KR102354533B1 - 신규 양이온성 그래프트 중합체를 사용하는 표적 물질의 분리 및 농축 방법 - Google Patents

신규 양이온성 그래프트 중합체를 사용하는 표적 물질의 분리 및 농축 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은, 현존하는 양이온성 중합체의 대안물로서 표적 물질을 분리하고 농축하는 방법 및 이러한 방법을 실행하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

Description

신규 양이온성 그래프트 중합체를 사용하는 표적 물질의 분리 및 농축 방법 {METHOD FOR SEPARATING AND CONCENTRATING TARGET SUBSTANCE USING NOVEL CATIONIC GRAFT POLYMER}
본 출원은 2014 년 3 월 24 일에 출원한 일본 특허 출원 제 2014-60419 호 및 제 2014-60420 호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 일본 출원의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본원 및 상기 2 개 일본 출원에서 인용하는 모든 문헌에 있어서의 기재가 본원에 포함된다.
본 발명은 도입 비용이 적고 간편한 조작으로 안전하며 안정하게 제조할 수 있는 그래프트 중합체를 사용하는 표적 생체분자 분리 및 농축 방법 및 상기 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.
이온 교환 중합체는 합성 수지의 일종이며, 이의 분자 구조의 일부에 이온기로서 이온화를 위한 구조를 갖는다. 이온 교환 중합체는 물과 같은 용매 중의 이온과 이온 교환을 수행한다. 이의 거동은 이온에 대한 선택성에 따른다. 이온 교환 중합체는 양이온 교환 중합체와 음이온 교환 중합체로 크게 분류된다. 중합체 중의 고정 이온과 각종 용액 중의 반대 이온 (교환되는 이온) 사이의 흡착 차이를 이용함으로써, 용액에 함유된 이온을 분리할 수 있다.
생체분자의 전하 특성은 전체 분자의 전하, 전하 밀도, 표면 전하의 분포 방법 및 용액의 pH 와 같은 다양한 인자에 의해 결정된다. 예를 들어, 단백질은 약산성 및 약염기성과 같은 많은 종류의 이온성 아미노산을 함유하며, 단백질 분자에 양전하와 음전하 모두를 갖는다. 이 전하의 총합을 유효 표면 전하라고 지칭하며, 아미노산의 하전 상태는 pH 에 의존적이다. 따라서, 단백질 분자의 유효 표면 전하는 용액의 pH 에 따라 양전하 또는 음전하로 변화한다.
이온 교환 크로마토그래피는, 이와 같은 생체분자의 하전 상태 (즉, 유효 표면 전하) 의 pH 또는 염 농도에 의한 변화를 이용하여, 반대 전하를 갖는 담체와 생체분자의 가역적 결합 및 용출을 기반으로 생체분자를 회수하는 방법이다 (예를 들어 특허 문헌 1 및 2, 및 비특허 문헌 1).
그러나 이러한 회수 조작을 수행하는 경우, 용출 동안 계면활성제, 고농도 염 등을 사용한다. 따라서, 표적의 3-차원 구조를 유지하거나 표적을 수집하면서 표적이 살아 있게 하는 것이 어렵다.
JP 1996-173194 A JP 2002-125695 A
Microbiology 152 (2006), 3575-3583
본 발명의 목적은 기존의 양이온성 중합체 대신 신규한 양이온성 그래프트 중합체를 사용하여 표적 물질을 분리 및 농축하는 방법, 및 이를 위한 키트를 제공하는 것이다.
즉, 본 발명은 하기 [1]~[11] 에 의해 구성된다.
[1] 하기 단계를 포함하는, 양이온성 그래프트 중합체를 사용하여 표적 물질을 분리 및 농축하는 방법으로서:
(1) 염기성 조건 하에 양이온성 그래프트 중합체와 표적 물질 함유 샘플을 접촉시켜, 표적 물질을 양이온성 그래프트 중합체에 결합시키는 단계;
(2) 양이온성 그래프트 중합체 및 표적 생체분자의 결합 복합체를 분리하는 단계; 및
(3) 상기 결합 복합체로부터 표적 물질을 용출하는 단계,
여기서 양이온성 그래프트 중합체가 하나 이상의 아미노기를 갖는 중합체 화합물 (a) 와 하나 이상의 에폭시기를 갖는 화합물 (b) 사이의 반응에 의해 수득한 폴리아민 유도체 및 에틸렌성 불포화 단량체 (c) 를 중합하여 수득되는 폴리아민 그래프트 중합체인, 양이온성 그래프트 중합체를 사용하여 표적 물질을 분리 및 농축하는 방법.
[2] 상기 [1] 에 있어서, 단계 (1) 에서 2 가 또는 3 가 금속 이온을 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
[3] 상기 [1] 또는 [2] 에 있어서, 단계 (2) 에서 결합 복합체를 세정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
[4] 상기 [1]~[3] 중 어느 하나에 있어서, 양이온성 그래프트 중합체가 고체상 표면에 고정되는 방법.
[5] 상기 [1]~[3] 중 어느 하나에 있어서, 단계 (3) 에서 표적 물질과 결합하지 않는 양이온성 그래프트 중합체를 응집시키는 단계를 포함하는 방법.
[6] 양이온성 그래프트 중합체를 포함하는, 상기 [1]~[5] 중 어느 하나에 따른 방법에 사용되는 키트.
[7] 상기 [6] 에 있어서, 금속 이온 염을 추가로 포함하는 키트.
[8] 상기 [6] 에 있어서, 염기성 용액 및 2 가 또는 3 가 금속 이온 염을 함유하는 반응액을 추가로 포함하는 키트.
[9] 상기 [6]~[8] 중 어느 하나에 있어서, 세정액을 추가로 포함하는 키트.
[10] 상기 [6]~[9] 중 어느 하나에 있어서, 산성 용액 또는 킬레이트제를 함유하는 분산액을 추가로 포함하는 키트.
[11] 상기 [6]~[10] 중 어느 하나에 있어서, 응집액을 추가로 포함하는 키트.
본 발명의 방법은 샘플 중의 표적 물질이 효율적으로 분리 및 농축되게 하고, 표적 물질이 분리 및 농축 과정에서 공지된 방법보다 덜 손상되어, 따라서 이후 분석이 용이하다. 보다 특히, 본 발명의 방법은 질량 분광기를 사용하는 분석에 적용할 수 있다.
[도 1] 대장균 및 양이온성 그래프트 중합체의 결합 복합체의 침전 펠렛
대장균은 좌측 튜브에 부재하며, 대장균은 우측 튜브에 존재한다.
[도 2] GFP-발현 대장균 및 양이온성 그래프트 중합체의 결합 복합체의 형광 현미경 관찰
레이저 파장 (488 nm) 으로 대장균에 의해 발현된 GFP 를 검출하였다. 가시광으로 양이온성 그래프트 중합체와 대장균을 검출하였다. 레이저 파장 및 가시광으로 화상을 연속 취득하고, 유사 컬러 표시에 의해 중첩시켰다. 좌측 도는 대장균이 양이온성 그래프트 중합체에 의해 포획되는 상태를 나타낸다. 우측 도는 펠렛이 분산액에 의해 분산되는 상태를 나타낸다.
[도 3] 분리한 대장균의 생존 (생존력) 확인
양이온성 그래프트 중합체를 대장균과 반응시켰다. 원심분리 후 상청액 및 펠렛을 분산액에 분산시킨 용액을 각각 배양하였다. 우측 화상은 분산액을 나타내고, 좌측 화상은 상청액을 나타낸다.
[도 4] 분리 및 회수한 핵산을 사용하는 전기영동
레인 1 은 양이온성 그래프트 중합체로 처리하지 않은 샘플의 전기영동 화상을 나타내고, 레인 2 는 양이온성 그래프트 중합체로 처리한 샘플의 전기영동 화상을 나타낸다.
[도 5] 회수한 세포의 검출
(1) 세포와 양이온성 그래프트 중합체 사이의 반응 및 원심분리 후 상청액 (좌측) 및 펠렛 (우측).
(2) 펠렛을 분산액으로 분산시킨 상태.
(1) 및 (2) 모두에서, 레이저 파장 350 nm 로 세포의 핵을 검출하고, 가시광으로 양이온성 그래프트 중합체를 검출하였다. 레이저 파장 및 가시광으로 화상을 연속 취득하였다. 유사 컬러 표시에 의해 화상을 중첩시키고, 응집 상태 및 분산 상태를 관찰하였다.
[도 6] 회수한 세포의 형광 현미경 관찰
양이온성 그래프트 중합체에 의해 세포를 포획하고, 분산액으로 분산시켰다. 이후, 면역염색을 수행하였다. 레이저 파장 350 nm 로 세포의 핵을 검출하고, 세포 표면에 발현된 항원 (MCAM) 과 반응하는 항체를 488 nm 로 검출하였다. 2 종류의 레이저 파장으로 화상을 연속 취득하였다. 유사 컬러 표시에 의해 화상을 중첩시키고, 세포 표면 상 항원을 관찰하였다.
[도 7] 회수한 소포 (vesicle) 의 검출
(1) 소포와 양이온성 그래프트 중합체 사이의 반응 및 원심분리 후 상청액 (좌측) 및 펠렛 (우측).
(2) 펠렛을 분산액으로 분산시킨 상태.
(1) 및 (2) 모두에서, 레이저 파장 488 nm 으로 소포를 검출하고, 가시광으로 양이온성 그래프트 중합체를 검출하였다. 레이저 파장 및 가시광으로 화상을 연속 취득하였다. 유사 컬러 표시에 의해 화상을 중첩시키고, 응집 상태 및 분산 상태를 확인하였다.
[도 8] 회수한 소포의 형광 현미경 관찰
양이온성 그래프트 중합체에 의해 포획한 소포를 분산액으로 분산시킨 후, 면역염색을 수행하였다.
레이저 파장 488 nm 으로 소포를 검출하고, 레이저 파장 594 nm 로 항체를 검출하였다. 2 종류의 레이저 파장으로 화상을 연속 취득하였다. 유사 컬러 표시에 의해 화상을 중첩시키고, 소포 표면 상의 항원 상태를 확인하였다.
[도 9] 계면활성제-함유 용액을 사용하여 회수한 대장균의 검출 (전기영동)
[도 10] 계면활성제-함유 용액을 사용하여 회수한 대장균의 검출 (질량 분석)
[도 11] 박테리오파지의 분리 및 검출
[도 12] 분리한 대장균의 생존 확인
에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체 (PAAEpo-g-DADMAC), 및 글리시딜 부티레이트-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체 (PAAGB-g-DADMAC) 를 사용하여, 대장균을 분리하였다. 각각의 그래프트 중합체를 라텍스 비즈와 혼합한 후, 세균 세포와 반응시켰다.
[도 13] 분리한 대장균의 생존 확인
에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체 (PAAEpo-g-DADMAC) 를 사용하여, 대장균을 분리하였다. 그래프트 중합체를 세균 세포와 반응시킨 후, 라텍스 비즈를 이에 첨가하였다.
[도 14] 분리한 대장균의 생존 확인
글리시돌-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체 (DAAGly-g-DADMAC) 를 사용하여, 대장균을 분리하였다. 각각의 그래프트 중합체를 라텍스 비즈와 혼합한 후, 세균 세포와 반응시켰다.
[도 15] 분리한 대장균의 생존 확인
글리시돌-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체 (DAAGly-g-DADMAC) 를 사용하여, 대장균을 분리하였다. 그래프트 중합체를 세균 세포와 반응시킨 후, 라텍스 비즈를 이에 첨가하였다.
"양이온성 그래프트 중합체" 란, 하나 이상의 아미노기를 갖는 중합체 화합물 (a) 와 하나 이상의 에폭시기를 갖는 화합물 (b) 사이의 반응에 의해 수득한 폴리아민 유도체 및 에틸렌성 불포화 단량체 (c) 를 중합하여 수득된다 [하나 이상의 아미노기를 갖는 중합체 화합물 (a) 는 일반식 (1) 로 나타내는 에틸렌이민 중합체, 일반식 (2) 으로 나타내는 비닐아민 중합체, 일반식 (3) 으로 나타내는 알릴아민 중합체, 일반식 (4) 로 나타내는 디알릴아민 중합체, 및 일반식 (5) 로 나타내는 아크릴 아민 중합체로 이루어지는 군에서 선택될 수 있음 (하기 일반식에서, n 은 10 내지 200,000 의 정수이고, m 은 5 내지 3,000 의 정수이고, l 은 5 내지 5,000 의 정수이고, o 는 10 내지 10,000 의 정수이고, p 는 1 내지 100 의 정수임)].
