ES2344246T3

ES2344246T3 - Floculacion de material celular.

Info

Publication number: ES2344246T3
Application number: ES00958355T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Hughes; Steven Weir; Paul Moran
Original assignee: Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd
Current assignee: Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd
Priority date: 1999-08-14
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2010-08-23
Anticipated expiration: 2020-08-02
Also published as: US6967085B1; WO2001012778A3; CZ2002536A3; HUP0202434A2; RU2266954C2; JP2003507032A; CA2380652A1; ATE466071T1; BR0013259A; GB9919187D0; EP1210406A2; NO20020729D0; NO20020729L; AU768242B2; CN1369004A; MXPA02001531A; WO2001012778A2; DK1210406T3; EP1210406B1; CN1288237C

Abstract

Procedimiento de floculación de material celular a partir de un medio de suspensión que contiene material celular microbiano, seleccionado del grupo consistente en células, residuos de células y esporas, cuyo medio de suspensión es un medio de crecimiento, de manera que el material celular es floculado en el caldo de fermentación, que comprende añadir al medio de suspensión un primer material polimérico que es catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca no mayor de 2 dl/g, y posterior o simultáneamente añadir al medio de suspensión un segundo material polimérico catiónico que es sustancialmente no iónico y que tiene un contenido en monómero iónico por debajo de 3% en peso (basado en el peso de la mezcla monómera) o catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g y hasta 20 dl/g, y permitir la floculación del material celular.

Description

Floculación de material celular.

Esta invención se refiere a procedimientos para flocular material celular en medios de suspensión. Con frecuencia es deseable separar material celular (tal como células y/o restos de células) de un medio de suspensión líquido que contiene el material celular. Una forma de realizar esto consiste en flocular el material celular de manera que los flóculos formados puedan ser separados del medio de suspensión líquido. Después de su separación, el propio material celular puede ser utilizado adicionalmente. Como alternativa, el material celular puede ser desechado y se puede emplear el contenido del medio de suspensión.

Sin embargo, ha resultado ser difícil encontrar sistemas de floculación que proporcionen un rendimiento de floculación adecuado en los medios de suspensión de los cuales ha de ser separado frecuentemente el material celular. En particular, suele ser necesario separar material celular de medios complejos tal como un medio de crecimiento. Se ha comprobado que la floculación empleando floculantes convencionales, tales como polímeros, es problemática en estos entornos.

Sitkey et al en Biotechnology Techniques, Vol. 6, no. 1, 49-52 (1992) describen la separación de células, sólidos y coloides de un caldo de fermentación. La finalidad de la separación consiste en recuperar enzimas extracelulares presentes en el medio de suspensión. Se describen sesenta materiales poliméricos para utilizarse como agentes de floculación. Los tipos de floculante utilizados son débilmente catiónicos, medianamente catiónicos, fuertemente catiónicos, débilmente aniónicos, medianamente aniónicos y no iónicos. Sin embargo, de acuerdo con los autores sólo dos polímeros proporcionan una clarificación eficaz. Estos fueron los polímeros medianamente aniónicos Sedipur T1 y Sedipur TF5, suministrados por BASF. Se describe la adición de varios polímeros catiónicos y no iónicos. Cada uno de ellos se añade como una sola dosis como el único floculante y es eficaz a la hora de proporcionar la clarificación del caldo de fermentación.

Mukhopadhyay et al en Biotechnology Techniques, vol. 4, no. 2, 121-126 (1990) también intentan separar sólidos suspendidos de un caldo de fermentación con el fin de recuperar enzimas extracelulares disueltas en el medio de suspensión. Los autores utilizan diferentes sistemas con el fin de mejorar la coagulación o floculación. Los agentes floculantes empleados fueron ácido acético glacial, cloruro de calcio, sulfato de aluminio y poliacrilamida catiónica. También se emplearon sistemas de tales agentes en donde se añadieron dos o más de los agentes al medio de suspensión. En particular, los autores describen sistemas en donde se emplean sulfato de aluminio y poliacrilamida catiónica como los dos agentes floculantes. Las cantidades de la poliacrilamida catiónica empleadas en los sistemas ejemplificados fueron de 0,1, 0,3 y 0,5 g/l (100, 300 y 500 ppm). La cantidad empleada de sulfato de aluminio fue siempre de 5,0 g/l (5.000 ppm). Aunque se obtuvo la clarificación del caldo de fermentación empleando este sistema, los autores establecen que, bajo alto esfuerzo cortante, los flóculos formados se desintegraron en partículas más pequeñas. Esto impide la sedimentación. De este modo, este sistema puede clarificar el caldo de fermentación pero no produce flóculos robustos. Por este motivo, los procedimientos que pueden ser empleados posteriormente para separar los flóculos del sobrenadante son limitados. En particular, los autores advierten incluso contra una centrifugación moderada.

