WO2015146487A1 - 新規カチオン性グラフト重合体を用いた標的物分離濃縮方法 - Google Patents

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一穂 芦澤
健太 野田
晃司 渡邉
洋子 照内
勝 文屋
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    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00051—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating and concentrating a target biomolecule using a graft polymer that can be produced safely and stably by a simple operation with a low introduction cost, and a kit used in the method.
  • An ion exchange polymer is a kind of synthetic resin and has a structure that ionizes as an ionic group in part of its molecular structure. It exhibits an ion exchange action with ions in a solvent such as water, and the behavior is roughly classified into a cation exchange polymer and an anion exchange polymer depending on the nature of the ionic group according to the selectivity for ions.
  • the charge characteristics of biomolecules are determined by various factors such as the charge and charge density of the entire molecule, the way the surface charge is distributed, and the pH of the solution.
  • the charge and charge density of the entire molecule in the case of protein, it contains many kinds of ionic amino acids such as weak acidity and weak basicity, and has both positive and negative charges on the surface of the molecule. This sum of charges is called effective surface charge, and the charged state of amino acids changes depending on pH. Therefore, the effective surface charge of protein molecules also changes positively or negatively depending on the pH of the solution.
  • Ion exchange chromatography is a technique that uses such changes in the charged state (effective surface charge) of biomolecules depending on pH and salt concentration, and reversibly binds to and elutes carriers having opposite charges.
  • Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1 For example, Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1).
  • the object is to provide a method for separating and concentrating a target substance using a novel cationic graft polymer instead of an existing cationic polymer, and a kit for the same.
  • the present invention has the following configurations [1] to [11].
  • [1] A method for separating and concentrating a target using a cationic graft polymer; (1) contacting the cationic graft polymer with a sample containing the target substance under basic conditions to bind the target substance to the cationic graft polymer; (2) separating the conjugate of the cationic graft polymer and the target biomolecule; and (3) eluting the target from the conjugate, wherein the cationic graft polymer is Polymerizing a polyamine derivative obtained by reacting a polymer compound (a) having at least one amino group with a compound (b) having at least one epoxy group, and an ethylenically unsaturated monomer (c) Is a polyamine graft polymer obtained by [2]
  • step (3) includes a step of aggregating the cationic graft polymer not bonded to the target.
  • the target object in the sample can be efficiently separated and concentrated by the method of the present invention, and the target object is not damaged by a known method in the process of separation and concentration, and subsequent analysis is easy. More specifically, the present invention can be applied to an analysis using a mass spectrometer.
  • Precipitation agglomerates of E. coli and a cationic graft polymer conjugate The left tube is E. coli (no), and the right tube is E. coli (yes). Fluorescence microscope observation of conjugate of GFP-expressing E. coli and cationic graft polymer. GFP expressed in E. coli was detected by laser wavelength (488 nm), and cationic graft polymer and E. coli were detected by visible light. Images were continuously acquired using laser wavelength and visible light and superimposed with pseudo color display. The figure on the left shows a state where E. coli is captured by a cationic graft polymer, and the figure on the right shows a state in which the aggregate is dispersed with a dispersion.
  • Observation of the collected vesicles with a fluorescence microscope The vesicles captured by the cationic graft polymer were dispersed in a dispersion and then immunostained. Vesicles are detected at a laser wavelength of 488 nm, and antibodies are detected at a laser wavelength of 594 nm. Images are acquired continuously using two types of laser wavelengths. Superimpose with pseudo color display to check the antigen state on the vesicle surface. Detection of E. coli recovered using surfactant-containing solution (electrophoresis) Detection of E.
  • the Escherichia coli was separated using a graft polymer (PAAEpo-g-DADMAC) of epoxyoctane-modified polyallylamine and diallyldimethylammonium chloride. After the graft polymer was reacted with the cells, latex beads were added. Confirmation of the survival of the separated E. coli The E. coli was separated using a graft polymer of glycidol-modified polydiallylamine and diallyldimethylammonium chloride (DAAGly-g-DADMAC). The graft polymer was mixed with latex beads and then reacted with the cells. Confirmation of the survival of the separated E.
  • PAAEpo-g-DADMAC graft polymer of epoxyoctane-modified polyallylamine and diallyldimethylammonium chloride. After the graft polymer was reacted with the cells, latex beads were added. Confirmation of the survival of the separated E. coli
  • the E. coli was separated using a graft polymer of glycidol-modified polydiallylamine and diallyldimethylammonium chloride (DAAGly-g-DADMAC). After the graft polymer was reacted with the cells, latex beads were added.
  • DAAGly-g-DADMAC diallyldimethylammonium chloride
  • “Cationic graft polymer” means a polyamine derivative obtained by reacting a polymer compound (a) having at least one amino group with a compound (b) having at least one epoxy group, an ethylenic non-polymer. Obtained by polymerizing a saturated monomer (c) [the polymer compound (a) having at least one amino group is an ethyleneimine polymer represented by the following general formula (1): It is represented by the vinylamine polymer represented by (2), the allylamine polymer represented by the general formula (3), the diallylamine polymer represented by the general formula (4), and the general formula (5).
  • n is an integer from 10 to 200,000, m is an integer from 5 to 3,000, and l is from 5
  • the “polymer compound (a) having at least one amino group” only needs to have at least one amino group, and may include a constituent unit having no amino group in the constituent unit. . Therefore, each polymer having the structure represented by the general formulas (1) to (5) also has an amino group in addition to the structural units represented by the general formulas (1) to (5). A constitutional unit that does not have to be included may be included or may not be included. Examples of the structural unit having no amino group include, but are not limited to, sulfur dioxide, acrylamide, allyl alcohol, and acrylic acid.
  • the “amino group” in the “polymer compound (a) having at least one amino group” may be any of a primary amino group, a secondary amino group, and a tertiary amino group. Particularly preferred is a secondary amino group.
  • the number of “amino groups” in “polymer compound (a) having at least one amino group” is not particularly limited, but is 5 to 15,000 per polymer from the viewpoint of reactivity, ease of use, and the like. It is preferable that the number is 8 to 3000. In terms of the number per molecular weight of the polymer compound, the molecular weight is preferably from 5 to 230, particularly preferably from 10 to 130, per 10,000 molecular weight.
  • the molecular weight of the “polymer compound (a) having at least one amino group” is not particularly limited, but from the viewpoint of reactivity, viscosity, handling, yield, etc., the number average molecular weight is 500 to 10,000,000. It is preferably 500 to 1,000,000.
  • the number of repeating units of the polymer compound (a) having at least one amino group used in the first invention of the present application is not particularly limited, but from the viewpoint of reactivity, viscosity, handling, yield, etc. The number is preferably 10 to 150,000, and more preferably 10 to 3000.
  • the “polymer compound (a) having at least one amino group” may be “an allylamine monomer (a ′) having at least one allyl group and at least one amino group”. Any compound can be used as long as it is a polymerizable compound having at least one allyl group and at least one amino group in the structure, but the structure represented by the general formula (a1) It is preferable that it is an allylamine type compound which has this.
  • at least one of R 9 and R 10 is a hydrogen atom, the other is hydrogen or a hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms, and a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. Preferably there is.
  • R 9 and R 10 are an allyl group, that is, a diallylamine monomer having two allyl groups.
  • a ′ is preferably a diallylamine monomer having two allyl groups
  • the allylamine monomer (a More preferably, 30 mol% or more of ') is a diallylamine monomer, and more preferably 50 mol% or more is a diallylamine monomer.
  • the allylamine compound having the structure represented by the general formula (a1) is preferably allylamine, methylallylamine, ethylallylamine, diallylamine, or benzylallylamine.
  • an organic acid salt or an inorganic acid salt of an allylamine compound having a structure represented by the general formula (a1) is also an allylamine compound having at least one allyl group and at least one amino group in the first invention of the present application. It can be preferably used as the monomer (a ′).
  • halogen ions more preferably, Cl ⁇ , Br ⁇ , or I ⁇
  • the cationic graft polymer is defined as above,
  • the polyamine graft polymer in which the compound (b) having at least one epoxy group is a compound represented by the general formula (6) (wherein R in the general formula (6) is substituted or unsubstituted 1) Valent hydrocarbon group).
  • the cationic graft polymer is defined as above,
  • the compound (b) having at least one epoxy group is a compound represented by the general formula (7), and (1) wherein R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are hydrogen atoms
  • An epoxy compound that is a hydrocarbon group (provided that R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are not all hydrogen atoms)
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are Each independently a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted monovalent hydrocarbon group (wherein R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are not all hydrogen atoms)
  • an epoxy compound (4) medium R 1, R 2, R 3 , and R 4 are each independently a
  • R 1, R 2, R 3, and all of R 4 There is not a hydrogen atom
  • Propylene oxide (see the formula below for the structure), Butylene oxide, 2,3-butylene oxide, 1,2-epoxyhexane, and 1,2-epoxyhexadecane,
  • Glycidyl methyl ether (see the formula below for the structure), Ethyl glycidyl ether, glycidyl isopropyl ether, and triglycidyl isocyanurate
  • 1,2-epoxycyclopentane (see the formula below for the structure), 1,2-epoxycyclohexane and 1,2-epoxy-4-vinylcyclohexane 3,4-epoxytetrahydrofuran
  • 1,2 3,4-diepoxybutane (see the formula below for the structure), 1,4-butanediol diglycidyl ether and ethylene glycol diglycidyl ether
  • Epoxy succinic acid (see the formula below for the structure)
  • the cationic graft polymer is defined as above,
  • the ethylenically unsaturated monomer (c) is a vinyl monomer, a styrene monomer, a methacrylic ester monomer, an acrylate monomer, an acrylamide monomer, an allyl monomer It may be a polyamine graft polymer selected from the group consisting of a monomer, a diallyl monomer, and an unsaturated carboxylic acid.
  • an ethylenically unsaturated monomer (c) there is no restriction
  • the number of carbon atoms in the ethylenically unsaturated monomer (c) is not particularly limited, but is preferably 2 to 50, and particularly preferably 2 to 30.
  • More specific examples of the monomer preferably used in the present invention among the ethylenically unsaturated monomers (c) include styrene, divinylbenzene, sodium p-styrenesulfonate, vinylbenzyltrimethylammonium chloride.
  • dimethylacrylamide, diallyldimethylammonium chloride, styrene, acrylonitrile, and the like are particularly preferable from the viewpoints of reactivity between the hydroxyl group on the trunk polymer and the adjacent carbon, and usefulness of the side chain terminal group after grafting. . Since the chemical structure, CAS number, etc. of these monomers are obvious to those skilled in the art, description thereof is omitted.
  • the ethylenically unsaturated monomer (c) can be used alone or in combination of two or more depending on the purpose of the present invention.
  • two or more types of ethylenically unsaturated monomers (c) are used in combination, all of them may correspond to the above preferred examples, or only some of them may correspond to the above preferred examples. You may do.
  • the amount of amino groups per unit weight contained in the cationic graft polymer is preferably 0.1 to 17 mmol / g, and particularly preferably 1 to 10 mmol / g.
  • the average particle size is preferably 250 nm or less, more preferably 100 nm to 200 nm when the cationic graft polymer is not fixed to the solid surface.
  • a graft polymer having a structure estimated below of propylene oxide-modified polyallylamine and styrene (wherein q is an integer of 0 to 3,000 in the following general formula) , R is an integer from 0 to 3000, s is an integer from 0 to 3000, t is an integer from 0 to 10,000, u is an integer from 0 to 10,000, w Is an integer from 0 to 10,000).
  • the average particle size was 120 nm.
  • the reaction solution was pH 12. Next, 65% by mass diallyldimethylammonium chloride (3 equivalents with respect to the amine) and 14.42 g of 28.5% by mass APS aqueous solution (10% by mol with respect to the monomer) were added in portions and polymerized for 24 hours. Thereafter, 14.42 g (10 mol% with respect to the monomer) of 28.5 mass% APS aqueous solution was divided and further added to obtain a graft polymer of styrene oxide-modified polyallylamine and diallyldimethylammonium chloride as an aqueous solution.
  • the reaction solution was pH 12. Next, 65% by mass diallyldimethylammonium chloride (3 equivalents with respect to the amine) and 14.42 g of 28.5% by mass APS aqueous solution (10% by mol with respect to the monomer) were added in portions and polymerized for 24 hours. Thereafter, 14.42 g of an APS aqueous solution of 28.5% by mass (10 mol% based on the monomer) was further divided and added to obtain a graft polymer of glycidyl butyrate-modified polyallylamine and diallyldimethylammonium chloride as an aqueous solution. .
  • the obtained graft polymer had the following structure (wherein q is an integer from 0 to 3,000, and r is from 0 to 3,000). S is an integer from 0 to 3000, t is an integer from 0 to 10,000, u is an integer from 0 to 10,000, and w is an integer from 0 to 10,000 Is).
  • sample is a mixture that is considered to contain an “object” to be detected.
  • Sample means a living body including a human (eg, blood, saliva, body fluid, body tissue, etc.), environment (eg, soil, seawater, environmental water (hot spring water, bathtub water, cooling tower water, etc.)), or an artificial or natural product.
  • processed foods such as bread, fermented foods such as yogurt, cultivated plants such as rice and wheat, microorganisms, and viruses. If necessary, these may be after purifying and separating. For example, this is blood plasma or blood serum obtained from blood. Further, a metal ion salt may be added.
  • the “sample” may contain a surfactant, and the surfactant may be added before the “object” is detected.
  • Surfactants include Triton (registered trademark) surfactants (such as poly (oxyethylene) octylphenyl ether), Tween (registered trademark) surfactants (such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters), and Brij (registered trademark).
  • An “object” is an object to be detected according to the present invention. Although it is not limited, it is preferable that it can have a negative charge. Examples include cells, fungi, bacteria, viruses and their degradation products, as well as peptides and nucleic acids.
  • the cells are not limited to those existing in the living body, but may be cultured cells. In addition to normal cells, cancer cells (for example, circulating cancer cells (CTC) in the blood) may be used.
  • CTC circulating cancer cells
  • Fungi is a general term for organisms generally called mushrooms, molds, and yeasts, such as ringworm, Candida, and Aspergillus. Bacteria are prokaryotes with cell membranes.
  • a virus is a minute structure that can replicate itself using cells of other organisms, and consists of a protein shell and a nucleic acid contained in the protein shell. These include norovirus, rotavirus, influenza virus, adenovirus, coronavirus, measles virus, rubella virus, hepatitis virus, herpes virus, and HIV.
  • Degradants of cells, fungi, bacteria, and viruses are factors that comprise them, and include phospholipids such as organelles (nucleus, Golgi apparatus, mitochondria, etc.), cells, fungi, and bacterial membrane fractions. It may be a complex of factors constituting cells (including inverted vesicles), cells, fungi, bacteria, and viruses. Moreover, although it does not exist in a normal cell etc., it may be a minute membrane vesicle (for example, Endothelial Microparticle: EMP) or bexyl produced by apoptosis.
  • organelles nucleus, Golgi apparatus, mitochondria, etc.
  • cells fungi, and bacterial membrane fractions. It may be a complex of factors constituting cells (including inverted vesicles), cells, fungi, bacteria, and viruses.
  • a minute membrane vesicle for example, Endothelial Microparticle: EMP
  • bexyl produced by apoptosis.
  • Peptide refers to a family of molecules formed by linking various amino acids, including complete proteins functioning in vivo, and may include various so-called post-translational modifications (eg glycosylation: glycosylation) .
  • Nucleic acids may be deoxyribonucleotides (DNA), ribonucleotides (RNA) and mixtures and conjugates thereof.