[식 1]
Figure 112016092603999-pct00001
[식 2]
Figure 112016092603999-pct00002
[식 3]
Figure 112016092603999-pct00003
[식 4]
Figure 112016092603999-pct00004
[식 5]
Figure 112016092603999-pct00005
"하나 이상의 아미노기를 갖는 중합체 화합물 (a)" 는, 하나 이상의 아미노기를 갖기에만 필요하며, 이의 구성 단위 중에 아미노기를 갖지 않는 구성 단위를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 일반식 (1)~(5) 로 나타내는 구조를 갖는 각각의 중합체는 각각 상기 일반식 (1)~(5) 로 나타내는 구조의 구성 단위 각각에 추가로 아미노기를 갖지 않는 구성 단위를 포함할 수 있거나, 아미노기를 갖지 않는 구성 단위를 포함할 필요는 없다. 아미노기를 갖지 않는 구성 단위의 예는 이산화황, 아크릴아미드, 알릴 알코올 및 아크릴산을 포함한다. 그러나, 아미노기를 갖지 않는 구성 단위가 이에 제한되는 것은 아니다.
"하나 이상의 아미노기를 갖는 중합체 화합물 (a)" 에 있어서의 "아미노기" 는 1급 아미노기, 2급 아미노기 또는 3급 아미노기일 수 있고, 1급 아미노기 또는 2급 아미노기가 특히 바람직하다.
"하나 이상의 아미노기를 갖는 중합체 화합물 (a)" 에 있어서의 "아미노기" 의 수는 특별히 제한되지 않으나, 반응성, 유용성 등의 관점에서, 중합체 당 5 내지 15000 개인 것이 바람직하고, 8 내지 3000 개인 것이 특히 바람직하다. 중합체 화합물의 분자량 당 수에 있어서, 수는 분자량 10000 당 5 내지 230 개인 것이 바람직하고, 10 내지 130 개인 것이 특히 바람직하다.
"하나 이상의 아미노기를 갖는 중합체 화합물 (a)" 의 분자량은 특별히 제한되지 않으나, 반응성, 점도, 취급, 수율 등의 관점에서, 수 평균 분자량에 있어서 500 내지 10000000 인 것이 바람직하고, 500 내지 1000000 인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 제 1 발명에서 사용되는 하나 이상의 아미노기를 갖는 중합체 화합물 (a) 의 반복 단위의 수는 특별히 제한되지 않으나, 반응성, 점도, 취급, 수율 등의 관점에서, 10 내지 150000 개인 것이 바람직하고, 10 내지 3000 개인 것이 특히 바람직하다.
"하나 이상의 아미노기를 갖는 중합체 화합물 (a)" 는 "하나 이상의 알릴기 및 하나 이상의 아미노기를 추가로 갖는 알릴아민 단량체 (a')" 일 수 있다. 이의 구조 중 하나 이상의 알릴기 및 하나 이상의 아미노기를 갖는 임의의 중합성 화합물이 사용될 수 있으나, 일반식 (a1) 로 나타내는 구조를 갖는 알릴아민 화합물이 바람직하다.
[식 6]
Figure 112016092603999-pct00006
일반식 (a1) 중, R9 및 R10 중 하나 이상은 수소 원자이고, 다른 것은 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 8 의 탄화수소기이고, 바람직하게는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 3 의 알킬기이다.
일반식 (a1) 에 있어서, R9 및 R10 중 하나는 또한 알릴기인 것, 즉 알릴아민 단량체 (a') 가 2 개의 알릴기를 갖는 디알릴아민 단량체인 것이 중합성 등의 관점에서 특히 바람직하다.
높은 중합성을 수득하는 관점에서는, 알릴아민 단량체 (a') 중 적어도 일부가 2 개의 알릴기를 갖는 디알릴아민 단량체인 것이 바람직하다. 알릴아민 단량체 (a') 의 30 몰% 이상이 디알릴아민 단량체인 것이 보다 바람직하다. 알릴아민 단량체 (a') 의 50 몰% 이상이 디알릴아민 단량체인 것이 특히 바람직하다.
일반식 (a1) 에 있어서, R9 및 R10 중 하나 (예를 들어 R9) 가 수소 원자인 경우, 다른 것 (이 경우 R10) 은 수소 원자, 메틸기, 에틸기, 알릴기 또는 벤질기인 것이 바람직하다. 즉, 일반식 (a1) 로 나타내는 구조를 갖는 알릴아민 화합물은 바람직하게는 알릴아민, 메틸 알릴아민, 에틸 알릴아민, 디알릴아민 또는 벤질 알릴아민이다.
또한, 일반식 (a1) 로 나타내는 구조를 갖는 알릴아민 화합물의 유기산 염 또는 무기산 염은 본 출원의 제 1 발명에 있어서, 하나 이상의 알릴기 및 하나 이상의 아미노기를 갖는 알릴아민 단량체 (a') 로서 바람직하게 사용될 수 있다. 유기산 염 또는 무기산 염에 있어서의 반대 이온으로서, 할로겐 이온 (보다 바람직하게는 Cl-, Br- 또는 I-), 메틸 술페이트 이온, 에틸 술페이트 이온, 메탄술포네이트 이온, 2-히드록시-1-에탄술포네이트 이온, 아세테이트 이온 또는 히드록시 아세테이트 이온이 바람직하다.
상기 정의에서, 양이온성 그래프트 중합체는 "하나 이상의 에폭시기를 갖는 화합물 (b)" 가 일반식 (6) 으로 나타내는 화합물인, 폴리아민 그래프트 중합체일 수 있다 (일반식 (6) 에서 R 은 치환 또는 비치환 1 가 탄화수소기임).
[식 7]
Figure 112016092603999-pct00007
상기 정의에서, 양이온성 그래프트 중합체는 "하나 이상의 에폭시기를 갖는 화합물 (b)" 가 일반식 (7) 로 나타내는 화합물인, (1) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 식 중 각각 수소 원자인 에틸렌 옥시드, (2) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 히드록시기를 가지며 탄소수 1 내지 8 인 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기인 (식 중 R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, (3) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 치환 또는 비치환 1 가 탄화수소기인 (식 중 R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, (4) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 에테르 결합을 가지며 탄소수 1 내지 8 인 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, (5) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 할로겐 원자인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, (6) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 불포화 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, (7) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 지환식 탄화수소기 또는 불포화 결합을 갖는 고리형 탄화수소기를 포함하는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, (8) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 방향족 고리 또는 헤테로시클릭 고리를 포함하는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, (9) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 에폭시 고리를 포함하는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 다관능성 에폭시 화합물, (10) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 알콕시실릴을 포함하며 탄소수 3 내지 12 인 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, (11) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 불소 원자를 갖는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, (12) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 카르복실기를 갖는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, (13) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 포함하며 탄소수 1 내지 12 인 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, 및 (14) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 술포네이트기를 포함하는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리아민 그래프트 중합체일 수 있다.
[식 8]
Figure 112016092603999-pct00008
"하나 이상의 에폭시기를 갖는 화합물 (b)" 의 예는 에틸렌 옥시드 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 9]
Figure 112016092603999-pct00009
글리시돌 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 10]
Figure 112016092603999-pct00010
프로필렌 옥시드 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 11]
Figure 112016092603999-pct00011
부틸렌 옥시드, 2,3-부틸렌 옥시드, 1,2-에폭시 헥산 및 1,2-에폭시 헥사데칸,
글리시딜 메틸 에테르 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 12]
Figure 112016092603999-pct00012
에틸 글리시딜 에테르, 글리시딜 이소프로필 에테르 및 트리글리시딜 이소시아누레이트,
에피클로로히드린 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 13]
Figure 112016092603999-pct00013
에피브로모히드린 및 2-(클로로메틸)-1,2-에폭시 부탄,
1,3-부타디엔 모노옥시드 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 14]
Figure 112016092603999-pct00014
1,2-에폭시-5-헥센 및 알릴 글리시딜 에테르,
1,2-에폭시 시클로펜탄 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 15]
Figure 112016092603999-pct00015
1,2-에폭시 시클로헥산 및 1,2-에폭시-4-비닐 시클로헥산 3,4-에폭시 테트라히드로푸란,
스티렌 옥시드 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 16]
Figure 112016092603999-pct00016
글리시딜 페닐 에테르 및 4-글리시딜옥시 카르바졸,
1,2:3,4-디에폭시 부탄 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 17]
Figure 112016092603999-pct00017
1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 및 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르,
3-글리시독시프로필 트리메톡시실란 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 18]
Figure 112016092603999-pct00018
및 3-글리시딜옥시프로필 (디메톡시) 메틸실란,
1,2-에폭시-1H, 1H, 2H, 3H, 3H 헵타데카플루오로 운데칸 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 19]
Figure 112016092603999-pct00019
에폭시 숙신산 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 20]
Figure 112016092603999-pct00020
글리시딜 부티레이트 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 21]
Figure 112016092603999-pct00021
및 N-글리시딜프탈이미드, 및
글리시딜 니트로벤즈술포네이트 (그의 구조에 대해서는 하기 식 참조),
[식 22]
Figure 112016092603999-pct00022
및 글리시딜-p-톨루엔 술포네이트를 포함한다. 그러나, 하나 이상의 에폭시기를 갖는 화합물 (b) 가 이들에 제한되는 것은 아니다.
상기 정의에서, 양이온성 그래프트 중합체는 "에틸렌성 불포화 단량체 (c)" 가 비닐 단량체, 스티렌 단량체, 메타크릴레이트 단량체, 아크릴레이트 단량체, 아크릴아미드 단량체, 알릴 단량체, 디알릴 단량체 및 불포화 카르복실산으로 이루어지는 군에서 선택되는, 폴리아민 그래프트 중합체일 수 있다.
에틸렌성 불포화 단량체 (c) 의 분자량은 특별히 제한되지 않으나, 그래프트 효율 등의 관점에서, 바람직하게는 28 내지 1100 이고, 특히 바람직하게는 28 내지 500 이다.
에틸렌성 불포화 단량체 (c) 의 탄소 원자수는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 2 내지 50 개이고, 특히 바람직하게는 2 내지 30 개이다.
본 발명에서 바람직하게 사용되는 에틸렌성 불포화 단량체 (c) 의 보다 구체적인 예는 스티렌, 디비닐벤젠, 나트륨 p-스티렌술포네이트 히드레이트, 비닐벤질 트리메틸 암모늄 클로라이드, 비닐 아세테이트, 1-비닐이미다졸, 2-비닐피리딘, 아크릴로니트릴, 알릴아민 히드로클로라이드, 디알릴아민 히드로클로라이드, 디메틸 디아민 히드로클로라이드, 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드, 특히 이의 60% 수용액, 디메틸 아크릴아미드, 히드록시에틸 아크릴아미드, 디메틸아미노프로필 아크릴아미드, 디메틸아미노프로필 아크릴아미드 메틸 클로라이드 4급 염, N-(3-디메틸아미노프로필) 메타크릴아미드, 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트, 메틸 아크릴레이트 및 부틸 아크릴레이트를 포함한다. 이러한 단량체 중, 트렁크 중합체 상의 히드록시기에 인접한 탄소 원자와의 반응성, 그래프트 후의 측쇄 말단에서의 기의 유용성 등의 관점에서, 디메틸 아크릴아미드, 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드, 스티렌, 아크릴로니트릴 등이 특히 바람직하다.
이들 단량체 각각의 화학 구조, CAS 번호 등은 당업자에게 명백하며, 따라서 이의 기재를 생략할 것이다.
에틸렌성 불포화 단량체 (c) 는 본 발명의 목적에 따라 1 종류만을 단독으로 또는 2 종류 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 2 종류 이상의 에틸렌성 불포화 단량체 (c) 를 조합하여 사용하는 경우, 단량체 모두가 상기 바람직한 예에 상응할 수 있거나, 일부 단량체만이 상기 바람직한 예에 상응할 수 있다.
양이온성 그래프트 중합체에 포함되는 단위 중량 당 아미노기의 양은, 바람직하게는 0.1 내지 17 mmol/g 이고, 특히 바람직하게는 1 내지 10 mmol/g 이다. 양이온성 그래프트 중합체를 고체상 표면에 고정하지 않는 경우, 평균 입자 직경은 바람직하게는 250 nm 이하이고, 보다 바람직하게는 100 nm 내지 200 nm 이다.
"양이온성 그래프트 중합체" 의 형태로서, 하기의 그래프트 중합체가 예시화된다.