La publicación EP-A-448.926 describe un sistema para la floculación de enzimas. El material celular, tal como células y restos celulares, se separa de un medio de suspensión tal como caldo de fermentación por medios mecánicos, tal como centrifugado, y la enzima que permanece en el sobrenadante es floculada empleando un agente floculante particular. El agente floculante es una mezcla de un polímero de acrilamida Mannich y un polímero de haluro de dialildimetilamonio. En el sistema descrito, es necesario separar primero el material celular del caldo de fermentación por medios mecánicos, de manera que no contamine más tarde a los productos precipitados por vía química.

Weir et al en Biotechnology Techniques, vol. 7, no. 3 (Marzo 1993) pp 199-204, describen la floculación de células en un caldo de fermentación empleando quitosano, un polielectrolito catiónico que, según se indica, es neutro por encima de pH 7,9. Los mismos autores también describen, en Biotechnology Techniques, vol. 8, no. 2 (Febrero 1994) pp 129-132, el uso de varios polímeros aniónicos como un tratamiento previo antes de utilizar quitosano como floculante.

Se sabe que la floculación de células microbianas en un medio de cultivo líquido mediante polielectrolitos catiónicos ayuda a separar las células del medio. Cuando el medio contiene altas concentraciones de polielectrolitos aniónicos como constituyentes del medio y/o producidos por las células, la adición de floculantes catiónicos de alto peso molecular produce flóculos. Estos flóculos estarán contaminado con una mezcla de floculante concentrado y complejo de polielectrolito formado a partir de un polímero aniónico y catiónico (polisal) y/o un precipitado de un polímero aniónico y catiónico que causa la adherencia de los flóculos a la instalación de procesado. Un procedimiento alternativo de adición de floculantes de polímeros catiónicos de bajo peso molecular a los cultivos bacterianos que contienen altas concentraciones de polielectrolitos aniónicos, requiere dosis de polímero elevadas en el caso de que se quiera conseguir una floculación adecuada, debido a la formación de complejo de polímero aniónico y catiónico y/o precipitados. Además, se ha comprobado que los flóculos producidos empleando floculantes de polímeros catiónicos de bajo peso molecular son considerablemente más débiles que los flóculos producidos con polímeros de alto peso molecular. Bajo esfuerzo cortante, las células son liberadas de los flóculos producidos usando floculantes de polímeros catiónicos de bajo peso molecular y ello se traduce en una reducción de la eficiencia de separación.

Sería deseable poder proporcionar un sistema eficiente para la separación de material celular de un medio de suspensión tal como caldo de fermentación. También sería deseable poder utilizar una variedad de métodos de separación después de la floculación y poder proporcionar flóculos suficientemente robustos para soportar los métodos de separación y, si es necesario, su posterior uso.

De acuerdo con la invención se proporciona un procedimiento de floculación de material celular a partir de un medio de suspensión que contiene material celular microbiano, seleccionado del grupo consistente en células, residuos de células y esporas, cuyo medio de suspensión es un medio de crecimiento, de manera que el material celular es floculado en el caldo de fermentación, que comprende añadir al medio de suspensión un primer material polimérico que es catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca no mayor de 2 dl/g, y posterior o simultáneamente añadir al medio de suspensión un segundo material polimérico catiónico que es sustancialmente no iónico y que tiene un contenido en monómero iónico por debajo de 3% en peso (basado en el peso de la mezcla monómera) o catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g y hasta 20 dl/g, y permitir la floculación del material
celular.

Se ha comprobado que el uso del primero y segundo materiales poliméricos antes definidos con el fin de flocular el material celular da lugar a la producción de flóculos robustos adecuados para su separación bajo alto esfuerzo cortante sin la necesidad de utilizar dosis excesivas de polímeros. En particular, se ha comprobado que tratando previamente un caldo microbiano que contiene altos niveles de polielectrolito aniónico con polímero catiónico con una viscosidad inherente no mayor de 2 dl/g y posteriormente con floculante polimérico que tiene una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g, da lugar a flóculos robustos que no contienen polímero concentrado adherente. La dosis total de polímero es mayor que en el método conocido que utiliza polímero con una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g únicamente pero menor que en el método conocido que utiliza polímero con una viscosidad intrínseca no mayor de 2 dl/g por sí solo.

De manera sorprendente, también se ha comprobado que la dosis total de polímeros del sistema de dos polímeros de la invención se puede reducir hasta en un 30% cuando los dos polímeros se añaden de un modo sustancialmente simultáneo o como una mezcla. Igualmente sorprendente fue el hallazgo de que la adición de polímero con una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g de forma simultánea o como una mezcla con polímero que tiene una viscosidad intrínseca no mayor de 2 dl/g, no produce flóculos adherentes.