  • the bases are naturally occurring nucleotides such as guanine (G), adenine (A), thymine (T), cytosine (C), uracil (U), but other natural and artificial modified bases are used. May be included.
  • the “modified base” means a base in which the five nucleotides are chemically modified.
  • methyl cytidine, pseudouridine, 4-thiouridine, dihydrouridine, cuocin, hypoxanthine (inosine (I)) and the like are examples thereof.
  • cDNAs prepared by reverse transcription using RNA as a template are also included.
  • Base condition refers to pH 8 or higher, preferably 9 or higher, more preferably 10 or higher, and even more preferably pH 11 or higher. It is preferable to use a basic solution to achieve basic conditions.
  • the basic solution include a weak base, a strong base such as an aqueous NaOH solution, or a buffer having a buffer capacity at pH 8 or higher (for example, glycine buffer, CHES, CAPS).
  • “Contacting” the sample containing the cationic graft polymer and the target substance includes not only an embodiment in which the cationic graft polymer solution is added to the sample but also an embodiment in which the cationic graft polymer is added to the sample.
  • “Bonded” refers to a state in which the cationic graft polymer and the object interact with each other through coordination bonds and / or ionic bonds.
  • “Separating” the conjugate refers to unwinding the above “binding” between the cationic graft polymer and the object under acidic conditions or in the presence of a chelating agent.
  • the acidic condition refers to pH 7 or less, preferably pH 6 or less, more preferably pH 5 or less. It is preferable to use an acidic solution and make the acidic condition.
  • the acidic solution include glycine buffer, formic acid solution, and acetic acid solution.
  • Examples of chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and glycol etherdiaminetetraacetic acid (EGTA).
  • the pH is not particularly limited as long as the protons of the chelating agent are separated from each other, but the pH is preferably 6.0 to pH 8.0.
  • Elution of the target substance refers to solubilization of the target substance in an appropriate solution after the above “separation” reaction.
  • the target is a living cell, it refers to recovery without breaking the cell membrane.
  • Divalent or trivalent metal ions are Mg 2+ , Ba 2+ , Ca 2+ , Sr 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Co 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ , Al 3+ , Cr 3+ , Cu 2+ , Cd 2+ , Sn 2+ and the like correspond to this.
  • “Fixed to a solid phase surface” refers to uneven distribution of “cationic graft polymer”. Although not limited to this, specifically, it means that the “cationic graft polymer” is fixed or coated on the surface of glass, nylon membrane, semiconductor wafer, microbead, latex bead, magnetic bead or colloidal particle.
  • a fixing method a known technique may be used to directly fix the “cationic graft polymer” on the surface of glass or the like, or may be indirectly fixed through a linker molecule.
  • a cationic graft polymer fixed on the solid surface may be synthesized by polymerizing monomers on the solid surface.
  • the column or the like may be packed with a “cationic graft polymer”.
  • Washing the conjugate refers to an operation for removing impurities that are non-specifically bound to the cationic graft polymer while maintaining the binding between the “cationic graft polymer” and the “target”.
  • the same solution as that used for the binding reaction may be used, or another solution may be used. It may be physiological saline or alcohol.
  • “Aggregating the cationic graft polymer not bound to the target” means that the cationic graft polymer is separated by hydrophobic interaction, or is ionic by a counter polyanion or anionic surfactant. Examples thereof include a method of aggregating and separating the cationic graft polymer by interaction. More specifically, it contains an aggregating liquid (aprotic polar solvent (eg acetonitrile) or an anionic surfactant (eg octane sulfonate Na or decane sulfonate Na) or polyanion (carboxymethylated polyallylamine: CMPAA). ) To agglomerate the cationic graft polymer by the hydrophobic interaction of acetonitrile and the ionic interaction with polyanions and ionic surfactants.
  • aprotic polar solvent eg acetonitrile
  • anionic surfactant eg octane sulfonate Na or
  • cationic graft polymer “reaction liquid”, “cleaning liquid”, “dispersion liquid” and “aggregation liquid” are only liquid (emulsion in the case of “cationic graft polymer”). Alternatively, the liquid may be dried.
  • Example 1 Separation of E. coli and confirmation of recovery rate Method The recovery rate of E. coli recovered using the cationic graft polymer was determined using a blood cell analyzer (Sysmex). Samples and reagents are as follows. 1) Sample E. coli was prepared using a GFP expression kit manufactured by Bio-Rad. A sample prepared by adding the necessary amount of E. coli to normal human serum (1 to 2 ⁇ 10 4 cells / ⁇ L) was used as a sample.
  • Reagent I Reaction solution: 1M glycine-NaOH pH 11.0, 3M magnesium chloride II: Dispersion solution: 500 mM glycine-HCl pH 5.0 3) While cooling and stirring polyallylamine (weight average molecular weight 3000) of 20% by mass of the cationic graft polymer with ice water, propylene oxide (0.1 equivalent with respect to the amine) was added dropwise. After reacting at 20 ° C. for 24 hours, the solution was concentrated to obtain propylene oxide-modified polyallylamine as an aqueous solution.
  • polyallylamine weight average molecular weight 3000
  • the separation of E. coli and confirmation of the recovery rate were performed as follows. 500 ⁇ L of the sample, 50 ⁇ L of 20% cationic graft polymer, and 100 ⁇ L of the reaction solution were mixed and reacted for 1 minute. Then, it centrifuged for 30 seconds with the desktop small centrifuge, and the precipitation agglomerate was obtained. The supernatant was collected, and the resulting precipitated aggregate was completely dispersed with 500 ⁇ L of the dispersion to obtain a dispersion. The supernatant and the dispersion solution were determined for the recovery rate of E. coli using a blood cell analyzer. Moreover, E. coli before reacting with the cationic graft polymer was used as a control.
  • Results Table 1 shows the measurement results of the blood cell analyzer.
  • Example 2 Survival confirmation of isolated E. coli 1.
  • Methods E. coli in blood was separated using a cationic graft polymer, and the survival of the separated E. coli was confirmed by culture.
  • Samples and reagents are as follows. 1) Sample In the same manner as in Example 1, a necessary amount of Escherichia coli prepared using a GFP expression kit manufactured by Bio-Rad was added to normal human serum and used as a sample. 2) Reagent I: Reaction solution: 1M glycine-NaOH pH 11.0, 3M magnesium chloride II: Dispersion solution: 500 mM glycine-HCl pH 5.0 3) Cationic graft polymer Prepared in the same manner as in Example 1.
  • E. coli was isolated and confirmed for survival as follows. 500 ⁇ L of the sample, 50 ⁇ L of 20% cationic graft polymer, and 100 ⁇ L of the reaction solution were mixed and reacted for 1 minute. Then, it centrifuged for 30 seconds with the desktop small centrifuge, and the precipitation agglomerate was obtained. The supernatant was removed, and the resulting precipitated aggregate was completely dispersed with 500 ⁇ L of the dispersion to obtain a dispersion (FIG. 2). The supernatant and 1/5000 of the dispersion solution were cultured at 37 ° C. for 18 hours using an LB bacterial culture agar medium, and survival was confirmed (FIG. 3).
  • Example 3 Measurement with mass spectrometer Methods Bacterial identification of E. coli recovered using a cationic graft polymer was performed using a MALDI TOF (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight) mass spectrometer MALDI BioType® (Bruker Daltonics). Samples and reagents are as follows. 1) Sample E. coli was prepared using a GFP expression kit manufactured by Bio-Rad. A sample prepared by adding a necessary amount of the prepared Escherichia coli to physiological saline was used.
  • MALDI TOF Microx Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight
  • the separation of E. coli and the measurement by a mass spectrometer were performed as follows. 500 ⁇ L of the sample, 50 ⁇ L of 20% cationic graft polymer, and 100 ⁇ L of the reaction solution were mixed and reacted for 1 minute. Thereafter, the mixture was centrifuged for 30 seconds with a desktop small centrifuge to obtain a precipitate aggregate (FIG. 1). The supernatant was removed, and the resulting precipitated aggregate was completely dispersed with 50 ⁇ L of the dispersion / extraction solution to extract proteins in the cells. Thereafter, 200 ⁇ L of the coagulated liquid was added, and the mixture was centrifuged for 30 seconds with a desktop small centrifuge to precipitate the cationic graft polymer. The supernatant was collected and used as a sample for mass spectrometer measurement.
  • Results Table 3 shows the measurement results of the mass spectrometer.
  • Examples 4 and 5 1. Separation of nucleic acid in serum and confirmation of recovery rate Method Nucleic acid added to serum was separated using a cationic graft polymer, and the obtained nucleic acid was subjected to agarose electrophoresis, stained using SYBR Safe (invitrogen), and detected by LAS4000 (GE). The recovery rate was determined from the fluorescence intensity of the spot. Samples and reagents are as follows. 1) Sample nucleic acids were plasmids and genomes. The plasmid was extracted from E. coli (Example 4) and the genome was extracted from Hela cells (Example 5).
  • the extracted plasmid solution was cultured using an LB bacterial culture agar medium, and colonies were not formed, and it was confirmed that there was no contamination with E. coli. Further, it was confirmed that the extracted genome solution was not contaminated with a fluorescence microscope. A necessary amount of the extracted DNA was added to normal human serum to prepare a sample. As a control, normal human serum to which no DNA was added was used. 2) Reagent I: Reaction solution: 1M glycine-NaOH pH 11.0, 3M magnesium chloride II: Dispersion solution: 500 mM EDTA-2Na pH 8.0 3) Cationic graft polymer Prepared in the same manner as in Example 1. 4) Electrophoresis 1.0% agarose gel was used. For sample preparation for electrophoresis, 6 ⁇ Loading Dye (TOYOBO) was used.
  • TOYOBO Loading Dye
  • Nucleic acid separation and detection methods were performed as follows. 500 ⁇ L of the sample, 50 ⁇ L of 20% cationic graft polymer, and 100 ⁇ L of the reaction solution were mixed and reacted for 1 minute. Then, it centrifuged for 30 seconds with the desktop small centrifuge, and the precipitation agglomerate was obtained. To the supernatant and the dispersion solution, 500 ⁇ L of a nucleic acid extraction reagent phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) of nacalai tesque was added to separate into a phenol phase and an aqueous phase.
  • Example 6> Separation of cells in serum, recovery rate, confirmation of three-dimensional structure / surface structure Methods Cationic graft polymer was used to separate cells added in serum. The cell recovery rate was confirmed using a blood cell analyzer (Sysmex). Furthermore, the antigen-antibody reaction on the cell surface was confirmed using a fluorescence microscope (Life technologies). Samples and reagents are as follows. 1) Hela cells were used as sample cells, and the required amount (1-2 ⁇ 10 6 cells / mL) added to normal human serum was used as a sample.
  • Reagent I Reaction solution: 1M glycine-NaOH pH 11.0, 3M magnesium chloride II: Dispersion solution: 500 mM EDTA-2Na pH 8.0 3) Cationic graft polymer Prepared in the same manner as in Example 1.
  • Hematology analyzer cells are measured as WBC. The measurement was performed according to the protocol of the blood cell analyzer as in Example 1.
  • Antibodies Primary antibodies anti-human CD146 (MCAM), a monoclonal antibody (N1238) (MONOSAM) was diluted 50-fold were used.
  • As the secondary antibody Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594 (Life Technology) was diluted 500 times and used. The primary antibody and the secondary antibody were reacted by inversion mixing for 1 hour in a light-shielded state to prepare a fluorescently labeled antibody.
  • the cell separation method and detection method were performed as follows. 500 ⁇ L of the sample, 50 ⁇ L of 20% cationic graft polymerization, and 100 ⁇ L of the reaction solution were mixed and reacted for 1 minute. Then, it centrifuged for 30 seconds with the desktop small centrifuge, and the precipitation agglomerate was obtained. The supernatant was collected, and the resulting precipitated aggregate was completely dispersed with 500 ⁇ L of the dispersion (FIG. 5). The recovery rate of the collected supernatant and the obtained dispersion solution was measured using a blood cell analyzer. As a control, cells not reacted with the cationic graft polymer were used. Next, the dispersion solution was mixed with a fluorescent-labeled antibody and reacted by inversion mixing for 1 hour in a light-shielded state, and the antigen-antibody reaction was confirmed with a fluorescence microscope (FIG. 6).
  • Results Table 5 shows the WBC values measured with the blood cell analyzer.
  • the cell recovery rate was 98%, and a good recovery rate was obtained. Since the blood cell analyzer measures a substance having a nucleus as WBC, it can be said that by using the method of the present invention, cells can be collected in a state of maintaining a three-dimensional structure. In addition, the antigen-antibody reaction between Hela cells and MCAM antibody was confirmed by a fluorescence microscope. From this result, it can be said that it can be recovered while maintaining the cell surface structure.
  • Example 7 Separation of vesicles in serum, recovery, and confirmation of three-dimensional structure and surface structure 1.
  • Methods Vesicles added in serum were separated using cationic graft polymer. The recovery rate of vesicles was confirmed using a blood cell analyzer. Whether the three-dimensional structure and the surface structure of the separated vesicles were maintained was confirmed using a fluorescence microscope (Life technologies). Samples and reagents are as follows. 1) Sample vesicles were prepared by crushing Hela cells with a sonicator.
  • the blood cell analyzer vesicle is measured as WBC.
  • the measurement was performed according to the protocol of the blood cell analyzer as in Example 1.
  • Antibodies Primary antibodies anti-human CD146 (MCAM), a monoclonal antibody (N1238) (MONOSAM) was diluted 50-fold were used.
  • As the secondary antibody Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594 (Life Technology) was diluted 500 times and used. The primary antibody and the secondary antibody were reacted by inversion mixing for 1 hour in a light-shielded state to prepare a fluorescently labeled antibody.
  • the vesicle separation method and detection method were as follows. 500 ⁇ L of the sample, 100 ⁇ L of 10% cationic graft polymer, and 50 ⁇ L of the reaction solution were mixed and reacted for 1 minute. Then, it centrifuged for 30 seconds with the desktop small centrifuge, and the precipitation agglomerate was obtained. The supernatant was collected, and the resulting precipitated aggregate was completely dispersed with 500 ⁇ L of the dispersion to obtain a dispersion (FIG. 7). The recovery rate of the collected supernatant and the obtained dispersion solution was measured using a blood cell analyzer. As a control, a vesicle that had not been reacted with a cationic graft polymer was used. Next, the dispersion solution was mixed with a fluorescently labeled antibody and reacted by inversion mixing for 1 hour in a light-shielded state, and the antigen-antibody reaction was confirmed with a fluorescence microscope (FIG. 8).
  • Results Table 6 shows the vesicle measurement values obtained with the blood cell analyzer.
  • the vesicle recovery rate was 82%, and a good recovery rate was obtained. Further, the vesicles in the dispersion solution were in a state of taking up the fluorescent dye, and it was confirmed with a fluorescence microscope that the fluorescently labeled antibody was surrounded by the vesicles of the vesicles. From this result, it can be said that the vesicle can be recovered while maintaining the three-dimensional structure and the surface structure.
  • a bacteriophage separation method and a detection method were performed as follows.
  • a bacteriophage sample 500 ⁇ L
  • a 10% cationic graft polymer 100 ⁇ L
  • a reaction solution 50 ⁇ L
  • a bacteriophage sample 500 ⁇ L
  • a 10% cationic graft polymer 100 ⁇ L
  • a reaction solution 50 ⁇ L
  • it centrifuged for 30 seconds with the desktop small centrifuge, and the precipitation agglomerate was obtained.