(1) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 디메틸 아크릴아미드의 그래프트 중합체
폴리알릴아민을 빙수로 냉각하고 교반하면서, 프로필렌 옥시드 (아민에 대해 2 당량) 를 20 질량% 폴리알릴아민 (중량 평균 분자량: 3000) 에 적가하였다. 20℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 용액을 농축하여 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
상기 방법에 따라 제조한 42 질량% 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민에, 농도가 14 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 10 이었다. 이후, 65 질량% 디메틸아크릴아미드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 12.01 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 디메틸 아크릴아미드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다 (중량 평균 분자량: 120000).
(2) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체
(1) 과 유사한 방식으로 제조한 50 질량% 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민에, 농도가 30 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 10 이었다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 를 첨가하였다. 추가로, 28.5 질량% APS 수용액 96.08 g (단량체에 대해 20 몰%) 을 분할하여 첨가하고, 72 시간 동안 중합을 수행하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다 (중량 평균 분자량: 24000).
(3) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 그래프트 중합체
폴리알릴아민을 빙수로 냉각 및 교반하면서 프로필렌 옥시드 (아민에 대해 0.1 당량) 를 20 질량% 폴리알릴아민에 적가하였다. 20℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 용액을 농축하여 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민에, 농도가 20 질량% 가 되도록 물을 첨가한 후, 스티렌 (아민에 대해 0.3 당량) 을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 12.01 g (단량체에 대해 20 몰%) 을 적가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 생성된 용액을 70℃ 에서 24 시간 동안 가열하여, 하기 추정 구조를 갖는 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 그래프트 중합체를 수득하였다 (하기 일반식 중, q 는 0 내지 3,000 의 정수이고, r 은 0 내지 3,000 의 정수이고, s 는 0 내지 3,000 의 정수이고, t 는 0 내지 10,000 의 정수이고, u 는 0 내지 10,000 의 정수이고, w 는 0 내지 10,000 의 정수임). 그래프트 중합체는 120 nm 의 평균 입자 직경을 가졌다.
[식 23]
Figure 112016092603999-pct00023
(4) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 디메틸 아크릴아미드의 그래프트 중합체의 제조 (pH 7 에서의 제조)
(1) 과 유사한 방식으로 제조한 42 질량% 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민에, 농도가 14 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 이후, 35 질량% 염산을 첨가하여 pH 를 7 로 조정하였다. 디메틸 아크릴아미드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 12.01 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 디메틸 아크릴아미드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다 (중량 평균 분자량: 210000).
(5) 에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체
20 질량% 폴리알릴아민에, 농도가 13 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 용액을 빙수로 냉각 및 교반하면서 에폭시 옥탄 (아민에 대해 0.1 당량) 을 적가하였다. 적가 종료 후, 용액을 40℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후 농축하여, 에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
상기 방법에 따라 제조한 30 질량% 에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민에, 농도가 19 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량%의 APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 분할하여 추가 첨가하여, 에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다.
(6) 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체
20 질량% 폴리알릴아민에, 농도가 13 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 용액을 빙수로 냉각 및 교반하면서 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (아민에 대해 0.05 당량) 를 적가하였다. 적가 종료 후, 용액을 40℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후 농축하여, 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 개질 폴리알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
상기 방법에 따라 제조한 30 질량% 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 개질 폴리알릴아민에, 농도가 19 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하여, 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 황색 겔로서 수득하였다.
(7) 스티렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체
20 질량% 폴리알릴아민에, 농도가 13 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 용액을 빙수로 냉각 및 교반하면서 스티렌 옥시드 (아민에 대해 0.1 당량) 를 적가하였다. 적가 종료 후, 용액을 40℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 농축하여 스티렌 옥시드-개질 폴리알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
상기 방법에 따라 제조한 30 질량% 스티렌 옥시드-개질 폴리알릴아민에, 농도가 19 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 분할하여 추가 첨가하여, 스티렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다.
(8) 글리시딜 부티레이트-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체
20 질량% 폴리알릴아민에, 농도가 13 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 용액을 빙수로 냉각 및 교반하면서 글리시딜 부티레이트 (아민에 대해 0.1 당량) 를 적가하였다. 적가 종료 후, 용액을 40℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 농축하여 글리시딜 부티레이트-개질 폴리알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
상기 방법에 따라 제조한 30 질량% 글리시딜 부티레이트-개질 폴리알릴아민에, 농도가 19 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 분할하여 추가 첨가하여, 글리시딜 부티레이트-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다.
(9) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 그래프트 중합체
(3) 과 유사한 방식으로 제조한 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민에, 농도가 20 질량% 가 되도록 물을 첨가한 후, 스티렌 (아민에 대해 0.3 당량) 을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 그 후, 28.5 질량% SPS 수용액 12.53 g (단량체에 대해 20 몰%) 을 적가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 생성된 용액을 70℃ 에서 24 시간 동안 가열하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 그래프트 중합체를 수득하였다. 그래프트 중합체는 135 nm 의 평균 입자 직경을 가졌다.
(10) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 그래프트 중합체
(3) 과 유사한 방식으로 제조한 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민에, 농도가 20 질량% 가 되도록 물을 첨가한 후, 스티렌 (아민에 대해 0.3 당량) 을 첨가하고, 생성된 용액을 80℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 12.01 g (단량체에 대해 20 몰%) 을 적가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 그래프트 중합체를 수득하였다. 그래프트 중합체는 144 nm 의 평균 입자 직경을 가졌다.
(11) 글리시돌-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체
디알릴아민에, 농도가 79 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 용액을 빙수로 냉각 및 교반하면서 글리시돌 (아민에 대해 1 당량) 을 적가하였다. 적가 종료 후, 용액을 45℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 농축하여 글리시돌-개질 디알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
78 질량% 글리시돌-개질 디알릴아민에 35 질량% 염산 (아민에 대해 1 당량) 을 첨가하였다. 그 후, 농도가 50 질량% 가 되도록 물을 첨가하였다. 생성된 용액을 60℃ 로 가열하고, 2,2'-아조비스(2-메틸 프로피온아미딘) 디히드로클로라이드 (단량체에 대해 6 몰%) 을 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 생성된 용액을 전기투석에 의해 정제하여, 글리시돌-개질 폴리디알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
상기 방법에 따라 제조한 43 질량% 글리시돌-개질 폴리디알릴아민에, 농도가 30 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 11 이었다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 36.04 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 36.04 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 분할하여 추가 첨가하고, 50℃ 에서 24 시간 동안 중합을 수행하여, 글리시돌-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다 (중량 평균 분자량: 84000).
(12) 프로필렌 옥시드-개질 폴리에틸렌 이민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체
폴리에틸렌 이민을 교반하면서, 프로필렌 옥시드 (아민에 대해 0.1 당량) 를 47 질량% 폴리에틸렌 이민 (중량 평균 분자량: 2000) 에 적가하였다. 생성된 용액을 20℃ 에서 24 시간 동안 반응시켜, 프로필렌 옥시드-개질 폴리에틸렌 이민 수용액을 수득하였다.
상기 방법에 따라 제조한 50 질량% 프로필렌 옥시드-개질 폴리에틸렌 이민에, 농도가 14 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 31.23 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리에틸렌 이민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다.
(13) 프로필렌 옥시드-개질 폴리비닐아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체
폴리비닐아민을 교반하면서, 프로필렌 옥시드 (아민에 대해 0.1 당량) 를 15 질량% 폴리비닐아민 (중량 평균 분자량: 150000) 에 적가하였다. 20℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 용액을 농축하여 23 질량% 프로필렌 옥시드-개질 폴리비닐아민 수용액을 수득하였다.
상기 방법에 따라 제조한 23 질량% 프로필렌 옥시드-개질 폴리비닐아민에, 농도가 15 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 31.23 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리비닐아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다.
(14) 프로필렌 옥시드-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체
디알릴아민에, 농도가 78 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 용액을 빙수로 냉각 및 교반하면서 프로필렌 옥시드 (아민에 대해 0.1 당량) 를 적가하였다. 용액을 20℃ 에서 24 시간 동안 반응시켜, 프로필렌 옥시드-개질 디알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
79 질량% 프로필렌 옥시드-개질 디알릴아민에 35 질량% 염산 (아민에 대해 1 당량) 을 첨가하여, 59 질량% 프로필렌 옥시드-개질 디알릴아민 히드로클로라이드를 수용액으로서 수득하였다. 생성된 59 질량% 프로필렌 옥시드-개질 디알릴아민 히드로클로라이드 41.33 g 에, 농도가 7 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 60℃ 로 가열하였다. 그 후, 59 질량% 프로필렌 옥시드-개질 디알릴아민 히드로클로라이드 123.99 g 및 2,2'-아조비스(2-메틸 프로피온아미딘) 디히드로클로라이드 (단량체에 대해 5.6 몰%) 를 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 생성된 용액을 전기투석에 의해 정제하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리디알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
상기 방법에 따라 제조한 30 질량% 프로필렌 옥시드-개질 폴리디알릴아민에, 농도가 24 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 분할하여 추가 첨가하고, 60℃ 에서 24 시간 중합을 수행하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다 (중량 평균 분자량: 19000).
(15) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체 (중량 평균 분자량: 2000, 아민에 대해 프로필렌 옥시드를 0.1 당량으로 첨가한 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민을 사용)
폴리알릴아민을 빙수로 냉각 및 교반하면서 프로필렌 옥시드 (아민에 대해 0.1 당량) 를 15 질량% 폴리알릴아민 (중량 평균 분자량: 1600) 에 적가하였다. 20℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 용액을 농축하여 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
상기 방법에 따라 제조한 30 질량% 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민에, 농도가 18 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 10 이었다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 분할하여 추가 첨가하고, 60℃ 에서 24 시간 동안 중합을 수행하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다 (중량 평균 분자량: 16000)
(16) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 2-비닐피리딘의 그래프트 중합체
(3) 과 유사한 방식으로 제조한 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민에, 농도가 20 질량% 가 되도록 물을 첨가하였다. 이후, 2-비닐피리딘 (아민에 대해 0.3 당량) 을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 반응 용액은 pH 가 12 였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 12.01 g (단량체에 대해 20 몰%) 을 적가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하여 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 2-비닐피리딘의 그래프트 중합체를 수득하였다. 그래프트 중합체는 225 nm 의 평균 입자 직경을 가졌다.
생성된 그래프트 중합체는 출발 물질 등으로부터의 하기 구조를 갖는 것으로 추정되었다 (하기 일반식 중, q 는 0 내지 3,000 의 정수이고, r 은 0 내지 3,000 의 정수이고, s 는 0 내지 3,000 의 정수이고, t 는 0 내지 10,000 의 정수이고, u 는 0 내지 10,000 의 정수이고, w 는 0 내지 10,000 의 정수임).
[식 24]
Figure 112016092603999-pct00024
"샘플" 은 검출 표적으로서 "표적" 을 포함한다고 생각되는 혼합물이다. "샘플" 은 인간을 포함하는 생체 (예를 들어 혈액, 타액, 체액 또는 신체 조직), 환경 (예를 들어 토양, 해수 또는 환경수 (온천수, 욕조수 또는 냉각 타워 수)), 또는 인공물 또는 자연물 (예를 들어 빵과 같은 가공 식품, 요구르트와 같은 발효 식품, 벼 또는 밀과 같은 재배 식물, 미생물 또는 바이러스) 에서 유래한다.
"샘플" 은 필요에 따라 이들을 정제 및 분리하여 수득한 생성물일 수 있다. 이의 예는 혈액으로부터 수득한 혈장 및 혈청을 포함한다.
금속 이온 염을 "샘플" 에 첨가할 수 있다.
"샘플" 은 계면활성제를 함유할 수 있으며, 계면활성제는 "표적" 이 검출되기 전에 첨가될 수 있다. 계면활성제의 예는 Triton (등록상표) 계면활성제 (폴리(옥시에틸렌) 옥틸페닐 에테르 등), Tween (등록상표) 계면활성제 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 등), Brij (등록상표) 계면활성제 (폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 등), 수크로오스 라우레이트 (Dojindo), 사포닌 (Sigma-Aldrich), BPSH (NIKKOL), NOIGEN TDS-70 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 및 TritonX-705 (Sigma-Aldrich) 를 포함한다.
"표적" 은 본 발명에 의해 검출할 대상이다. "표적" 은 제한되지 않으나, 바람직하게는 음전하를 가질 수 있다. 이의 예는 세포, 진균, 세균, 바이러스, 이의 분해물, 펩티드 및 핵산을 포함한다.
세포는 생체 내에 존재하는 세포일 뿐 아니라 배양 세포일 수도 있다. 세포는 정상 세포일 뿐 아니라 암 세포 (예를 들어 혈중 순환 암세포 (CTC)) 일 수도 있다.