De este modo, la invención aporta una flexibilidad en cuanto al uso de varios tipos de procedimientos de separación sin destruir los flóculos.

En la invención, el material celular es floculado en un medio de suspensión. Por material celular se entiende células, restos celulares y/o esporas, en particular células y/o restos de células. La entidad solicitante no incluye la floculación únicamente de productos celulares tal como enzima o polímero.

La invención se puede emplear para flocular material celular a partir de diversos microorganismos.

De este modo, la invención es de valor para flocular cualquier material celular microbiano en un medio de suspensión. Dicho material incluye bacterias tal como Bacillus subtilis, en medios de suspensión.

La concentración de material celular en el medio de suspensión es normalmente de al menos 0,5 g (peso seco)/l, con frecuencia de al menos 2 o 3 g/l y puede ser de hasta 100 o 150 g/l.

El medio de suspensión suele ser un medio de crecimiento, de manera que el material celular es floculado en el caldo de fermentación. Se trata este de un medio complejo que contiene constituyentes de medios de crecimiento convencionales tales como almidón (por ejemplo almidón de patata), harina de maíz, licor de maceración de maíz, harina de soja, gluten de maíz, extracto de levadura, destilados de melazas, harina de pescado, peptona y otros lisados comercialmente disponibles. El pH del medio de suspensión no es crítico pero normalmente es de 3 a 10, con frecuencia de 4 a 9, por ejemplo de 6 a 8. El medio de crecimiento tiende a contener altos niveles de material aniónico tales como polielectrolitos aniónicos, bien como parte de los constituyentes del medio de crecimiento o bien como productos de las células en crecimiento. La invención es de un uso particular en tales medios, puesto que se ha comprobado que la floculación de material celular en dichos medios resulta especialmente difícil.

En el procedimiento de la invención, el primero y segundo materiales poliméricos se añaden al medio de suspensión que contiene el material celular. Los dos materiales poliméricos se pueden añadir al medio de suspensión de forma secuencial, es decir, se añade el primer material polimérico catiónico seguido por el segundo material polimérico catiónico. Cuando se emplea la adición en secuencia, el primer material polimérico catiónico se mezcla preferentemente en el medio de suspensión, antes de añadir el segundo material polimérico catiónico.

Es preferible que se añadan el primero y segundo materiales poliméricos catiónicos al medio de suspensión de forma simultánea sustancialmente. Se pueden añadir por separado al mismo tiempo, con un intervalo entre sí no mayor de 30 segundos. Prácticamente no se utiliza operación de mezcla de uno de los materiales poliméricos en el medio de suspensión, antes de añadirse el otro. Con preferencia, se añaden como una mezcla pre-formada. Se ha comprobado que la adición simultánea, en especial como una mezcla pre-formada, es particularmente ventajosa en comparación con la adición de los dos materiales poliméricos de forma secuencial (es decir, no simultáneamente). De hecho, se pueden reducir las dosis de ambos materiales poliméricos con la adición simultánea en comparación con la adición en secuencia y mantenerse el rendimiento al mismo tiempo.

Los materiales poliméricos se pueden añadir al medio de suspensión en cualquier forma adecuada. Formas de adición adecuadas incluyen polvo, pero se prefiere la solución acuosa. Por ejemplo, si el primero y segundo materiales poliméricos catiónicos se añaden por separado, cada uno de ellos se añade preferentemente como una solución en agua de una concentración de al menos 0,05% p/v, y con frecuencia no es mayor de 1,0% p/v. Una concentración adecuada en la solución acuosa es de alrededor de 0,1% p/v, pero puede encontrarse en concentraciones mucho mayores, por ejemplo, por encima de 8,0% p/v y, en algunos casos, de hasta 50,0% p/v.

La cantidad añadida de primer material polimérico catiónico activo al medio de suspensión puede ser no mayor de 1.000 ppm, con preferencia no mayor de 500 ppm, basado en el peso total del medio de suspensión (incluyendo el material celular y el polímero añadido). Con frecuencia no es mayor de 300 o 200 ppm. Se pueden obtener buenos resultados con cantidades tan bajas como 150 ppm e inferiores y se pueden obtener incluso resultados óptimos con cantidades tan bajas como de 120 ppm. En general, la cantidad es de al menos 50 ppm, con frecuencia al menos 100 ppm. Sin embargo, cuando han de flocularse concentraciones altas de biomasa, se pueden requerir dosis mucho mayores, por ejemplo de hasta 4.000 ppm. Similarmente, para los polímeros que tienen una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g, se pueden requerir dosis más altas que las ejemplificadas anteriormente.