  • the supernatant was collected, and the resulting precipitated aggregate was completely dispersed with 500 ⁇ L of the dispersion to obtain a dispersion.
  • the resulting solution is serially diluted, and the diluted solution is mixed with the host E. coli culture medium, added to soft agar, cultured overnight on an agar plate, and the titer of phage recovered from the number of plaques is calculated. .
  • Example 8 Alive 1 of the bacteria was recovered by surfactant-containing solution.
  • Method The E. coli precipitated on the separating agent of the blood collection tube is recovered in a living state using a solution containing a nonionic surfactant.
  • Samples and reagents are as follows. 1) Sample E. coli was prepared using a GFP expression kit manufactured by Bio-Rad. A sample prepared by adding 2 ⁇ 10 8 cells / mL of Escherichia coli prepared in physiological saline was used.
  • Reagent I 1% Surfactant solution As the surfactants in Experiments 1 to 6, sucrose laurate (Dojindo), saponin (Sigma-Aldrich), BPSH (NIKKOL), Neugen TDS-70 (Daiichi Kogyo Seiyaku) ), Triton X-705 (Sigma Aldrich), or CHAPS (Dojin Chemical).
  • II Reaction liquid: 1M glycine pH 11.0, 3M magnesium chloride
  • Dispersion liquid 500 mM glycine pH 5.0 3) Cationic graft polymer Prepared in the same manner as in Example 1.
  • the collection of cells and confirmation of survival were performed as follows. 3 mL of a bacterial solution in which Escherichia coli is dispersed in physiological saline is added to a blood collection tube, centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes, and then the supernatant is removed. Next, 0.5 mL of 1% surfactant solution is added to the blood collection tube to disperse the cells that have precipitated on the surface of the separating agent. The bacterial cell dispersion was allowed to stand at 20 ° C. for 30 minutes and for 3 hours, and then 100 ⁇ L of 10% cationic graft polymer and 100 ⁇ L of the reaction liquid were mixed and reacted for 1 minute.
  • Results Table 8 shows the number of colonies in the cultured sample.
  • Bacteria can be recovered alive when the nonionic surfactant used in Experiments 1 to 5, especially sucrose laurate, is used.
  • Example 9 Measurement of Escherichia coli recovered using a surfactant-containing solution using a mass spectrometer
  • the precipitated E. coli on a separating agent methods blood collection tube and recovered using surfactant-containing solution, after the reaction with the cationic polymer, to suppress the influence of the blood components by washing the reaction product with 70% acetonitrile, and mass spectrometry
  • a sample was prepared that could be measured with a vessel.
  • Samples and reagents are as follows. 1) Sample E. coli was prepared using a GFP expression kit manufactured by Bio-Rad. Whole blood and the prepared Escherichia coli were added to a culture bottle for bacterial culture (BD) with 2 ⁇ 10 8 cells / mL as a sample.
  • BD bacterial culture
  • a tube containing the recovered solution was mixed with 100 ⁇ L of 10% cationic graft polymer, reaction solution 1 and reaction solution 2, and reacted for 1 minute. Thereafter, the mixture was centrifuged for 30 seconds with a desktop small centrifuge to obtain an aggregated sediment. The supernatant was removed, and the resulting agglomerated precipitate mass was completely dispersed with 500 ⁇ L of the washing solution, and centrifuged for 30 seconds in a desktop centrifuge to obtain an agglomerated sediment mass. The supernatant was collected in a 1.5 tube and used as sample 1.
  • the aggregated precipitate mass was completely dispersed in 50 ⁇ L of the extract, and then 150 ⁇ L of the aggregated precipitate was added, followed by centrifugation for 30 seconds in a tabletop centrifuge. The supernatant was transferred to a new 1.5 tube and used as sample 2. These were measured for mass spectrum by Auto Flex II. In addition, confirmation by electrophoresis was performed in order to confirm the influence of impurities. Samples used for measurement were Control 1 and Samples 1 and 2 obtained from Experiments 7 to 12, respectively, and centrifuged at 15000 rpm for 30 minutes. The supernatant was collected, and the supernatant was lyophilized to concentrate. I went there overnight. The dried sample was dissolved with 50 ⁇ L of SDS sample Buffer to prepare a sample for electrophoresis. Electrophoresis was performed using ER155e-pagel 15% gel.
  • a mass spectrum obtained by Auto Flex II is shown in FIG.
  • the number of mass peaks was counted from the obtained mass spectrum by the Find Mass List function of the data processing software flexAnalysis. The results are shown in Table 9. Table 10 shows the count conditions. Further, in order to confirm the effect of avoiding the influence of blood components, the ratio of the peak intensity of the blood component-derived mass peak to the cell-derived mass peak was determined. As the mass peak derived from the cells, 6250 and 9740 m / z were selected from the mass peaks detected when the colony was used as a sample. As the mass peak derived from blood components, 15130 m / z, which is the mass peak of hemoglobin, was selected. The results are shown in Table 11.
  • Example 10 Separation and recovery confirmation of virus particles (Further examination of Reference Example 1) 1.
  • Method 1) Using an Escherichia coli phase T7 (Code: 20007) purchased from the sample NBRC (Biotechnology Center, National Institute of Technology and Evaluation), using the NBRC designated protocol and general experimental procedures, such as “Unbeatable Biotechnical Series” -Bacteriophage was prepared according to "Genetic engineering experiment note (top)-2. Bacteriophage section (Yodosha)”. After suspending the dried cells with 200 ⁇ L of condensate (10% polypeptone, 2% Yeast extract, 1% MgSO 4), 0.6% agar medium containing about 10 5 cells of E.
  • condensate 10% polypeptone, 2% Yeast extract, 1% MgSO 4
  • coli (10% polypepton, 5% Yeast extract, 2.5% NaCl, 1% agar). This medium plate was cultured overnight at 37 ° C., and the agar of the portion where no colony was formed was scraped (about several cm 2 ) and transferred to a 1.5 mL tube. 1 mL of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) was added, shaken for 90 minutes at 20 ° C., and then centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to collect the supernatant and used as a bacteriophage sample (refrigerated storage).
  • Reagent I Reaction solution 1: 1 M glycine-NaOH pH 11.0
  • Reaction solution 2 3M magnesium chloride solution
  • Dispersion solution 1M glycine-HCl pH 5.0 3) Cationic graft polymer Prepared in the same manner as in Example 1.
  • Bacteriophage separation and titer confirmation were performed as follows. 500 ⁇ L of sample, 100 ⁇ L of 20% cationic graft polymer, reaction solution 1: 100 ⁇ L, and reaction solution 2: 100 ⁇ L were mixed. Then, it centrifuged for 30 seconds with the desktop small centrifuge, and the precipitation agglomerate was obtained. The supernatant was removed, and the resulting precipitate agglomerate was completely dispersed with 100 ⁇ L of the dispersion to obtain a dispersion. The dispersion solution was mixed with an agar medium containing about 10 5 cells of Escherichia coli and cultured at 37 ° C. for 18 hours to confirm lysis of Escherichia coli (FIG. 11). Further, as a positive control, E. coli was infected with a bacteriophage sample before reacting with the cationic graft polymer.
  • Example 10 Survival confirmation of isolated E. coli 1.
  • Method 1) Sample In the same manner as in Example 1, a necessary amount of Escherichia coli prepared using GFP expression kit manufactured by Bio-Rad was added to normal human serum and used as a sample. About 10 8 cells of E. coli.
  • Reagent I Reaction solution 1: 1 M glycine-NaOH pH 11.0
  • Reaction solution 2 3M magnesium chloride solution
  • Dispersion solution 1M glycine-HCl pH 5.0 3)
  • Cationic graft polymer (5) Graft polymer (PAAEpo-g-DADMAC) of epoxyoctane-modified polyallylamine and diallyldimethylammonium chloride, and (8) Glycidyl butyrate-modified polyallylamine and diallyldimethylammonium chloride And a graft polymer (PAAGB-g-DADMAC).
  • the above graft polymer was mixed at a final concentration of 8%, and latex beads produced by a known method, for example, polystyrene latex LE (average particle size: 120 nm, manufactured by Nitto Bo Medical Co., Ltd.) so that the final concentration was 5%.
  • a graft polymer solution was obtained.
  • a graft polymer (PAA-g-PSt) of the propylene oxide-modified polyallylamine and styrene used in Example 1 was also used as a positive control.
  • E. coli was isolated and confirmed for survival as follows. 500 ⁇ L of the sample, 100 ⁇ L of the graft polymer solution, reaction solution 1: 100 ⁇ L, and reaction solution 2: 200 ⁇ L were mixed. Then, it centrifuged for 30 seconds with the desktop small centrifuge, and the precipitation agglomerate was obtained. The supernatant was transferred to another centrifuge tube and further centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, and the resulting precipitate was dispersed in 500 ⁇ L of the dispersion. The precipitated aggregate obtained by removing the supernatant was completely dispersed with 500 ⁇ L of the dispersion to obtain a dispersion.
  • Example 11 Survival confirmation of isolated E. coli 1.
  • Method 1 Sample In the same manner as in Example 1, a necessary amount of Escherichia coli prepared using GFP expression kit manufactured by Bio-Rad was added to normal human serum and used as a sample.
  • E. coli 10 8 cells or so 2)
  • Reagent I Reaction solution 1: 1 M Glycine-NaOH pH 11.0
  • Reaction solution 2 3M magnesium chloride solution
  • Cationic graft polymer The above (5) graft polymer (PAAEpo-g-DADMAC) of epoxyoctane-modified polyallylamine and diallyldimethylammonium chloride was used.
  • E. coli was isolated and confirmed for survival as follows. 500 ⁇ L of the sample, 100 ⁇ L of the graft polymer solution, reaction solution 1: 100 ⁇ L, and reaction solution 2: 200 ⁇ L were mixed. After mixing the sample and the graft polymer, a latex bead produced by a known method, for example, polystyrene latex LE (average particle size: 120 nm, manufactured by Nitto Bo Medical Co., Ltd.) 20 ⁇ L is added and mixed well. Centrifugation was performed for 30 seconds with a centrifuge to obtain a precipitate aggregate.
  • a latex bead produced by a known method, for example, polystyrene latex LE (average particle size: 120 nm, manufactured by Nitto Bo Medical Co., Ltd.) 20 ⁇ L is added and mixed well. Centrifugation was performed for 30 seconds with a centrifuge to obtain a precipitate aggregate.
  • the supernatant was transferred to another centrifuge tube and further centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, and the resulting precipitate was dispersed in 500 ⁇ L of the dispersion.
  • the precipitated aggregate obtained by removing the supernatant was completely dispersed with 500 ⁇ L of the dispersion to obtain a dispersion.
  • 50 ⁇ L of the dispersion solution derived from the above supernatant and the precipitate aggregate was applied onto an LB bacterial culture agar medium, cultured at 37 ° C. for 18 hours, and the survival of E. coli was confirmed by colony formation.
  • Example 12 Survival confirmation of isolated E. coli 1.
  • Method 1 Sample In the same manner as in Example 1, a necessary amount of Escherichia coli prepared using GFP expression kit manufactured by Bio-Rad was added to normal human serum and used as a sample. E. coli 10 8 cells or so 2) Reagent I: Reaction mixture 1: 1 M Glycine-NaOH pH 11.0 II: Reaction solution 2: 3M magnesium chloride solution III: Dispersion solution: 1M glycine-HCl pH 5.0 3) Cationic Graft Polymer (11) A graft polymer of glycidol-modified polydiallylamine and sialyldimethylammonium chloride was used.
  • the above graft polymer was mixed at a final concentration of 8%, and latex beads produced by a known method, for example, polystyrene latex LE (average particle size: 120 nm, manufactured by Nitto Bo Medical Co., Ltd.) so that the final concentration was 5%.
  • a graft polymer solution was obtained.
  • the graft polymer (PAA-g-PSt) of (3) propylene oxide-modified polyallylamine and styrene used in Example 1 was also used as a positive control.
  • E. coli was isolated and confirmed for survival as follows. 500 ⁇ L of the sample, 100 ⁇ L of the graft polymer solution, reaction solution 1: 100 ⁇ L, and reaction solution 2: 200 ⁇ L were mixed. Then, it centrifuged for 30 seconds with the desktop small centrifuge, and the precipitation agglomerate was obtained. The supernatant was transferred to another centrifuge tube and further centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, and the resulting precipitate was dispersed in 500 ⁇ L of the dispersion. The precipitated aggregate obtained by removing the supernatant was completely dispersed with 500 ⁇ L of the dispersion to obtain a dispersion.
  • Example 13 Measurement with mass spectrometer Method 1
  • a necessary amount of Escherichia coli prepared using GFP expression kit manufactured by Bio-Rad was added to normal human serum and used as a sample.
  • E. coli 10 8 cells or so
  • Reagent I Reaction mixture 1: 1 M Glycine-NaOH pH 11.0
  • Reaction liquid 2 3M magnesium chloride solution
  • Dispersion liquid 70% formic acid
  • the above graft polymer was mixed at a final concentration of 8%, and latex beads produced by a known method, for example, polystyrene latex LE (average particle size: 120 nm, manufactured by Nitto Bo Medical Co., Ltd.) so that the final concentration was 5%.
  • a graft polymer solution was obtained.
  • the graft polymer (PAA-g-PSt) of (3) propylene oxide-modified polyallylamine and styrene used in Example 1 was also used as a positive control.
  • the separation of E. coli and measurement with a mass spectrometer were performed as follows. 500 ⁇ L of the sample, 50 ⁇ L of the graft polymer solution, reaction solution 1: 100 ⁇ L, and reaction solution 2: 200 ⁇ L were mixed. Then, it centrifuged for 30 seconds with the desktop small centrifuge, and the precipitation agglomerate was obtained. The supernatant was removed, and the resulting precipitated aggregate was completely dispersed with 30 ⁇ L of the dispersion. Subsequently, 100 ⁇ L of the aggregate solution was mixed, and then centrifuged for 60 seconds in a desktop small centrifuge. The obtained supernatant was used as a measurement sample for the mass spectrometer. The handling of the mass spectrometer was performed in the same manner as in Example 3. In addition, as a control, the case where polystyrene latex LE was included but the graft polymer was not included was also examined.
  • Example 14 Survival confirmation of isolated E. coli 1.
  • Method 1 Sample In the same manner as in Example 1, a necessary amount of Escherichia coli prepared using GFP expression kit manufactured by Bio-Rad was added to normal human serum and used as a sample.
  • E. coli 10 8 cells or so 2)
  • Reagent I Reaction mixture 1: 1 M Glycine-NaOH pH 11.0
  • Reaction solution 2 3M magnesium chloride solution
  • Cationic Graft Polymer The graft polymer of (11) glycidol-modified polydiallylamine and sialyldimethylammonium chloride used in Example 12 was used.
  • E. coli was isolated and confirmed for survival as follows. 500 ⁇ L of the sample, 100 ⁇ L of the graft polymer solution, reaction solution 1: 100 ⁇ L, and reaction solution 2: 200 ⁇ L were mixed. After mixing the sample and the graft polymer, a latex bead produced by a known method, for example, polystyrene latex LE (average particle size: 120 nm, manufactured by Nitto Bo Medical Co., Ltd.) 20 ⁇ L is added and mixed well. Centrifugation was performed for 30 seconds with a centrifuge to obtain a precipitate aggregate.
  • a latex bead produced by a known method, for example, polystyrene latex LE (average particle size: 120 nm, manufactured by Nitto Bo Medical Co., Ltd.) 20 ⁇ L is added and mixed well. Centrifugation was performed for 30 seconds with a centrifuge to obtain a precipitate aggregate.