진균은 일반적으로 버섯, 곰팡이 또는 효모로 지칭되는 유기체의 총칭이다. 이의 예는 백선균 (Trichophyton), 칸디다 (candida) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 를 포함한다.
각각의 세균은 세포막을 갖는 원핵생물이다. 이의 예는 포도상구균 (Staphylococcus aureus), 대장균 (Escherichia coli), 살모넬라균 (Salmonella), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 콜레라균 (Vibrio cholerae), 시겔라 (Shigella), 탄저균 (Bacillus anthracis), 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis), 보툴리누스균 (Clostridium botulinum), 파상풍균 (tetanus bacteria) 및 연쇄상구균 (streptococci) 을 포함한다.
바이러스는 또 다른 유기체의 세포를 사용하여 자가 복제할 수 있는 미소 구조이며, 단백질 껍질 및 이에 포함된 핵산으로 형성된다. 이의 예는 노로바이러스 (norovirus), 로타바이러스 (rotavirus), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 아데노바이러스 (adenovirus), 코로나바이러스 (coronavirus), 홍역 바이러스 (measles virus), 풍진 바이러스 (rubella virus), 간염 바이러스 (hepatitis virus), 헤르페스 바이러스 (herpes virus) 및 HIV 를 포함한다.
세포, 진균, 세균 및 바이러스의 분해물은 이의 구성 물질이며, 세포소기관 (핵, 골지체, 미토콘드리아 등), 세포, 진균 또는 세균의 막 분획물의 인산 지질을 포함할 수 있거나 (반전 소포 포함), 세포, 진균, 세균 및 바이러스 등을 구성하는 물질의 복합체일 수 있다. 세포, 진균, 세균 및 바이러스의 분해물은, 미소 막 소포 또는 소포가 정상 세포에는 존재하지 않지만, 세포자멸사에 의해 생성된 미소 막 소포 (예를 들어 내피 극미립자: EMP) 또는 소포일 수 있다.
펩티드는 각종 아미노산을 연결하여 형성된 일련의 분자를 의미하며 생체 내에서 기능하는 완전한 단백질을 포함하고, 여러 소위 번역 후 개질 (예를 들어 글리코실화: 당 사슬 개질) 을 포함할 수 있다.
핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA), 리보뉴클레오티드 (RNA) 또는 이의 혼합물 및 결합 복합체일 수 있다. 이의 구성 염기는 자연 발생적 뉴클레오티드, 예를 들어 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T), 시토신 (C) 또는 우라실 (U) 이다. 그러나, 임의의 다른 천연 또는 인공 개질 염기를 포함할 수 있다. 여기서 "개질 염기" 는 상기 5 개의 뉴클레오티드를 화학적으로 개질하여 수득한 염기를 의미한다. 이의 예는 메틸 시티딘, 슈도우리딘, 4-티오우리딘, 디히드로우리딘, 케오신 및 히폭산틴 (이노신 (I)) 을 포함하나, 개질 염기가 이에 제한되는 것은 아니다. 주형으로서 RNA 를 사용하여 역전사 반응에 의해 생성되는 cDNA 가 또한 포함된다.
"염기성 조건 하" 는 pH 가 8 이상, 바람직하게는 9 이상, 보다 바람직하게는 10 이상, 보다 더 바람직하게는 11 이상인 것을 의미한다. 염기성 용액을 사용하여 염기성 조건을 형성하는 것이 바람직하다. 염기성 용액의 예는 약염기, NaOH 수용액과 같은 강염기, 및 pH 8 이상에서 완충 능력을 갖는 완충제 (예를 들어 글리신 완충제, CHES 또는 CAPS) 를 포함한다.
양이온성 그래프트 중합체를, 표적 물질을 함유하는 샘플과 "접촉" 시키는 형태는, 양이온성 그래프트 중합체 용액을 샘플에 첨가하는 형태에 추가로, 양이온성 그래프트 중합체를 샘플에 첨가하는 형태를 포함한다.
"결합" 은 양이온성 그래프트 중합체와 표적이 배위 결합 및/또는 이온 결합에 의해 상호작용하는 상태를 의미한다.
결합 복합체를 "분리한다" 는 것은 결합 복합체를 산성 조건 하에 푸는 것, 또는 킬레이트제의 존재 하에 양이온성 그래프트 중합체와 표적의 상기 "결합" 을 푸는 것을 의미한다.
"산성 조건 하" 는 pH 가 7 이하, 바람직하게는 6 이하, 보다 바람직하게는 5 이하인 것을 의미한다. 산성 용액을 사용하여 산성 조건을 형성하는 것이 바람직하다. 산성 용액의 예는 글리신 완충제, 포름산 용액 및 아세트산 용액을 포함한다.
킬레이트제의 예는 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA) 및 글리콜 에테르 디아민 테트라아세트산 (EGTA) 을 포함한다. 킬레이트제 중의 양성자가 분리되는 pH 이면 제한되지 않으나, pH 가 6.0 내지 8.0 인 것이 바람직하다.
"표적 물질을 용출한다" 는 것은 상기 "분리" 반응 후, 표적 물질을 적절한 용액에 용해하는 것을 의미한다. 표적 물질이 살아 있는 세포인 경우, "표적 물질을 용출한다" 는 것은 세포막 파쇄 없이 회수하는 것을 의미한다.
2 가 또는 3 가 금속 이온의 예는 Mg2+, Ba2+, Ca2+, Sr2+, Ni2+, Zn2 +, Mn2+, Co2+, Fe2+, Fe3+, Al3+, Cr3+, Cu2+, Cd2+ 및 Sn2+ 를 포함한다.
"고체상 표면에 고정시킨다" 는 것은 "양이온성 그래프트 중합체" 를 균질하지 않게 분포시키는 것을 의미한다. 구체적으로, "고체상 표면에 고정한다" 는 것은 유리, 나일론 멤브레인, 반도체 웨이퍼, 마이크로 비즈, 라텍스 비즈, 자성 비즈, 콜로이드성 입자 등의 표면에 "양이온성 그래프트 중합체" 를 고정시키거나, 표면을 "양이온성 그래프트 중합체" 로 코팅하는 것을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 고정 방법으로서, 공지된 기술을 사용하여 "양이온성 그래프트 중합체" 를 유리 등의 표면에 직접 고정시킬 수 있거나, 링커 분자를 통해 간접적으로 고정시킬 수 있다. 또, 단량체를 고체상 표면에서 중합시켜, 고체상 표면에 고정된 양이온성 그래프트 중합체를 합성할 수 있다.
"고체상 표면에 고정시킨다" 는 것은 또한, 크로마토그래피 컬럼 등에 "양이온성 그래프트 중합체" 를 충전하는 것을 의미할 수 있다.
"결합 복합체를 세정한다" 는 것은 "양이온성 그래프트 중합체" 와 "표적 물질" 사이의 결합을 유지하면서, 양이온성 그래프트 중합체에 비특이적으로 결합하는 불순물을 제거하는 작업을 의미한다. 세정을 위해서는, 결합 반응에 사용한 용액과 동일한 용액을 사용할 수 있거나, 또 다른 용액을 사용할 수 있다. 생리 식염수 또는 알코올을 사용할 수 있다.
"표적 물질과 결합하지 않는 양이온성 그래프트 중합체를 응집시키는" 것의 예는, 소수성 상호작용에 의해 양이온성 그래프트 중합체를 분리하는 것, 또는 분리를 위해 음이온성 계면활성제, 또는 반대 이온으로서 폴리음이온과의 이온성 상호작용에 의해 양이온성 그래프트 중합체를 응집시키는 것을 포함한다. 보다 구체적으로, 응집액 (비양성자성 극성 용매 (예컨대 아세토니트릴), 음이온성 계면활성제 (예컨대 옥탄술포네이트 또는 나트륨 데칸술포네이트) 및 폴리음이온 (카르복시메틸화 폴리알릴아민: CMPAA) 을 포함) 을 사용하여, 아세토니트릴의 소수성 상호작용 또는 폴리음이온 또는 이온성 계면활성제와의 이온성 상호작용에 의해 양이온성 그래프트 중합체를 응집시킨다.
상기 "양이온성 그래프트 중합체", "반응액", "세정액", "분산액" 및 "응집액" 의 예는 액체 유형 ("양이온성 그래프트 중합체" 의 경우 유화된 유형) 뿐 아니라 액체를 건조시켜 수득한 생성물도 포함할 수 있다.
[실시예]
하기 실시예, 비교예 및 참조예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1>
대장균의 분리 및 회수율의 확인
1. 방법
양이온성 그래프트 중합체로 회수한 대장균의 회수율을 혈구 분석기 (Sysmex) 를 사용하여 측정하였다.
샘플 및 시약은 하기와 같다.
1) 샘플
대장균을 Bio-Rad Laboratories, Inc. 사제의 GFP 발현 키트를 사용하여 제작하였다.
제작한 대장균을 정상 인간 혈청에 필요량 (1 ~ 2 x 104 개 세포/μL) 으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 샘플로서 사용하였다.
2) 시약
I: 반응액: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0, 3 M 염화마그네슘
II: 분산액: 500 mM 글리신-HCl pH 5.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
폴리알릴아민을 빙수로 냉각 및 교반하면서 프로필렌 옥시드 (아민에 대해 0.1 당량) 를 20 질량% 폴리알릴아민 (중량 평균 분자량: 3000) 에 적가하였다. 20℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 용액을 농축하여 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민에, 농도가 20 질량% 가 되도록 물을 첨가한 후, 스티렌 (아민에 대해 0.3 당량) 을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 그 후, 농도 28.5 질량% 에서 과황산암모늄 (APS) 수용액 12.01 g (단량체에 대해 20 몰%) 을 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 생성된 용액을 70℃ 에서 24 시간 동안 가열하여, 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 양이온성 그래프트 중합체를 수득하였다 (평균 입자 직경: 120 nm) (상기 (3) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 그래프트 중합체).
4) 혈구 분석기
대장균을 혈구 분석기를 사용하여 혈소판 (PLT) 에서 검출한다.
혈구 분석기의 프로토콜에 따라 측정을 수행하였다.
대장균의 분리 및 회수율의 확인을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 20% 양이온성 그래프트 중합체 50 μL 및 반응액 100 μL 를 혼합하고, 1 분 동안 반응시켰다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 회수하고, 생성된 침전 펠렛을 분산액 500 μL 로 완전하게 분산시켜, 현탁액을 수득하였다. 상청액 또는 현탁액에 대한 대장균 회수율을 혈구 분석기를 사용하여 측정하였다. 대조군으로서, 양이온성 그래프트 중합체와 반응시키기 전의 대장균을 사용하였다.
2. 결과
혈구 분석기를 사용하는 측정 결과를 표 1 에 나타낸다.
[표 1]
Figure 112016092603999-pct00025
표 1 의 결과는 회수율이 약 70% 인 것을 나타내며, 이는 양호한 회수율이었다.
<실시예 2>
분리한 대장균의 생존 (생존력) 확인
1. 방법
양이온성 그래프트 중합체로 혈액 중 대장균을 분리하고, 분리한 대장균의 생존을 배양에서 확인하였다.
샘플 및 시약은 하기와 같다.
1) 샘플
실시예 1 과 유사한 방식으로, Bio-Rad Laboratories, Inc. 사제의 GFP 발현 키트를 사용하여 제작한 대장균을 정상 인간 혈청에 필요량으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 샘플로서 사용하였다.
2) 시약
I: 반응액: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0, 3 M 염화마그네슘
II: 분산액: 500 mM 글리신-HCl pH 5.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 1 과 유사한 방식으로 양이온성 그래프트 중합체를 제조하였다.
대장균의 분리 및 이의 생존 (생존력) 확인을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 20% 양이온성 그래프트 중합체 50 μL 및 반응액 100 μL 를 혼합하고, 1 분 동안 반응시켰다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 제거하고, 생성된 침전 펠렛을 분산액 500 μL 로 완전하게 분산시켜, 현탁액을 수득하였다 (도 2). 각각의 상청액 및 현탁액의 5000 분의 1 을 LB 세균 배양 한천 배지를 사용하여 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하고, 생존 확인을 수행하였다 (도 3).
비교예로서, 실시예와 유사한 방식으로 침전 펠렛을 수득하였다. 그 후, 1.5 M NaCl 용액 500 μL (비교예 1) 및 1.5% TritonX-100 500 μL (비교예 2) 를 각각 첨가하고, 펠렛을 완전하게 분산시켰다. 각각의 상청액 및 분산액을 실시예와 유사한 방식으로 배양하고, 생존력을 확인하였다.
2. 결과
배양 결과를 표 2 에 나타낸다.
[표 2]
Figure 112016092603999-pct00026
표 2 의 결과는 본 발명의 방법을 사용함으로써 세균을 용균하지 않고 생존 상태로 회수할 수 있다는 것을 나타낸다.
