝物剪切稳定性较差，这由剪切作用后％RT的减小所证实。采用相继加入聚合物1和聚合物3或4产生大量快速沉降的絮凝物，在高剪切作用下其尺寸会减小(由沉降速率测量)，但不会侵蚀(由高FSI证实)。聚合物共混物提供了高沉降速率的絮凝物，在聚合物总剂量大大减少时它仍是剪切稳定的。
Claims (16)
1.一种从含有细胞材料的悬浮培养基中絮凝化微生物细胞材料的方法，它包括向悬浮培养基中加入一种第一聚合材料，该材料是阳离子的并且特性粘度不超过2dl/g，然后相继或同时向悬浮培养基中加入一种第二聚合材料，该材料是阳离子的或基本上是非离子的并且特性粘度至少是4dl/g，然后将细胞材料絮凝化。
2.按照权利要求1的方法，其中第一聚合材料的理论阳离子电荷密度至少是5meq/g。
3.按照权利要求1或2的方法，其中第二聚合材料是阳离子的。
4.按照任何上述权利要求的方法，其中第二聚合材料的理论阳离子电荷密度不超过4meq/g。
5.按照任何上述权利要求的方法，其中第二聚合材料是二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酸盐单体作为季盐或酸加成盐与一种非离子烯键式不饱和单体的共聚物，并且优选是丙烯酰胺和用氯代甲烷季铵化的二甲基氨基乙基丙烯酸盐的共聚物。
6.按照任何上述权利要求的方法，其中第一和第二聚合材料同时被加入到悬浮培养基中。
7.按照任何上述权利要求的方法，其中第一和第二聚合材料作为预形成的共混物被加入到悬浮培养基中。
8.按照任何上述权利要求的方法，其中第二聚合材料的活性剂量不超过500ppm，优选不超过250ppm，基于悬浮培养基的重量。
9.按照任何上述权利要求的方法，其中第一聚合材料的活性剂量不超过1000ppm，优选不超过500ppm，基于悬浮培养基的重量。
10.按照任何上述权利要求的方法，其中第一和第二聚合材料作为预形成的共混物被加入到悬浮培养基中，且共混物的活性剂量不超过500ppm，优选不超过250ppm，基于悬浮培养基的重量。
11.按照任何上述权利要求的方法，其中第一和第二聚合材料加入到悬浮培养基中的比例为，第一∶第二聚合材料为60∶40到80∶20，优选第一∶第二聚合材料为65∶35到75∶25。
12.按照权利要求10的方法，其中第一聚合材料是聚二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)，第二聚合材料是丙烯酰胺和用氯代甲烷季铵化的二甲基氨基乙基丙烯酸盐的共聚物。
13.按照任何上述权利要求的方法，其中絮凝化后的细胞材料从悬浮培养基中分离出来并且用作一种催化剂。
14.一种用来评估两种凝结剂材料剂量的测试方法，该材料加入到含有悬浮细胞材料的培养基中，该方法包括：
I)取一个悬浮培养基的样品，然后用机械方法从样品中分离出细胞材料，以提供分离出的细胞材料和用过的悬浮培养基，
II)向用过的悬浮培养基中加入一种第一聚合材料，并使得吸光度增加，
III)重复此方法以得到更多的悬浮培养基样品和第一聚合材料的不同用量，然后将第一聚合材料在吸光度增加最大处的用量标作剂量1，
IV)将分离出的细胞材料重新悬浮在等体积的盐水溶液中，离子强度和pH值与用过的悬浮培养基相同，
V)向重新悬浮的细胞材料中加入一种第二聚合材料，并使得产生混浊度的减小，
VI)重复步骤IV)以得到第二聚合材料的不同用量，然后将混浊度减小最大处的用量标作剂量2。
15.按照权利要求14的方法，其中第一聚合材料如权利要求1中所定义，第二聚合材料如权利要求1中所定义，且所述剂量随后用于权利要求1的方法中。
16.按照权利要求15的方法，其中该相继加入法具有权利要求2-13中指出的任何特点。
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