  • the supernatant was transferred to another centrifuge tube and further centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, and the resulting precipitate was dispersed in 500 ⁇ L of the dispersion.
  • the precipitated aggregate obtained by removing the supernatant was completely dispersed with 500 ⁇ L of the dispersion to obtain a dispersion.
  • 50 ⁇ L of the dispersion solution derived from the above supernatant and the precipitate aggregate was applied onto an LB bacterial culture agar medium, cultured at 37 ° C. for 18 hours, and the survival of E. coli was confirmed by colony formation.
  • the method of the present invention and the kit for the same can separate and purify an object more efficiently than the conventional method using an ion exchange polymer, and can detect even if the abundance of the object in the sample is extremely small. To.

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Abstract

本発明の課題は、既存のカチオン性ポリマーの代わりに、標的物を分離濃縮する方法及びそのためのキットを提供することにある。

Description

新規カチオン性グラフト重合体を用いた標的物分離濃縮方法
　本出願は２０１４年３月２４日に出願された日本特許出願２０１４－６０４１９号及び２０１４－６０４２０号明細書に対する優先権を主張し、前記日本出願は、全体を参照により本明細書に組み込む。
　本願明細書及び上記２つの日本出願で引用する全ての文献の記載を全て明細書に組み込む。
　本発明は、導入コストが低く、簡便な操作で、安全に且つ安定して製造することができるグラフト重合体を用いた標的生体分子分離濃縮方法及びその方法に用いるキットに関する。
　イオン交換ポリマーは、合成樹脂の一種で分子構造の一部にイオン基として電離する構造を持つ。水などの溶媒中のイオンとイオン交換作用を示すが、その挙動はイオンに対する選択性に従い、イオン基の性質により、陽イオン交換ポリマーと陰イオン交換ポリマーに大別される。ポリマー中の固定イオンと様々な溶液中の対立イオン（交換されるイオン）との吸着の差を利用することによって、溶液に含まれた各イオンを分離することができる。
　生体分子の電荷特性は分子全体の電荷や電荷密度、表面電荷の分布の仕方、溶液のｐＨなどさまざまな要因によって決定される。たとえばタンパク質の場合は、弱酸性や弱塩基性など多種類のイオン性のアミノ酸を含み、正の電荷と負の電荷の両方を分子表面に持つ。この電荷の総和を有効表面電荷と呼び、アミノ酸の荷電状態がｐＨによって変化するため、タンパク質分子の有効表面電荷も溶液のｐＨに依存して正や負へ変化する。
　イオン交換クロマトグラフィーは、このような生体分子の荷電状態（有効表面電荷）のｐＨや塩濃度による変化を利用し、反対の電荷を有する担体と可逆的に結合・溶出させて回収する手法である（たとえば特許文献１、２及び非特許文献１）。
　しかしながらかかる回収操作をした場合、溶出の際、界面活性剤や高濃度塩などを使用しているため、目的物の立体構造の維持や生存した状態で回収することが難しい。
特開１９９６－１７３１９４号公報 特開２００２－１２５６９５号公報
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１５２（２００６），３５７５－３５８３
　既存のカチオン性ポリマーの代わりに、新規のカチオン性グラフト重合体を用いて、標的物を分離濃縮する方法及びそのためのキットを提供することにある。
　即ち、本発明は本発明の構成は以下の［１］から［１１］の通りである。
［１］カチオン性グラフト重合体を用いた、標的物を分離濃縮する方法であって；
　　（１）塩基性条件下でカチオン性グラフト重合体と標的物を含む試料と接触させ、標的物をカチオン性グラフト重合体に結合させるステップ；
　　（２）カチオン性グラフト重合体と標的生体分子との結合体を分離するステップ；及び
　　（３）前記結合体から標的物を溶出するステップ；を
含む方法
＜ここで前記カチオン性グラフト重合体は、少なくとも１のアミノ基を有する高分子化合物（ａ）と、少なくとも１のエポキシ基を有する化合物（ｂ）とを反応して得られるポリアミン誘導体と、エチレン性不飽和単量体（ｃ）とを重合して得られる、ポリアミングラフト重合体である＞；
［２］ステップ（１）において、さらに二価又は三価の金属イオンを添加することを含む、上記［１］に記載の方法；
［３］ステップ（２）において、結合体を洗浄する工程をさらに含む、上記［１］又は［２］に記載の方法；
［４］前記カチオン性グラフト重合体が固相面に固定されている、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］ステップ（３）において、標的物と結合していないカチオン性グラフト重合体を凝集させるステップを含む、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［６］上記［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法のために用いられるキットであって、カチオン性グラフト重合体を含むキット；
［７］さらに金属イオン塩を含む上記［６］に記載のキット；
［８］さらに、塩基性溶液と金属イオン塩を含む反応液を含む上記［６］に記載のキット；
［９］さらに、洗浄液を含む上記［６］～［８］のいずれか一項に記載のキット；
［１０］さらに、酸性溶液又はキレート剤を含む分散液を含む上記［６］～［９］のいずれか一項に記載のキット。
［１１］さらに、凝集液を含む上記［６］～［１０］のいずれか一項に記載のキット。
　本発明の方法によって、試料中の標的物を効率よく分離濃縮可能であり、かつ分離濃縮の過程で、標的物は既知の方法よりダメージを受けていないため、その後の解析が容易である。より詳しくは質量分析装置を用いた解析にも適用できる。
大腸菌とカチオン性グラフト重合体との結合体との沈殿凝集塊　左のチューブは大腸菌（無）、右のチューブは大腸菌（有）。 ＧＦＰ発現大腸菌とカチオン性グラフト重合体との結合体の蛍光顕微鏡観察　レーザー波長（４８８ｎｍ）により大腸菌に発現させたＧＦＰを検出、可視光によりカチオン性グラフト重合体と大腸菌を検出。レーザー波長および可視光を用いて画像を連続取得し、疑似カラー表示でスーパーインポーズした。左図は大腸菌がカチオン性グラフト重合体により捕獲されている状態、右図はその凝集塊を分散液により分散させた状態。 分離した大腸菌の生存確認　カチオン性グラフト重合体と大腸菌を反応させ、遠心後の上清と、凝集塊を分散液により分散した溶液をそれぞれ培養した。右半分の画像が上清、左半分が分散液。 分離回収した核酸を用いた電気流動　レーン１がカチオン性グラフト重合体処理なしサンプル、レーン２がカチオン性グラフト重合体処理後サンプルの電気泳動画像。 回収した細胞の検出　（１）細胞とカチオン性グラフト重合体を反応させ遠心後の上清(左)と凝集塊(右)。　（２）その凝集塊を分散液で分散させた状態。　（１），（２）ともに、レーザー波長３５０ｎｍにより細胞の核を検出、可視光によりカチオン性グラフト重合体を検出。レーザー波長および可視光を用いて画像を連続取得。疑似カラー表示でスーパーインポーズし、凝集状態、および分散状態を観察。 回収した細胞の蛍光顕微鏡観察　カチオン性グラフト重合体により捕獲し、分散液で分散後に免疫染色を行った。レーザー波長３５０ｎｍで細胞の核を検出し、細胞表面に発現している抗原（ＭＣＡＭ）と反応する抗体を４８８ｎｍで検出。２種類のレーザー波長を用いて画像を連続取得。疑似カラー表示でスーパーインポーズし、細胞表面抗原を観察。 回収したベシクルの検出　（１）ベシクルとカチオン性グラフト重合体を反応させて遠心後の上清（左）及び凝集塊（右）。　（２）その凝集塊を分散液で分散した状態。（１），（２）ともに、レーザー波長４８８ｎｍによりベシクルを検出、可視光によりカチオン性グラフト重合体を検出。レーザー波長および可視光を用いて画像を連続取得。疑似カラー表示でスーパーインポーズし、凝集状態、及び分散状態を確認。 回収したベシクルの蛍光顕微鏡観察　カチオン性グラフト重合体により捕獲したベシクルを分散液にて分散後、免疫染色を行った。レーザー波長４８８ｎｍにてベシクルを検出し、レーザー波長５９４ｎｍにて抗体を検出。２種類のレーザー波長を用いて画像を連続取得。疑似カラー表示でスーパーインポーズし、ベシクル表面の抗原の状態を確認。 界面活性剤入り溶液を用いて回収した大腸菌の検出（電気泳動） 界面活性剤入り溶液を用いて回収した大腸菌の検出（質量分析） バクテリオファージの分離検出 分離した大腸菌の生存確認　エポキシオクタン変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体（ＰＡＡＥｐｏ－ｇ－ＤＡＤＭＡＣ）、およびグリシジルブチレート変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体（ＰＡＡＧＢ－ｇ－ＤＡＤＭＡＣ）を用いて、大腸菌の分離を行った。グラフト重合体をラテックスビーズと混合した後、菌体と反応させた。 分離した大腸菌の生存確認　エポキシオクタン変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体（ＰＡＡＥｐｏ－ｇ－ＤＡＤＭＡＣ）を用いて、大腸菌の分離を行った。グラフト重合体を菌体と反応させた後、ラテックスビーズを添加した。 分離した大腸菌の生存確認　グリシドール変性ポリジアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体（ＤＡＡＧｌｙ－ｇ－ＤＡＤＭＡＣ）を用いて、大腸菌の分離を行った。グラフト重合体をラテックスビーズと混合した後、菌体と反応させた。 分離した大腸菌の生存確認　グリシドール変性ポリジアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体（ＤＡＡＧｌｙ－ｇ－ＤＡＤＭＡＣ）を用いて、大腸菌の分離を行った。グラフト重合体を菌体と反応させた後、ラテックスビーズを添加した。
　「カチオン性グラフト重合体」とは、少なくとも１のアミノ基を有する高分子化合物（ａ）と、少なくとも１のエポキシ基を有する化合物（ｂ）とを反応して得られるポリアミン誘導体と、エチレン性不飽和単量体（ｃ）とを重合して得られる［前記少なくとも１のアミノ基を有する高分子化合物（ａ）が、以下の一般式（１）で表されるエチレンイミン系重合体、一般式（２）で表されるビニルアミン系重合体、一般式（３）で表されるアリルアミン系重合体、一般式（４）で表されるジアリルアミン系重合体、及び一般式（５）で表されるアクリルアミン系重合体からなる群より選ばれてもよい（ただし、下記一般式中、ｎは１０から２００,０００の整数であり、ｍは５から３,０００の整数であり、ｌは５から５,０００の整数であり、ｏは１０から１０,０００の整数であり、ｐは１から１００の整数である］。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　「少なくとも１のアミノ基を有する高分子化合物（ａ）」は、少なくとも１のアミノ基を有すればよいものであり、その構成単位中にアミノ基を有さない構成単位を含んでいてもよい。従って、上記一般式（１）から（５）で表される構造を有する各重合体も、それぞれ上記一般式（１）から（５）で表される構造の構成単位に加えて、アミノ基を有さない構成単位を含んでいてもよく、また含んでいなくともよい。アミノ基を有さない構成単位としては二酸化硫黄、アクリルアミド、アリルアルコール、アクリル酸等を挙げることができるが、これらには限定されない。
　「少なくとも１のアミノ基を有する高分子化合物（ａ）」における「アミノ基」は、一級アミノ基、二級アミノ基、及び三級アミノ基のいずれであってもよく、一級アミノ基、又は二級アミノ基であることが特に好ましい。
　「少なくとも１のアミノ基を有する高分子化合物（ａ）」における「アミノ基」の数には、特に制限はないが、反応性、使いやすさ等の観点から、１高分子あたり５～１５０００個であることが好ましく、８～３０００個であることが特に好ましい。また、高分子化合物の分子量あたりの個数に換算すると、分子量１００００あたり、５個から２３０個であることが好ましく、１０個から１３０個であることが特に好ましい。　
　「少なくとも１のアミノ基を有する高分子化合物（ａ）」の分子量には特に制限は無いが、反応性、粘度、ハンドリング、歩留などの観点から、数平均分子量で５００～１０００００００であることが好ましく、５００～１００００００であることが特に好ましい。
　また、本願第１発明において用いられる少なくとも１のアミノ基を有する高分子化合物（ａ）が有する繰り返し単位の数にも特に制限は無いが、反応性、粘度、ハンドリング、歩留などの観点から、１０～１５００００個であることが好ましく、１０～３０００個であることが特に好ましい。
　「少なくとも１のアミノ基を有する高分子化合物（ａ）」は「さらに少なくとも１のアリル基と少なくとも１のアミノ基とを有するアリルアミン系単量体（ａ’）」であってもよい。その構造中に少なくとも１のアリル基と少なくとも１のアミノ基を有とする重合性の化合物であれば、いかなる化合物をも使用することが可能であるが、一般式（ａ１）で表される構造を有するアリルアミン系化合物であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　一般式（ａ１）中、Ｒ９及びＲ１０はその少なくとも一方が水素原子であり、他方が水素又は炭素数１から８の炭化水素基であり、水素原子又は炭素数１から３のアルキル基であることが好ましい。
　また、一般式（ａ１）において、Ｒ９及びＲ１０のいずれか一方もアリル基であること、すなわち２のアリル基を有するジアリルアミン系単量体であることが、重合性等の観点から特に好ましい。
　高い重合性を得る観点からは、アリルアミン系単量体（ａ’）のうち少なくとも一部は、２のアリル基を有するジアリルアミン系単量体であることが好ましく、該アリルアミン系単量体（ａ’）の３０モル％以上がジアリルアミン系単量体であることがより好ましく、５０モル％以上がジアリルアミン系単量体であることが特に好ましい。
　一般式（ａ１）において、Ｒ９及びＲ１０の一方（例えばＲ９）が水素原子である場合、他方（この場合Ｒ１０）は、水素原子、メチル基、エチル基、アリル基、又はベンジル基であることが好ましい。すなわち、一般式（ａ１）で表される構造を有するアリルアミン系化合物は、好ましくは、アリルアミン、メチルアリルアミン、エチルアリルアミン、ジアリルアミン、又ベンジルアリルアミンである。
　また、一般式（ａ１）で表される構造を有するアリルアミン系化合物の有機酸塩又は無機酸塩も、本願第１発明において、少なくとも１のアリル基と少なくとも１のアミノ基とを有するアリルアミン系単量体（ａ’）として好ましく用いることができる。上記有機酸塩又は無機酸塩におけるカウンターイオンとしては、ハロゲンイオン（さらに好ましくは、Ｃｌ－、Ｂｒ－、若しくはＩ－）、メチル硫酸イオン、エチル硫酸イオン、メタンスルホン酸イオン、２－ヒドロキシ－１－エタンスルホン酸イオン、酢酸イオン又はヒドロキシ酢酸イオンが好ましい。
　カチオン性グラフト重合体は上記定義において、
前記少なくとも１のエポキシ基を有する化合物（ｂ）が、一般式（６）で表される化合物である、ポリアミングラフト重合体（ただし、一般式（６）中のＲは、置換又は非置換の１価の炭化水素基である。）であってよい。
　カチオン性グラフト重合体は上記定義において、
前記少なくとも１のエポキシ基を有する化合物（ｂ）が、一般式（７）で表される化合物であって、（１）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、水素原子である、エチレンオキサイド、（２）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または鎖中に水酸基を含む炭素数１～８の直鎖もしくは分岐している飽和炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、（３）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または置換若しくは非置換の１価の炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）エポキシ化合物、（４）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または鎖中にエーテル結合を含む炭素数１～８の直鎖もしくは分岐している飽和炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、（５）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子またはハロゲンである（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、（６）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または不飽和炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、（７）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または脂環式または不飽和結合を有する環式炭化水素基を含む炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、（８）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または芳香環もしくは複素環を含む炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、（９）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子またはエポキシ環を含む炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、多官能エポキシ化合物、（１０）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または鎖中にアルコキシシリルを含む炭素数３～１２の直鎖もしくは分岐している飽和炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、（１１）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または鎖中にフッ素を有する炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、（１２）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または鎖中にカルボキシル基を有する炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、（１３）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または鎖中にエステル結合もしくはアミド結合を含む炭素数１～１２の直鎖もしくは分岐している飽和炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、並びに（１４）式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、それぞれ独立に水素原子または鎖中にスルホン酸エステル基を有する炭化水素基である（但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の全てが水素原子ではない）、エポキシ化合物、からなる群より選ばれる、ポリアミングラフト重合体であってよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　また、「少なくとも１のエポキシ基を有する化合物（ｂ）」としては、エチレンオキサイド（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　グリシドール（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　プロピレンオキサイド（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　ブチレンオキサイド、２，３－ブチレンオキサイド、１，２－エポキシヘキサン、及び１，２－エポキシヘキサデカン、