La cantidad del segundo material polimérico activo añadido al medio de suspensión generalmente no es mayor de 500 ppm, con preferencia no mayor de 250 ppm. Suele estar por debajo de 100 o 80 ppm y se pueden obtener incluso resultados óptimos con cantidades de 50 ppm o menores. En general, la cantidad es de al menos 25 ppm.

Estas cantidades del primero y segundo materiales poliméricos son adecuadas para su adición por separado (secuencial o simultáneamente) y para el uso de los dos materiales poliméricos como una mezcla pre-formada. Sin embargo, la adición simultánea, especialmente como una mezcla pre-formada permite el uso de cantidades más bajas que en el caso de la adición secuencial.

En una mezcla pre-formada, la relación del primero al segundo material polimérico (polímero activo, en peso) es con preferencia de 40:60 a 95:5 (primero: segundo material polimérico). Más preferentemente, la relación es de 50:50 a 90:10, con suma preferencia de 60:40 a 80:20. Se han obtenido resultados particularmente buenos con mezclas en donde la relación del primero al segundo material polimérico es de 65:35 a 75:25, en especial de alrededor de
70:30.

La cantidad total de mezcla polimérica activa añadida al medio de suspensión se encuentra generalmente por debajo de 1.000 ppm, con frecuencia por debajo de 500 ppm. Puede estar por debajo de 300 o 250 ppm y se han obtenido buenos resultados con cantidades por debajo de 200 ppm. Incluso se pueden obtener resultados óptimos con cantidades tan pequeñas como de 170 ppm. La cantidad total de polímero activo añadido al medio de suspensión es en general de al menos 50 ppm, con preferencia de al menos 100 ppm.

Cuando el primero y segundo materiales poliméricos se añaden como una mezcla, esta puede encontrarse en cualquier forma adecuada, por ejemplo, polvo o, preferentemente, como una solución acuosa. La concentración total de polímero en la solución acuosa es en general de al menos 0,05% p/v y normalmente no es mayor de 1% p/v.

El primer material polimérico tiene una viscosidad intrínseca no mayor de 2 dl/g. En esta descripción, la viscosidad intrínseca (IV) se mide mediante un viscómetro de nivel suspendido a 25º C en solución de cloruro sódico 1 N tamponada a pH 7. Con preferencia, la IV no es mayor de 1,5 dl/g. Preferentemente, es de al menos 0,5 dl/g. Puede ser de hasta 1 dl/g o menor. El material polimérico es catiónico. Con preferencia es un material polimérico sintético y generalmente se produce por polimerización de monómero o mezcla de monómeros etilénicamente instaurados.

Preferentemente, el primer material polimérico catiónico tiene una densidad de carga relativamente alta. En particular, tiene una densidad de carga catiónica teórica de al menos 4 meq/g, normalmente de al menos 5 meq/g. Normalmente, la densidad de carta catiónica teórica no es mayor de 25 meq/g aproximadamente. En esta descripción, la densidad de carga catiónica teórica es la densidad de carga obtenida mediante cálculo a partir de la composición monomérica que se intenta utilizar para formar el polímero.

Preferentemente, el polímero se forma a partir de monómeros de los cuales al menos el 60% en peso, preferentemente al menos el 70% en peso, son catiónicos. El contenido en monómero catiónico es con preferencia de al menos 90% en peso y puede ser de 100% en peso.

Los monómeros catiónicos adecuados incluyen haluros de dialildialquilamonio, por ejemplo cloruro de dialildimetilamonio (DADMAC). Se pueden emplear copolímeros de este con una cantidad menor (normalmente por debajo de 30% en peso y preferentemente por debajo de 10% en peso) de (met)acrilamida, aunque se prefieren los homopolímeros. También se pueden emplear homopolímeros de sal cuaternaria o sal de adición de ácido de (met)acrilato de dialquilaminoalquilo y homopolímeros de dialquilaminoalquil(met)acrilamida, opcionalmente como una sal cuaternaria o de adición de ácido, y también se pueden emplear copolímeros de estos con pequeñas cantidades (generalmente por debajo de 30% en peso y preferentemente por debajo de 10% en peso) de (met)acrilamida. Otros primeros materiales poliméricos catiónicos adecuados incluyen polietileniminas, poliaminas, productos de condensación de epiclorhidrina-diamina, polímeros de diciandiamina y otros polímeros coagulantes catiónicos de bajo peso molecular convencionales. Se prefiere poliDADMAC.

El segundo material polimérico tiene una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g y de hasta 20 dl/g. Con preferencia, la IV es de 8 a 15 dl/g o de 8 a 20 dl/g.

Este material puede ser catiónico o sustancialmente no iónico. Con preferencia es catiónico.