<실시예 3>
질량 분석기를 사용하는 측정
1. 방법
양이온성 그래프트 중합체로 회수한 대장균을 MALDI TOF (매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화 비행시간형) 질량 분석기, MALDI BioTyper (등록상표) (Bruker Daltonics K.K.) 를 사용하여 세균 동정을 수행하였다.
샘플 및 시약은 하기와 같다.
1) 샘플
대장균을 Bio-Rad Laboratories, Inc. 사제의 GFP 발현 키트를 사용하여 제작하였다.
제작한 대장균을 생리 식염수에 필요량으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 샘플로서 사용하였다.
2) 시약
I: 반응액: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0, 3 M 염화마그네슘
II: 분산액: 70% 포름산
III: 응집액: 100% 아세토니트릴
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 1 과 유사한 방식으로 양이온성 그래프트 중합체를 제조하였다.
4) 질량 분석기
매트릭스로서 Bruker Daltonics K.K. 사제 Matrix HCCA portioned 를 사용하였다. MALDI BioTyper (등록상표) 의 프로토콜에 따라 측정을 수행하였다. 세균 동정의 측정을 BioTyper (등록상표) 에 의해 명시된 스코어에 의해 평가하였다.
대장균의 분리 및 질량 분석기를 사용한 측정을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 20% 양이온성 그래프트 중합체 50 μL 및 반응액 100 μL 를 혼합하고, 1 분 동안 반응시켰다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다 (도 1). 상청액을 제거하고, 생성된 침전 펠렛을 분산액-추출액 50 μL 로 완전하게 분산시키고, 균체 내의 단백질을 추출하였다. 그 후, 응집액 200 μL 를 첨가하고, 생성된 혼합물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 양이온성 그래프트 중합체를 침전시켰다. 질량 분석기를 사용하는 측정용 샘플로 사용할 상청액을 회수하였다.
2. 결과
질량 분석기를 사용한 측정 결과를 표 3 에 나타낸다.
[표 3]
Figure 112016092603999-pct00027
표 3 의 결과는 동정 스코어가 1.7 이상인 것을 나타내며, 이는 양호한 동정 정밀도였다. 이 결과는 대장균 중의 단백질을 추출할 수 있으며 질량 분석기를 사용하여 측정을 수행할 수 있다는 것을 나타낸다.
<실시예 4 및 5>
혈청 중 핵산의 분리 및 회수율의 확인
1. 방법
양이온성 그래프트 중합체로 혈청에 첨가한 핵산을 분리하였다. 생성된 핵산은 아가로오스 전기영동을 수행하여, SYBR Safe (Invitrogen) 로 염색하고, LAS4000 (GE) 에 의해 검출하였다. 회수율을 스팟의 형광 강도로부터 측정하였다.
샘플 및 시약은 하기와 같다.
1) 샘플
핵산으로서, 플라스미드 및 게놈을 사용하였다. 플라스미드를 대장균으로부터 추출하고 (실시예 4), 게놈을 Hela 세포로부터 추출하였다 (실시예 5). 추출한 플라스미드 용액을 LB 세균 배양 한천 배지를 사용하여 배양하였고, 콜로니는 형성되지 않았다. 이로써 대장균의 오염이 없는 것을 확인하였다. 형광 현미경을 사용하여, 추출한 게놈 용액 중 세포의 오염이 없는 것을 확인하였다.
추출한 DNA를, 정상 인간 혈청에 필요량으로 첨가하여 샘플로서 사용하였다. 대조군으로서, DNA 를 함유하지 않는 정상 인간 혈청을 사용하였다.
2) 시약
I: 반응액: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0, 3 M 염화마그네슘
II: 분산액: 500 mM EDTA-2 Na pH 8.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 1 과 유사한 방식으로 양이온성 그래프트 중합체를 제조하였다.
4) 전기영동
1.0% 아가로오스 겔을 사용하였다.
전기영동용 샘플을 조정하기 위해, 6 x 로딩 색소 (TOYOBO) 를 사용하였다.
핵산의 분리 및 이의 검출 방법을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 20% 양이온성 그래프트 중합체 50 μL 및 반응액 100 μL 를 혼합하고, 1 분 동안 반응시켰다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액 및 현탁액에, Nacalai Tesque, Inc. 사제 핵산 추출 시약 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 (25:24:1) 500 μL 를 첨가하고, 페놀상 및 수상으로 분리하였다. 수상 중의 DNA 를 300 μL 회수하고, 에탄올 600 μL 및 나트륨 아세테이트 수용액 30 μL 를 혼합하고, 에탄올 침전에 의해 DNA 를 침전시켰다. 침전물을 증류수 100 μL 에 현탁하고, 로딩 색소와 혼합하여 전기영동용 샘플로 사용하였다. 1% 아가로오스 겔을 사용하여 전기영동을 수행하였다. SYBRSafe 로 염색을 수행한 후, LAS4000 에 의해 형광 검출하였다 (도 4).
2. 결과
DNA 회수량을 표 4 에 나타낸다.
[표 4]
Figure 112016092603999-pct00028
표 4 의 결과는 플라스미드 DNA 의 회수율이 60% 였고 게놈 DNA 회수율이 40% 였다는 것을 나타낸다.
<실시예 6>
혈청 중 세포의 분리, 회수율, 및 3-차원 구조 및 표면 구조의 확인
1. 방법
양이온성 그래프트 중합체로 혈청에 첨가한 세포를 분리하였다. 세포의 회수율을 혈구 분석기 (Sysmex) 를 사용하여 확인하였다. 세포 표면 상의 항원-항체 반응을 형광 현미경 (Life technologies) 을 사용하여 확인하였다.
샘플 및 시약은 하기와 같다.
1) 샘플
세포로서, Hela 세포를 사용하고, Hela 세포를 정상 인간 혈청에 필요량 (1 ~ 2 x 106 개 세포/mL) 으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 샘플로서 사용하였다.
2) 시약
I: 반응액: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0, 3 M 염화마그네슘
II: 분산액: 500 mM EDTA-2 Na pH 8.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 1 과 유사한 방식으로 양이온성 그래프트 중합체를 제조하였다.
4) 혈구 분석기
세포를 WBC 로서 측정하였다.
실시예 1 과 유사한 방식으로 혈구 분석기의 프로토콜에 따라 측정을 수행하였다.
5) 항체
1 차 항체로서, 항-인간 CD 146 (MCAM) 및 모노클로날 항체 (N 1238) (MONOSAM) 를 50 배 희석하여 사용하였다.
2 차 항체로서, 항-마우스 IgG Alexa Fluor 594 (Life Technologies) 를 500 배 희석하여 사용하였다.
1 차 항체 및 2 차 항체를 차광 상태로 1 시간 동안 역전 혼합 (inversion mixing) 에 의해 반응시켜, 형광 표지 항체를 제조하였다.
세포의 분리 및 검출 방법을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 20% 양이온성 그래프트 중합체 50 μL 및 반응액 100 μL 를 혼합하고, 1 분 동안 반응시켰다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에서 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 회수하고, 생성된 침전 펠렛을 분산액 500 μL 로 완전하게 분산시켰다 (도 5). 회수한 상청액 또는 생성된 현탁액에 대한 회수율을 혈구 분석기를 사용하여 측정하였다. 대조군으로서, 양이온성 그래프트 중합체와 반응하기 전 세포를 사용하였다.
이후, 현탁액을 형광 표지 항체와 혼합하고, 차광 상태로 1 시간 동안 역전 혼합에 의해 반응시켜, 형광 현미경을 사용하여 항원 항체 반응을 확인하였다 (도 6).
2. 결과
혈구 분석기를 사용한 WBC 측정치를 표 5 에 나타낸다.
[표 5]
Figure 112016092603999-pct00029
표 5 의 결과는 회수율이 98% 였다는 것을 나타내며, 이는 양호한 회수율이었다.
혈구 분석기는 WBC 로서 핵을 갖는 물질을 측정한다. 따라서, 세포는 본 발명의 방법을 사용하여 3-차원 구조를 유지하면서 회수될 수 있다.
Hela 세포와 MCAM 항체 사이의 항원-항체 반응을 형광 현미경을 사용하여 확인하였다. 이러한 결과는 세포가 그의 표면 구조를 유지하면서 회수될 수 있다는 것을 나타낸다.
<실시예 7>
혈청 중 소포 의 분리, 회수율, 및 3-차원 구조 및 표면 구조의 확인
1. 방법
양이온성 그래프트 중합체로 혈청에 첨가한 소포를 분리하였다. 소포의 회수율을 혈구 분석기를 사용하여 확인하였다. 분리한 소포의 3-차원 구조 및 표면 구조가 유지되었는지 여부를 형광 현미경 (Life technologies) 을 사용하여 확인하였다.
샘플 및 시약은 하기와 같다.
1) 샘플
초음파발생기를 사용하여 Hela 세포를 파쇄함으로써 소포를 제작하였다.
형광 현미경을 사용하여 소포를 관찰하기 위해, 세포를 DyLight 488 항체 표지 키트 (Thermo) 에 포함된 형광 색소 (DyLight, Ex/Em: 493/518) 수용액 중에서 파쇄하고, 소포 내에 형광 색소를 혼입시켰다.
제작한 소포를 정상 인간 혈청에 필요량으로 첨가하여 샘플로서 사용하였다.
2) 시약
I: 반응액: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0, 3 M 염화마그네슘
II: 분산액: 500 mM EDTA-2 Na pH 8.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 1 과 유사한 방식으로 양이온성 그래프트 중합체를 제조하였다.
4) 혈구 분석기
소포를 WBC 로서 측정하였다.
실시예 1 과 유사한 방식으로 혈구 분석기의 프로토콜에 따라 측정을 수행하였다.
5) 항체
1 차 항체로서, 각각의 항-인간 CD 146 (MCAM) 및 모노클로날 항체 (N 1238) (MONOSAM) 를 50 배 희석하여 사용하였다.
2 차 항체로서, 항-마우스 IgG Alexa Fluor 594 (Life Technologies) 를 500 배 희석하여 사용하였다.
1 차 항체 및 2 차 항체를 차광 상태로 1 시간 동안 역전 혼합에 의해 반응시켜, 형광 표지 항체를 제조하였다.
소포의 분리 및 검출 방법을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 10% 양이온성 그래프트 중합체 100 μL 및 반응액 50 μL 를 혼합하고, 1 분 동안 반응시켰다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 회수하고, 생성된 침전 펠렛을 분산액 500 μL 로 완전하게 분산시켜, 현탁액을 수득하였다 (도 7). 회수한 상청액 또는 생성된 현탁액에 대한 회수율을 혈구 분석기를 사용하여 측정하였다. 대조군으로서 양이온성 그래프트 중합체와 반응하기 전 소포를 사용하였다.
이후, 현탁액을 형광 표지 항체와 혼합하고, 차광 상태로 1 시간 동안 역전 혼합에 의해 반응시켜, 형광 현미경을 사용하여 항원-항체 반응을 확인하였다 (도 8).
2. 결과
혈구 분석기를 사용한 소포 측정치를 표 6 에 나타낸다.
[표 6]
Figure 112016092603999-pct00030
표 6 의 결과는 소포의 회수율이 82% 였다는 것을 나타내며, 이는 양호한 회수율이었다.
현탁액 중의 소포에 형광 색소가 혼입되고 소포의 가장자리가 형광 표지 항체에 의해 둘러싸인 상태를, 형광 현미경을 사용하여 확인하였다. 이러한 결과는 소포가 3-차원 구조 및 표면 구조를 유지하면서 회수될 수 있다는 것을 나타낸다.
<참조예 1>
바이러스 입자의 분리 및 회수 확인
1. 방법
단백질 껍질 및 그에 포함된 핵산으로 형성된 바이러스의 모델로서, 박테리오파지를 사용하였다. 일정한 역가 (titer) 를 갖는 파지 용액을 조정하고, 본 발명의 방법에 의해 박테리오파지를 회수하고, 회수 후 역가를 대장균을 용균시킨 플라크를 계수함으로써 계산하였다.
1) 샘플
박테리오파지
숙주 대장균
2) 시약
I: 반응액: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0, 3 M 염화마그네슘
II: 분산액: 500 mM 글리신-HCl pH 5.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 1 과 유사한 방식으로 양이온성 그래프트 중합체를 제조하였다.
박테리오파지의 분리 및 검출 방법을 하기와 같이 수행하였다.