　グリシジルメチルエーテル（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　エチルグリシジルエーテル、グリシジルイソプロピルエーテル、及びトリグリシジルイソシアヌレート
　エピクロリヒドリン（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　エピブロモヒドリン、及び２－（クロロメチル）－１，２－エポキシブタン
　１，３－ブタジエンモノオキサイド（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
１，２－エポキシ－５－ヘキセン、及びアリルグリシジルエーテル
　１，２－エポキシシクロペンタン（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
１，２－エポキシシクロヘキサン、及び１，２－エポキシ－４－ビニルシクロヘキサン３，４－エポキシテトラヒドロフラン
　スチレンオキサイド（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　グリシジルフェニルエーテル、及び４－グリシジルオキシカルバゾール
　１，２：３，４－ジエポキシブタン（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、及びエチレングリコールジグリシジルエーテル
　３－グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　及び３－グリシジルオキシプロピル（ジメトキシ）メチルシラン
　１，２－エポキシ－１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈヘプタデカフルオロウンデカン（構造は、下式参照）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　エポキシコハク酸（構造は、下式参照）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　グリシジルブチレート（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　及びＮ－グリシジルフタルイミド、並びに、
　グリシジルニトロベンズスルホネート（構造は、下式参照）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　及びグリシジル－ｐ－トルエンスルホネートなどを挙げることができるが、これらには限定されない。
　カチオン性グラフト重合体は上記定義において、
　前記エチレン系不飽和単量体（ｃ）が、ビニル系単量体、スチレン系単量体、メタクリル酸エステル系単量体、アクリル酸エステル系単量体、アクリルアミド系単量体、アリル系単量体、ジアリル系単量体、及び不飽和カルボン酸からなる群より選ばれる、ポリアミングラフト重合体であってよい。
　エチレン系不飽和単量体（ｃ）の分子量には特に制限はないが、グラフト効率などの観点から、分子量２８から１１００であることが好ましく、２８から５００であることが特に好ましい。
　エチレン系不飽和単量体（ｃ）の炭素原子数にも特に制限はないが、２個から５０個であることが好ましく、２個から３０個であることが特に好ましい。
エチレン系不飽和単量体（ｃ）のうち本発明において好ましく用いられる単量体のより具体的な例としては、スチレン、ジビニルベンゼン、ｐ－スチレンスルホン酸ナトリウム水和物、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、酢酸ビニル、１－ビニルイミダゾール、２－ビニルピリジン、アクリロニトリル、アリルアミン塩酸塩、ジアリルアミン塩酸塩、ジメチルジアミン塩酸塩、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、特にその６０％水溶液、ジメチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド塩化メチル４級塩、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）メタクリルアミド、メタクリル酸３－（トリメトキシシリル）プロピル、アクリル酸メチル、アクリル酸ブチル、などを挙げることができる。これらのうち、幹ポリマー上のヒドロキシ基と隣接した炭素との反応性、グラフト後の側鎖末端の基の有用性などの観点から、ジメチルアクリルアミド、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、スチレン、アクリロニトリルなどが特に好ましい。
　これらの単量体の化学構造、ＣＡＳ番号等は、当業者において自明であるので、その記載を省略する。
　エチレン系不飽和単量体（ｃ）は、本発明の目的に応じて、１種類のみを単独で使用することもできるし、２種類以上を組み合わせて使用することもできる。２種類以上のエチレン系不飽和単量体（ｃ）を組み合わせて使用する場合、その全てが上記の好ましい例に該当するものであってもよいし、その一部のみが上記の好ましい例に該当するものであってもよい。
　カチオン性グラフト重合体に含まれる単位重量当たりのアミノ基の量は、０．１～１７ｍｍｏｌ／ｇであることが好ましく、１～１０ｍｍｏｌ／ｇであることが特に好ましい。また平均粒子径はカチオン性グラフト重合体を固相面に固定しない場合は２５０ｎｍ以下が好ましく、１００ｎｍ～２００ｎｍがより好ましい。
「カチオン性グラフト重合体」の一態様として以下のグラフト重合体が挙げられる。　
（１）プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとジメチルアクリルアミドとのグラフト重合体
　　２０質量％のポリアリルアミン（重量平均分子量３０００）を氷水で冷却及び撹拌しながらプロピレンオキシド（アミンに対し２当量）を滴下した。２０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンを水溶液として得た。
　上記に従い調製した４２質量％のプロピレンオキシド変性ポリアリルアミンに、１４質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１０であった。次に６５質量％のジメチルアクリルアミド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１２．０１ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させ、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとジメチルアクリルアミドのグラフト重合体を水溶液として得た（重量平均分子量１２００００）。
（２）　プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体
　（１）と同様に調製した５０質量％のプロピレンオキシド変性ポリアリルアミンに、３０質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１０であった。次に６５質量％ジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）を加えた。さらに２８．５質量％のＡＰＳ水溶液９６．０８ｇ（モノマーに対して２０モル％）を分割して加え７２時間重合させ、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た（重量平均分子量２４０００）。
（３）　プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンとのグラフト重合体
　２０質量％のポリアリルアミンを氷水で冷却及び撹拌しながらプロピレンオキシド（アミンに対し０．１当量）を滴下した。２０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンを水溶液として得た。
　プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンに２０質量％となるように水を加え、次にスチレン （アミンに対し０．３当量）を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２で  あった。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１２．０１ｇ（モノマーに対して２０モル％）を滴下し、２４時間重合させた。その後７０℃で２４時間加温し、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンの以下に推定される構造のグラフト重合体を得た（ただし、下記一般式中、ｑは０から３,０００の整数であり、ｒは０から３,０００の整数であり、ｓは０から３,０００の整数であり、ｔは０から１０,０００の整数であり、ｕは０から１０,０００の整数であり、ｗは０から１０,０００の整数である）。平均粒径は、１２０ｎｍであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 
 (４)　プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとジメチルアクリルアミドとのグラフト重合体の製造（ｐＨ７での製造）
　（１）と同様に調製した４２質量％のプロピレンオキシド変性ポリアリルアミンに、１４質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。次に３５質量％の塩酸を加えｐＨを７に調整し、ジメチルアクリルアミド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１２．０１ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させ、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとジメチルアクリルアミドのグラフト重合体を水溶液として得た（重量平均分子量２１００００）。
（５）エポキシオクタン変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体
　２０質量％のポリアリルアミンに１３質量％となるように水を加え、氷水で冷却及び撹拌しながらエポキシオクタン（アミンに対し０．１当量）を滴下した。滴下終了後４０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、エポキシオクタン変性ポリアリルアミンを水溶液として得た。
　　上記に従い調製した３０質量％のエポキシオクタン変性ポリアリルアミンに、１９質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２であった。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させた。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）を分割してさらに追加し、エポキシオクタン変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た。
（６）エチレングリコールジグリシジルエーテル変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体
　２０質量％のポリアリルアミンに１３質量％となるように水を加え、氷水で冷却及び撹拌しながらエチレングリコールジグリシジルエーテル（アミンに対し０．０５当量）を滴下した。滴下終了後４０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、エチレングリコールジグリシジルエーテル変性ポリアリルアミンを水溶液として得た。
　上記に従い調製した３０質量％のエチレングリコールジグリシジルエーテル変性ポリアリルアミンに、１９質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２であった。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させ、エチレングリコールジグリシジルエーテル変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を黄色ゲルとして得た。
（７）スチレンオキシド変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体
　２０質量％のポリアリルアミンに１３質量％となるように水を加え、氷水で冷却及び撹拌しながらスチレンオキシド（アミンに対し０．１当量）を滴下した。滴下終了後４０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、スチレンオキシド変性ポリアリルアミンを水溶液として得た。
　上記に従い調製した３０質量％のスチレンオキシド変性ポリアリルアミンに、１９質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２であった。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させた。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）を分割してさらに追加し、スチレンオキシド変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た。
（８）グリシジルブチレート変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体
　２０質量％のポリアリルアミンに１３質量％となるように水を加え、氷水で冷却及び撹拌しながらグリシジルブチレート（アミンに対し０．１当量）を滴下した。滴下終了後４０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、グリシジルブチレート変性ポリアリルアミンを水溶液として得た。
　上記に従い調製した３０質量％のグリシジルブチレート変性ポリアリルアミンに、１９質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２であった。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させた。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）を分割してさらに追加し、グリシジルブチレート変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た。
（９）プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンとのグラフト重合体
　（３）と同様に調製したプロピレンオキシド変性ポリアリルアミンに２０質量％となるように水を加え、次にスチレン （アミンに対し０．３当量）を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２であった。その後、２８．５質量％のＳＰＳ水溶液１２．５３ｇ（モノマーに対して２０モル％）を滴下し、２４時間重合させた。その後７０℃で２４時間加温し、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンのグラフト重合体を得た。平均粒径は、１３５ｎｍであった。
（１０）プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンとのグラフト重合体
　（３）と同様に調製したプロピレンオキシド変性ポリアリルアミンに２０質量％となるように水を加え、次にスチレン （アミンに対し０．３当量）を加え、８０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２であった。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１２．０１ｇ（モノマーに対して２０モル％）を滴下し、２４時間重合させ、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンのグラフト重合体を得た。平均粒径は、１４４ｎｍであった。
（１１）グリシドール変性ポリジアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体
　ジアリルアミンに７９質量％となるように水を加え、氷水で冷却及び撹拌しながらグリシドール（アミンに対し１当量）を滴下した。滴下終了後４５℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、グリシドール変性ジアリルアミンを水溶液として得た。
　７８質量％のグリシドール変性ジアリルアミンに３５質量％の塩酸（アミンに対し１当量）を加えた。その後、５０質量％となるように水を加え、６０℃に加温し、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）２塩酸塩（モノマーに対し６モル％）を分割して加え、２４時間重合させた。得られた溶液を電気透析によって精製し、グリシドール変性ポリジアリルアミンを水溶液として得た。
　上記に従い調製した、４３質量％のグリシドール変性ポリジアリルアミンに３０質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１１であった。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液３６．０４ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させた。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液３６．０４ｇ（モノマーに対して１０モル％）を分割してさらに追加し、５０℃で２４時間重合させ、グリシドール変性ポリジアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た（重量平均分子量８４０００）。
（１２）プロピレンオキシド変性ポリエチレンイミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体
　４７質量％のポリエチレンイミン（重量平均分子量２０００）を撹拌しながらプロピレンオキシド（アミンに対し０.１当量）を滴下した。２０℃にて２４時間反応させ、プロピレンオキシド変性ポリエチレンイミン水溶液を得た。
　上記に従い調製した５０質量％のプロピレンオキシド変性ポリエチレンイミンに、１４質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２であった。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液３１．２３ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させ、プロピレンオキシド変性ポリエチレンイミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た。
（１３）プロピレンオキシド変性ポリビニルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体