En el caso de que sea catiónico, el segundo material polimérico es en general de una densidad de carga catiónica relativamente baja. Con preferencia, la densidad de carga catiónica teórica es del orden de 4 meq/g, con frecuencia de 3 o 2 meq/g aproximadamente, pero puede ser tan baja como de 0,1 meq/g aproximadamente o incluso de 0,5 meq/g aproximadamente.

El segundo material polimérico es preferentemente un polímero sintético, en particular un polímero formado por polimerización de monómeros o mezclas de monómeros etilénicamente insaturados.

Cuando el segundo material polimérico es catiónico, la cantidad de monómero catiónico en la mezcla es normalmente de al menos 2 o 3% en peso. Puede ser de hasta 50% en peso, pero en general no es mayor de 20% en peso.

Los monómeros catiónicos preferidos son (met)acrilatos de dialquilaminoalquilo como sales de adición de ácido o, preferentemente, como sales cuaternarias. Se pueden emplear dialquilaminoalquil(met)acrilamidas, con preferencia como sales de adición de ácido o sales cuaternarias, pero preferentemente el polímero no es un polímero de acrilamida de Mannich. Los grupos alquilo pueden contener cada uno de ellos de 1 a 4 átomos de carbono y el grupo aminoalquilo puede contener de 1 a 8 átomos de carbono. Particularmente preferidos son los (met)acrilatos de dialquilamino-
etilo.

Estos monómeros se copolimerizan normalmente con monómero no iónico tal como metacrilamida o, preferentemente, acrilamida. El segundo material polimérico catiónico puede ser un polímero anfótero, debido a la inclusión de una cantidad menor de monómero aniónico, tal como ácido acrílico u otro monómero carboxílico etilénicamente insaturado.

Alternativamente, el segundo material polimérico puede ser sustancialmente no iónico y tiene un contenido en monómero iónico por debajo de 3% en peso (basado en el peso de mezcla monómera). Por ejemplo, puede estar formado a partir de 100% de acrilamida, opcionalmente con una pequeña cantidad de hidrólisis para formar por debajo de 3% en peso, normalmente por debajo de 1 o 2% en peso, de ácido acrílico. Otros monómeros no iónicos incluyen metacrilamida.

El segundo material polimérico, especialmente cuando es catiónico, puede ser un material totalmente soluble en agua o puede encontrarse en forma de polímeros que están reticulados. El polímero puede prepararse con una pequeña cantidad de agente reticulante, por ejemplo como se describe en EP-A-202.780. Los polímeros preferidos de este tipo tienen una recuperación iónica de 20 a 80% (como se describe en EP-A-202.780). Preferentemente, el polímero es un polímero lineal.

En el procedimiento, el primero y segundo materiales poliméricos se añaden al medio de suspensión y se deja que flocule el material celular. Preferentemente, la floculación tiene lugar bajo agitación. Con frecuencia esta operación se trata de una mezcla continua.

Cuando ambos materiales poliméricos se han añadido, la suspensión se deja generalmente sedimentar durante 5 a 30 minutos aproximadamente, normalmente de 10 a 20 minutos. Las velocidades de sedimentación se miden observando la interfase sólida formada por los flóculos de material celular y observando el tiempo que toma la interfase para desplazarse 1 cm en un tubo de ensayo convencional de 12 ml y de 12 mm de diámetro. En los procedimientos preferidos, la velocidad de sedimentación es de al menos 3, con preferencia al menos 8 cm/min y en un procedimiento particularmente preferido es de al menos 10 cm/min. La efectividad de la floculación se mide en términos de la reducción en porcentaje de la turbidez (%RT). El %RT es la reducción de absorbancia (a 600 nm) y del medio de suspensión después de la floculación, en comparación con la absorbancia antes de la floculación. De este
modo,

%RT = ((A_{1}-A_{2}) x 100)/A_{1}

en donde A_{1} = absorbancia a 600 nm del medio de suspensión antes de la floculación y A_{2} = absorbancia a 600 nm del medio de suspensión después de la adición del primero y segundo materiales poliméricos y sedimentación durante 15 minutos.

En el procedimiento, el %RT puede ser muy alto, por ejemplo de al menos 90 o 95% e incluso puede ser de al menos 98% o sustancialmente de 100%.

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En la presente invención, se calcula la dosis efectiva mínima (MED) de polímero activo. La MED es la dosis activa más baja de polímero (total de primero y segundo materiales poliméricos, por separado o como una mezcla) que genera un 90% de RT. En la invención, la MED puede ser tan baja como de 200 ppm o inferior, incluso tan baja como de 170 ppm o inferior.