박테리오파지 샘플 500 μL, 10% 양이온성 그래프트 중합체 100 μL 및 반응액 50 μL 를 혼합하고, 1 분 동안 반응시켰다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 회수하고, 생성된 침전 펠렛을 분산액 500 μL 로 완전하게 분산시켜, 현탁액을 수득하였다. 생성된 용액을 단계 희석하였다. 희석한 용액을 숙주 대장균 배양액과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 연질 한천에 첨가하고, 한천 플레이트 상에서 하룻밤 배양하였다. 회수한 플라크의 역가를 플라크 수로부터 계산한다.
<실시예 8>
계면활성제-함유 용액을 사용하여 회수한 세균의 생존 (생존력) 확인
1. 방법
비이온성 계면활성제-함유 용액을 사용하여, 채혈 튜브 내에서 분리제 상에 침전시킨 대장균을 살아 있는 상태로 회수한다.
샘플 및 시약은 하기와 같다.
1) 샘플
대장균을 Bio-Rad Laboratories, Inc. 사제의 GFP 발현 키트를 사용하여 제작하였다.
제작한 대장균을 생리 식염수에 필요량 (2 x 108 개 세포/mL) 으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 샘플로서 사용하였다.
2) 시약
I: 1% 계면활성제 용액
실험 1 ~ 6 에서, 수크로오스 라우레이트 (Dojindo), 사포닌 (Sigma-Aldrich), BPSH (NIKKOL), NOIGEN TDS-70 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.), Triton X-705 (Sigma-Aldrich) 및 CHAPS (Dojindo) 를 계면활성제로서 사용하였다.
[표 7]
Figure 112016092603999-pct00031
II: 반응액: 1 M 글리신 pH 11.0, 3 M 염화마그네슘
III: 분산액: 500 mM 글리신 pH 5.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 1 과 유사한 방식으로 양이온성 그래프트 중합체를 제조하였다.
균체의 회수 및 이의 생존 (생존력) 확인을 하기와 같이 수행하였다.
생리 식염수에 대장균을 분산시킨 균액 3 mL 를 채혈 튜브에 첨가하고, 3000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하였다. 그 후, 상청액을 제거하였다. 이후, 1% 계면활성제 용액 0.5 mL 를 채혈 튜브에 첨가하고, 분리제 표면 상 침전된 균체를 분산시켰다.
균체 분산액을 20℃ 에서 30 분 및 3 시간 동안 정치시켰다. 그 후, 10% 양이온성 그래프트 중합체 100 μL 및 반응액 100 μL 를 혼합하고, 1 분 동안 반응시켰다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 제거하고, 생성된 침전 펠렛을 분산액 500 μL 로 완전하게 분산시켜 현탁액을 수득하였다. 현탁액의 100 분의 1 을 LB 세균 배양 한천 배지를 사용하여 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하고, 콜로니 수에 의해 생균수를 확인하였다.
대조군으로서, 계면활성제 용액 대신 생리 식염수를 사용하였다 (대조군 1).
2. 결과
배양 후 샘플 중의 콜로니 수를 표 8 에 나타낸다.
[표 8]
Figure 112016092603999-pct00032
실험 1 ~ 5 에서 비이온성 계면활성제, 특히 수크로오스 라우레이트를 사용한 경우, 세균을 살아 있는 상태로 회수할 수 있다.
<실시예 9>
계면활성제-함유 용액을 사용하여 회수한 대장균의 질량 분석기를 사용한 측정
1. 방법
계면활성제-함유 용액을 사용하여, 채혈 튜브 내에서 분리제 상에 침전시킨 대장균을 회수하고, 양이온성 중합체와 반응시켰다. 그 후, 70% 아세토니트릴로 반응 생성물을 세정하였다. 혈액 성분의 영향을 억제하고 질량 분석기를 사용하여 측정할 수 있는 샘플을 그에 따라 제조하였다.
샘플 및 시약은 하기와 같다.
1) 샘플
대장균을 Bio-Rad Laboratories, Inc. 사제의 GFP 발현 키트를 사용하여 제작하였다.
전혈 및 제작 대장균을 세균 배양용의 배양 보틀 (BD) 에 2 x 108 개 세포/mL 의 양으로 첨가하여 샘플로서 사용하였다.
2) 시약
I: 회수액: 0.1% 계면활성제
II: 반응액 1: 1 M 글리신 pH 11.0
III: 반응액 2: 3 M 염화마그네슘
IV: 세정액: 70% 아세토니트릴
V: 추출액: 70% 포름산
VI: 분리액: 100% 아세토니트릴
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 1 과 유사한 방식으로 양이온성 그래프트 중합체를 제조하였다.
4) 전기영동
E-R155e-PAGEL 15% 겔 (ATTO) 을 사용하였다.
2D-은 염색 시약 II (Cosmo Bio) 를 겔 염색에 사용하였다.
5) 질량 분석
Auto FlexII flex Control 2.0 (Bruker) 를 사용하여 지시사항 설명서에 따라 측정을 수행하였다.
Flex Analysis 를 질량 스펙트럼 분석에 사용하였다.
혈액 성분 제거를 하기와 같이 확인하였다.
채혈하였다. 배양 보틀에, 회수한 혈액 10 mL 를 첨가하고, 그로부터 3 mL 를 채혈 튜브에 옮겼다. 채혈 튜브를 3000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하여, 균체로부터 혈구 성분을 분리하였다. 채혈 튜브에 회수액 500 μL 를 첨가하고, 채혈 튜브 내에서 분리제 표면에 의해 흡착된 대장균을 1.5 mL 튜브에 회수하였다. 여기서, 실험 7 ~ 12 에서, 수크로오스 라우레이트, NOIGEN XL60, 사포닌, BPSH, TritonX-705 및 CHAPS 를 회수액에 함유된 계면활성제로서 사용하였다.
대조군 2 로서, 검사용 회수액에 첨가한 계면활성제 대신 증류수를 사용하였다. 회수 용액을 함유하는 튜브에서, 100 μL 의 10% 양이온성 그래프트 중합체, 반응액 1: 100 μL, 및 반응액 2: 100 μL 를 혼합하고, 1 분 동안 반응시켰다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 제거하였다. 생성된 침전 펠렛을 세정액 500 μL 로 완전하게 분산시키고, 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 1.5 mL 튜브에 회수하여 샘플 1 로서 사용하였다. 침전 펠렛을 추출액 50 μL 로 완전하게 분산시켰다. 그 후, 응집 침전액 150 μL 를 이에 첨가하고, 생성된 혼합물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하였다. 상청액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮겨, 샘플 2 로서 사용하였다.
Auto FlexII 를 사용하여 이의 질량 스펙트럼을 측정하였다.
오염물의 영향을 확인하기 위해, 전기영동에 의한 확인을 수행하였다. 측정에 사용한 샘플로서, 대조군 2, 및 실험 7 ~ 12 에서 수득한 샘플 1 및 2 를 15000 rpm 에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 회수하고, 농축을 위해 하룻밤 동결건조시켰다. 건조시킨 샘플을 SDS 샘플 완충제 50 μL 에 용해하여, 전기영동용 샘플로서 사용하였다. E-R155e-PAGEL 15% 겔을 사용하여 전기영동을 수행하였다.
2. 결과
전기영동 결과를 표 9 에 나타낸다.
샘플 1 에서, 주요 밴드가 분자량 10000 및 30000 부근에서 확인되었다. 이 결과는, 양이온성 중합체에 의해 흡착된 혈액 성분을 세정액으로 제거할 수 있다는 것을 나타낸다. 샘플 2 는 대조군 2 에 대해 30000 이하의 더 큰 밴드 수를 가졌다. 이 결과는, 균체 유래의 단백질 밴드가 세정액으로의 혈액 성분 제거에 의해 검출되었다는 것을 나타낸다.
Auto FlexII 을 사용하여 수득한 질량 스펙트럼을 표 10 에 나타낸다.
사용한 계면활성제에 의해 질량 분석기에서의 이온화가 저해되는지 여부를 측정하기 위해, 수득한 질량 스펙트럼으로부터 데이터 처리용 소프트웨어 flex Analysis 의 Find Mass List 기능으로 질량 피크 수를 계수하였다. 그 결과를 표 9 에 나타낸다. 계수 조건을 표 10 에 나타낸다.
혈액 성분의 영향 회피 효과를 확인하기 위해, 균체 유래의 질량 피크에 대한 혈액 성분 유래의 질량 피크의 피크 강도 비율을 측정하였다. 균체 유래의 질량 피크로서, 콜로니를 샘플로서 사용한 경우 검출된 질량 피크로부터 6250 m/z 및 9740 m/z 를 선택하였다. 혈액 성분 유래의 질량 피크로서, 헤모글로빈의 질량 피크인 15130 m/z 를 선택하였다. 그 결과를 표 11 에 나타낸다.
[표 9]
Figure 112016092603999-pct00033
[표 10]
Figure 112016092603999-pct00034
[표 11]
Figure 112016092603999-pct00035
표 9 는, 실험 7 및 8 에서, 계수된 질량 피크수가 대조군 2 에서보다 더 크며, 따라서 이온화가 촉진될 수 있다는 것을 나타낸다. 한편 표 9 는, 실험 9 ~ 11 에서, 계수된 질량 피크수가 대조군 2 에서보다 더 작으며, 따라서 이온화가 저해될 수 있다는 것을 나타낸다.
표 11 은, 실험 7 및 8 에서, 균체 유래의 질량 피크와 혈액 유래의 질량 피크 사이의 비율이 1.0 이상이며, 균체 유래의 피크가 혈액 유래의 피크보다 더 높은 강도로 검출되었다는 것을 나타낸다. 한편 표 11 은, 실험 9 ~ 12 에서, 균체 유래의 질량 피크와 혈액 유래의 질량 피크 사이의 비율이 1.0 이하이고, 혈액 유래의 피크가 균체 유래의 피크보다 더 높은 강도로 검출되며, 혈액 성분의 영향 회피 효과가 낮았다는 것을 나타낸다.
이러한 결과로부터, 실험 7 및 8 의 방법은 혈액 성분의 영향을 억제할 수 있고 질량 분석기를 사용한 측정이 가능하게 한다.
<실시예 10A>
바이러스 입자의 분리 및 회수 확인 (참조예 1 의 추가 시험)
1. 방법
1) 샘플
NBRC (National Institute of Technology and Evaluation Center for Biotechnology) 에서 구입한 대장균 파지 T7 (코드: 20007) 을 사용하여, NBRC 지정 프로토콜 및 일반적 실험 절차, 예를 들어 "invincible biotechnical series-genetic engineering laboratory notebook (first volume) 2. section of bacteriophage (Yodosha)" 에 따라 박테리오파지를 제작하였다.
복수액 (10% 폴리펩톤, 2% 효모 추출물, 1% MgSO4) 200 μL 에 건조 균체를 현탁한 후, 대장균 약 105 개 세포를 포함하는 0.6% 한천 배지 (10% 폴리펩톤, 5% 효모 추출물, 2.5% NaCl, 1% 한천) 상에 덮었다. 상기 배지 플레이트를 37℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 콜로니가 형성되지 않은 부분의 한천을 버리고 (대략 수 cm2), 1.5 mL 튜브에 옮겼다. 여기에, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 1 mL 를 넣고, 90 분 동안 20℃ 에서 진탕하였다. 그 후, 3000 rpm 에서 15 분 동안 원심분리하고, 상청액을 회수하여 박테리오파지 샘플로서 사용하였다 (냉장함).
2) 시약
I: 반응액 1: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0
II: 반응액 2: 3 M 염화마그네슘 용액
III: 분산액: 1 M 글리신-HCl pH 5.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 1 과 유사한 방식으로 양이온성 그래프트 중합체를 제조하였다.
박테리오파지의 분리 및 이의 역가 확인을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 20% 양이온성 그래프트 중합체 100 μL, 반응액 1: 100 μL, 및 반응액 2: 100 μL 를 혼합하였다. 그 후, 생성된 혼합물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 제거하고, 생성된 침전 펠렛을 분산액 100 μL 로 완전하게 분산시켜 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 대장균 약 105 개 세포를 함유하는 한천 배지와 혼합하고, 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하여, 대장균의 용균을 확인하였다 (도 11).
양이온성 그래프트 중합체와 반응하기 전 박테리오파지 샘플을 양성 대조군으로서 대장균으로 감염시켰다.
2. 결과
그래프트 중합체로 박테리오파지를 분리할 수 있다는 것이 발견되었다.