　１５質量％のポリビニルアミン（重量平均分子量１５００００）を撹拌しながらプロピレンオキシド（アミンに対し０.１当量）を滴下した。２０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、２３質量％のプロピレンオキシド変性ポリビニルアミン水溶液を得た。
　上記に従い調製した２３質量％のプロピレンオキシド変性ポリビニルアミンに、１５質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２であった。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液３１．２３ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させ、プロピレンオキシド変性ポリビニルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た。
（１４）プロピレンオキシド変性ポリジアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体
　ジアリルアミンに７８質量％となるように水を加え、氷水で冷却及び撹拌しながらプロピレンオキシド（アミンに対し０．１当量）を滴下した。２０℃にて２４時間反応させ、プロピレンオキシド変性ジアリルアミンを水溶液として得た。
　７９質量％のプロピレンオキシド変性ジアリルアミンに３５質量％の塩酸（アミンに対し１当量）を加え、５９質量％のプロピレンオキシド変性ジアリルアミン塩酸塩を水溶液として得た。得られた５９質量％のプロピレンオキシド変性ジアリルアミン塩酸塩４１．３３ｇに７質量％となるように水を加え、６０℃に加温した。その後、５９質量％のプロピレンオキシド変性ジアリルアミン塩酸塩１２３．９９ｇと２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）２塩酸塩（単量体に対し５．６モル％）を分割して加え、２４時間重合させた。得られた溶液を電気透析によって精製し、プロピレンオキシド変性ポリジアリルアミンを水溶液として得た。
上記に従い調製した３０質量％のプロピレンオキシド変性ポリジアリルアミンに、２４質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２であった。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（単量体に対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させた。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（単量体に対して１０モル％）を分割してさらに追加し、６０℃で２４時間重合させ、プロピレンオキシド変性ポリジアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た(重量平均分子量１９０００)。
（１５）プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体（重量平均分子量２０００、アミンに対してプロピレンオキシド０．１当量添加したプロピレンオキシド変性ポリアリルアミンを使用）
　１５質量％のポリアリルアミン（重量平均分子量１６００）を氷水で冷却及び撹拌しながらプロピレンオキシド（アミンに対し０．１当量）を滴下した。２０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンを水溶液として得た。
上記に従い調整した３０質量％のプロピレンオキシド変性ポリアリルアミンに、１８質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１０であった。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（単量体に対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させた。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（単量体に対して１０モル％）を分割してさらに追加し、６０℃で２４時間重合させ、プロピレンキシド変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た（重量平均分子量１６０００）。
（１６）プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンと２－ビニルピリジンとのグラフト重合体
　（３）と同様にして調整したプロピレンオキシド変性ポリアリルアミンに２０質量％となるように水を加えた。次に２－ビニルピリジン （アミンに対し０．３当量）を加え、２０℃で撹拌した。反応溶液はｐＨ１２であった。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１２．０１ｇ（単量体に対して２０モル％）を滴下し、２４時間重合させ、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンと２－ビニルピリジンのグラフト重合体を得た。平均粒径は、２２５ｎｍであった。
　出発原料等から、得られたグラフト重合体は下式の構造を有するものと推定された（ただし、下記一般式中、ｑは０から３,０００の整数であり、ｒは０から３,０００の整数であり、ｓは０から３,０００の整数であり、ｔは０から１０,０００の整数であり、ｕは０から１０,０００の整数であり、ｗは０から１０,０００の整数である）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　「試料」とは検出対象となる「対象物」を含むと考えられる混合物である。「試料」はヒトを含む生体（例えば血液、唾液、体液、体組織等）、環境（例えば、土壌、海水、環境水（温泉水、浴槽水、冷却塔水等））、あるいは人工物又は自然物（例えば、パンなどの加工食品、ヨーグルトなどの発酵食品、或いは米や小麦などの栽培植物、微生物、ウィルス）に由来するものである。
　必要に応じてこれらを精製分離処理操作した後のものであってもかまわない。たとえば、血液から得られる血漿(ｂｌｏｏｄ　ｐｌａｓｍａ)ないし血清（ｂｌｏｏｄ　ｓｅｒｕｍ）がこれにあたる。
　また、金属イオン塩を加えたものであってもかまわない。
　さらに「試料」には界面活性剤が含まれていてよく、「対象物」を検出する前に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤（ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルなど）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなど）、Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテルなど）、スクロースラウレート（同仁化学）、サポニン（シグマ・アルドリッチ）、ＢＰＳＨ（ＮＩＫＫＯＬ）、ノイゲンＴＤＳ－７０（第一工業製薬）、ＴｒｉｔｏｎＸ－７０５（シグマ・アルドリッチ）などがこれにあたる。
　「対象物」とは本発明により検出すべき物である。限定されないが、マイナスチャージを持ちうる物であることが好ましい。たとえば、細胞、真菌、細菌、ウィルス及びこれらの分解物、ならびにペプチド、核酸などが含まれる。
　細胞とは生体内に存在するものだけでなく、培養細胞であってもかまわない。また正常な細胞だけでなく、がん細胞（たとえば血中循環がん細胞（ＣＴＣ））であってもよい。
　真菌とは一般にキノコ・カビ・酵母と呼ばれる生物の総称であり、白癬菌、カンジダ、ならびにアスペルギルスなどがこれにあたる。
　細菌とは細胞膜を持つ原核生物である。ブドウ球菌、大腸菌、サルモネラ菌、緑膿菌、コレラ菌、赤痢菌、炭疽菌、結核菌、ボツリヌス菌、破傷風菌、ならびにレンサ球菌などがこれにあたる。
　ウィルスとは、他の生物の細胞を利用して、自己を複製させることのできる微小な構造体で、タンパク質の殻とその内部に入っている核酸からなるものである。ノロウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ならびにＨＩＶなどがこれにあたる。
　細胞、真菌、細菌及びウィルスの分解物とは、これらを構成する因子であり、各オルガネラ（核、ゴルジ体、ミトコンドリアなど）、細胞、真菌、細菌の膜画分などのリン酸脂質を含むもの（反転小胞を含む）、細胞、真菌、細菌及びウィルスを構成する因子の複合体などであってもかまわない。また正常な細胞などには存在しないが、アポトーシスによって生じる微小な膜小胞（たとえばＥｎｄｏｔｈｅｒｉａｌＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ：ＥＭＰ）やベクシルであってもよい。
　ペプチドとは様々なアミノ酸がつながってできた分子の系統群を指す、生体内で機能している完全なたんぱく質を含み、様々ないわゆる翻訳後修飾（たとえばグリコシル化：糖鎖修飾）を含んでもよい。
　核酸とはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）及びこれらの混合物及び結合物であってもよい。またその構成塩基は天然に存在するヌクレオチド、例えばグアニン（Ｇ），アデニン（Ａ），チミン（Ｔ），シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）であるが、それ以外の天然及び人工の修飾塩基を含んでいてもよい。ここで「修飾塩基」とは、上記５つのヌクレオチドが化学的修飾を受けた塩基を意味する。これに限定されないが、メチルシチジン、シュードウリジン、４－チオウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、ヒポキサンチン（イノシン（Ｉ））等がこれにあたる。ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により作製されるｃＤＮＡも含まれる。
　「塩基性条件下」とは、ｐＨ８以上、好ましくは９以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましいのはｐＨ１１以上を指す。塩基性溶液を用いて、塩基性条件にするのが好ましい。塩基性溶液として弱塩基、ＮａＯＨ水溶液などの強塩基、あるいはｐＨ８以上で緩衝能をもつｂｕｆｆｅｒ（例えば、グリシンｂｕｆｆｅｒ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ）などがあげられる。
　カチオン性グラフト重合体と標的物を含む試料と「接触」させるとは、カチオン性グラフト重合体溶液を試料に加える態様以外に、該試料にカチオン性グラフト重合体を加える態様も含まれる。
　「結合」とはカチオン性グラフト重合体と対象物が配位結合及び／又はイオン結合にて相互作用している状態を指す。
　結合体を「分離」するとは、結合体を酸性条件下または、キレート剤存在下、カチオン性グラフト重合体と対象物との上記「結合」をほどくことを指す。
　酸性条件下とは、ｐＨ７以下、好ましくはｐＨ６以下、より好ましくはｐＨ５以下を指す。酸性溶液を用いて、酸性条件にするのが好ましい。酸性溶液としてはグリシンｂｕｆｆｅｒ、ギ酸溶液、酢酸溶液などがあげられる。
　キレート剤としてはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）などがこれにあたる。キレート剤のプロトンが乖離しているｐＨであれば限定されないが、ｐＨは６．０からｐＨ８．０が好ましい。
　「標的物を溶出する」とは、上記「分離」反応後、標的物を適当な溶液中に可溶化することを指す。標的物が生きている細胞である場合は、細胞膜を壊すことなく回収することを指す。
　二価又は三価の金属イオンとは、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｎｉ２＋，Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋，Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ２＋、Ｃｄ２＋、Ｓｎ２＋などがこれにあたる。
　「固相面に固定」とは、「カチオン性グラフト重合体」を偏在させることを指す。これに限定されないが、具体的にはガラス、ナイロンメンブレン、半導体ウェハー、マイクロビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズやコロイド粒子などの表面に「カチオン性グラフト重合体」を固定又はコーティングすることを意味する。固定の方法は公知の技術を用いて、直接「カチオン性グラフト重合体」をガラス等の表面に固定してもよいし、あるいはリンカー分子を介して間接的に固定させてもよい。また、モノマーを固相面で重合させて固相面に固定されたカチオン性グラフト重合体を合成してもよい。
　また、カラムなどに「カチオン性グラフト重合体」を充填した状態であってもよい。
　「結合体を洗浄する」とは「カチオン性グラフト重合体」と「標的物」の結合を維持したまま、非特異的にカチオン性グラフト重合体に結合している、不純物を取り除く操作を指す。洗浄には、結合反応に用いた溶液と同じ溶液を使ってもよいし、他の溶液であってもかまわない。生理食塩水やアルコール類であってもかまわない。
　「標的物と結合していないカチオン性グラフト重合体を凝集させる」とは、疎水的相互作用によって、カチオン性グラフト重合体を分離する、またはカウンターとなるポリアニオンやアニオン性界面活性剤によって、イオン性相互作用によりカチオン性グラフト重合体を凝集させ分離する方法等が挙げられる。より詳細には凝集液（非プロトン性極性溶媒(アセトニトリルなど)もしくは、アニオン性界面活性剤(オクタンスルホン酸Ｎａやデカンスルホン酸Ｎａなど)や、ポリアニオン(カルボキシメチル化ポリアリルアミン：CMPAA)などを含む）を用いて、アセトニトリルの疎水性相互作用や、ポリアニオン、イオン性界面活性剤とのイオン性相互作用によりカチオン性グラフト重合体を凝集させる。
　上記「カチオン性グラフト重合体」、「反応液」、「洗浄液」、「分散液」及び「凝集液」には液体状（「カチオン性グラフト重合体」にあっては乳化状）のものだけでなく、その液体を乾燥させたものを含んでもよい。
　以下の実施例、比較例及び参考例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜実施例１＞
大腸菌の分離、および回収率の確認
１．方法
　カチオン性グラフト重合体を用いて回収した大腸菌の回収率を血球分析装置（シスメックス）を用いて求めた。
　試料、および試薬は以下の通りである。
　１）試料
　大腸菌はバイオラッド社製のＧＦＰ発現Ｋｉｔを用いて作製した。
　作製した大腸菌をノーマルヒト血清中に必要量（１～２×１０４ｃｅｌｌ／μＬ） 添加したものを試料として用いた。
　２）試薬
　Ｉ　：　反応液：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０、３Ｍ　塩化マグネシウム
　ＩＩ：　分散液：５００ｍＭ　グリシン-ＨＣｌ　ｐＨ５．０
　３）カチオン性グラフト重合体
　２０質量％のポリアリルアミン（重量平均分子量３０００）を氷水で冷却及び撹拌しながらプロピレンオキシド（アミンに対し０．１当量）を滴下した。２０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンを水溶液として得た。
　プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンに２０質量％となるように水を加え、次にスチレン （アミンに対し０．３当量）を加え、２０℃で撹拌した。その後、濃度２８．５質量％の過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）水溶液１２．０１ｇ（モノマーに対して２０モル％）を滴下し、２４時間重合させた。その後７０℃で２４時間加温し、プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンのカチオン性グラフト重合体を得た（平均粒径１２０ｎｍ）（上記（３）プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンとのグラフト重合体）。
　４）血球分析装置
　大腸菌は血球分析装置で血小板（ＰＬＴ）に検出される。
　測定は血球分析装置のプロトコルに従い行った。
　大腸菌の分離、および回収率の確認は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと２０％カチオン性グラフト重合体５０μＬ、および反応液１００μＬを混合し、１分間反応させた。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清を回収し、得られた沈殿凝集塊を分散液５００μＬで完全に分散し分散溶液を得た。上清、および分散溶液は血球分析装置を用いて大腸菌の回収率を求めた。また、対照としてカチオン性グラフト重合体と反応させる前の大腸菌を用いた。
２．結果
　血球分析装置の測定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　表１の結果から回収率は約７０％であり、良好な回収率を得た。
＜実施例２＞
分離した大腸菌の生存確認
１．方法
　カチオン性グラフト重合体を用いて血液中の大腸菌を分離し、分離した大腸菌の生存を培養にて確認した。
　試料、および試薬は以下の通りである。
　１）試料
　実施例１と同様にバイオラッド社製のＧＦＰ発現Ｋｉｔを用いて作製した大腸菌をノーマルヒト血清中に必要量添加し試料として用いた。
　２）試薬
　Ｉ　：　反応液：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０、３Ｍ　塩化マグネシウム
　ＩＩ：　分散液：５００ｍＭ　グリシン－ＨＣｌ　ｐＨ５．０
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１と同様に調製した。
　大腸菌の分離、および生存確認は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと２０％カチオン性グラフト重合体５０μＬ、および反応液１００μＬを混合し、１分間反応させた。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清を除去し、得られた沈殿凝集塊を分散液５００μＬで完全に分散し分散溶液を得た（図２）。上清、および分散溶液の５０００分の１量をＬＢ細菌培養寒天培地を用いて３７℃で１８時間培養し、生存を確認した（図３）。
　また、比較例として実施例と同様の方法で凝集沈殿塊を得た後、１．５Ｍ　ＮａＣｌ溶液５００μＬ(比較例１)と１．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　５００μＬ(比較例２)をそれぞれ添加し、凝集塊を完全に分散させた。それぞれの上清、および分散溶液を実施例と同様の方法で培養し生存を確認した。
２．結果
　培養結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　表２の結果より、本発明方法を用いることにより細菌を溶菌することなく生存した状態で回収可能といえる。
＜実施例３＞
質量分析器での測定
１．方法
　カチオン性グラフト重合体を用いて回収した大腸菌をＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型）質量分析器ＭＡＬＤＩ　ＢｉｏＴｙｐｅｒ（登録商標）（ブルカー・ダルトニクス）を用いて細菌同定を行った。
　試料、および試薬は以下の通りである。
　１）試料
　大腸菌はバイオラッド社製のＧＦＰ発現Ｋｉｔを用いて作製した。
　作製した大腸菌を生理食塩水中に必要量添加したものを試料として用いた。
　２）試薬
　Ｉ　　：反応液：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０、３Ｍ　塩化マグネシウム
　ＩＩ　：分散液：７０％　ギ酸
　ＩＩＩ：凝集液：１００％　アセトニトリル
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１と同様に調製した。
　４）質量分析器
　マトリクスはブルカー・ダルトニクス社のｍａｔｒｉｘ　ＨＣＣＡ　ｐｏｒｔｉｏｎｅｄを用いた。
　測定はＭＡＬＤＩ　ＢｉｏＴｙｐｅｒ（登録商標）のプロトコルに従い行った。細菌同定の判定はＢｉｏＴｙｐｅｒ（登録商標）に指定するスコアにより評価した。