Una ventaja de la invención reside en la robustez de los flóculos que se forman. En la invención, se mide la resistencia de los flóculos en términos de un índice de resistencia de los flóculos (FSI). Este valor representa la resistencia de los flóculos bajo alto esfuerzo cortante. Los flóculos formados después de 15 minutos de sedimentación se someten a un alto esfuerzo cortante. Este se define aquí como el esfuerzo cortante ejercido sobre 5 ml de suspensión en un tubo de ensayo estándar de 12 ml durante 30 segundos de mezcla vorticial producida en el grado más alto en un mezclador maximático (Jencons). Los flóculos que se han sometido a esfuerzo cortante se dejan entonces sedimentar durante 15 minutos y se mide el %RT de la suspensión sedimentada. De este modo,

índice de resistencia de los flóculos = 100 - (%RT_{A}-%RT_{B})

en donde %RT_{A}=%RT después de la floculación y %RT_{B}=%RT después del esfuerzo cortante. El %RT se calcula siempre con respecto a la turbidez del medio de suspensión sin flocular.

Preferentemente, el FSI es de al menos 90%, con preferencia al menos 95% y puede ser incluso tan alto como de al menos 98%.

Otra forma de evaluar la resistencia de los flóculos consiste en medir la velocidad de sedimentación después del ensayo de esfuerzo cortante. Con preferencia, la velocidad de sedimentación después del esfuerzo cortante es de al menos 2, preferentemente al menos 3 cm/min y con frecuencia es de al menos 5 cm/min.

El material celular floculado se separa entonces del medio de suspensión clarificado. Métodos de separación adecuados incluyen centrifugado (discontinuo), filtración semi-continua o continua, por ejemplo filtración en vacío, y cualquier otro método de separación conocido.

Una ventaja de la invención reside en la resistencia mejorada de los flóculos lo cual permite el uso de diversos métodos de separación diferentes, incluyendo aquellos que someten los flóculos a agitación mecánica y/o esfuerzo cortante y que conduciría, como cabría esperar, a la rotura de los flóculos en el caso de los flóculos más débiles.

Después de la separación, los materiales celulares floculados pueden ser utilizados en diversos procedimientos, por ejemplo como catalizadores. El contenido del sobrenadante también se puede emplear en varios procedimientos. Si se desea, la enzima presente en el sobrenadante puede ser floculada en el sobrenadante.

La invención será ahora ilustrada por los siguientes ejemplos.

Ejemplos

En estos ejemplos, la efectividad de la floculación se expresa como %RT medida como se ha descrito anteriormente. La dosis efectiva mínima se mide como se ha descrito anteriormente. La velocidad de sedimentación y el índice de resistencia de los flóculos también se miden como anteriormente se ha descrito. Los polímeros empleados fueron como sigue:

Polímero 1:: poliDADMAC, IV aproximadamente 1 dl/g.

Polímero 2:: copolímero de 67% en peso de acrilamida y 33% en peso de monómero catiónico (metacrilato de dimetilaminoetilo cuaternizado con cloruro de metilo), IV aproximadamente 11 dl/g.

En los experimentos, la floculación se llevó a cabo como sigue salvo que se indique lo contrario. Se utilizó una suspensión de Bacillus subtilis con una concentración de biomasa de 2,7 g (peso seco)/l. Se colocaron partes alícuotas del medio (4 ml) en tubos de ensayo de 12 ml y cada polímero o mezcla floculante se añadió con agitación de alta intensidad a un mezclador vorticial durante 5 seg aproximadamente para asegurar una mezcla completa.

Cada polímero o mezcla se añadió al medio como una solución al 0,1% (p/v) en agua, salvo que se indique otra cosa.

Ejemplo 1

En este ejemplo, se ensayaron varias mezclas de polímero 1 y polímero 2 para encontrar la relación óptima para estos dos polímeros en la suspensión de Bacillus subtilis.

Se ensayaron como anteriormente se ha descrito mezclas que tienen relaciones de polímero 1: polímero 2 de 40:60, 50:50, 60:40, 65:35 y 70:30. La mezcla 70:30 proporcionó el mejor precipitado, el cual se encontraba completamente en forma de partículas. La mezcla 65:35 también proporcionó un precipitado adecuado con algún material en partículas y con cierta naturaleza filamentosa. Para estos polímeros en esta suspensión, las mezclas 40:60, 50:50 y 60:40 no fueron óptimas, proporcionando precipitados bastante "filamentosos".

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Ejemplo 2

La mezcla 70:30, que se comprobó que era óptima en el ejemplo 1, se ensayó adicionalmente. Se comprobaron los valores MED para el polímero 1 por sí solo, para el polímero 2 por sí solo y para la mezcla 70:30 de polímero 1 y polímero 2.

Se observó la naturaleza del precipitado, al igual que la velocidad de sedimentación después de la adición de la mezcla.

Se calculó también el %RT después de la floculación como se ha descrito anteriormente. Los flóculos se sometieron a elevado esfuerzo cortante para obtener el índice de resistencia de los flóculos como se ha descrito anteriormente. Después de la aplicación del alto esfuerzo cortante, se determinó de nuevo la velocidad de sedimentación. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 1.