<실시예 10B>
분리한 대장균의 생존 (생존력) 확인
1. 방법
1) 샘플
실시예 1 과 유사한 방식으로 Bio-Rad Laboratories, Inc. 사제의 GFP 발현 키트를 사용하여 제작한 대장균을 정상 인간 혈청에 필요량으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 대장균: 약 108 개 세포
2) 시약
I: 반응액 1: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0
II: 반응액 2: 3 M 염화마그네슘 용액
III: 분산액: 1 M 글리신-HCl pH 5.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
상기 (5) 에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체 (PAAEpo-g-DADMAC), 및 상기 (8) 글리시딜 부티레이트-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체 (PAAGB-g-DADMAC) 를 사용하였다.
구체적으로는, 20 질량% 폴리알릴아민에, 농도가 13 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 용액을 빙수로 냉각 및 교반하면서 에폭시 옥탄 (아민에 대해 0.1 당량) 을 적가하였다. 적가 종료 후, 용액을 40℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후 농축하여, 에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민을 수용액으로서 수득하였다. 제조한 30 질량% 에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민에, 농도가 19 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 분할하여 추가 첨가하여, 에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다.
대안적으로, 20 질량% 폴리알릴아민에, 농도가 13 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 용액을 빙수로 냉각 및 교반하면서 글리시딜 부티레이트 (아민에 대해 0.1 당량) 를 적가하였다. 적가 종료 후, 40℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후 농축하여, 글리시딜 부티레이트-개질 폴리알릴아민을 수용액으로서 수득하였다. 제조한 30 질량% 글리시딜 부티레이트-개질 폴리알릴아민에, 농도가 19 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 14.42 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 분할하여 추가 첨가하여, 글리시딜 부티레이트-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다.
그래프트 중합체가 최종 농도 8%, 및 라텍스 비즈, 예를 들어 폴리스티렌 라텍스 LE (평균 입자 직경: 120 nm, Nittobo Medical Co., Ltd. 사제) 가 최종 농도 5% 가 되도록, 공지된 방법에 의해 제조한 상기 그래프트 중합체 및 라텍스 비즈를 혼합하여, 그래프트 중합체 용액을 수득하였다.
또한, 실시예 1 에서 사용한 상기 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 그래프트 중합체 (PAA-g-PSt) 를 양성 대조군으로서 사용하였다.
대장균의 분리 및 이의 생존 (생존력) 확인을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 상기 그래프트 중합체 100 μL, 반응액 1: 100 μL, 및 반응액 2: 200 μL 를 혼합하였다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 또 다른 원심 튜브에 옮기고, 15000 rpm 에서 5 분 동안 추가 원심분리하였다. 생성된 침전물을 분산액 500 μL 에 분산시켰다.
상청액을 제거함으로써 수득한 침전 펠렛을 분산액 500 μL 로 완전하게 분산시켜, 현탁액을 수득하였다.
상청액 유래의 현탁액 100 μL 및 침전 펠렛 유래의 현탁액 100 μL 각각을 LB 액체 배지 5 mL 에 첨가하고, 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하였다. 대장균의 생존을 확인하기 위해, 배양 전후의 배양액 샘플 각각의 흡광도를 분광광도계를 사용하여 측정하고, 그 변화량을 대장균량으로서 사용하였다.
상청액 유래의 현탁액 50 μL 및 침전 펠렛 유래의 현탁액 50 μL 각각을 LB 세균 배양 한천 배지 상에 도포하고, 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하였다. 콜로니의 형성에 의해 대장균의 생존력을 확인하였다 (도 12).
음성 대조군으로서, 폴리스티렌 라텍스 LE 를 포함하지만 상기 그래프트 중합체를 포함하지 않는 경우를 검사하였다.
2. 결과
하기 표 12 에 나타낸 바와 같이, 입자를 형성하지 않는 그래프트 중합체로 표적 물질을 분리하고 농축할 수 있다는 것이 발견되었다.
[표 12]
Figure 112016092603999-pct00036
<실시예 11>
분리한 대장균의 생존 (생존력) 확인
1. 방법
1) 샘플
실시예 1 과 유사한 방식으로 Bio-Rad Laboratories, Inc. 사제의 GFP 발현 키트를 사용하여 제작한 대장균을 정상 인간 혈청에 필요량으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 대장균: 약 108 개 세포
2) 시약
I: 반응액 1: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0
II: 반응액 2: 3 M 염화마그네슘 용액
III: 분산액: 1 M 글리신-HCl pH 5.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
상기 (5) 에폭시 옥탄-개질 폴리알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체 (PAAEpo-g-DADMAC) 를 사용하였다.
대장균의 분리 및 이의 생존 (생존력) 확인을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 상기 그래프트 중합체 100 μL, 반응액 1: 100 μL, 및 반응액 2: 200 μL 를 혼합하였다. 샘플 및 상기 그래프트 중합체를 혼합하였다. 그 후, 20 μL 의, 공지된 방법으로 제조한 라텍스 비즈, 예를 들어 폴리스티렌 라텍스 LE (평균 입자 직경: 120 nm, Nittobo Medical Co., Ltd. 사제) 를 첨가하고 잘 혼합하였다. 생성된 혼합물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 또 다른 원심분리 튜브에 옮기고, 15000 rpm 에서 5 분 동안 추가 원심분리하였다. 생성된 침전물을 분산액 500 μL 에 분산시켰다.
상청액을 제거함으로써 수득한 침전 펠렛을, 분산액 500 μL 로 완전하게 분산시켜 현탁액을 수득하였다.
상청액 유래의 현탁액 50 μL 및 침전 펠렛 유래의 현탁액 50 μL 각각을 LB 세균 배양 한천 배지 상에 도포하고, 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하였다. 콜로니의 형성에 의해 대장균의 생존력을 확인하였다.
2. 결과
그래프트 중합체를 라텍스 비즈와 미리 혼합한 경우, 균체와의 반응 후에 라텍스 비즈를 첨가한 경우와 유사한 방식으로 균체를 포획하였다 (도 13).
<실시예 12>
분리한 대장균의 생존 (생존력) 확인
1. 방법
1) 샘플
실시예 1 과 유사한 방식으로 Bio-Rad Laboratories, Inc. 사제의 GFP 발현 키트를 사용하여 제작한 대장균을 정상 인간 혈청에 필요량으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 대장균: 약 108 개 세포
2) 시약
I: 반응액 1: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0
II: 반응액 2: 3 M 염화마그네슘 용액
III: 분산액: 1 M 글리신-HCl pH 5.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
상기 (11) 글리시돌-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 사용하였다.
구체적으로는, 디알릴아민에, 농도가 79 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 용액을 빙수로 냉각 및 교반하면서 글리시돌 (아민에 대해 1 당량) 을 적가하였다. 적가 종료 후, 용액을 45℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 농축하여 글리시돌-개질 디알릴아민을 수용액으로서 수득하였다.
78 질량% 글리시돌-개질 디알릴아민에, 35 질량% 염산 (아민에 대해 1 당량) 을 첨가하였다. 그 후, 농도가 50 질량% 가 되도록 물을 첨가하였다. 생성된 용액을 60℃ 로 가열하고, 2,2'-아조비스(2-메틸 프로피온아미딘) 디히드로클로라이드 (단량체에 대해 6 몰%) 를 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 생성된 용액을 전기투석에 의해 정제하여, 글리시돌-개질 폴리디알릴아민을 수용액으로서 수득하였다. 제조한 43 질량% 글리시돌-개질 폴리디알릴아민에, 농도가 30 질량% 가 되도록 물을 첨가하고, 생성된 용액을 20℃ 에서 교반하였다. 이후, 65 질량% 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (아민에 대해 3 당량) 및 28.5 질량% APS 수용액 36.04 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 각각 분할하여 첨가하고, 24 시간 동안 중합을 수행하였다. 그 후, 28.5 질량% APS 수용액 36.04 g (단량체에 대해 10 몰%) 을 분할하여 추가 첨가하고, 50℃ 에서 24 시간 동안 중합시켜, 글리시돌-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 수용액으로서 수득하였다.
그래프트 중합체가 최종 농도 8%, 및 라텍스 비즈, 예를 들어 폴리스티렌 라텍스 LE (평균 입자 직경: 120 nm, Nittobo Medical Co., Ltd. 사제) 가 최종 농도 5% 가 되도록, 공지된 방법에 의해 제조한 상기 그래프트 중합체 및 라텍스 비즈를 혼합하여, 그래프트 중합체 용액을 수득하였다.
또한, 실시예 1 에서 사용한 상기 (3) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 그래프트 중합체 (PAA-g-PSt) 를 양성 대조군으로서 사용하였다.
대장균의 분리 및 이의 생존 (생존력) 확인을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 상기 그래프트 중합체 100 μL, 반응액 1: 100 μL, 및 반응액 2: 200 μL 를 혼합하였다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 또 다른 원심 튜브에 옮기고, 15000 rpm 에서 5 분 동안 추가 원심분리하였다. 생성된 침전물을 분산액 500 μL 에 분산시켰다.
상청액을 제거함으로써 수득한 침전 펠렛을, 분산액 500 μL 로 완전하게 분산시켜 현탁액을 수득하였다.
상청액 유래의 현탁액 100 μL 및 침전 펠렛 유래의 현탁액 100 μL 각각을 LB 액체 배지 5 mL 에 첨가하고, 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하였다. 대장균의 생존을 확인하기 위해, 배양 전후의 배양액 샘플 각각의 흡광도를 분광광도계를 사용하여 측정하고, 그 변화량을 대장균량으로서 사용하였다.
상청액 유래의 분산액 50 μL 및 침전 펠렛 유래의 분산액 50 μL 각각을 LB 세균 배양 한천 배지 상에 도포하고, 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하였다. 콜로니의 형성에 의해 대장균의 생존력을 확인하였다 (도 14).
대조군으로서, 폴리스티렌 라텍스 LE 를 포함하지만 상기 그래프트 중합체를 포함하지 않는 경우를 검사하였다.
2. 결과
[표 13]
Figure 112016092603999-pct00037
<실시예 13>
질량 분석기를 사용하는 측정
1. 방법
1) 샘플
실시예 1 과 유사한 방식으로 Bio-Rad Laboratories, Inc. 사제의 GFP 발현 키트를 사용하여 제작한 대장균을 정상 인간 혈청에 필요량으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 대장균: 약 108 개 세포
2) 시약
I: 반응액 1: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0
II: 반응액 2: 3 M 염화마그네슘 용액
III: 분산액: 70% 포름산
IV: 응집액: 100% 아세토니트릴
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 12 에서 사용한 상기 (11) 글리시돌-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 사용하였다.
그래프트 중합체가 최종 농도 8%, 및 라텍스 비즈, 예를 들어 폴리스티렌 라텍스 LE (평균 입자 직경: 120 nm, Nittobo Medical Co., Ltd. 사제) 가 최종 농도 5% 가 되도록, 공지된 방법에 의해 제조한 상기 그래프트 중합체 및 라텍스 비즈를 혼합하여, 그래프트 중합체 용액을 수득하였다.
또한, 실시예 1 에서 사용한 상기 (3) 프로필렌 옥시드-개질 폴리알릴아민 및 스티렌의 그래프트 중합체 (PAA-g-PSt) 를 양성 대조군으로서 사용하였다.
대장균의 분리 및 질량 분석기를 사용하는 측정을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 상기 그래프트 중합체 50 μL, 반응액 1: 100 μL, 및 반응액 2: 200 μL 를 혼합하였다. 그 후, 생성물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다.
상청액을 제거하고, 생성된 침전 펠렛을 분산액 30 μL 로 완전하게 분산시켰다. 이후, 응집액 100 μL 를 혼합한 다음, 생성된 혼합물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 60 초 동안 원심분리하였다. 생성된 상청액을 질량 분석기 사용 측정용 샘플로서 사용하였다. 질량 분석기는 실시예 3 과 유사한 방식으로 취급하였다.
대조군으로서, 폴리스티렌 라텍스 LE 를 포함하지만 상기 그래프트 중합체를 포함하지 않는 경우를 검사하였다.
2. 결과
[표 14]
Figure 112016092603999-pct00038
글리시돌-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체와 라텍스 비즈의 혼합액을 사용하는 경우, 반응액 2 (마그네슘 이온) 를 첨가하지 않고 대장균을 포착/회수할 수 있다는 것이 질량 분석기를 사용하는 측정으로부터 판명되었다.
[표 15]
Figure 112016092603999-pct00039
<실시예 14>
분리한 대장균의 생존 (생존력) 확인
1. 방법
1) 샘플
실시예 1 과 유사한 방식으로 Bio-Rad Laboratories, Inc. 사제의 GFP 발현 키트를 사용하여 제작한 대장균을 정상 인간 혈청에 필요량으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 대장균: 약 108 개 세포
2) 시약
I: 반응액 1: 1 M 글리신-NaOH pH 11.0
II: 반응액 2: 3 M 염화마그네슘 용액
III: 분산액: 1 M 글리신-HCl pH 5.0
3) 양이온성 그래프트 중합체
실시예 12 에서 사용한 상기 (11) 글리시돌-개질 폴리디알릴아민 및 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드의 그래프트 중합체를 사용하였다.