　大腸菌の分離、および質量分析器の測定は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと２０％カチオン性グラフト重合体５０μＬ、および反応液１００μＬを混合し、１分間反応させた。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た（図１）。上清を除去し、得られた沈殿凝集塊を分散・抽出液５０μＬで完全に分散させ、菌体中のタンパク質を抽出した。その後、凝集液２００μＬを添加し、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、カチオン性グラフト重合体を沈殿させた。上清を回収し、質量分析器の測定用試料とした。
２．結果
　質量分析器の測定結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　表３の結果から同定スコアが１．７以上であり、良好な同定精度を得た。この結果から、大腸菌中のタンパク質の抽出、および質量分析器での測定が可能といえる。
＜実施例４及び５＞
血清中の核酸の分離、および回収率の確認
１．方法
　カチオン性グラフト重合体を用いて血清中に添加した核酸を分離し、得られた核酸はアガロース電気泳動を行い、ＳＹＢＲ　Ｓａｆｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、ＬＡＳ４０００（ＧＥ）により検出した。回収率はスポットの蛍光強度から求めた。
　試料、および試薬は以下の通りである。
　１）試料
　核酸はプラスミドとゲノムを対象とした。プラスミドは大腸菌から抽出し（実施例４）、ゲノムはＨｅｌａ細胞から抽出した（実施例５）。抽出したプラスミド溶液はＬＢ細菌培養寒天培地を用い培養し、コロニーが形成されなかったことから大腸菌の混入がないことを確認した。また、抽出したゲノム溶液は蛍光顕微鏡にて、細胞が混入していないことを確認した。
　抽出したＤＮＡをノーマルヒト血清中に必要量添加し試料とした。また、対照としてＤＮＡ未添加のノーマルヒト血清を用いた。
　２）試薬
　Ｉ　：　反応液：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０、３Ｍ　塩化マグネシウム
　ＩＩ：　分散液：５００ｍＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａ　ｐＨ８．０
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１と同様に調製した。
　４）電気泳動
　１．０％アガロースゲルを用いた。
　電気泳動用のサンプル調整は６×Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。
　核酸の分離、および検出方法は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと２０％カチオン性グラフト重合体５０μＬ、および反応液１００μＬを混合し、１分間反応させた。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清、および分散溶液にｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅの核酸抽出用試薬フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）５００μＬ添加し、フェノール相、および水相に分離した。水相中のＤＮＡを３００μＬ回収し、エタノールを６００μＬおよび酢酸ナトリウム水溶液３０μＬを混合し、エタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。沈殿物は蒸留水１００μＬで懸濁し、Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅと混合し電気泳動用の試料とした。１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ない、ＳＹＢＲ　Ｓａｆｅにより染色した後、ＬＡＳ４０００にて蛍光検出した（図４）。
２．結果
　ＤＮＡ回収量を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　表４の結果からプラスミドＤＮＡの回収率は６０％、ゲノムＤＮＡ回収率は４０％であった。
　＜実施例６＞
　血清中の細胞の分離、回収率、および立体構造・表面構造の確認
１．方法
　カチオン性グラフト重合体を用いて血清中に添加した細胞を分離した。細胞の回収率は血球分析装置(シスメックス)を用いて確認した。さらに細胞表面の抗原抗体反応を蛍光顕微鏡（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて確認した。
　試料、および試薬は以下の通りである。
　１）試料
　細胞はＨｅｌａ細胞を用い、ノーマルヒト血清中に必要量（１～２×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ）添加したものを試料として用いた。
　２）試薬
　Ｉ　：　反応液：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０、３Ｍ　塩化マグネシウム
　ＩＩ：　分散液：５００ｍＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａ　ｐＨ８．０
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１と同様に調製した。
　４）血球分析装置
　細胞はＷＢＣとして測定される。
　測定は実施例１同様に血球分析装置のプロトコルに従い行った。
　５）抗体
　一次抗体は抗ヒトＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）、モノクローナル抗体（Ｎ１２３８）（ＭＯＮＯＳＡＭ）を５０倍希釈し用いた。
　二次抗体はＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４（ライフテクノロジー）を５００倍希釈し用いた。
　一次抗体、および二次抗体を遮光状態で１時間転倒混和により反応させ、蛍光標識抗体を調製した。
　細胞の分離方法、および検出方法は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと２０％カチオン性グラフト重合５０μＬ、および反応液１００μＬを混合し、１分間反応させた。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清を回収し、得られた沈殿凝集塊を分散液５００μＬで完全に分散した（図５）。回収した上清、および得られた分散溶液は血球分析装置を用いて回収率を測定した。対照としてカチオン性グラフト重合体と反応させていない細胞を用いた。
　次いで、分散溶液を蛍光標識抗体と混合し、遮光状態で１時間転倒混和により反応させ、蛍光顕微鏡にて抗原抗体反応を確認した（図６）。
２．結果
　血球分析装置でのＷＢＣ測定値を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　表５の結果から細胞の回収率は９８％であり、良好な回収率を得た。
血球分析装置は核を持つ物質をＷＢＣとして測定することから、本発明方法を用いることで、細胞は立体構造を維持した状態で回収可能といえる。
　また、Ｈｅｌａ細胞とＭＣＡＭ抗体の抗原抗体反応を蛍光顕微鏡により確認した。この結果から、細胞の表面構造を維持した状態で回収可能といえる。
＜実施例７＞
　血清中のベシクルの分離、回収率、および立体構造・表面構造の確認
１．方法
　カチオン性グラフト重合体を用いて血清中に添加したベシクルを分離した。ベシクルの回収率は血球分析装置を用いて確認した。また、分離したベシクルの立体構造、および表面構造を維持しているかは蛍光顕微鏡（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて確認した。
　試料、および試薬は以下の通りである。
　１）試料
　ベシクルはＨｅｌａ細胞をソニケータで破砕し作製した。
　ベシクルを蛍光顕微鏡で観察するために、細胞破砕はＤｙＬｉｇｈｔ　４８８　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ(Ｔｈｅｒｍｏ)付属の蛍光色素（ＤｙＬｉｇｈｔ，Ｅｘ／Ｅｍ：４９３／５１８）水溶液中で行ないベシクル内部に蛍光色素を取り込ませた。
　作製したベシクルをノーマルヒト血清中に必要量添加し試料として用いた。
　２）試薬
　Ｉ　：　反応液：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０、３Ｍ　塩化マグネシウム
　ＩＩ：　分散液：５００ｍＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａ　ｐＨ８．０
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１と同様に調製した。
　４）血球分析装置
　ベシクルはＷＢＣとして測定される。
　測定は実施例１と同様に血球分析装置のプロトコルに従い行った。
　５）抗体
　一次抗体は抗ヒトＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）、モノクローナル抗体（Ｎ１２３８）（ＭＯＮＯＳＡＭ）を５０倍希釈し用いた。
　二次抗体はＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４（ライフテクノロジー）を５００倍希釈し用いた。
　一次抗体、および二次抗体を遮光状態で１時間転倒混和により反応させ、蛍光標識抗体を調製した。
　ベシクルの分離方法、および検出方法は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと１０％カチオン性グラフト重合体１００μＬ、および反応液５０μＬを混合し、１分間反応させた。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清を回収し、得られた沈殿凝集塊を分散液５００μＬで完全に分散し、分散溶液を得た（図７）。回収した上清、および得られた分散溶液は血球分析装置を用いて回収率を測定した。対照としてカチオン性グラフト重合体と反応させていないベシクルを用いた。
　次いで、分散溶液を蛍光標識抗体と混合し、遮光状態で１時間転倒混和により反応させ、蛍光顕微鏡にて抗原抗体反応を確認した（図８）。
２.　結果
　血球分析装置でのベシクル測定値を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　表６の結果からベシクルの回収率は８２％であり、良好な回収率を得た。
　また、分散溶液中のベシクルが蛍光色素を取り込んだままの状態であり、そのベシクルの淵に蛍光標識抗体が取り囲んでいる様子を蛍光顕微鏡で確認した。この結果から、ベシクルの立体構造、および表面構造を維持した状態で回収可能といえる。
＜参考例１＞
　ウィルス粒子の分離、回収確認
１．方法
　タンパク質の殻とその内部に入っている核酸からなるウィルスのモデルとして、バクテリオファージを用いる。一定力価（ｔｉｔｅｒ）のファージ溶液を調整し、本発明の方法でバクテリオファージを回収し、回収後力価を大腸菌を溶菌させたプラークをカウントすることにより計算する。
　１）試料
　バクテリオファージ
　宿主大腸菌
　２）試薬
　Ｉ　：　反応液：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０、３Ｍ　塩化マグネシウム
　ＩＩ：　分散液：５００ｍＭ　グリシン－ＨＣｌ　ｐＨ５．０
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１と同様に調製した。
　バクテリオファージの分離方法、および検出方法は以下のようにして行った。
　バクテリオファージ試料５００μＬと１０％カチオン性グラフト重合体１００μＬ、および反応液５０μＬを混合し、１分間反応させた。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清を回収し、得られた沈殿凝集塊を分散液５００μＬで完全に分散し、分散溶液を得た。得られた溶液を段階希釈し、希釈した溶液を宿主大腸菌培養液と混合し、軟寒天に加えて、寒天プレート上で一晩培養し、そのプラーク数から回収できたファージの力価を計算する。
＜実施例８＞
界面活性剤入り溶液にて回収した細菌の生存確認
１．方法
　採血管の分離剤上に沈殿した大腸菌を非イオン性界面活性剤入り溶液を用いて、生存した状態で大腸菌を回収させる。
　試料、および試薬は以下の通りである。
　１）試料
　大腸菌はバイオラッド社製のＧＦＰ発現Ｋｉｔを用いて作製した。
生　理食塩水中に作製した大腸菌２×１０８ｃｅｌｌ／ｍＬを添加したものを試料として用いた。
　２）試薬
　Ｉ　　：１％　界面活性剤溶液
　界面活性剤は実験１～６として、スクロースラウレート（同仁化学）、サポニン（シグマ・アルドリッチ）、ＢＰＳＨ（ＮＩＫＫＯＬ）、ノイゲンＴＤＳ－７０（第一工業製薬）、ＴｒｉｔｏｎＸ－７０５（シグマ・アルドリッチ）、またはＣＨＡＰＳ（同仁化学）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　ＩＩ　：反応液：１Ｍ　グリシン　ｐＨ１１．０、３Ｍ　塩化マグネシウム
　ＩＩＩ：分散液：５００ｍＭ　グリシン　ｐＨ５．０
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１と同様に調製した。
　菌体の回収と生存確認は以下のようにして行った。
　生理食塩水中に大腸菌を分散させた菌液３ｍＬを採血管に加え、遠心３０００ｒｐｍ、５分間遠心を行った後、上清を除去する。つぎに１％界面活性剤溶液０．５ｍLを採血管に添加し、分離剤表面に沈殿した菌体を分散させる。
　菌体分散液は２０℃で３０分間、および３時間静置後、１０％カチオン性グラフト重合体１００μＬ、および反応液１００μＬを混合し、１分間反応させた。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清を除去し、得られた沈殿凝集塊を分散液５００μＬで完全に分散し分散溶液を得た。分散溶液の１００分の１量をＬＢ細菌培養寒天培地を用いて３７℃で１８時間培養し、コロニー数にて生菌数を確認した。
対照として、界面活性剤溶液の代わりに生理食塩水を用いた（対照１）。
２．結果
培養後の試料におけるコロニー数を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　実験１～５で用いた非イオン性界面活性剤、特にスクロースラウレートを用いた際に細菌を生きたまま回収することが可能である。
＜実施例９＞
界面活性剤入り溶液を用いて回収した大腸菌の質量分析器での測定
１．方法
　採血管の分離剤上に沈殿した大腸菌を界面活性剤入り溶液用いて回収し、カチオン性ポリマーと反応後、７０％アセトニトリルにより反応物を洗浄することにより血液成分の影響を抑え、かつ質量分析器での測定が可能な試料を調製した。
　試料、および試薬は以下の通りである。
　１）試料
　大腸菌はバイオラッド社製のＧＦＰ発現Ｋｉｔを用いて作製した。
　全血と作製した大腸菌を細菌培養用の培養ボトル（ＢＤ社）に２×１０８ｃｅｌｌ／ｍＬ添加したものを試料として用いた。
　２）試薬
　Ｉ　　：回収液：０．１％　界面活性剤
　ＩＩ　：反応液１：１Ｍ　グリシン　ｐＨ１１．０
　ＩＩＩ：反応液２：３Ｍ　塩化マグネシウム
　ＩＶ　：洗浄液：７０％　アセトニトリル
　Ｖ　　：抽出液：７０％　ギ酸
　ＶＩ　：分離液：１００％　アセトニトリル
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１と同様に調製した。
　４）電気泳動
　Ｅ－Ｒ１５５ｅ－パジェル　１５％ゲル（ＡＴＴＯ）を用いた。
　ゲル染色は２Ｄ－銀染色試薬II(コスモ・バイオ)を用いた。
　５）質量分析
　Ａｕｔｏ　ＦｌｅｘII（Ｂｒｕｋｅｒ）のｆｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ　２．０を用い取扱い説明書に従って測定をおこなった。
　マススペクトル解析は、ｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓを用いた。
　血液成分除去の確認は以下のようにして行った。
　採血し、得られた血液１０ｍＬを培養ボトルに加え、そこから３ｍＬを採血管に移す。採血管は３０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、血球成分と菌体を分離する。採血管中の分離剤表面に吸着した大腸菌は回収液５００μＬを添加し、１．５ｍＬチューブに回収した。ここで回収液に含まれる界面活性剤として実験７～１２ではスクロースラウレート、ノイゲンＸＬ６０、サポニン、ＢＰＳＨ、ＴｒｉｔｏｎＸ－７０５、ＣＨＡＰＳを用いた。
　また対照２として、回収液に加える界面活性剤の代わりに蒸留水を用いて回収を検討した。回収溶液の入ったチューブに１０％カチオン性グラフト重合体１００μＬ、反応液１、および反応液２をそれぞれ１００μＬ混合し、１分間反応させた。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、凝集沈殿塊を得た。上清を除去し、得られた凝集沈殿塊を洗浄液５００μＬで完全に分散し、卓上遠心機にて３０秒間遠心し、凝集沈殿塊を得た。上清は１．５チューブに回収し、試料１とした。凝集沈殿塊は抽出液５０μＬに完全に分散後、凝集沈殿液１５０μＬを加え、卓上遠心機にて３０秒間遠心した。その上清を新しい１．５チューブに移し、試料２とした。
これらはＡｕｔｏ　ＦｌｅｘIIにてマススペクトルを測定した。
また、夾雑物の影響を確認するため電気泳動による確認を実施した。測定に用いた試料は対照２、および実験７～１２のそれぞれから得られる試料１および２を１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、その上清を回収し、さらにその上清は濃縮するために凍結乾燥を一晩行った。乾燥させた試料をＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　５０μＬで溶解し、電気泳動用の試料とした。Ｅ－Ｒ１５５ｅ－パジェル　１５％ゲルを用いて、電気泳動を行った。
２．結果
　電気泳動結果を図９に示す。
　試料１は分子量１００００、および３００００付近にメジャーバンドが確認された。この結果から、洗浄液により、カチオン性ポリマーに吸着した血液成分を除去可能であることが分かった。また、試料２は対照２に対して、３００００以下のバンド数が多い。この結果から、洗浄液により血液成分が除去されたことで、菌体由来のタンパク質バンドが検出された。
　Ａｕｔo　ＦｌｅｘIIにて得られたマススペクトルを図１０に示す。
　用いた界面活性剤により質量分析器でのイオン化を阻害しないかどうかを判定するために、得られたマススペクトルからデータ処理用ソフトウェアｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓのＦｉｎｄ　Ｍａｓｓ　Ｌｉｓｔ機能によりマスピーク数をカウントした。その結果を表９に示す。カウント条件は、表１０に示す。
　また、血液成分の影響回避効果を確認するために、菌体由来のマスピークに対する血液成分由来のマスピークのピーク強度の比率を求めた。菌体由来のマスピークはコロニーをサンプルとした場合に検出されたマスピークから６２５０、９７４０ｍ／ｚを選んだ。血液成分由来のマスピークはヘモグロビンのマスピークである１５１３０ｍ／ｚを選んだ。その結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　表９より、対照２に比べ実験７，８においてはカウントされたマスピーク数が増大していることから、イオン化が促進され、一方、実験９～１１においてはカウントされたマスピーク数が減少していることから、イオン化が阻害されている可能性が高い。
　表１１より、実験７、８は菌体由来と血液由来のマスピーク比率が１．０以上であり、菌体由来ピークが血液由来ピークよりも高い強度で検出されている。それに対して、実験９～１２は菌体由来と血液由来のマスピーク比率が１．０以下であり血液由来ピークが菌体由来ピークよりも高い強度で検出されており、血液成分の影響回避効果が低かった。
　この結果から、実験７、８の方法は、血液成分の影響を抑え、かつ質量分析器での測定が可能である。