TABLA 1

1

A partir de estos resultados puede apreciarse que aunque el polímero 1 por sí solo proporcionó un precipitado en partículas, la velocidad de sedimentación fue baja al igual que lo fue la resistencia de los flóculos, como quedó demostrado por un bajo FSI y una baja velocidad de sedimentación después de aplicar alto esfuerzo cortante. El polímero 2 por sí solo proporcionó buena velocidad de sedimentación y buena resistencia de los flóculos pero un precipitado filamentoso. La mezcla proporcionó un precipitado en partículas y buena velocidad de sedimentación y buena resistencia de los flóculos. También se observa que la MED es más baja que la MED para el polímero 1 y no significativamente mayor que la MED para el polímero 2.

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Ejemplo 3

En este experimento se emplearon ensayos para obtener la cantidad óptima de cada uno de los primero y segundo materiales catiónicos.

Una muestra de B. subtilis crecida a una concentración de 4 g/l en medio de caldo nutriente se centrifugó a 3.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante fue entonces recuperado y las células centrifugadas se volvieron a suspender en el mismo volumen de solución de salina (cloruro sódico al 0,85% [p/p]).

Se obtuvo la cantidad óptima de polímero 1 añadiendo la solución del polímero 1 de forma continua al sobrenadante hasta que la absorbancia en 600 nm alcanzó un máximo. La dosis requerida fue de 140 ppm.

Se obtuvo la dosis óptima del polímero 2 añadiendo diferentes dosis a la suspensión de B. subtilis en salina hasta que se observó un 100 %RT. La dosis requerida para esto fue de 500 ppm.

Se utilizó entonces una mezcla de 140 ppm de polímero 1 y 50 ppm de polímero 2 para flocular B. subtilis como se ha descrito anteriormente. El %RT después de 15 minutos de sedimentación fue de 100%.

En los siguientes ejemplos, las floculaciones se llevan a cabo en partes alícuotas de 100 cm^{3} en un vaso de precipitados de 250 cm^{3} agitado con un impulsor Lightnin A200 (diámetro 4,7 cm) y luego se mide la velocidad de sedimentación en un cilindro de medición de 100 cm^{3} calculando el intervalo de tiempo para que la línea de lodo de B. subtilis floculado se desplace 50 mm.

El polímero 3 es un polímero catiónico comercialmente disponible [composición activa: 40% de acrilamida y 60% de monómero catiónico (metacrilato de dimetilaminoetilo cuaternizado con cloruro de metilo)] que tiene una viscosidad intrínseca de alrededor de 12 dl/g.

El polímero 4 es un polímero catiónico comercialmente disponible (composición activa: 20% de acrilamida y 80% de monómero como en el polímero 3) que tiene una viscosidad intrínseca de 4 dl/g, preferentemente después del esfuerzo cortante (como se ha descrito en la Patente europea 0202780B).

Los polímeros 1 y 3 o 4 individualmente o en mezcla se añadieron al medio como una solución al 1% y 0,2% (p/p) respectivamente en agua, salvo que se indique lo contrario.

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Ejemplo 4

En este ejemplo, se añade primero una dosis de polímero 1 a una suspensión de 4,76 g/l de B. subtilis crecida en 13 g/l de caldo nutriente (Oxoid) en matraces sacudidos de 2 litros provistos de deflectores a 30ºC durante 16 horas. La primera dosis de polímero 1 utilizada es de 210 ppm que, según se comprobó, causaba una precipitación máxima tras el tratamiento del medio agotado por sí solo. En un segundo experimento, la dosis utilizada de polímero 1 es de 290 ppm que es significativamente mayor que la dosis en el primer experimento. Las dos suspensiones tratadas con polímero se dividen entonces en partes alícuotas y a cada una de ellas (210 y 290 ppm), se añaden diferentes dosis de polímero 3 o polímero 4 hasta que se observa una MED de polímero 3 o 4 (95%RT). Los resultados se muestran en la tabla 2.

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TABLA 2 Adiciones secuenciales de polímeros

2

Los resultados muestran que una mayor dosis de polímero 1 se traduce en una reducción de la dosis efectiva mínima de polímero 3 o 4 requerida.

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Ejemplo 5

Se llevó a cabo la floculación de B. subtilis a una concentración de 4,76 g (célula seca)/l en caldo nutriente agotado (Oxoid) mediante una mezcla de polímero 1 y polímero 3 en una relación de 65:35 y mediante una mezcla de polímero 1 y polímero 4 en una relación de 60:40.

En la tabla 3 se muestra la dosis efectiva mínima de cada una de las dos mezclas.