대장균의 분리 및 이의 생존 (생존력) 확인을 하기와 같이 수행하였다.
샘플 500 μL, 상기 그래프트 중합체 100 μL, 반응액 1: 100 μL, 및 반응액 2: 200 μL 를 혼합하였다. 샘플 및 상기 그래프트 중합체를 혼합하였다. 그 후, 20 μL 의, 공지된 방법으로 제조한 라텍스 비즈, 예를 들어 폴리스티렌 라텍스 LE (평균 입자 직경: 120 nm, Nittobo Medical Co., Ltd. 사제) 를 첨가하고 잘 혼합하였다. 그 후, 생성된 혼합물을 탁상형 소형 원심분리기에 의해 30 초 동안 원심분리하여, 침전 펠렛을 수득하였다. 상청액을 또 다른 원심분리 튜브에 옮기고, 15000 rpm 에서 5 분 동안 추가 원심분리하였다. 생성된 침전물을 분산액 500 μL 에 분산시켰다.
상청액을 제거함으로써 수득한 침전 펠렛을, 분산액 500 μL 로 완전하게 분산시켜 현탁액을 수득하였다.
상청액 유래의 현탁액 50 μL 및 침전 펠렛 유래의 현탁액 50 μL 각각을 LB 세균 배양 한천 배지 상에 도포하고, 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하였다. 콜로니의 형성에 의해 대장균의 생존력을 확인하였다.
2. 결과
그래프트 중합체를 미리 라텍스 비즈와 혼합한 경우, 균체와의 반응 후에 라텍스 비즈를 첨가한 경우와 유사한 방식으로 균체를 포획하였다 (도 15).
본 발명의 방법 및 이를 위한 키트는, 이온 교환 중합체를 사용하는 종래의 방법보다 표적을 더 효율적으로 분리 및 정제할 수 있으며, 샘플 중 표적의 존재량이 매우 적더라도 표적을 검출할 수 있다.

Claims (11)

  1. 하기 단계를 포함하는, 양이온성 그래프트 중합체를 사용하여 표적 생체분자를 분리 및 농축하는 방법으로서:
    (1) 염기성 조건 하에 양이온성 그래프트 중합체와 표적 생체분자 함유 샘플을 접촉시켜, 표적 생체분자를 양이온성 그래프트 중합체에 결합시키는 단계;
    (2) 양이온성 그래프트 중합체 및 표적 생체분자의 결합 복합체를 분리하는 단계; 및
    (3) 상기 결합 복합체로부터 표적 생체분자를 용출하는 단계,
    여기서 양이온성 그래프트 중합체가 하나 이상의 아미노기를 갖는 중합체 화합물 (a) 와 하나 이상의 에폭시기를 갖는 화합물 (b) 사이의 반응에 의해 수득한 폴리아민 유도체 및 에틸렌성 불포화 단량체 (c) 를 중합하여 수득되는 폴리아민 그래프트 중합체이고,
    하나 이상의 에폭시기를 갖는 화합물 (b) 는 일반식 (7) 로 나타내는 화합물로서,
    Figure 112021077300947-pct00055

    (1) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 식 중 각각 수소 원자인 에틸렌 옥시드,
    (2) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 히드록시기를 가지며 탄소수 1 내지 8 인 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기인 (식 중 R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물,
    (3) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 치환 또는 비치환 1 가 탄화수소기인 (식 중 R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물,
    (4) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 에테르 결합을 가지며 탄소수 1 내지 8 인 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물,
    (5) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 할로겐 원자인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물,
    (6) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 불포화 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물,
    (7) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 지환식 탄화수소기 또는 불포화 결합을 갖는 고리형 탄화수소기를 포함하는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물,
    (8) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 방향족 고리 또는 헤테로시클릭 고리를 포함하는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물,
    (9) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 에폭시 고리를 포함하는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 다관능성 에폭시 화합물,
    (10) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 알콕시실릴을 포함하며 탄소수 3 내지 12 인 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물,
    (11) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 불소 원자를 갖는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물,
    (12) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 카르복실기를 갖는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물,
    (13) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 포함하며 탄소수 1 내지 12 인 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물, 및
    (14) 식 중 R1, R2, R3 및 R4 가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 사슬 내에 술포네이트기를 포함하는 탄화수소기인 (R1, R2, R3 및 R4 의 모두가 수소 원자는 아님) 에폭시 화합물
    로 이루어진 군에서 선택되는, 양이온성 그래프트 중합체를 사용하여 표적 생체분자를 분리 및 농축하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 (1) 에서 2 가 또는 3 가 금속 이온을 첨가하는 것을 추가로 포함하는 양이온성 그래프트 중합체를 사용하여 표적 생체분자를 분리 및 농축하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 단계 (2) 에서 결합 복합체를 세정하는 단계를 추가로 포함하는 양이온성 그래프트 중합체를 사용하여 표적 생체분자를 분리 및 농축하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 양이온성 그래프트 중합체가 고체상 표면에 고정되는 양이온성 그래프트 중합체를 사용하여 표적 생체분자를 분리 및 농축하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 단계 (3) 에서 표적 생체분자와 결합하지 않는 양이온성 그래프트 중합체를 응집시키는 단계를 포함하는 양이온성 그래프트 중합체를 사용하여 표적 생체분자를 분리 및 농축하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용되는 키트로서, 제 1 항에서 정의되는 양이온성 그래프트 중합체를 포함하는 키트.
  7. 제 6 항에 있어서, 2 가 또는 3 가 금속 이온 염을 추가로 포함하는 키트.
  8. 제 6 항에 있어서, 염기성 용액 및 2 가 또는 3 가 금속 이온 염을 함유하는 반응액을 추가로 포함하는 키트.
  9. 제 6 항에 있어서, 세정액을 추가로 포함하는 키트.
  10. 제 6 항에 있어서, 산성 용액 또는 킬레이트제를 함유하는 분산액을 추가로 포함하는 키트.
  11. 제 6 항에 있어서, 응집액을 추가로 포함하는 키트.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10189931B2 (en) 2014-03-24 2019-01-29 Nitto Boseki Co., Ltd. Graft polymer and method for producing same
CN108395567B (zh) * 2018-04-17 2020-07-14 兰州大学 整体凝胶复合材料制备及用于高效分离人血清中蛋白质和小分子物质
US11045773B2 (en) * 2018-08-31 2021-06-29 Pall Corporation Salt tolerant porous medium
US10737259B2 (en) * 2018-08-31 2020-08-11 Pall Corporation Salt tolerant anion exchange medium

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010009759A1 (en) 1999-12-08 2001-07-26 Jsr Corporation Virus-binding particles, virus-separating reagent, separation of viruses, and detection of viruses
JP2002125695A (ja) 2000-10-27 2002-05-08 Jsr Corp 微生物および生体由来物質の検出方法
WO2011120156A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Alberta Innovates - Technology Futures Polyamine-containing polymers and methods of synthesis and use
WO2012144554A1 (ja) 2011-04-20 2012-10-26 Dic株式会社 ウイルス濃度の評価方法及び評価キット
JP2013231145A (ja) 2012-05-01 2013-11-14 Asahi Kasei Chemicals Corp 重合体溶液の精製方法

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4929886B1 (ko) 1970-03-05 1974-08-08
JPS57189692A (en) * 1981-05-18 1982-11-22 Nippon Oil Co Ltd Immobilizing method of microorganism
EP0358358B1 (en) 1988-08-26 1994-11-30 Nippon Oil And Fats Company, Limited Pigment dispersing agent
JPH03103478A (ja) 1988-08-26 1991-04-30 Nippon Oil & Fats Co Ltd 顔料分散剤
US5582988A (en) 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
US6395849B1 (en) 1997-10-29 2002-05-28 Nitto Boseki Co., Ltd. Processes for producing N,N-dialkylallylamine polymers and N,N-dialkyllylamine polymers
WO2000066197A1 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 Children's Hospital Medical Center Hemofiltration system
JP4248207B2 (ja) 2002-08-29 2009-04-02 川研ファインケミカル株式会社 分散剤
JP3940367B2 (ja) 2003-01-21 2007-07-04 中部キレスト株式会社 キレート形成性繊維及びその製法、並びに該繊維を用いた金属イオン捕捉法、及び金属キレート繊維
EP1584633B1 (en) 2003-04-01 2010-10-20 Nitto Boseki Co., Ltd. Modified polyallylamine and process for producing the same
JP4239201B2 (ja) 2003-11-28 2009-03-18 独立行政法人 日本原子力研究開発機構 金を吸着回収する吸着材の合成方法及び排水処理
WO2005092013A2 (en) * 2004-03-19 2005-10-06 Perkinelmer Las, Inc. Separations platform based upon electroosmosis-driven planar chromatography
JP2006036830A (ja) 2004-07-23 2006-02-09 Toyo Ink Mfg Co Ltd 顔料分散剤、それを用いた顔料組成物および顔料分散体
KR20130019031A (ko) * 2004-09-23 2013-02-25 트리패스 이미징, 인코포레이티드 생물학적 시료의 고정을 위한 다가양이온성 중합체 코팅
KR100682945B1 (ko) * 2005-05-24 2007-02-15 삼성전자주식회사 상 분리를 이용한 세포 분리 방법 및 키트
DE102005055497A1 (de) * 2005-11-18 2007-05-31 Stockhausen Gmbh Geruchsbindende superabsorbierende Zusammensetzung
JP4942015B2 (ja) 2005-12-15 2012-05-30 旭化成株式会社 リガンド固定化用基材および細胞選択吸着材
US20100029544A1 (en) 2006-07-12 2010-02-04 Woei Ping Cheng Composition
CN101627067B (zh) 2007-03-05 2012-10-03 巴斯夫欧洲公司 聚胺-聚丙烯酸酯分散剂
US8105493B2 (en) 2007-06-29 2012-01-31 Jnc Corporation Aggregation and dispersion methods of magnetic particles, separation and detection methods using the same and detection kit
JP5428166B2 (ja) * 2007-06-29 2014-02-26 Ｊｎｃ株式会社 磁性粒子の凝集及び分散方法並びにこれを用いた分離、検出方法及び検出用キット
JP2009235185A (ja) * 2008-03-26 2009-10-15 Jsr Corp 重合体の精製方法および重合体溶液
JP5725394B2 (ja) * 2009-03-25 2015-05-27 公立大学法人大阪府立大学 造血幹細胞の培養方法
JP5750793B2 (ja) * 2009-07-22 2015-07-22 国立大学法人信州大学 Ｅｓ細胞の継代方法及びｅｓ細胞増殖方法
JP5700668B2 (ja) 2010-07-01 2015-04-15 旭化成株式会社 二酸化炭素吸収用ポリマー、該ポリマーを利用した二酸化炭素の分離回収方法
US8709466B2 (en) * 2011-03-31 2014-04-29 International Business Machines Corporation Cationic polymers for antimicrobial applications and delivery of bioactive materials
ES2540330T3 (es) * 2011-03-31 2015-07-09 Coty Germany Gmbh Composición con efecto bronceador mejorado
PL2773438T5 (pl) * 2011-11-02 2022-01-17 F.Hoffmann-La Roche Ag Chromatografia przeciążenia i elucji
JP2013189595A (ja) 2012-03-15 2013-09-26 Nitto Denko Corp グラフト鎖を有する高分子電解質膜およびその製造方法
US20150093800A1 (en) * 2013-09-05 2015-04-02 Genentech, Inc. Method for chromatography reuse
US10189931B2 (en) 2014-03-24 2019-01-29 Nitto Boseki Co., Ltd. Graft polymer and method for producing same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010009759A1 (en) 1999-12-08 2001-07-26 Jsr Corporation Virus-binding particles, virus-separating reagent, separation of viruses, and detection of viruses
JP2002125695A (ja) 2000-10-27 2002-05-08 Jsr Corp 微生物および生体由来物質の検出方法
WO2011120156A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Alberta Innovates - Technology Futures Polyamine-containing polymers and methods of synthesis and use
WO2012144554A1 (ja) 2011-04-20 2012-10-26 Dic株式会社 ウイルス濃度の評価方法及び評価キット
JP2013231145A (ja) 2012-05-01 2013-11-14 Asahi Kasei Chemicals Corp 重合体溶液の精製方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF BIOMATERIALS SCIENCE, POLYMER EDITION, VOL.5, NO.6, P. 569_590

Also Published As

Publication number Publication date
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