＜実施例１０＞
ウィルス粒子の分離、回収確認（参考例１の追試）
１．方法
　１）試料
　ＮＢＲＣ(独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター)より購入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｐｈａｇｅ　Ｔ７　(コード：２０００７)を用い、ＮＢＲＣ指定プロトコルおよび一般的な実験手順、例えば「無敵のバイオテクニカルシリーズ・遺伝子工学実験ノート(上)・２．バクテリオファージの項（羊土社）」に従ってバクテリオファージを調製した。
　復水液（１０％　ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ、２％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１％　ＭｇＳＯ４）２００μＬで乾燥菌体を懸濁させた後、大腸菌１０５ｃｅｌｌ程度を含んだ０．６％寒天培地（１０％　ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ、５％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、２．５％　ＮａＣｌ、１％　寒天）上に重層した。この培地プレートを３７℃、一晩培養し、コロニーのできていない部分の寒天を削り取り（数ｃｍ２　程度）、１．５ｍＬチューブに移した。１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ７．５）　１ｍＬを入れ、９０分間２０℃にて振盪した後、３０００ｒｐｍ、１５分間遠心し上清を回収し、バクテリオファージサンプルとした(冷蔵保存)。
　２）試薬
　Ｉ　　：反応液１：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０
　ＩＩ　：反応液２：３Ｍ　塩化マグネシウム溶液
　ＩＩＩ：分散液：１Ｍ　グリシン－ＨＣｌ　ｐＨ５．０
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１と同様に調製した。
　バクテリオファージの分離、および力価確認は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと２０％カチオン性グラフト重合体１００μＬ、反応液１：１００μＬ、および反応液２：１００μＬを混合した。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清を除去し、得られた沈殿凝集塊を分散液１００μＬで完全に分散し分散溶液を得た。分散溶液を大腸菌１０５ｃｅｌｌ程度を含む寒天培地と混合し、３７℃、１８時間培養し、大腸菌の溶菌を確認した(図１１)。
　また、ポジティブコントロールとしてカチオン性グラフト重合体と反応させる前のバクテリオファージ試料を大腸菌に感染させた。
２．結果
　グラフト重合体により、バクテリオファージが分離できることがわかった。
＜実施例１０＞
分離した大腸菌の生存確認
１．方法
　１）試料
　実施例１と同様にバイオラッド社製のＧＦＰ発現Ｋｉｔを用いて作製した大腸菌をノーマルヒト血清中に必要量添加し試料として用いた。大腸菌１０８ｃｅｌｌ程度。
　２）試薬
　Ｉ：　　反応液１：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０
　ＩＩ：　反応液２：３Ｍ　塩化マグネシウム溶液
　ＩＩＩ：分散液：１Ｍ　グリシン－ＨＣｌ　ｐＨ５．０
　３）カチオン性グラフト重合体
　上記（５）エポキシオクタン変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体（ＰＡＡＥｐｏ－ｇ－ＤＡＤＭＡＣ）、および上記（８）グリシジルブチレート変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体（ＰＡＡＧＢ－ｇ－ＤＡＤＭＡＣ）を用いた。
　具体的には、２０質量％のポリアリルアミンに１３質量％となるように水を加え、氷水で冷却及び撹拌しながらエポキシオクタン（アミンに対し０．１当量）を滴下した。滴下終了後４０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、エポキシオクタン変性ポリアリルアミンを水溶液として得た。調製した３０質量％のエポキシオクタン変性ポリアリルアミンに、１９質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させた。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）を分割してさらに追加し、エポキシオクタン変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た。
　あるいは、２０質量％のポリアリルアミンに１３質量％となるように水を加え、氷水で冷却及び撹拌しながらグリシジルブチレート（アミンに対し０．１当量）を滴下した。滴下終了後４０℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、グリシジルブチレート変性ポリアリルアミンを水溶液として得た。調製した３０質量％のグリシジルブチレート変性ポリアリルアミンに、１９質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させた。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液１４．４２ｇ（モノマーに対して１０モル％）を分割してさらに追加し、グリシジルブチレート変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た。
　上記グラフト重合体を終濃度８％、公知方法にて製造されるラテックスビーズ、例えばポリスチレンラテックスＬＥ（平均粒径：１２０ｎｍ、ニットーボーメディカル社製）を終濃度５％となるように両者を混合させ、グラフト重合体溶液とした。
　さらに実施例１で用いた上記プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンとのグラフト重合体(ＰＡＡ－ｇ－ＰＳｔ)もポジティブコントロールとして用いた。
　大腸菌の分離、および生存確認は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと上記グラフト重合体溶液１００μＬ、反応液１：１００μＬ、および反応液２：２００μＬを混合した。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清は別の遠心チューブに移し、さらに１５０００ｒｐｍ、５分間遠心し、得られた沈殿物を分散液５００μＬに分散させた。
　上清を除去することにより得られた沈殿凝集塊は、分散液５００μＬで完全に分散し分散溶液を得た。
　上清由来、および沈殿凝集塊由来の分散溶液１００μＬを別々のＬＢ液体培地５ｍＬに加え、３７℃、１８時間培養し、大腸菌の生存を確認するために培養前後の培養液試料の吸光度を分光光度計により測定し、その変化量を大腸菌量とした。
　また、上記の上清由来、および沈殿凝集塊由来の分散溶液５０μＬをＬＢ細菌培養寒天培地上に塗布し、３７℃、１８時間培養し、コロニーの形成によって大腸菌の生存を確認した（図１２）。
　また、ネガティブコントロールとして、ポリスチレンラテックスＬＥを含み上記グラフト重合体を含まない場合についても検討した。
２．結果
　以下の表１２にあるように、粒子を形成しないグラフト重合体でも標的物を分離濃縮できることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
＜実施例１１＞
分離した大腸菌の生存確認
１．方法
　１）試料
　実施例１と同様にバイオラッド社製のＧＦＰ発現Ｋｉｔを用いて作製した大腸菌をノーマルヒト血清中に必要量添加し試料として用いた。大腸菌１０８ｃｅｌｌ程度
　２）試薬
　Ｉ　　：反応液１：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０
　ＩＩ　：反応液２：３Ｍ　塩化マグネシウム溶液
　ＩＩＩ：分散液：１Ｍ　グリシン－ＨＣｌ　ｐＨ５．０
　３）カチオン性グラフト重合体
上記（５）エポキシオクタン変性ポリアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体（ＰＡＡＥｐｏ－ｇ－ＤＡＤＭＡＣ）を用いた。
　大腸菌の分離、および生存確認は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと上記グラフト重合体溶液１００μＬ、反応液１：１００μＬ、および反応液２：２００μＬを混合した。試料と上記グラフト重合体を混合させた後、公知方法にて製造されるラテックスビーズ、例えばポリスチレンラテックスＬＥ（平均粒径：１２０ｎｍ、ニットーボーメディカル社製）２０μＬを添加しよく混合させてから、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清は別の遠心チューブに移し、さらに１５０００ｒｐｍ、５分間遠心し、得られた沈殿物を分散液５００μＬに分散させた。
　上清を除去することにより得られた沈殿凝集塊は、分散液５００μＬで完全に分散し分散溶液を得た。
　上記の上清由来、および沈殿凝集塊由来の分散溶液５０μＬをＬＢ細菌培養寒天培地上に塗布し、３７℃、１８時間培養し、コロニーの形成によって大腸菌の生存を確認した。
２．結果
　グラフト重合体ははじめにラテックスビーズと混合しておいても、菌体と反応させた後にラテックスビーズを添加しても同じように菌体捕獲した（図１３）。
＜実施例１２＞
分離した大腸菌の生存確認
１．方法
　１）試料
　実施例１と同様にバイオラッド社製のＧＦＰ発現Ｋｉｔを用いて作製した大腸菌をノーマルヒト血清中に必要量添加し試料として用いた。大腸菌１０８ｃｅｌｌ程度
　２）試薬
　Ｉ　　：　反応液１：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０
　ＩＩ　：　反応液２：３Ｍ　塩化マグネシウム溶液
　ＩＩＩ：　分散液：１Ｍ　グリシン－ＨＣｌ　ｐＨ５．０
３）カチオン性グラフト重合体
　上記（１１）グリシドール変性ポリジアリルアミンとシアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体を用いた。
　具体的には　ジアリルアミンに７９質量％となるように水を加え、氷水で冷却及び撹拌しながらグリシドール（アミンに対し１当量）を滴下した。滴下終了後４５℃にて２４時間反応させた後、溶液を濃縮し、グリシドール変性ジアリルアミンを水溶液として得た。
　７８質量％のグリシドール変性ジアリルアミンに３５質量％の塩酸（アミンに対し１当量）を加えた。その後、５０質量％となるように水を加え、６０℃に加温し、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）２塩酸塩（モノマーに対し６モル％）を分割して加え、２４時間重合させた。得られた溶液を電気透析によって精製し、グリシドール変性ポリジアリルアミンを水溶液として得た。調製した４３質量％のグリシドール変性ポリジアリルアミンに３０質量％となるように水を加え、２０℃で撹拌した。次に６５質量％のジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アミンに対し３当量）と２８．５質量％のＡＰＳ水溶液３６．０４ｇ（モノマーに対して１０モル％）をそれぞれ分割して加え２４時間重合させた。その後、２８．５質量％のＡＰＳ水溶液３６．０４ｇ（モノマーに対して１０モル％）を分割してさらに追加し、５０℃で２４時間重合させ、グリシドール変性ポリジアリルアミンとジアリルジメチルアンモニウムクロライドのグラフト重合体を水溶液として得た。
　上記グラフト重合体を終濃度８％、公知方法にて製造されるラテックスビーズ、例えばポリスチレンラテックスＬＥ（平均粒径：１２０ｎｍ、ニットーボーメディカル社製）を終濃度５％となるように両者を混合させ、グラフト重合体溶液とした。
　さらに実施例１で用いた上記（３）プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンとのグラフト重合体(ＰＡＡ－ｇ－ＰＳｔ)もポジティブコントロールとして用いた。
　大腸菌の分離、および生存確認は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと上記グラフト重合体溶液１００μＬ、反応液１：１００μＬ、および反応液２：２００μＬを混合した。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清は別の遠心チューブに移し、さらに１５０００ｒｐｍ、５分間遠心し、得られた沈殿物を分散液５００μＬに分散させた。
　上清を除去することにより得られた沈殿凝集塊は、分散液５００μＬで完全に分散し分散溶液を得た。
　上清由来、および沈殿凝集塊由来の分散溶液１００μＬを別々のＬＢ液体培地５ｍＬに加え、３７℃、１８時間培養し、大腸菌の生存を確認するために培養前後の培養液試料の吸光度を分光光度計により測定し、その変化量を大腸菌量とした。
　また、上記の上清由来、および沈殿凝集塊由来の分散溶液５０μＬをＬＢ細菌培養寒天培地上に塗布し、３７℃、１８時間培養し、コロニーの形成によって大腸菌の生存を確認した（図１４）。
　また、対照として、ポリスチレンラテックスＬＥを含み上記グラフト重合体を含まない場合についても検討した。
２．結果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
＜実施例１３＞
質量分析器での測定
１．方法
　１）試料
　実施例１と同様にバイオラッド社製のＧＦＰ発現Ｋｉｔを用いて作製した大腸菌をノーマルヒト血清中に必要量添加し試料として用いた。大腸菌１０８ｃｅｌｌ程度
　２）試薬
　Ｉ　　：　反応液１：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０
　ＩＩ　：　反応液２：３Ｍ　塩化マグネシウム溶液
　ＩＩＩ：　分散液：７０％ギ酸
　ＩＶ　：　凝集液：１００％アセトニトリル
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１２で用いた上記（１１）グリシドール変性ポリジアリルアミンとシアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体を用いた。
　上記グラフト重合体を終濃度８％、公知方法にて製造されるラテックスビーズ、例えばポリスチレンラテックスＬＥ（平均粒径：１２０ｎｍ、ニットーボーメディカル社製）を終濃度５％となるように両者を混合させ、グラフト重合体溶液とした。
　さらに実施例１で用いた上記（３）プロピレンオキシド変性ポリアリルアミンとスチレンとのグラフト重合体(ＰＡＡ－ｇ－ＰＳｔ)もポジティブコントロールとして用いた。
　大腸菌の分離、および質量分析器による測定は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと上記グラフト重合体溶液５０μＬ、反応液１：１００μＬ、および反応液２：２００μＬを混合した。その後、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。
　上清を除去し、得られた沈殿凝集塊を分散液３０μＬで完全に分散させた。続いて、凝集液１００μＬを混合した後、卓上小型遠心機にて６０秒間遠心した。得られた上清を質量分析器の測定試料とした。質量分析器の取り扱いについては、実施例３と同様に行った。
　また、対照として、ポリスチレンラテックスＬＥを含み上記グラフト重合体を含まない場合についても検討した。
２．結果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　また、グリシドール変性ポリジアリルアミンとシアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体とラテックスビーズの混合液を用いる場合には、反応液２（マグネシウムイオン）を添加せずとも大腸菌を捕捉/回収できることが質量分析器による測定から判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
＜実施例１４＞
分離した大腸菌の生存確認
１．方法
　１）試料
　実施例１と同様にバイオラッド社製のＧＦＰ発現Ｋｉｔを用いて作製した大腸菌をノーマルヒト血清中に必要量添加し試料として用いた。大腸菌１０８ｃｅｌｌ程度
　２）試薬
　Ｉ　　：　反応液１：１Ｍ　グリシン－ＮａＯＨ　ｐＨ１１．０
　ＩＩ　：　反応液２：３Ｍ　塩化マグネシウム溶液
　ＩＩＩ：　分散液：１Ｍ　グリシン－ＨＣｌ　ｐＨ５．０
　３）カチオン性グラフト重合体
　実施例１２で用いた上記（１１）グリシドール変性ポリジアリルアミンとシアリルジメチルアンモニウムクロライドとのグラフト重合体を用いた。
　大腸菌の分離、および生存確認は以下のようにして行った。
　試料５００μＬと上記グラフト重合体溶液１００μＬ、反応液１：１００μＬ、および反応液２：２００μＬを混合した。試料と上記グラフト重合体を混合させた後、公知方法にて製造されるラテックスビーズ、例えばポリスチレンラテックスＬＥ（平均粒径：１２０ｎｍ、ニットーボーメディカル社製）２０μＬを添加しよく混合させてから、卓上小型遠心機にて３０秒間遠心し、沈殿凝集塊を得た。上清は別の遠心チューブに移し、さらに１５０００ｒｐｍ、５分間遠心し、得られた沈殿物を分散液５００μＬに分散させた。
　上清を除去することにより得られた沈殿凝集塊は、分散液５００μＬで完全に分散し分散溶液を得た。
　上記の上清由来、および沈殿凝集塊由来の分散溶液５０μＬをＬＢ細菌培養寒天培地上に塗布し、３７℃、１８時間培養し、コロニーの形成によって大腸菌の生存を確認した。
２．結果
　グラフト重合体ははじめにラテックスビーズと混合しておいても、菌体と反応させた後にラテックスビーズを添加しても同じように菌体捕獲した（図１５）。
　本発明方法及びそのためのキットは従来のイオン交換ポリマーを用いた方法より、対象物を効率よく分離精製することが可能であり、試料中の対象物の存在量が極めてすくなくとも、検出することを可能にする。
 

Claims (11)

  1. 　カチオン性グラフト重合体を用いた、標的物を分離濃縮する方法であって；
    　　（１）塩基性条件下でカチオン性グラフト重合体と標的物を含む試料と接触させ、標的物をカチオン性グラフト重合体に結合させるステップ；
    　　（２）カチオン性グラフト重合体と標的生体分子との結合体を分離するステップ；及び
    　　（３）前記結合体から標的物を溶出するステップ；を
    含む方法
    ［ここで前記カチオン性グラフト重合体は、少なくとも１のアミノ基を有する高分子化合物（ａ）と、少なくとも１のエポキシ基を有する化合物（ｂ）とを反応して得られるポリアミン誘導体と、エチレン性不飽和単量体（ｃ）とを重合して得られる、ポリアミングラフト重合体である］。
  2. 　ステップ（１）において、さらに二価又は三価の金属イオンを添加することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　ステップ（２）において、結合体を洗浄する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記カチオン性グラフト重合体が固相面に固定されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　ステップ（３）において、標的物と結合していないカチオン性グラフト重合体を凝集させるステップを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の方法のために用いられるキットであって、カチオン性グラフト重合体を含むキット。
  7. 　さらに、二価又は三価の金属イオン塩を含む請求項６に記載のキット。
  8. 　さらに、塩基性溶液と二価又は三価の金属イオン塩を含む反応液を含む請求項６に記載のキット。
  9. 　さらに、洗浄液を含む請求項６～８のいずれか一項に記載のキット。
  10. 　さらに、酸性溶液又はキレート剤を含む分散液を含む請求項６～９のいずれか一項に記載のキット。
  11. 　さらに、凝集液を含む請求項６～１０のいずれか一項に記載のキット。
     
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