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TABLA 3

3

La comparación de la dosis total de polímero empleada para flocular la misma suspensión de B. subtilis empleando los polímeros añadidos secuencialmente (por ejemplo, añadiendo las dosis secuenciales de polímero 1 más polímero 3 de la tabla 2 del ejemplo 4) y como una mezcla, demuestra de manera sorprendente que la dosis total de polímero se reduce en gran medida.

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Ejemplo 6

La tabla 4 muestra las propiedades de sedimentación de los flóculos y la estabilidad bajo esfuerzo cortante de los flóculos producidos por la adición de solo el polímero 1, la adición secuencial del polímero 1 seguido por el polímero 3 o 4 y la adición de la mezcla de polímero 1 y polímero 3 o 4.

Como en los ejemplos 4 y 5, la suspensión a flocular consiste en B. subtilis en una concentración de 4,76 g/l (células secas) en caldo nutriente agotado. Para ensayar la estabilidad bajo esfuerzo cortante de los flóculos producidos por cada método, se sometieron suspensiones floculadas (100 cm^{3}) a esfuerzo cortante a un vaso de precipitados de 250 cm^{3} empleando un mezclador Triton durante 90 segundos (velocidad del agitador 300 rpm, diámetro del impulsor 6,2 cm, ancho del impulsor 0,5 cm).

TABLA 4 Velocidades de sedimentación

4

El uso del polímero 1 por sí solo proporciona una suspensión de flóculos en partículas finas con una velocidad de sedimentación lenta y los flóculos producidos tenían una pobre estabilidad bajo esfuerzo cortante tal como se puso de manifiesto por la reducción en el %RT después del esfuerzo cortante. El uso de polímero 1 y polímero 3 o 4 añadidos secuencialmente produce flóculos grandes que sedimentan rápidamente y que son de menor tamaño (tal como se mide por la velocidad de sedimentación) tras la aplicación de alto esfuerzo cortante, pero que no erosionan (como se manifiesta por un alto FSI). Las mezclas de polímeros proporcionan flóculos con altas velocidades de sedimentación, que son estables bajo esfuerzo cortante, a una dosis de polímeros en total muy reducida.

Claims

1. Procedimiento de floculación de material celular a partir de un medio de suspensión que contiene material celular microbiano, seleccionado del grupo consistente en células, residuos de células y esporas, cuyo medio de suspensión es un medio de crecimiento, de manera que el material celular es floculado en el caldo de fermentación, que comprende añadir al medio de suspensión un primer material polimérico que es catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca no mayor de 2 dl/g, y posterior o simultáneamente añadir al medio de suspensión un segundo material polimérico catiónico que es sustancialmente no iónico y que tiene un contenido en monómero iónico por debajo de 3% en peso (basado en el peso de la mezcla monómera) o catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g y hasta 20 dl/g, y permitir la floculación del material celular.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el primer material polimérico tiene una densidad de carga catiónica teórica de al menos 5 meq/g y no mayor de 25 meq/g, en donde la densidad de carga catiónica teórica es la densidad de carga obtenida mediante cálculo a partir de la composición monomérica que se intenta utilizar para formar el polímero.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en donde el segundo material polimérico es catiónico.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo material polimérico tiene una densidad de carga catiónica teórica no mayor de 4 meq/g.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo material polimérico es un copolímero de un monómero de (met)acrilato de dialquilaminoalquilo como una sal cuaternaria o una sal de adición de ácido con un monómero no iónico etilénicamente insaturado, y preferentemente es un copolímero de acrilamida y acrilato de dimetilaminoetilo cuaternizado con cloruro de metilo.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primero y segundo materiales poliméricos se añaden al medio de suspensión de manera simultánea.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primero y segundo materiales poliméricos se añaden al medio de suspensión como una mezcla pre-formada.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la dosis activa del segundo material polimérico no es mayor de 500 ppm, preferentemente no mayor de 250 ppm, basado en el peso del medio de suspensión.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la dosis activa del primer material polimérico no es mayor de 1.000 ppm, preferentemente no mayor de 500 ppm, basado en el peso del medio de suspensión.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primero y segundo materiales poliméricos se añaden al medio de suspensión como una mezcla pre-formada y la dosis activa de la mezcla no es mayor de 500 ppm, preferentemente no mayor de 250 ppm, basado en el peso del medio de suspensión.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primero y segundo materiales poliméricos se añaden al medio de suspensión en una relación de 60:40 a 80:20 del primero: segundo material polimérico, preferentemente de 65:35 a 75:25 del primero: segundo material polimérico.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde el primer material polimérico es poliDADMAC y el segundo material polimérico es un copolímero de acrilamida y acrilato de dimetilaminoetilo cuaternizado con cloruro de metilo.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el material celular floculado se separa del medio de suspensión y se utiliza como un catalizador.